NL9500639A - Isotoon verdunningsmiddel voor het verdunnen van totaal bloed, verdunningsmiddel in combinatie met een lyseermiddel, en werkwijze voor het behandelen van een monster van totaal bloed. - Google Patents

Description

Op grond van de niet-eenheidsbeschikking van 22 november 1994 van octrooiaanvrage 8103855 afgesplitste octrooiaanvrage

Korte aanduiding: Isotoon verdunningsmiddel voor het verdunnen van totaal bloed, verdunningsmiddel in combinatie met een lyseermiddel, en werkwijze voor het behandelen van een .

monster van totaal bloed.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een isotoon verdunningsmiddel voor het verdunnen van totaal bloed, dat een waterige oplossing van bloedcel-stabiliserende stoffen omvat.

Een soortgelijk verdunningsmiddel is bekend uit het Amerikaanse octrooischrift nr. 4.185.965. Het verdunningsmiddel volgens deze referentie bevat anorganische zouten, om een in hoofdzaak osmotisch gebalanceerde oplossing te verschaffen, en bovendien anorganische buffers en antimicrobiële middelen.

De onderhavige uitvinders hebben er nu naar gestreefd een verdunningsmiddel te ontwikkelen waarmee het mogelijk wordt differentiële tellingen van bloedcellen uit te voeren, met name ten minste twee volume-bepalingen van leukocyten. Het verdunningsmiddel volgens de onderhavige uitvinding is gekenmerkt doordat de oplossing de volgende stoffen omvat: a) één of meer anesthetische verbindingen met inbegrip van 4-aminobenzoëzuuresterderivaten voor het stabiliseren van de cellulaire componenten van het bloedmonster, b) één of meer organische buffers om interferentie van de differentiële bepaling van de leukocyten door erythrocyten te voorkomen en c) één of meer celmembraan-stabilisatoren om een bijkomende maatregel voor het stabiliseren van het leukocytenmembraan te verkrijgen.

Een isotoon verdunningsmiddel dat volgens de uitvinding de voorkeur verdient is gekenmerkt doordat de oplossing de volgende combinatie van stoffen omvat: a) procaïnehydrochloride, b) N-(2-aceetamido)iminodiazijnzuur, c) één of meer celmembraan-stabilisatoren gekozen uit de groep bestaande uit dimethylolureum, hexamethyleentetramine en N-hydroxymethylaceetami de, d) één of meer germiciden gekozen uit de groep bestaande uit chloorhexidinediacetaat, dimethylolureum en natrium-l-hydroxypyridine-2-thion.

Het verdient de voorkeur dat het verdunningsmiddel als celmembraan-stabilisator en als germicide dimethylolureum bevat. De concentratie van het procaïnehydrochloride bedraagt bij voorkeur 75-250 mg/1. De concentratie van het N-(2-aceetamido)iminodiazijnzuur bedraagt bij voorkeur 1,2-2,0 g/1.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een isotoon verdunningsmiddel dat is gekenmerkt doordat het verdunningsmiddel volgens de uitvinding is gecombineerd met een lyseermiddel bestaande uit een waterige oplossing die ten minste één kwaternaire ammoniumzout bevat met bloedceloppervlakte-actieve eigenschappen, waarbij het zout aanwezig is in een concentratie die werkzaam is om ten minste een twee-volume-leukocytenhystogram te verkrijgen. Tenslotte betreft de uitvinding een werkwijze voor het behandelen van een monster van totaal bloed met een verdunningsmiddel en een lyseermiddel.

