CH645466A5 - Procede pour la determination des leucocytes et de l'hemoglobine du sang. - Google Patents
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Description
La présente invention a pour objet un procédé pour la détermination des leucocytes et de l'hémoglobine du sang, selon lequel un agent de lyse, contenant une solution aqueuse d'un sel quaternaire d'ammonium ayant des propriétés actives de surface et un cyanure métallique alcalin, est utilisé pour la stromatolyse des érythrocytes et des cellules de plaquettes et pour convertir l'hémoglobine en un chromagène, ledit sel quaternaire d'ammonium ayant trois groupes alkyles à courte chaîne attachés à l'azote et un groupe alkyle à longue chaîne.
D'une façon générale, l'invention a trait à la détermination de l'hémoglobine du sang ainsi qu'à celle des paramètres des plaquettes dans un seul échantillon de sang au moyen d'une instrumentation électronique adéquate. En particulier, il est désirable de développer des réactifs et des méthodes utilisables dans des compteurs de Coulter du modèle S Plus (marque déposée) automatiques pour le comptage du sang, fabriqués par Coulter Electronics, Inc., à Hialeah (Floride), qui permettent, à l'aide des données relatives au volume des globules accumulées sur un Channelyzer de Coulter (marque déposée), de discriminer deux populations de leucocytes:
1) une population lymphoïde (lymphocytes), et
2) une population myéloïde (neutrophiles, monocytes, éosino-philes et basophiles).
De telles données sont utilisées comme moyen d'observation pour le dépistage des rapports de leucocytes anormaux. Les situations anormales mises à jour par cette méthode donnent des informations de valeur pour les diagnostics et pour les études ultérieures.
La séparation des leucocytes humains normaux par la distribution de volumes utilisant les principes de comptage et de dimension-nement développés par Wallace H. Coulter et utilisés par le compteur de Coulter est maintenant appliquée à une méthode de diagnostic clinique. Cette méthode est fondée sur la propriété fondamentale de toutes les cellules vivantes de régler leur volume cellulaire par un code d'information génétique. Chaque type de cellules dans la circulation du sang a sa propre caractéristique de volume, allant de 3 (i3 pour les plaquettes jusqu'à 450 |i3 pour les cellules polymorphonu-cléaires. Les instruments du compteur de Coulter sont destinés à utiliser ce volume différentiel à des fins de comptage et de détermination des distributions des dimensions des plaquettes et des érythrocytes pour détecter et considérer les états pathologiques.
Les érythrocytes et les leucocytes lymphoïdes, malheureusement, se chevauchent considérablement pour ce qui est de la dimension cellulaire, et il n'est pas possible d'effectuer le comptage des unes par rapport aux autres par une simple discrimination de dimension. Une pratique traditionnelle emploie un réactif à fort Surfactant lytique qui stromatolyse les érythrocytes, les réduisant à des particules très petites ou produisant une solvatisation de membrane, et ôte le cytoplasme à la fois des leucocytes lymphoïdes, et myéloïdes ne laissant à compter que le noyau, résistant à la lyse. Du fait que le volume des cellules originales est fortement affecté et réduit à un minimum,
seule une population simple peut être traitée par l'analyse de distribution de dimension.
Le compteur de Coulter modèle S Plus de comptage automatique des cellules sanguines est destiné à diluer un échantillon de sang entier dans un diluant isotonique additionné d'un agent de lyse et à en effectuer le comptage après 7,5 s. Les données sont collectées pendant 4 s pour les érythrocytes et les leucocytes, et jusqu'à 20 s pour les plaquettes. Ainsi, un système diluant-lyse doit fournir les vitesses de lyse des érythrocytes suffisamment rapidement pour permettre que soit effectuée une stromatisation complète pendant la période de lyse, sans cependant que soient complètement supprimés les leucocytes pendant ce temps. En outre, les changements du volume des leucocytes doivent être minimes pendant l'étape de collection des données et, idéalement, devraient être stables pendant plusieurs minutes. Le système réactif doit également préserver l'intégrité du nombre des érythrocytes et des plaquettes, et la distribution de dimension, la courbe d'absorbance d'hémoglobine et le compte total des leucocytes. Des sangs prélevés sur le doigt doivent être stables lorsqu'ils sont prédilués dans le diluant isotonique pendant au moins 2 h.
