ES2207232T3 - Una antraquinona y sus derivados. - Google Patents
Una antraquinona y sus derivados.Info
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Abstract
Un compuesto aislado de la siguiente fórmula: en la que cada uno de X1 y X2 son independientemente NH-A- NR1R2, y donde A es un grupo alquileno C2-8 y R1 y R2 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1- 4, hidroxialquilo C2-4 y aminoalquilo C2-4, o R1 y R2 juntos forman un grupo alquileno C2-6 que con el átomo de nitrógeno al que R1 y R2 están unidos forma un anillo heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o inorgánico.
Description
Una antraquinona y sus derivados.
Esta invención se refiere a una antraquinona y
sus derivados, incluyendo en particular, aunque no exclusivamente,
sus aplicaciones en tecnologías de detección en un intervalo de
fluorescencia.
Hay una serie de fluorocromos disponibles que se
unen al DNA que cubren la región UV y visible del espectro.
Recientemente, están disponibles comercialmente fluorocromos muy
brillantes de cianina que se intercalan con el DNA, basados en
dímeros modificados de naranja de tiazol. Estos colorantes de
cianina no comparten las propiedades de penetración celular de otros
fluorocromos activados por UV específicos del DNA. Además, los
fluorocromos interactivos con el DNA usados comúnmente tienen marcas
fluorescentes que solapan las de otros fluorocromos, activados en el
intervalo espectral de la luz visible, que se usan como marcas
moleculares para explorar aspectos de la biología celular o de
estructuras biológicas. Ejemplos de colorantes de cianina
actualmente conocidos se describen en los documentos US 5410030 y US
5436134.
La presente invención intenta desarrollar agentes
interactivos con el DNA que penetran en las células, los cuales
pueden proporcionar una señal de fluorescencia que se extiende hasta
la región infrarroja del espectro. Un agente tal, podría, por
ejemplo, ser excitado de manera óptima por los rayos láser que
emiten en la línea roja en aplicaciones
multi-láser/multi-fluorocromo tanto
para las muestras fijadas como para las células viables.
Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la
presente invención, se proporciona un compuesto de la siguiente
fórmula (I):
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo
heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la
forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o
inorgánico.
El término "alquileno" se usa aquí para
indicar una cadena alquílica.
En una realización preferida, cuando R^{1} y
R^{2} forman un anillo heterocíclico, el anillo tiene de 3 a 7
átomos en el mismo. Preferiblemente, tanto X_{1} como X_{2} son
ambos NH(CH_{2})_{2}NR^{1}R^{2}. En
particular, se prefiere que R^{1} y R^{2} sean ambos grupos
alquilo C_{1-4}, preferiblemente grupos
metilo.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona un compuesto de la siguiente fórmula
(II):
En una realización, el compuesto (II) puede estar
en la forma de su derivado N-óxido.
El compuesto de la fórmula general (I) y sus
derivados N-óxidos, y en particular el compuesto específico (II) se
puede usar, por ejemplo, como un colorante de DNA y puede ser un
compuesto sintético puro que es soluble en disolventes
biológicamente compatibles incluyendo el agua. El compuesto (II)
tiene una alta afinidad por el DNA (la constante de unión al DNA es
aproximadamente 10^{7}M^{-1}) y tiene la capacidad de penetrar
rápidamente en las células vivas.
El espectro de absorbancia del compuesto (II)
presenta una Ex_{max} próxima a 647 nm y produce un espectro de
fluorescencia que se extiende en las longitudes de onda desde 665 nm
hasta más allá de 780 nm (la Ex_{max} está aproximadamente en
677,5 nm).
\newpage
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para preparar un compuesto de la siguiente
fórmula (I):
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo
heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la
forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o
inorgánico,
comprendiendo el método la etapa de hacer
reaccionar un compuesto de la siguiente fórmula
(III):
con
NH_{2}-A-NR^{1}R^{2}, donde A,
R^{1} y R^{2} son como se han definido
antes.
El método comprende preferiblemente también la
etapa de tratar el compuesto resultante con un ácido,
preferiblemente ácido sulfúrico concentrado. Adicionalmente, en una
realización preferida, el método puede comprender además el
tratamiento subsiguiente con clorato de sodio y/o hidrógenosulfito
de sodio.
La modelación ha demostrado que los compuestos de
la presente invención pueden formar complejos estables intercalados
con DNA. Por tanto, según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona un complejo fluorescente que comprende un
ácido nucleico y un compuesto de la siguiente fórmula (I):
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo
heterocíclico,
o uno de sus derivados
N-óxidos,
y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido
está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un
ácido orgánico o
inorgánico.
El ácido nucleico es preferiblemente DNA. Se ha
encontrado que el DNA puede estar presente en una célula viva. Los
compuestos de la presente invención pueden teñir cromosomas humanos
fijados. Cuando aumenta la relación molar DNA:compuesto, hay un
desplazamiento batocrómico en el espectro de la solución del
compuesto más DNA. A las altas relaciones DNA:compuesto, que se
obtienen dentro de las células vivas, el desplazamiento espectral
contribuye a una previa separación significativa del espectro de
emisión del compuesto-DNA de la de un ejemplo de un
compuesto Cy 5 con fluorescencia roja.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para analizar una célula o material biológico
que contiene uno o más ácidos nucleicos, que comprende las etapas
de:
a) preparar una solución biológicamente
compatible que contiene un compuesto de la fórmula (I):
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo
heterocíclico,
o uno de sus derivados N-óxidos, y donde el
compuesto (I) o su derivado N-óxido está opcionalmente en la forma
de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o
inorgánico;
b) tratar la célula o material biológico con la
solución biológicamente compatible;
c) excitar el compuesto (I) en la célula o
material biológico tratados con una fuente de luz; y
d) detectar la señal de fluorescencia
emitida.