Het verdunningsmiddel voor bloed is met name geschikt om te worden toegepast bij de elektronische bepaling van de grootte en het aantal van de bloedcellen, de bepaling van hemoglobine en van de gezamenlijke indices en de bepaling van de parameters van bloedplaatjes in één enkel monster van bloedcellen door middel van hiertoe geschikte elektronische apparatuur. Met name is het gewenst om reagentia en werkwijzen te ontwikkelen die kunnen worden toegepast bij de automatische bloedteller "Coulter Counter Model S Plus" (merkaanduiding van Coulter Electronics), vervaardigd door Coulter Electronics Inc. Hialeah, Florida, waarmee het mogelijk is om met de op een "Coulter Channelyzer" verzamelde gegevens met betrekking tot het cel vol urne twee populaties leukocyten te onderscheiden, te weten 1) een lymfoïde populatie (lymfocyten) en 2) een myeloïde populatie (neutrofielen, monocyten, eosinofielen en basofielen). Dergelijke gegevens zijn geschikt voor het onderzoek naar abnormale onderlinge verhoudingen van leukocyten. Abnormale situaties die door middel van deze methode worden vastgesteld leveren informatie die een diagnostische betekenis heeft en zijn tevens van belang voor verder onderzoek.

De scheiding van normale menselijke leukocyten door een volumeverdeling, waarbij gebruik wordt gemaakt van het principe dat een telling en bepaling van de grootte wordt uitgevoerd, is ontwikkeld door Wallace H. Coulter en toegepast in Coulter Counter instrumenten, en deze methode wordt nu toegepast als een klinische, diagnostische methode. Deze methode is gebaseerd op de fundamentele eigenschap van alle levende cellen dat het cel vol urne wordt geregeld op basis van de informatie van de genetische code. Elk celtype in de bloedsomloop heeft zijn eigen karakteristiek volume dat varieert van ongeveer 3 μιη3 voor polymorfo-nucleaire cellen. De onlangs ontwikkelde Coulter Counter instrumenten zijn op zodanige wijze ontworpen, dat gebruik wordt gemaakt van dit volume-verschil met het oog op het tellen en bepalen van de grootteverdeling van de plaatjes en erythrocyten, om pathologische toestanden te detecteren en te volgen.

Erythrocyten en lymfoïde leukocyten hebben jammer genoeg een aanzienlijke overlap wat betreft hun celgrootte, en het is niet mogelijk alleen op basis van grootteverschillen één van deze cel soorten te tellen in aanwezigheid van de andere. Meestal wordt gebruik gemaakt van een sterk lyserende oppervlakte-actieve stof die de erythrocyten stromatolyseert, waardoor ze tot zeer kleine deeltjes worden verkleind, of waardoor het membraan in oplossing wordt gebracht, en het cytoplasma van zowel de lymfoïde als de myeloïde leukocyten wordt verwijderd, waardoor alleen de lyse-bestendige kernen overblijven om te worden geteld. Omdat het oorspronkelijke celvolume sterk is beïnvloed en tot een minimum is herleid, kan bij onderzoek van de grootteverdeling slechts één populatie worden waargenomen.

Het Coulter Counter Model S Plus-automatische tel apparaat voor bloedcellen is ontworpen om een totaal monster van bloed te verdunnen in een isotoon verdunningsmiddel waaraan een lyseermiddel wordt toegevoegd en vervolgens na 7,5 seconden de telling uit te voeren. Gegevens worden verzameld gedurende 4 seconden voor erythrocyten en leukocyten en tot 20 seconden voor plaatjes. Zodoende moet een verder systeem van verdunningsmiddel-lyseermiddel een erythrocyten-lyseerkinetiek geven die voldoende snel is om volledige stromatisering te bewerkstelligen tijdens het lyseren, maar de leukocyten gedurende deze tijd niet volledig stript. Bovendien moeten de veranderingen in het volume van de leukocyten minimaal zijn tijdens het verzamelen van de gegevens en het zou ideaal zijn dat deze gedurende enkele minuten stabiel zouden zijn. Het systeem van reagentia moet er ook voor zorgen dat de integriteit van het aantal erythrocyten en plaatjes en de grootteverdeling wordt behouden, de hemoglobineadsorptiecurve en het totale aantal leukocyten. Bloedmonsters verkregen door vingerprikken moeten gedurende ten minste twee uren stabiel zijn wanneer deze worden voorverdund in het isotone verdunningsmiddel.