Pour réaliser une analyse des populations relatives des cellules lymphoïdes et myéloïdes dans le sang, un histogramme de volume des leucocytes doit montrer clairement les pointes de lymphoïdes et myéloïdes séparément, avec de faibles débris des érythrocytes, permettant à des vallées d'être très près de la ligne de base. L'intégration de chaque pointe donnera le rapport des populations des cellules lymphoïdes et myéloïdes. Il a été démontré que la pointe des lymphoïdes contient des lymphocytes et des petits lymphocytes atypiques, alors que la pointe myéloïde contient des cellules polymorpho-nucléaires, des bandes, des monocytes, des basophiles et de grands lymphocytes atypiques.
Dans le brevet USA N° 3874852 (1975) appartenant à Coulter Diagnostics, Inc., figure une formule pour une composition contenant un détergent au sel quaternaire d'ammonium et de cyanure qui doit être employé comme réactif de lyse et de formation de chromagène pour obtenir un compte des leucocytes d'un volume simple et la détermination de l'hémoglobine dans l'appareil de Coulter modèle S. Une investigation plus poussée est nécessaire pour utiliser des sels quaternaires d'ammonium comme agents de lyse pour obtenir le compte de deux populations de leucocytes.
Dans le brevet USA N° 4286963 appartenant à Coulter Electronics, Inc., un diluant liquide pour la lyse rapide des globules rouges du sang dans du sang entier pour réaliser la détermination différentielle des populations lymphoïdes/myéloïdes des leucocytes, et également pour mesurer l'hémoglobine par la formation d'un chromagène, contient un mélange d'une solution saline aqueuse d'au moins un sel quaternaire d'ammonium ayant des propriétés actives de surface et de certains additifs tels que le 2-phénoxyéthanol.
L'analyse à deux distributions de volume est difficile du fait que, avec beaucoup de diluants, les deux populations se transforment rapidement en une seule, de sorte qu'on ne dispose pas d'assez de temps pour effectuer les calculs pour l'analyse.
Le procédé suivant l'invention est caractérisé par le fait que le sel quaternaire d'ammonium et le cyanure métallique alcalin sont présents dans une gamme de concentrations qui convient pour donner des histogrammes des leucocytes à deux volumes et pour permettre une calculation de routine de l'histogramme lymphoïde/myéloïde des leucocytes et leur concentration relative, en particulier dans des systèmes de comptage automatiques.
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Une formulation préférée du diluant isotonique est la suivante:
Ingrédients Plages de concentrations effectives
Chlorhydrate de procaïne 0,11 g/1
Acide N-(2-acétamido)iminodiacêtique (ADA) 1,40 g/1
Diacétate de chlorhexydène 0,02 g/I
Diméthylolurée 1,00 g/1
l-Hydroxypyridine-2-thione de sodium 0,50 g/1
Hydroxyde de sodium 0,50 g/1
Sulfate de sodium, anhydre 9,72 g/1
Chlorure de sodium 4,50 g/1
Eau jusqu'à 1 1
Ce diluant est réglé à un pH de 7,0 + 0,1 au moyen d'hydroxyde de sodium ou d'une solution d'acide hydrochlorhydrique si nécessaire. L'osmolalité est réglée à 320 ± 5 milliosmoles par kilogramme au moyen de chlorure de sodium.
Il est connu que les cellules du sang contiennent des enzymes ATP qui transportent des cations de métaux alcalins associés avec de petits anions (chlorure) vers l'intérieur et vers l'extérieur de la cellule par un mécanisme nécessitant de l'énergie afin de maintenir l'équilibre osmotique, la tergidité de la cellule et les propres potentiels de la membrane. Les ions de sodium associés avec les anions de sulfate, beaucoup plus grands, ne sont apparemment pas transportés aussi facilement en raison des grandes différences dans les densités de charge entre les anions de sulfate et de chlorure et les changements de potentiels dans la charge de la membrane lorsque les ions sont transportés vers l'intérieur et vers l'extérieur de la cellule. L'équilibre de la pression osmotique intérieure dans la cellule est maintenu par l'adjonction d'environ 30 milliosmoles de chlorure de sodium. Le sulfate de sodium est connu pour sa capacité à solubiliser les globulines de plasmas anormales et à réduire ou éliminer la turbidité des solutions d'hémoglobine due au compte élevé des leucocytes.