El compuesto de la fórmula (I) puede estar
presente en su estado libre o formar complejos con otra u otras
moléculas, por ejemplo por unión covalente o no covalente.
La fuente de luz proporciona preferiblemente
longitudes de onda en la región espectral de las longitudes de onda
de máxima absorción del compuesto (I).
Se ha encontrado que la señal de fluorescencia de
los compuestos de la presente invención se extiende hasta la región
del infrarrojo del espectro. El compuesto de la presente invención
puede estar presente en la célula o material biológico en
combinación con uno o más de otros fluorocromos o compuestos que
emiten luz. Los otros fluorocromos pueden emitir en la región UV o
visible del espectro. Por tanto, los compuestos de la presente
invención se prestan por sí mismos al análisis multiparamétrico con
otros fluorocromos con espectros que se solapan con los de las
sondas de DNA de la región visible usadas comúnmente.
Se pueden usar uno o más de otros compuestos, por
ejemplo, para detectar la anexina V y se usan preferiblemente en
combinación con el derivado N-óxido del compuesto (I). Se puede usar
el análisis por citometría de flujo, por ejemplo con el instrumento
en modo de láser dual. La invención por tanto puede proporcionar un
modo de discriminar las células viables intactas de las que están
sufriendo las diferentes etapas de la muerte celular.
Por tanto, los compuestos de la presente
invención proporcionan colorantes fluorescentes en el rojo
lejano/infrarrojo que penetran en el DNA adecuados para el análisis
del DNA celular en el que se pueden necesitar células intactas, por
ejemplo para la detección de moléculas sobre la superficie celular
(por ejemplo una molécula receptora o un marcador para
diferenciación) o dentro de las células (por ejemplo, las enzimas
citosólicas) por métodos que requieren el mantenimiento de la
integridad de la membrana para evitar la perturbación o pérdida de
tales moléculas.
Como se ha mencionado antes, en este método, los
compuestos de la presente invención pueden teñir los ácidos
nucleicos en los cromosomas humanos fijados, en las células fijadas
y en los materiales biológicos fijados, y en procedimientos que
modifican la permeabilidad de las membranas de las células
vivas.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso del compuesto (I) en un ensayo
biológico. El compuesto (I) puede estar presente o en su estado
libre o formando complejos con otras moléculas, ya sea por unión
covalente o no covalente, en el ensayo biológico. El compuesto (I)
puede estar presente como uno de sus derivados N-óxidos. El ensayo
biológico es preferiblemente un procedimiento de manipulación de
rápida y/o de gran capacidad. El uso de los compuestos de la
presente invención, como se ha indicado para el compuesto (I), como
un parámetro de discriminación u orientación para los núcleos
celulares, ha sido demostrado tanto por citometria de flujo como por
microscopía confocal de barrido con láser.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se proporciona el uso del compuesto (I) en
citometría. El compuesto (I) está opcionalmente presente como uno de
sus derivados N-óxidos. El procedimiento de citometría puede ser por
ejemplo, citometría de flujo de simple haz o de haz múltiple.
A modo de ejemplo, la citometría de flujo de
simple haz (488 nm) ha sido usada para demostrar la utilidad de la
fluorescencia del compuesto (I)-DNA nuclear
(preferiblemente la fluorescencia del compuesto
(II)-DNA nuclear) como un parámetro discriminatorio
para las células de la sangre humana y de los linfomas, en
combinación con anticuerpos marcados con fluorocromo para la
detección de antígenos de superficie y reconocimiento de las
subpoblaciones. Se ha encontrado que la fluorescencia del compuesto
(I) refleja un contenido de DNA celular como se evidencia por los
perfiles de distribución del DNA en el ciclo celular para la
poblaciones de células que proliferan exponencialmente demostrando
un estado de equilibrio o una distribución asíncrona de las células
con respecto a la edad del ciclo celular, o para las poblaciones de
células alteradas en las cuales, por ejemplo, la acción del fármaco
ha causado el retraso o parada de las células en un punto dado del
ciclo celular. En una realización, la citometría de flujo de haz
dual (488 nm/633 nm) muestra la excitación selectiva del compuesto
(I), preferiblemente del compuesto (II), y la fluoresceína en
células intactas. Además, en una realización, la aplicación del
compuesto (I), preferiblemente del compuesto (II), en citometría de
flujo de triple haz (multilínea UV/488 nm/633 nm) se ha demostrado
en aplicaciones que implican el retraso de la discriminación de la
señal en la que la separación del haz permite la discriminación del
haz de excitación asociado con una señal de emisión de fluorescencia
con respecto al retraso de la llegada de la señal a un detector.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso del compuesto (I) en microscopía.
El compuesto (I) puede estar presente como su derivado N-óxido.
Preferiblemente la microscopía es microscopía confocal de barrido
con láser (CLSM). A modo de ejemplo, la CLSM que emplea una
excitación a una longitud de onda o de 647 nm o de 568 nm del
compuesto (I) intracelular, preferiblemente del compuesto (II)
intracelular, muestra la fluorescencia específicamente localizada en
el núcleo revelando la estructura nuclear dentro de las células
humanas vivas o fijadas.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso del compuesto (I) como un agente de
tinción nuclear. El compuesto (I) puede estar presente como su
derivado N-óxido.
Según un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso del compuesto (I) como un agente
para formación de imágenes. El compuesto (I) puede estar presente
como su derivado N-óxido.
En una realización, el compuesto (I) se puede
usar como un agente de imagen en la formación de imágenes por
excitación de multifotones.
La formación de imágenes con longitud de onda
dual, que usa el compuesto (I) para revelar la forma nuclear, se
puede utilizar para demostrar la heterogenicidad de la carga de
fluoresceína dependiente de la esterasa de las células enteras en la
evaluación de la función mitocondrial mediante marcado con rodamina
123. En tales aplicaciones de formación de imágenes, el compuesto
(I) no presentó evidencia de fotodecoloración y fue persistente.