Om een analyse te verkrijgen van de relatieve populatie van de lymfoïde en myeloïde cellen in het bloed moet het histogram van het leukocytenvolume duidelijk gescheiden lymfoïde en myeloïde pieken vertonen, met weinig afvalmateriaal van erythrocyten, waarbij de dalen tot zeer dicht bij de basislijn kunnen liggen. Integratie van elke piek zal de relatieve populatie van de lymfoïde en myeloïde cellen geven. Uit de lymfoïde piek is gebleken dat deze lymfocyten en kleine atypische lymfocyten bevat terwijl de myeloïde piek polymorfonucleaire cellen, banden, monocyten, eosinofielen, basofielen en grote atypische lymfocyten bevat.

De analyse op basis van de twee volume-verdeling is moeilijk omdat met veel oplosmiddelen de twee populaties snel in elkaar overgaan zodat er onvoldoende tijd beschikbaar is waarbinnen de tellingen kunnen worden verricht voor de analyse.

Volgens de onderhavige werkwijze wordt een isotoon verdunningsmiddel voor bloed met een multi-functioneel karakter verkregen en een werkwijze om dit verdunningsmiddel te gebruiken met een lyseer-middelsysteem om de routine-telling van traditionele histogramwaarden te bepalen en ook om het lymfoïde/myeloïde histogram van de leukocyten en hun onderlinge concentraties weer te geven en te berekenen, met name volgens een automatisch tel systeem zoals met de geautomatiseerde Coulter Counter (merk)-apparatuur met een niet-gemodificeerde programmering en een externe of interne leukocyt Channelyzer(merkaanduiding)-instrument-mogelijkheid.

Dit multi-functionele isotone verdunningsmiddel omvat een mengsel van organische buffers, anesthetica zoals 4-aminobenzoëzure esterderivaten en germiciden, van welk mengsel de pH wordt ingesteld op 7,0 ±0,1 en de osmolaliteit op 320 ± 5 milliosmol per kilogram, in een osmotisch uitgebalanceerde en nagenoeg neutrale oplossing, en dient om de kinetiek van de cytoplasmatische stripping van de leukocyten te vertragen terwijl de traditionele hemogramparameters worden gestabiliseerd.

Het met het verdunningsmiddel toepasbare lyseermiddelts een mengsel van een waterige oplossing van ten minste één kwaternair ammoniumzout met oppervlakte-actieve eigenschappen op een alkalimetaal-cyanide in een concentratiegebied dat effectief is om histogrammen te geven van twee-volume-leukocyten. De weergave van de gegevens kan worden uitgevoerd met standaard Coulter Counter-apparatuur samen met een Channelyzer (merkaanduiding) en een X-Y plotter. Aanvullende berekenings-en gegevensverwerkende apparatuur is gewenst voor een volledige automatisering, maar niet essentieel om de metingen te kunnen uitvoeren.

Een werkwijze voor het bepalen van leukocyten en hemoglobine in het bloed waarbij een lyseermiddel wordt gebruikt dat een waterige oplossing bevat van een kwaternair ammoniumzout met oppervlakte-actieve eigenschappen en een alakalimetaalcyanide om erythrocyten en plaatjes-cellen te stromatolyseren en om hemoglobine om te zetten tot een chromageen, welk kwaternair ammoniumzout aan het stikstofatoom drie korte alkyl groepen heeft en een lange alkyl groep, waarbij het kwaternaire ammoniumzout en het al kalimetaalzout aanwezig is in een concentratie die effectief is ter verkrijging van twee volume-leukocytenhistogrammen en om een routineberekening mogelijk te maken van het lymfoïde/myeloïde histogram van de leukocyten en de hiermee samenhangende concentraties, met name in een automatisch telsysteem. Een multi-functioneel isotoon verdunningsmiddel wordt hierdoor gekenmerkt dat dit een waterige oplossing is van organische buffers, anesthetische middelen zoals 4-aminobenzoëzure esterderivaten en germiciden, welk verdunningsmiddel wordt ingesteld op een pH van 7,0 ± 0,1 met natriumhydroxyde of zoutzuur in oplossing indien dit noodzakelijk is, en op een osmol al itische waarde van 320 ± 5 milliosmol per kilogram met natriumchloride en natriumsulfaat.