Le chlorhydrate de procaïne, comme l'un des représentants des anesthésiques comportant les dérivés ester acide 4-aminobenzoïque et leurs sels, a été constaté comme ayant une influence stabilisatrice de la membrane érythrocyte, mais son mode d'action est incertain. L'utilisation d'acide N-(2-acétamido)iminodiacétique (ADA), un tampon organique, est indiquée en raison de sa propriété d'aider les agents de lyse constitués de sel quaternaire d'ammonium faible à réduire les débris érythrocytes lysés en particules de dimension électriquement plus petite que 45 n3, ce qui empêche l'interférence éry-throcytique dans l'énumération et la distribution des leucocytes dans deux populations distinctes (lymphoïde et myéloïde).
Bien que le mécanisme opérationnel de l'ADA n'ait pas été rigoureusement étudié, il est connu qu'il est un ligand modérément fort pour les métaux alcalins du groupe II et les métaux de transition du groupe IIB, comme il est également un tampon raisonnablement efficace. En ressemblant à un acide amino de degré élevé, l'ADA apparemment est attiré et interfère avec les protéines de membrane de cellule. Il est alors coordonné avec les cations métalliques donnant à la surface extérieure de la membrane une apparence de charge positive supérieure à la solution environnante, encourageant ainsi la sol-vatisation et l'attraction des anions autour de la membrane extérieure. Ce revêtement des molécules de solvant et des anions empêche effectivement l'approche et l'interaction d'agglutination avec les autres cellules en suspension. L'action tampon de l'ADA empêche des changements dans l'environnement local produisant la dissolvation et la perte de stabilité.
Ce mécanisme, s'ajoutant à l'action d'un anesthésique local tel que du chlorhydrate de procaïne et le sulfate de sodium, aide à la stabilisation des composants cellulaires de l'échantillon du sang, rendant ceux-ci essentiellement non modifiés à partir de leur état d'origine dans le spécimen de sang en termes de nombre, de distribution de dimension et de forme. Ce facteur est de grande importance au point de vue du diagnostic dans l'interprétation des paramètres des hémogrammes additionnels.
Le diacétate de chlorhexydène, quoique utilisé habituellement comme virocide et germicide, n'est que marginalement efficace par lui-même à la concentration utilisée, mais aide sensiblement l'ADA à réduire les débris de fond qui interfèrent avec l'énumération de la distribution de dimension des leucocytes. Le chlorhexydène présente également quelque ressemblance avec les aminés arginine et guani-dine et il peut être escompté qu'il interagit avec les protéines de membrane par coordination et liaison avec l'hydrogène. Comme tel, il aide apparemment les agents de lyse à stromatolyser complètement les membranes érythrocytes.
La diméthylolurée, un condensât de formaldéhyde et d'urée, est supposée réagir très lentement aux solutions à pH neutre avec les membranes de leucocytes pour assurer une mesure de stabilité, ce qui n'apparaît pas lorsqu'on élimine ce composé. Il est connu comme étant un composé antiseptique bactériostatique prévenant l'accroissement des micro-organismes à des concentrations modérées. D'autres composants ajoutés pour stabiliser les leucocytes sont l'hexaméthylènetétramine et le N-hydroxyméthylacétamide.
Le l-hydroxypyridine-2-thione de sodium est connu pour son emploi comme fongicide et bactéricide dans des shampooings antipelliculaires. Il est utilisé ici comme un bactéricide et fongicide qui ne présente pas d'effets apparents de l'éther sur la forme, la distribution de dimension ou le nombre des composants cellulaires dans le sang humain complet.
L'utilisation de la combinaison de diméthylolurée et de 1-hy-droxypyridine-2-thione de sodium donne un produit très bactéricide qui est supérieur à celui obtenu avec chacune de ces substances utilisée séparément. Cette combinaison donne un hémogramme stable à la fois pour les échantillons normaux et anormaux alors que, simultanément, il autorise une information sur la distribution de volume concernant les globules blancs qui doivent être collectés par un système d'instrumentation automatique.