Por tanto, los compuestos de la presente
invención se pueden considerar como un fluorocromo para su
aplicación como un agente en el uso, calibración, estandarización, y
configuración de sistemas basados en la fluorescencia. El compuesto
preferido de la presente invención es el compuesto (II) con una
bisalquilaminoantraquinona con fluorescencia roja intensa
(DRAQ5).
Se ha encontrado que la alta penetración de los
rayos láser de línea roja en los tejidos y las propiedades de
penetración de los compuestos de la presente invención proporcionan
una combinación que permite la orientación tridimensional y la
localización de los núcleos dentro de los tejidos vivos. Además, la
disponibilidad de los láser HeNe u otros dispositivos de emisión de
luz roja, de bajo coste, con mayor potencia hace posible que los
compuestos de la presente invención encuentren aplicaciones en los
sistemas de detección en los que sus marcas de fluorescencia se
pueden usar como un parámetro de discriminación.
Aunque la invención ha sido descrita antes, se
extiende a cualquier combinación inventiva de las características
indicadas antes o en la siguiente descripción.
La invención será descrita ahora, a modo de
ejemplo, con referencia a los dibujos y ejemplos que la acompañan, y
en los cuales:
las figuras 1a a 1c muestran las características
espectrales de DRAQ5;
las figuras 2a a 2f muestran las características
espectrales de la fluorescencia de DNA asociado con DRAQ5, detectada
por CLSM;
la figura 2g muestra la imagen multifotónica de
núcleos celulares teñidos por DRAQ5;
las figuras 2h a 2k muestran una comparación de
las células viables teñidas por DRAQ5 o su derivado N-óxido
(DRAQ5N);
las figuras 3a a 3d muestran la excitación
diferencial de la fluoresceína y la DRAQ5 en células A375 viables
analizadas por CLSM;
las figuras 4a a 4c muestran la excitación
diferencial de la rodamina 123 y DRAQ5 en células A375 viables
analizadas por microscopía confocal de barrido con láser;
la figura 5 muestra los análisis por citometría
de flujo de la acumulación de DRAQ5 durante un periodo de exposición
de una hora, en células HL60 viables;
las figuras 6a a 6d muestran el análisis por
citometría de flujo de haz dual para la detección de la
fluorescencia asociada con DRAQ5 en células HL60 viables marcadas
con fluoresceína;
las figuras 7a a 7d muestran el análisis por
citometría de flujo de simple haz de la fluorescencia de DRAQ5
frente a la fluorescencia de anticuerpos para células humanas
cultivadas y derivadas de la sangre;
la figura 8 muestra la cuantificación por
citometría de flujo de simple haz de la intensidad de fluorescencia
de las células humanas cultivadas y derivadas de la sangre expuestas
a DRAQ5;
la figura 9 muestra el análisis por citometría de
flujo de haz dual de la expresión de la ciclina B1 específica del
ciclo celular;
las figuras 10a a 10f muestran el análisis por
citometría de flujo de triple haz de células de linfoma SUD4
asíncronas fijadas y teñidas con DRAQ5 y digeridas con RNasa A;
las figuras 11a a 11c muestran el análisis por
citometría de flujo del contenido de DNA celular de las células de
linfoma SUD4 intactas usando excitación a 488 nm, 633 nm o
multilínea UV;
las figuras 12a a 12d ilustran ejemplos de
acumulación celular, usando una línea celular de linfoma humano de
células B, usando combinaciones de tratamientos con reactivos; y
las figuras 13a a 13d ilustran ejemplos que
muestran la misma combinación de reactivos para los cultivos
tratados con VP-16.
Se disolvió
1,6-dicloroantraquinona (15 g, 54 mmol) en
N,N-dimetiletilendiamina (47,6 g, 540 mmol) y se
mantuvo a reflujo durante 16 horas. Se hizo seguimiento de la
reacción por TLC (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 9:1). Se enfrió la mezcla a
temperatura ambiente y se diluyó con agua para precipitar el
compuesto del epígrafe. El sólido filtrado se recristalizó en
metanol para obtener (A) (15,89, 89%) como un sólido cristalino. Rf
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH 9:1): 0,60.
^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 9,8 (t, 2H),
7,6 (m, 4H), 6,9 (m, 2H), 3,4 (q, 4H), 2,7 (t, 4H), 2,4 (s,
12H).
Espectro de masas, m/z 381 (m^{+}+1).
Se disolvió el derivado de
antraceno-9,10-diona (A) (6 g, 15,8
mmol) en 65 g de H_{2}SO_{4} concentrado y se enfrió a 10ºC. Se
añadió clorato de sodio anhidro (6,5 g, 61,6 mmol) en porciones a lo
largo de 1,5 horas y después se agitó la mezcla durante 3 horas a
temperatura ambiente. La solución azul se añadió lentamente a una
solución fría de hidrógenosulfito de sodio (1%, 1000 ml). Se
neutralizó la mezcla a pH 7 con NaOH 5 M. El compuesto del epígrafe
(B) se extrajo de la fase acuosa con CH_{2}Cl_{2} y se concentró
en vacío. Por cromatografía en columna (SiO_{2},
CH_{2}Cl_{2}/MeOH 9:1) se obtuvo (B)(1,2 g, 20%).
Se preparó el compuesto del epígrafe a partir del
ejemplo 1 (DRAQ5) como sigue. Se añadió DRAQ5 (0,1 g, 24 mmol) a
ácido meta-cloroperoxibenzoico (80% de pureza, 0,186
g, 0,95 mmol) en diclorometano seco y se dejó a -20ºC durante la
noche. Se sometió el producto crudo a cromatografía en columna de
sílice usando 9:1:0,1 de diclorometano:metanol:amoniaco (densidad
relativa 0,88) como disolvente eluyente. Se aisló el compuesto del
epígrafe como un polvo azul. Punto de fusión 221ºC.