Een bij voorkeur toegepaste samenstelling van het isotone verdunningsmiddel is: procaïnehydrochloride 0,11 g/1 N-(2-aceetamido)iminodiazijnzuur (ADA) 1,40 g/1 chloorhexideendiacetaat 0,02 g/1 dimethylolureum 1,00 g/1 natrium-l-hydroxypyridine-2-thion 0,50 g/1 natriumhydroxyde 0,50 g/1 natriumsulfaat (watervrij) 9,72 g/1 natriumchloride 4,50 g/1 water aanvullen tot 1 liter

Dit verdunningsmiddel wordt met een oplossing van natriumhydroxyde of zoutzuur ingesteld op een pH van 7,0 ± 0,1, indien dit noodzakelijk is. De osmolaliteit wordt met natriumchloride ingesteld op 320 ± 5 milliosmol per kilogram.

Het is bekend dat bloedcellen ATPase-enzymen bevatten die alkalimetaal-kationen samen met kleine anionen (bijvoorbeeld chloride) in en uit de cellen transporteren door een energievereisend mechanisme teneinde de osmotische balans, de turgor van de cel en de gewenste membraanpotentialen te behouden. Natriumionen samen met de veel grotere sulfaationen worden klaarblijkelijk niet zo gemakkelijk getransporteerd door het grotere verschil in 1adingsdichtheid tussen de sulfaationen en chlorideïonen en het potentiaalverschil in de membraanlading wanneer ionen worden getransporteerd in en uit de cel. De balans van de inwendige osmotische druk binnen de cel wordt gehandhaafd door het opnemen van ongeveer 30 milliosmol natriumchloride. Natriumsulfaat is bekend voor de mogelijkheid om abnormale plasmaglobulines in oplossing te brengen en om de troebelheid in de hemoglobine-oplossing veroorzaakt door de verhoogde leukocytentelling te verminderen of op te heffen.

Procaïnehydrochloride is één van de ane.sUtetische middelen met inbegrip van 4-aminobenzoëzure esterderivaten en de zouten hiervan en het is bekend dat deze stof een stabiliserende invloed heeft op het erythrocytenmembraan, maar het werkingsmechanisme is nog niet zeker.

Het gebruik van N-(2-aceetamido)iminodi azijnzuur (ADA) als organische buffer is gebaseerd op de mogelijkheid hiervan om de werking van zwakke kwaternaire ammoniumzouten als lyseermiddel te versterken voov het verkleinen van het gelyseerd afval materiaal van erythrocyten tot deeltjesgrootte kleiner dan 45 μπι3, zodat de interferentie door erythrocyten met de telling en de verdeling van de leukocyten in twee afzonderlijke populaties (lymfoïde en myeloïde) wordt voorkomen.

Hoewel het mechanisme van de werking van ADA niet volledig is onderzocht is het bekend dat het een tamelijk sterk ligand is voor alkalimetalen uit groep II en overgangsmetalen uit groep IIB, evenals een redelijk effectieve buffer. Door de sterke gelijkenis met een aminozuur wordt ADA klaarblijkelijk aangetrokken tot en werkt het in op de celmembraaneiwitten. Vervolgens wordt het gecoördineerd met metaal-kationen waardoor aan het buitenoppervlak van het membraan een meer positief ladingsvoorkomen wordt verkregen ten opzichte van de omringende oplossing, waardoor solvateren en anion-aantrekking rond het buitenmembraan wordt bevorderd. Deze coating van de moleculen van oplosmidden en an ionen voorkomt effectief benaderen en agglutineringsinteracties met andere cellen die in suspensie zijn. De bufferende werking van ADA voorkomt de verandering in deze "lokale" omgeving, waardoor desolvatieen stabiliteits-verlies worden voorkomen.