Le premier but du système diluant est de stabiliser la dimension et la forme des cellules et l'intégrité de tous les composants cellulaires du sang à une valeur non obtenue précédemment afin d'assurer une précision de diagnostic des hémogrammes du sang dérivée de l'analyse de distribution de volume automatique et de l'énumération. La présente invention permet l'extension et l'amélioration de ce qui s'est fait précédemment en rendant les conditions des cellules du courant de sang relativement inchangées lorsqu'elles sont diluées et préparées pour un comptage et un dimensionnement automatiques. Lorsque les dispositions connues sont utilisées en conjonction avec un agent de lyse approprié, elles peuvent être étendues à la production d'informations de distribution à deux volumes concernant les leucocytes.
Le diluant décrit reproduira des hémogrammes précis avec un appareil de Coulter automatique ou semi-automatique, mais produira des histogrammes de leucocytes à deux volumes seulement lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le présent réactif de lyse.
L'agent de lyse est une solution aqueuse d'au moins un sel quaternaire d'ammonium ayant des propriétés de surface active et un cyanure métallique alcalin, comme décrit de façon générale dans le brevet USA N° 3874852, pour obtenir un compte de leucocytes à un seul volume. La plage effective des concentrations des ingrédients mentionnés doit être suivie spécifiquement afin que puisse être obtenu le compte des leucocytes à deux populations.
Dans les compositions préférées, l'alkyle à longue chaîne de la formule qui suit a 12 à 16 atomes de carbone, les chaînes courtes étant le triméthyle, et X~ étant le chlorure ou le bromure.
Le détergent au sel quaternaire d'ammonium a la formule suivante:
"Ri R21 +
\ /
N X"
/ \
_R.ß R4 _
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où R! est un radical alkyle à longue chaîne ayant 10 à 18 atomes de carbone, R2, R3 et R4 sont des radicaux alkyles à courte chaîne ayant 1 à 6 atomes de carbone, et X- est un sel formant radical tel que Cl, Br, I, P04 et CH3S04.
Une formulation préférée pour cet agent de lyse est:
Ingrédient
Plage effective des concentrations
Chlorure de dodécyltriméthylammonium (solution à 50%) Bromure de tétradécyltri-méthylammonium (Mytab, marque déposée)
Cyanure de potassium Eau
60 g/1 40-70 g/1
6 g/1 4-7 g/1 300 mg/1 250-500 mg/1 jusqu'à 1 1
L'agent de lyse susmentionné est beaucoup plus faible et lent dans sa vitesse de réaction que l'agent de lyse S II (marque déposée) utilisé couramment. D'autres sels quaternaires d'ammonium qui sont aussi efficaces sont le bromure d'hexadécyltriméthylammonium Cetrimide (marque déposée), et le bromure de céthyldiméthyléthyl-ammonium Bretol (marque déposée), soit seul, soit en combinaison avec le chlorure de dodécyltriméthylammonium. Le système diluant est apparemment apte à stabiliser la membrane des leucocytes suffisamment pour ralentir les vitesses de réaction de l'agent de lyse à un point où il est possible de distinguer le plus petit volume des cellules lymphoïdes du plus grand volume des séries myéloïdes (neutrophi-les, monocytes, éosinophiles et basophiles). Une mesure répétée de distribution de dimension des leucocytes a montré que les histogrammes sont stables jusqu'à une durée de 30 s avant que ne débute leur dégénération. Les résultats expérimentaux indiquent que les cellules de lymphoïdes sont réduites essentiellement à leur volume cellulaire minimal en 7,5 s de durée de lyse. Les cellules myéloïdes apparaissent comme ayant deux à trois fois leur volume terminal après 30 s après l'addition de l'agent de lyse, après quoi le volume se réduit lentement jusqu'à ce que la fraction de myéloïde se confonde avec la fraction de lymphoïde.