^{1}H NMR (CD_{3}OD): \delta (delta) 7,39
(d, 2H), 7,2 (d, 2H), 4,0 (t, 4H), 3,65 (t, 4H), 3,30 (s, 12H).
^{13}H NMR (CD_{3}OD): \delta (delta) 189, 156,5, 147, 130,
122,5, 116, 69,5, 59,5, 38,5.
Espectro de masas, m/z 445 (m^{+}+1).
Los espectros de absorbancia se obtuvieron usando
un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16 UV y una
solución 10 \muM del agente disuelto en diclorometano y se
midieron en una cubeta de cuarzo o sílice de 1 cm de paso óptico.
Los espectros de fluorescencia para 0,8 ml de una solución 20 \muM
de DRAQ5 en una semi-microcubeta de cuarzo o sílice
de 1 cm de paso óptico se determinaron por excitación a una longitud
de onda de 647 nm o haciendo seguimiento de la emisión a una
longitud de onda de 670 nm. Las medidas de fluorescencia se hicieron
en un espectrofotómetro Perkin-Elmer LS50 con el
ancho de ranura fijado a 10 nm. El espectrofluorímetro estaba
equipado con un tubo fotomultiplicador sensible al rojo (PMT; tipo
R928; Hamamatsu Photonics KK, Japan). Se acumularon los datos de
cuatro barridos para cada condición y se exportaron a un programa de
hoja de cálculo para corregir los valores del tampón control y para
determinar los máximos de emisión. La fluorescencia de
DNA-DRAQ5 se midió por la adición a la cubeta de
volúmenes, en microlitros, de soluciones concentradas de DNA de timo
de ternera, con mezclado. Tanto el agente como el DNA se prepararon
en tampón de unión al DNA (fosfato de sodio 0,05 M, pH 6,2, NaCl
0,05 M, EDTA 0,001 M; 3). Los espectros obtenidos se corrigieron en
cuanto al ruido del tampón y no en cuanto a la sensibilidad
espectral del PMT. Los espectros de rodamina 123 se generaron en el
tampón de unión al DNA usando o bien una excitación a 488/5 nm o
bien haciendo seguimiento de la emisión a 530/5 nm. Los espectros de
excitación y emisión previamente publicados se obtuvieron de los
archivos de la fuente original y se normalizaron para la intensidad
del pico.
Las figuras 1a a 1c muestran las características
espectrales de DRAQ5. Fig. 1a: Espectro de absorbancia en el visible
para DRAQ5 (10 \muM en diclorometano).
Fig. 1b: Comparación de los espectros de
excitación para las longitudes de onda de emisión especificadas
para: FITC (\medcirc, emisión a 620 nm), rodamina 123
(\triangledown, 0,5 \mug/ml, emisión a 530 nm), Texas Red
(\triangle, emisión a 660 nm), Cy 5,18 (\Box emisión a 715 nm),
DRAQ5 (\bullet, emisión a 670 nm).
Fig. 1c: Espectros de emisión comparativos para
las longitudes de onda de excitación especificadas para: FITC
(\medcirc, excitación a 425 nm), rodamina 123 (\triangledown, 0,5 \mug/ml, excitación a 488 nm), Texas Red (\triangle, excitación a 500 nm), Cy 5,18 (\Box, excitación a 570 nm), DRAQ5 20 \muM (\bullet, excitación a 647 nm), y DRAQ5 20 \muM más DNA 1280 \muM
(\blacksquare, excitación a 647 nm).
(\medcirc, excitación a 425 nm), rodamina 123 (\triangledown, 0,5 \mug/ml, excitación a 488 nm), Texas Red (\triangle, excitación a 500 nm), Cy 5,18 (\Box, excitación a 570 nm), DRAQ5 20 \muM (\bullet, excitación a 647 nm), y DRAQ5 20 \muM más DNA 1280 \muM
(\blacksquare, excitación a 647 nm).
La Fig. 1a muestra el espectro de absorbancia en
el visible para DRAQ5 en tampón de fosfato a pH 7,4. El espectro
presentó máximos a 622 y 676 nm, en adición a los máximos a 240 y
314 nm (no se muestran datos). El coeficiente de extinción a una
longitud de onda de 676 nm fue determinado como 20949
cm^{-1}mol^{-1}. Las características de fluorescencia de DRAQ5
se estudiaron para permitir la interpretación de los datos
fluorométricos generados por citometría de flujo y técnicas de
imagen confocal. Se generó un espectro de excitación para el
intervalo 460-660 nm para emisión a una longitud de
onda de 680 nm y se comparó con uno optimizado para la rodamina 123
y los de otros fluorocromos. La Fig. 1b muestra que la excitación de
DRAQ5 en la región 630-650 nm es esencialmente
similar al espectro de excitación del colorante de cianina Cy 5,18
(Ex_{\lambda max} 649 nm) pero distinta de la de Texas Red
(Ex_{\lambda max} 596 nm), rodamina 123 (Ex_{\lambda max} 511
nm) e isotiocianato de fluoresceína (FITC; Ex_{\lambda max} 490
nm). En todos los casos mostrados en la Fig. 1, los espectros han
sido normalizados para los valores de intensidad o en Ex_{\lambda
max} o en Em_{\lambda max}.
El espectro de emisión de DRAQ5 solo (Fig. 1c)
demostró que para la excitación a 647 nm hay una emisión
significativa que se extiende en las longitudes de onda desde 665 nm
hasta más allá de 780 nm con una Em_{\lambda max} de 677,5 nm. El
espectro de emisión se ha desplazado significativamente hacia el
rojo comparado con el de Cy 5,18. La DRAQ5 parece que presenta
excitabilidad residual a longitudes de onda mucho más bajas aunque
la intensidad de la fluorescencia para la excitación a la longitud
de onda de 514 nm se redujo para DRAQ5 en comparación con los
valores de excitación a 647 nm, manteniendo las características del
espectro de excitación (no se muestran los datos).