Dit mechanisme, gekoppeld aan de werking van een lokaal anesthetisch middel zoals procaïnehydrochloride en natriumsulfaat, levert een bijdrage bij het stabiliseren van de cellulaire componenten van het bloedmonster, waardoor deze in hoofdzaak onveranderd blijven ten opzichte van de oorspronkelijke toestand in het bloed wat betreft het aantal, de grootteverdeling en de vorm. Deze factor is diagnostisch van groot belang bij de interpretatie van de traditionele hemogramparameters.

Chloorhexideendiacetaat is, hoewel gewoon!ijk toegepast als virocide en germicide, slechts mmarginaal effectief wanneer het alleen wordt gebruikt bij de toegepaste concentratie, maar geeft een significant betere werking aan ADA bij het vertragen van het achtergrond-afvalmateriaal dat interfereert met de bepaling van de grootteverdel ing van de leukocyten. Chloorhexideen heeft ook enige overeenkomst met de amines van arginine en guanidine en het kan worden verwacht dat deze stof van invloed is op de membraaneiwitten door coördinatie en waterstofbinding. Als zodanig helpt het de lyseermiddelen waarschijnlijk om de erythrocyten membranen volledig te stromatolyseren.

Dimethylolureum is een condensaat van formaldehyde en ureum en er wordt aangenomen dat deze stof bij neutrale pH in oplossing zeer langzaam reageert met 1 eukocytenmembranen om een maat van stabiliteit bij bewaring te verschaffen, die niet duidelijk is na verwijdering van deze verbinding. Het is bekend als een bacteriostatische, antiseptische stof, waarmee bij matige concentraties de groei van de micro-organismen kan worden voorkomen. Andere verbindingen die worden toegevoegd om de leukocyten te stabiliseren zijn hexamethyleentetramine en N-hydroxymethyl-aceetamide.

Natrium-l-hydroxypyridine-2-thion is bekend als fungicide en bacteriocide in shampoo met een werking tegen roos. Deze stof wordt hier gebruikt als bacteriocide en fungicide, welke stof geen merkbare nadelige invloed heeft op de vorm, de grootteverdeling of het aantal cellulaire componenten in een volledig menselijk bloedmonster.

Het gebruik van de combinatie van dimethylolureum en natrium-l-hydroxypyridine-2-thion geeft een zeer bactericidaal produkt dat een betere werking heeft dan verkregen met elke stof afzonderlijk. Deze combinatie geeft een stabiel hemogram voor zowel normale als abnormale monsters waarbij het tegelijkertijd mogelijk is om informatie te verkrijgen met betrekking tot de volumeverdeling van de witte cellen die moeten worden verzameld door een geautomatiseerd apparatuursysteem.

De primaire doelstelling van dit verdunningssysteem is dat de cel grootte, de vorm en de integriteit van alle bloed-cellulaire componenten wordt gestabiliseerd tot een mate die tot nu toe niet is bereikt, zodat de nauwkeurigheid voor de diagnostische bepaling van bloedhemogrammen, die zijn afgeleid van een geautomatiseerde volume-verdelingsanalyse en telling worden verbeterd. Door het resultaat van de gedane onderzoekingen is het mogelijk om een verbetering en uitbreiding te verkrijgen ten opzichte van de bekende technieken door de bloedstroom-omstandigheden van de cellen relatief ongewijzigd te houden wannej·· deze worden verdund en voorbereid voor automatische bepalingen van het aantal en de grootte van de bloedcellen. Wanneer het verdunningsmiddel samen met een geschikt lyseermiddel wordt gebruikt kan een verbetering worden verkregen ten opzichte van de bekende werkwijzen door over leukocyten informatie te verschaffen op basis van twee volume-verdelingen.

Het aangegeven verdunningsmiddel zal nauwkeurige hemogrammen kunnen produceren met een half-geautomatiseerd of geautomatiseerd Coulter-bloedceltel apparaat, maar zal alleen twee volume-leukocytenhistogrammen geven wanneer het samen met het lyseermiddel volgens de uitvinding wordt gebruikt.