En utilisant un appareil de Coulter calibré à érythrocyte modèle S Plus et un appareil de Coulter calibré modèle C-1000 à Channely-. zer, les volumes des pointes de lymphoïdes et de myéloïdes, après traitement avec le système réactif, ont été trouvés se situant au voisinage de respectivement 85 et 260 n3 avec des largeurs de distribution étroites. Les leucocytes obtenus à partir de sang frais par simple sédimentation sur un gradient de Ficoll-Paque (marque déposée) ont été trouvés présentant des volumes d'environ 260 p3 pour la pointe des lymphoïdes et 500 n3 pour la pointe des myéloïdes, avec des largeurs de distribution beaucoup plus étendues. Un échantillon de sang frais séparé par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Paque utilisant une technique standard a produit des cellules mononucléaires (lymphocytes et monocytes) séparées des granulocytes (neutro-philes, éosinophiles et basophiles). Les lymphocites ont été trouvés comme coïncidant avec la pointe des lymphoïdes à 250 jj.3, alors que les monocytes ont été trouvés se centrant autour de 550 |j.3. La fraction granulocyte a formé une pointe assez large centrée autour de 500 (x3. La séparation des deux populations a été plus distincte avec le sang lysé chimiquement du compteur de Coulter modèle S Plus qu'avec les leucocytes viables obtenus par la méthode de Ficoll-Paque. Il apparaît de ce fait que l'agent de lyse endommage les leucocytes sensiblement du fait que leurs volumes sont réduits 2 à 3 fois en comparaison des leucocytes obtenus au moyen de la séparation de Ficoll-Paque du même échantillon sanguin.
Dans la présente invention, l'incorporation de chlorure de dodécyltriméthylammonium s'est révélée réduire de préférence le volume des cellules de lymphoïdes (c'est-à-dire une réduction triple en volume, de 260 à 85 p.3), tout en influençant le volume des cellules myéloïdes plus faiblement (c'est-à-dire une double réduction en volume allant de 500 à 260 |i3). Le chlorure de dodécyltriméthylammonium est réellement un pauvre agent de lyse par lui-même. Il apparaît comme modérant les forces d'effets lytiques du Mytab (marque déposée), ralentissant les vitesses de lyse à un degré qui permet la mesure de plusieurs volumes nucléaires de cellules. L'incorporation du bromure de dodécyltriméthylammonium donne aussi une lyse beaucoup plus claire et rapide des érythrocytes et une conversion plus rapide de l'hémoglobine avec une concentration plus faible de Mytab, donnant ainsi une meilleure stabilité aux populations de leucocytes.
Des valeurs préliminaires sur plus de cent spécimens de sang frais normaux et anormaux obtenus à partir de centres de donneurs de sang et d'hôpitaux locaux indiquent un degré élevé en corrélation entre les valeurs de populations de leucocytes provenant d'un compteur de Coulter modèle S Plus à Channelyzer et 100 cellules différenciées manuelles. Bien que de légères variations dans les fractions myéloïdes et lymphoïdes aient été observées, il n'y a pas eu d'écarts importants de corrélation.
En utilisant la combinaison du diluant et du réactif de lyse suivant l'invention, des observations spectrophotométriques (longueur d'onde versus absorbance) du sang lysé à partir d'un bain de leucocytes du compteur de Coulter modèle S Plus ont produit des courbes d'hémoglobine essentiellement identiques à celles produites par le Lyse S II; cependant, l'absorbance à 540 nm et le résultat calculé des valeurs d'hémoglobine sont sensiblement de 0,2 g/1 supérieurs à ceux obtenus avec la combinaison de l'Isoton II (marque déposée) et du Lyse S II. Des valeurs moyennes de volume de cellules ont également été notées comme se trouvant situées entre 1,0 et 1,5 |i3 de plus dans le nouveau système à deux réactifs. Tous autres paramètres sont identiques à ceux obtenus avec la combinaison de l'Isoton II et du Lyse SII.
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Claims (2)
1. Procédé pour la détermination des leucocytes et de l'hémoglobine du sang, selon lequel un agent de lyse, contenant une solution aqueuse d'un sel quaternaire d'ammonium ayant des propriétés actives de surface et un cyanure métallique alcalin, est utilisé pour la stromatolyse des érythrocytes et des cellules de plaquettes et pour convertir l'hémoglobine en un chromagène, ledit sel quaternaire d'ammonium ayant trois groupes alkyles à courte chaîne attachées à l'azote et un groupe alkyle à longue chaîne, caractérisé par le fait que ledit sel quaternaire d'ammonium et ledit cyanure métallique alcalin sont présents dans une gamme de concentrations qui convient pour donner des histogrammes des leucocytes à deux volumes et pour permettre une calculation de routine de l'histogramme lym-phoïde/myéloïde des leucocytes et leur concentration relative, en particulier dans des systèmes de comptage automatiques.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit sel quaternaire d'ammonium est un mélange de chlorure de do-décyltriméthylammonium et de bromure de tétradécyltriméthylam-monium.
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