El modelado molecular sugiere que la DRAQ5 es
capaz de unirse al DNA por medio de intercalación, teniendo cada una
de las cadenas laterales sobre los lados opuestos de la estructura
del anillo aromático, el potencial para estabilizar la molécula
sobre DNA.
Los experimentos fluorométricos indican que el
DNA afecta a la fluorescencia de DRAQ5 de una manera compleja con
relaciones crecientes DNA:DRAQ5 asociadas con un desplazamiento al
rojo de la Em_{\lambda max} a 697 nm a una relación molar de
DNA:DRAQ5 de 64. Este desplazamiento por la interacción del DNA se
muestra en la Fig. 1c. A altas relaciones DNA:DRAQ5, equivalentes a
las encontradas en las tinciones de células vitales, la pérdida de
la señal de DRAQ5 debida a algún efecto de apagamiento
colorante-colorante parece ser mínima. El
desplazamiento al rojo de Em_{\lambda max} y la considerable
disminución de la señal infrarrojo/infrarrojo a longitudes de onda
más allá de 730 nm distingue esta sonda de Cy 5,18 a pesar de las
características similares de excitación.
Los aspectos preferidos de la invención se
refieren al desarrollo de un colorante interactivo con el DNA que
penetra en la célula, capaz de actuar como un marcador
discriminatorio u orientador del DNA celular, con una señal de
fluorescencia que se extiende a la región del infrarrojo del
espectro. La invención permite que los métodos de microscopía de
excitación de multi-láser, multifluorocrómicos y
multifotónicos sean usados tanto en muestras fijadas como en células
viables. Se describen aquí las características espectrales de DRAQ5
y se demuestran las aplicaciones potenciales de esta sonda de DNA
para el análisis multiparamétrico de las células vivas y fijadas
usando microscopía confocal de barrido con láser.
Se cultivó la línea de células A375 de melanoma
humano como cultivo asíncrono en medio esencial mínimo de Eagle
suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina 1 mM y
antibióticos y se incubó a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%
en aire. Para experimentos de imagen, se cultivaron las células a
una densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo como una monocapa sobre
cubres de vidrio autoclavados en placas de 6 pocillos durante 48
horas antes del tratamiento. Las células viables adheridas se
montaron en PBS fresco para microscopía. Cuando fue indicado, se
fijaron las células adheridas con metanol al 70% a -20ºC durante 10
minutos antes de la rehidratación y tinción con bromuro de etidio a
5 \mug/ml durante 10 minutos en presencia de 5 mg/ml de RNasa
A.
Se sintetizó DRAQ5 usando los principios
descritos y se almacenó a +4ºC como una solución acuosa stock de
concentración 10 mM. Las diluciones de DRAQ5 se prepararon en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añadieron
directamente a los cultivos. Se preparó diacetato de fluoresceína
(FDA; Koch Light Laboratories) como una solución stock de
concentración 12 mM en acetona y se almacenó a -20ºC. Se trataron
las células con FDA 0,2 \muM durante 10 minutos a 37ºC bien solas
o bien después de una exposición de 50 min a DRAQ5. Asimismo las
células tratadas con DRAQ5 se marcaron con rodamina 123 (grado
láser, Kodak) a 2 \mug/ml de medio de cultivo durante 10 min,
antes del análisis.
El sistema usado fue un equipo de barrido Leica
TCS 4D (LaserTechnik Gmbh, Germany) acoplado a un microscopio Leitz
DM R y que opera con un láser Ominchrome de argón/criptón. El láser
proporcionaba líneas de emisión a 488, 568 y 647 nm con potencia
variable. Los cultivos en cubres se lavaron brevemente con PBS, se
montaron en posiciones invertidas sobre portas, siendo sostenidos
los cubres en los bordes por un ribeteado de vaselina para evitar
que las células se compriman. Se examinaron inmediatamente los
portas usando lentes de objetivo de inmersión en aceite x100 x40 con
diafragma de intervalo medio y ajustes de la amplificación del
fotomultiplicador. Las longitudes de onda de excitación/emisión para
DRAQ5, fluoresceína y rodamina 123 fueron 647 nm/>665 nm, 488
nm/>515 nm y 488 nm/>590 nm respectivamente. Las ganancias de
amplificación se ajustaron de tal modo que la muestra más
fluorescente tratada con el fármaco dio unas intensidades pixel
justo por debajo de la saturación. Se ajustó el nivel
negro/contraste para dar efectivamente un fondo cero (<4 para el
valor pixel) después de la filtración del ruido de circuito 16x de
las imágenes de los controles no tratados. Usando este método, los
controles no tratados, mostraron una autofluorescencia mínima y no
dieron ninguna imagen discernible evitando la necesidad de una
corrección del fondo. Las imágenes conseguidas se convirtieron para
análisis y se combinaron usando un software de análisis de imágenes
IP Lab Spectrum (Signal Analytics Corp. Vienna, VA, USA).
Para llegar a comprender algo sobre la
dependencia de la fluorescencia de DRAQ5 de la longitud de onda de
excitación y la separación espectral de su señal de fluorescencia de
la de otra sonda de DNA, se han comparado células teñidas con DRAQ5
o con bromuro de etidio. El intervalo de sensibilidad de la CLSM con
excitación a 488 nm o a 568 nm se optimizó con respecto a la
fluorescencia de las células fijadas con etanol, teñidas con bromuro
de etidio (Figuras 2d-2f), mientras que la imagen
con excitación a 647 nm se optimizó sobre células viables tratadas
con DRAQ5 (Fig. 2c). Las figuras 2a-2f muestran que
a concentraciones adecuadas de fluorocromo para obtener imágenes de
los núcleos y con una apropiada filtración de la emisión, se pueden
usar condiciones de excitación a 488 nm y 647 nm para obtener
exclusivamente imágenes con tinción bien de bromuro de etidio o bien
de DRAQ5, respectivamente. Se puede usar también DRAQ5 para obtener
imágenes de células fijadas con retención de gran parte de la
estructura nuclear observable en las células viables intactas (no se
muestran datos). La activación de la fluorescencia se ha observado
también usando excitación multifotónica de las células fijadas
teñidas con DRAQ5 (células humanas del linfoma de células B; fijadas
con etanol; DRAQ5 10 \muM; excitación con láser YLF de modos fijos
a 15 mW usando un sistema modificado de imagen confocal MRC600;
Ex_{\lambda} = 1047 nm; Em_{\lambda} = rojo lejano; Fig.