Het verdunningsmiddel is in staat het 1eukocytenmembraan voldoende te stabiliseren om de kinetiek van de reactie van het lyseermiddel te vertragen tot een punt waarbij het mogelijk is het kleinere volume van de lymfoïde cellen te onderscheiden van het grotere volume van de myeloïde cellen, zoals neutrofielen, monocyten, eosinofielen en basofielen. Herhaalde metingen van de grootteverdeling van de leukocyten . hebben aangetoond dat de histogrammen stabiel zijn gedurende 30 seconden voordat degeneratie plaatsheeft. Experimentele resultaten geven aan de de lymfoïde cellen binnen de lyseringstijd van 7,5 seconden worden gereduceerd tot het minimale cellulaire volume. De myeloïde cellen komen tot 2 tot 3 keer het eindvolume binnen 30 seconden na het toevoegen van het lyseermiddel, waarna het volume langzaam vermindert totdat de myeloïde fractie samensmelt met de lymfoïde fractie.

Onder toepassing van een met erythrocyten geijkt Coulter Model S Plus-apparaat en een geijkte Coulter Model C-1000 Channelyzer (merkaanduiding) bleken de volumes van de lymfoïde en de myeloïde pieken na behandeling met het reagenssysteem in de nabijheid te liggen van respectievelijk 85 jL/m3 en 260 jL/m3 met een smalle verdelingsbreedte. De leukocyten die uit een vers volledig bloedmonster zijn verkregen door eenvoudige sedimentatie door een "Ficoll-Plaque"(merkaanduiding)-gradiënt bleken een volume te hebben van ongeveer 260 μηι3 voor de lymfoïde piek en 500 μπι3 voor de myeloïde piek met een veel ruimere verdelingsbreedte. Een monster vers bloed, gescheiden door centrifugatie door een Ficoll-Paque-gradiënt onder toepassing van een standaard-techniek gaf mononucleaire cellen (lymfocyten en monocyten) gescheiden van granulocyten (neutrofielen, eosinofielen en basofielen). De lymfocyten bleken samen te vallen met de lymfoïde piek bij 260 μηι3 terwijl de monocyten gecentreerd bleken bij ongeveer 550 μπι3. De scheiding van de twee populaties was veel duidelijker met het chemisch gelyseerde bloed verkregen door de Coulter Counter Model S Plus-experimenten dan met de levende leukocyten verkregen volgens de Ficoll-Paque-methode. Het is daarom duidelijk dat het lyseermiddel de leukocyten aanzienlijk beschadigt, aangezien hun volume twee- tot drievoudig wordt gereduceerd in vergelijking met leukocyten die verkregen zijn door de Ficol1-Paque-scheiding van hetzelfde bloedmonster.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding is gebleken dat dodecyl tri methyl ammoniumchl or i de bij voorkeur het volume van de lymfoïde cellen reduceert (een drievoudige vermindering van het volume van 260 /vm3 tot 85 /im3) terwijl het volume van de myeloïde cellen aanzienlijk minder wordt beïnvloed (te weten een tweevoudige vermindering van het volume van 500 //m3 tot 260 /Tm3). Dodecyltrimethylammoniumchloride is zelf in feite een zwak lyseermiddel. Het is gebleken dat het de sterk lytische werking van Mytab (merkaanduiding) mildert, waarbij de lyseerkinetiek wordt vertraagd tot een mate waarin de meting van de verschillende volumes van de celkernen mogelijk is. Het gebruik van dodecyltrimethylammoniumbromide geeft ook een veel snellere en zuiverdere lyse van de erythrocyten en een snellere omzetting van hemoglobine met lagere concentraties aan Mytab (merkaanduiding) zodat een betere stabiliteit wordt verkregen ten aanzien van de leukocytenpopulaties.