2g).
Usando la CLSM con excitación a 647 nm (Fig. 2c)
hubo una clara demostración de la fluorescencia localizada en el
núcleo, bastante diferente de otros agentes seleccionados basados en
antraquinona y antraciclina, que produjeron tanto señales nucleares
como señales citoplásmicas. La Fig. 2c muestra que las células
viables tratadas con DRAQ5 presentan una clara definición de la
estructura nuclear y la definición de los bordes de las regiones de
la membrana nucleolar y nuclear.
Por tanto, las figuras 2a-2f
muestran características espectrales de la fluorescencia de DNA
asociada a DRAQ5 detectada por CLSM: Paneles a-c,
excitación a longitudes de onda de 488, 568 y 647 nm respectivamente
para las células viables de melanoma A375 humano. Paneles
d-f, excitación a longitudes de onda de 488, 568 y
647 nm respectivamente para las células fijadas con etanol teñidas
con bromuro de etidio. La imágenes miden 100 x 100 \mum.
El principio de la microscopía de fluorescencia
excitada con 2 fotones fue demostrado en primer lugar por Web y
colaboradores (Science, 248, 73-76 (1990); patente
de Estados Unidos 5.034.613). En esencia, esto incluye la captura de
dos fotones por una molécula excitable mediante el ordenamiento de
las condiciones de excitación que favorecen tales sucesos. El
espectro de excitación para un fluorocromo dado para sucesos
multifotónicos difiere del correspondiente espectro de excitación
por un único fotón aunque los espectros de emisión son
independientes del modo de excitación. El componente clave del
sistema de excitación, cuando se aplica a la obtención de imágenes,
es un láser sintonizable o un láser de modos fijos con longitud de
onda fija, dando pulsos ultracortos con una velocidad de repetición
alta. El microscopio multifotónico típicamente incorpora un láser
sintonizable Ti-Sapphire que emite dentro del
intervalo de longitud de onda 700-950, con una
amplitud de pulsos de aproximadamente 100 femtosegundos, y una
velocidad de repetición de 80 MHz. Se pueden usar también los láser
de longitud de onda fija tal como un láser YLF con modos fijos que
proporciona una excitación multifotónica a 1047 nm. La intensidad
del pico de tales láser es tan alta que la excitación del color
puede ocurrir por absorción de dos o más fotones en rápida sucesión.
De forma importante, la excitación multifotónica evita la necesidad
de longitudes de onda de excitación cortas (por ejemplo, UV).
Además, puesto que la excitación de fluorescencia se localiza en la
región del punto focal, el sistema multifotónico puede seccionar
ópticamente un objeto escaneado con fotodecoloración restringida. La
excitación multifotónica (dual) de DRAQ5 se ha conseguido usando el
láser YLF de modos fijos y en la Fig. 2g se muestra un ejemplo de
una imagen recogida que muestra la fluorescencia de las células
fijadas localizada en el núcleo. Se ha observado también la
excitación multifotónica de DRAQ5 en los núcleos de las células
fijadas usando un láser Ti-Sapphire (bombeado con 5
W) que emite a una longitud de onda de 740 nm (consistente con la
capacidad de excitar en UV a los núcleos de células tratadas con
DRAQ5, como se muestra en la Fig. 11). Se espera que el espectro de
excitación de DRAQ5, consistente con lo encontrado para otros
fluorocromos, difiere del determinado por espectroscopía de un
simple fotón. La penetración de los rayos láser infrarrojos ofrece
aplicaciones para la excitación multifotónica de DRAQ5 en el barrido
de sección/tejidos profundos para la localización, cuantificación y
morfología de los núcleos permitiendo una reconstrucción 3D precisa
de los entornos celulares complejos.
La Fig. 2g muestra la imagen multifotónica de los
núcleos celulares teñidos con DRAQ5. Las células del linfoma de
células B humano se fijaron con etanol y se tiñeron con DRAQ5 20
\muM. Se usó la excitación con láser YLF de modos fijos a 15 mW
(Ex \lambda = 1047 nm; Em \lambda = rojo lejano) y se obtuvieron
imágenes usando objetivos de aceite 60 x N.A. 1,4, un factor de zoom
de 1,9 y un promedio Kalman de 37 marcos.
Se ha intentado poner un ejemplo del efecto de
los cambios de la estructura de un compuesto de la forma general del
compuesto (I) sobre las características de tinción de las células
viables. Un derivado N-óxido de DRAQ5 (esto es DRAQ5N) retiene la
estructura general (I) pero ha perdido la carga global. El cambio
afecta a la eficiencia del potencial de unión del agente en las
células viables aunque se retiene la fluorescencia, las propiedades
de penetración en las células y la localización en el núcleo. Las
figuras 2h a 2k muestran que bajo condiciones equivalentes para la
detección de la fluorescencia nuclear en células humanas viables, la
intensidad de la fluorescencia nuclear integrada de DRAQ5 por
sección del núcleo fue aproximadamente 10 veces mayor que el valor
derivado para las células tratadas con DRAQ5N. En las publicaciones
anteriores (véanse las referencias 1-10 más
adelante) se han descrito las características de los N-óxidos de
alquilaminoantraquinona y sus potenciales como
pro-fármacos biorreductores. Por tanto el N-óxido de
DRAQ5 (esto es DRAQ5N) descrito aquí compartirá las propiedades de
esta clase de agentes siendo capaz de la conversión biorreductora a
DRAQ5. Se sugiere en esta invención que las nuevas características
de fluorescencia de DRAQ5 proporcionarán un marcador de la actividad
biorreductora celular y por implicación de un estado hipóxico, en
virtud de la conversión de DRAQ5N. Por tanto, la presente invención
contempla el uso de DRAQ5N como un marcador de las células
hipóxicas.
Por tanto, las figuras 2h a 2k muestran
simultáneamente la captura por CSLM de la transmisión (paneles h y
j) y las correspondientes imágenes de la fluorescencia en el rojo
lejano/infrarrojo inferior (paneles i y j respectivamente) de las
células viables HL60 expuestas o bien a DRAQ5 10 \muM o bien a
DRAQ5N 10 \muM durante 1 h.
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Se ha intentado demostrar la separación espectral
de la señal de fluorescencia de DRAQ5 de las de otros fluorocromos
usados habitualmente utilizando una excitación selectiva. La Fig. 3b
muestra la variación significativa de la capacidad de las células
A375 para la conversión intracelular de la FDA por escisión con
esterasa hasta la forma retenida de fluoresceína. La obtención de
imágenes de la misma muestra usando la excitación selectiva de DRAQ5
demuestra claramente la morfología nuclear (Fig. 3c), mientras que
la obtención de imágenes por transmisión (Fig. 3a) revela la forma
celular global. El análisis por triple imagen identifica los pares
de células hijas (marcadas x, y, y z por flechas en la Fig. 3d). La
obtención dual de imágenes se ha extendido a un colorante vital
capaz de definir las organelas citoplásmicas. Las figuras
4a-4c muestran las células
co-marcadas con DRAQ5 (núcleos) y con rodamina 123
(mitocondrias).
Por tanto, las figuras 3a-3d
muestran la excitación díferencial de la fluoresceina y la DRAQ5 en
células A375 viables analizadas por CLSM. Las células se trataron
con DRAQ5 10 \muM durante 1 h y posteriormente se marcaron con FDA
a 1 \muM durante 15 min. Los paneles muestran las mismas vistas de
imágenes como sigue: a, imagen por transmisión; b, excitación de
fluoresceína a 488 nm; c, excitación a 647 nm de DRAQ5; d, imágenes
combinadas a-c codificadas con azul, verde y rojo
respectivamente. Las imágenes miden 250 x 250 \mum; los pares de
células hijas se indican por flechas.
Las figuras 4a-4c representan las
imágenes a-c que muestran la excitación diferencial
de rodamina 123 y DRAQ5 en células A375 viables analizadas por
microscopía confocal de barrido con láser. Las células fueron
tratadas con DRAQ5 10 \muM durante 1 h y posteriormente fueron
marcadas con rodamina 123 a 2 \mug/ml durante 5 minutos. Las
imágenes a y b muestran la misma vista con excitación a 488 nm o a
647 nm, respectivamente. La imagen c representa las imágenes
combinadas de a (codificada en verde) y b (codificada en rojo ). Las
imágenes miden 100 x 100 \mum.
La citometría de flujo, como se usa aquí, es un
procedimiento para la medida de las características de dispersión de
la luz y de fluorescencia de las células o partículas que pasan a
través de un aparato de medir en una corriente fluida en la que las
células individuales atraviesan la posición(s) focal de los
rayos láser simples o múltiples. Se hace seguimiento
electrónicamente del retraso en el tiempo del paso a lo largo de las
posiciones focales separadas espacialmente que permite que el
citómetro genere medidas multiparamétricas totalmente
correlacionadas para configuraciones de haz múltiple. Se demuestra
aquí el uso de DRAQ5 en sistemas de haz simple, dual y triple en un
conjunto de aplicaciones usando células humanas.
Se cultivaron células HL60 (línea de células de
la leucemia promielocítica humana) y células SUD4 (línea de células
del linfoma de células B humano) como cultivos en suspensión en
medio RMPI con 10% de suero fetal bovino, glutamína 1 mM y
antibióticos y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al
5% en aire. Para los experimentos de citometría de flujo, los
cultivos en suspensión, que crecen asíncronamente se diluyeron a
2,5-4 x 10^{5} células/ml a las 2 h antes del
tratamiento con el fármaco. Se obtuvieron poblaciones con el ciclo
celular alterado tratando células SUD4 con el fármaco etopósido
(VP-16-213) a 0,25 \muM durante 18
h. Se trataron las células con DRAQ5 y FDA como se ha descrito
antes. Las concentraciones de células se determinaron usando un
contador Coulter y se determinó la distribución del ciclo celular
usando un algoritmo para la distribución normal de los perfiles de
intensidad de fluorescencia para las células G1 y G2 teñidas por
fluorocromo.
Los cultivos en suspensión se analizaron por
citometría de flujo sin lavado. La sangre humana se obtuvo usando
venopunción rutinaria de un donante sano y las muestras se
manipularon usando procedimientos hematológicos estándar para el
aislamiento de las células sanguíneas mononucleares y para el
reconocimiento del antígeno de superficie usando paneles de
anticuerpos (véase la Tabla 1).
(Tabla pasa a página
siguiente)
^{a} Fluorescencia detectada sobre FL3 y
analizada como un parámetro del área del pulso para las poblaciones
de células elegidas sobre las relevantes características de
dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Todas las
preparaciones celulares se analizaron a 2,5 x 10^{5}/ml a menos
que se indique otra cosa, en solución salina tamponada con fosfato
más BSA al 1% (esto es tampón de análisis) sin DRAQ5 20 \muM (0
min de exposición) o con DRAQ5 20 \muM (5 ó 120 min de
exposición).