Voorlopige gegevens met betrekking tot meer dan honderd normale en abnormale verse bloedmonsters, verkregen via een bloeddonor-centrum en lokale ziekenhuizen, geven een hoge mate van correlatie aan tussen gegevens met betrekking tot de de leukocytenpopulaties afkomstig van het Coulter Counter Model S Plus-Channelyzer systeem (merkaanduidingen) en 100 met de hand verrichte differentiële tellingen. Hoewel een lichte variatie werd waargenomen met betrekking tot de myeloïde en lymfoïde fracties, werden geen aanzienlijke afwijkingen van de correlatie waargenomen.

Onder toepassing van de combinatie van een verdunnings-middel en het lyseermiddel volgens de uitvinding produceerden spectrofoto-metrische scans (golflengte ten opzichte van absorptie) van gelyseerd bloed uit het leukocytenbad van het Coulter Counter Model S Plus apparaat hemoglobinecurves die nagenoeg identiek waren aan de curves die zijn geproduceerd door Lyse S II (merkaanduiding). De absorptie bij 540 nm en de verkregen berekende hemoglobinewaarden waren echter ongeveer 0,2 g/1 hoger dan met de combinatie van Isoton II en Lyse S II (merkaanduidingen). Bovendien werd vastgesteld dat de gemiddelde waarden voor de cel volumes 1,0 tot 1,5 jL/m3 hoger waren in het nieuwe systeem van twee reagentia. Alle andere parameters waren nagenoeg gelijk aan degene die waren verkregen door de combinatie van Isoton II en Lyse S II (merkaanduiding).

Claims (8)

1. Isotoon verdunningsmiddel voor het verdunnen van totaal bloed, dat een waterige oplossing van bloedcel-stabiliserende stoffen omvat, met het kenmerk, dat de oplossing de volgende stoffen omvat: a) één of meer anesthetische verbindingen met inbegrip van 4-aminobenzoëzuuresterderivaten voor het stabiliseren van de cellulaire componenten van het bloedmonster, b) één of meer organische buffers om interferentie van de differentiële bepaling van de leukocyten door erythrocyten te voorkomen en c) één of meer celmembraan-stabilisatoren om een bijkomende maatregel voor het stabiliseren van het leukocytenmembraan te verkrijgen.

2. Isotoon verdunningsmiddel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de oplossing de volgende combinatie van stoffen omvat: a) procaïnehydrochloride, b) N-(2-aceetamido)iminodiazijnzuur, c) één of meer celmembraan-stabilisatoren gekozen uit de groep bestaande uit dimethylolureum, hexamethyleentetramine en N-hydroxymethylaceetamide, d) één of meer germiciden gekozen uit de groep bestaande uit chloorhexidinediacetaat, dimethylolureum en natrium-l-hydroxypyridine-2-thion.

3. Isotoon verdunningsmiddel volgens conclusie 1 of conclusie 2, met het kenmerk, dat het als celmembraan-stabilisator en als germicide dimethylolureum bevat.

4. Isotoon verdunningsmiddel volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de concentratie van het procaïnehydrochloride 75-250 mg/1 bedraagt.

5. Isotoon verdunningsmiddel volgens een der conclusies 2-4, met het kenmerk, dat de concentratie van het N-(2-aceetamido)iminodi-azijnzuur 1,2-2,0 g/1 bedraagt.

6. Isotoon verdunningsmiddel in combinatie met een lyseermiddel, met het kenmerk, dat het verdunningsmiddel volgens een der conclusies 1-5 is gecombineerd met een lyseermiddel bestaande uit een waterige oplossing die ten minste één kwaternair ammoniumzout bevat met bloedceloppervlakte-actieve eigenschappen, en het zout aanwezig is in een concentratie die werkzaam is om ten minste een twee volume-leukocyten-histogram te verkrijgen.

7. Isotoon verdunningsmiddel volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de waterige oplossing een mengsel van ten minste twee in hoofdzaak zuivere kwaternaire ammoniumzouten bevat.

8. Werkwijze voor het behandelen van een monster van totaal bloed met een verdunningsmiddel en met een lyseermiddel, met het kenmerk, dat een combinatie van het verdunningsmiddel en het lyseermiddel volgens een der conclusies 6-7 wordt gebruikt.