^{b} Preparación 1: células derivadas del
cultivo celular de la línea del linfoma de células B foliculares
humanas SUD4 y resuspendidas en tampón de análisis. El análisis
paralelo de muestras usando tinción convencional con bromuro de
etidio de las células permeabilizadas digeridas con RNasa A dio G1 =
34,9%, fase S = 48,0%, G2/M = 17,1% para cultivos asíncronos y G1 =
0,6%, fase S = 55,3%. G2/M = 44,0% para las células paradas en el
final del ciclo celular obtenidas tratando las células con el
fármaco citotóxico VP-16 (0,25 \muM durante 18 h).
El análisis cuantitativo del contenido de DNA de G1 (SUD4):G1
(linfocitos diploides normales) dio una relación de 1,083.
^{c} Preparación 2: como la Preparación 1 pero
procesada para análisis del antígeno de superficie usando
anticuerpos marcados directamente:
anti-CD54-FITC (detectado sobre el
parámetro FL1), anti-CD19-PE
(detectado sobre el parámetro FL2).
^{d} Preparación 3: células sanguíneas viables
mononucleares de un donante normal separadas por gradiente de
Ficoll. Las muestras se obtuvieron por venopunción rutinaria
(relación linfocitos:monocitos = 11,5:1) y se resuspendieron en
tampón de análisis.
^{e} Preparación 4: como la Preparación 3 pero
procesada para análisis del antígeno de superficie usando
anti-CD54-FITC.
^{f} Preparación 5: sangre entera de un donante
normal procesada para análisis del antígeno de superficie, analizada
como células viables usando la positividad
anti-CD54-FITC como el activador
maestro del parámetro FL1 para excluir las RBC. Las poblaciones
separadas tienen 25,5% de linfocitos, 13,3% de monocitos, 61,2% de
granulocitos.
^{g} Preparación 6: como la Preparación 5 pero
después de procesada para análisis del antígeno de superficie,
células fijadas y RBC lisadas en FACSLyse™ y resuspendidas en tampón
de análisis. El parámetro FSC como activador maestro. Las
poblaciones separadas tienen 43,7% de linfocitos, 9,7% de monocitos,
46,6% de granulocitos.
Se analizaron las células usando uno de estos
cuatro citómetros según los requerimientos de excitación.
Citómetro A: Excitación por láser de
criptón a 647 nm con alta potencia y haz simple: El sistema era un
citómetro construido a petición del cliente al que se incorporó un
láser de criptón Innova 3000K (Coherent Corp., Palo Alto, CA, USA)
ajustado a la línea de 647 nm. Se recogieron emisiones de dispersión
de luz directa, de dispersión de luz a 90º y de fluorescencia para 1
x 10^{4} células usando el parámetrode dispersión de luz a 90º
como la señal maestra. El sistema óptico permitió el análisis de
diferentes longitudes de onda de emisión de fluorescencia
incluyendo: >715 nm (denominada infrarrojo inferior) y, como se
indica aquí fluorescencia >780 nm (infrarrojo). Se analizaron la
dispersión de la luz directa y la dispersión de la luz a 90º, para
la identificación de los restos celulares. La potencia del láser se
fijó a 200 mW y se usaron amplificadores lineales para las señales
de fluorescencia. Los elementos ópticos de análisis incluyeron un
espejo dicroico frío a 675 nm, la temperatura ambiental del
laboratorio fue aproximadamente 12ºC y el reservorio de cubierta se
mantuvo a 10ºC. Los filtros fueron suministrados por Melles Griot.
Se calcularon los parámetros mediana, media y modo para la
distribución de los valores de la intensidad de fluorescencia a lo
largo de una población celular dada. En todos los experimentos, los
valores de la mediana y la media produjeron resultados muy
similares. Se registraron sólo los valores de la mediana porque este
parámetro es menos afectado por la presencia de células altamente
fluorescentes más allá del límite superior de cuantificación.
Citómetro B: Excitación por láser de haz
dual a 633 nm con baja potencia y a 488 nm con alta potencia: El
sistema fue un clasificador celular FACS 440 (Beckton Dickinson
Inc., Cowley, UK) que incorpora un láser de ion argón de Spectra
Physics (máximo 500 mW de salida), ajustado a la línea de 488 nm
(100 mW de salida), y un láser secundario de
helio-neón Spectra Physics 156 que emite a 633 nm
(emisión < 5mW),con una separación temporal del haz de
aproximadamente 30 \mus. Se recogieron emisiones de dispersión de
luz directa, de dispersión de luz a 90ºC y de fluorescencia para 1 x
10^{4} células usando el parámetro de dispersión de luz directa
como la señal maestra desde el haz primario a 488 nm, mientras que
la dispersión lateral se recogió a través de un filtro d paso de
banda de 488/10 nm. Los elementos ópticos de análisis incluyeron :
i) un espejo dicroico frío (transmisión > 675 nm), ii)
fluorescencia de la fluoresceína excitada por el haz a 488 nm,
detectada con un PMT guardado por un filtro de paso de banda de
535/15 nm sin señal de retraso, y iii) un PMT sensible al rojo con
un retraso apropiado, adicionalmente guardado por un filtro de paso
largo a 620 nm, para detectar el haz transmitido de la fluorescencia
asociada a DRAQ5 a longitudes de onda más allá de 675 nm (rojo alto
y extendiéndose hasta la región infrarrojo del espectro). Se
analizaron la dispersión de la luz directa y la dispersión de la luz
a 90º para excluir todos los restos celulares. Todos los parámetros
se adquirieron en el canal de resolución 256 con un software Consort
30 (Becton Dickinson) y se analizaron después con software WinMDI
(J. Trotter, La Jolla, CA). El sistema empleó los mismos elementos
ópticos de análisis cuando se usó en el modo de haz simple a 488 nm
pero sin retraso de la señal para el PMT sensible al rojo.
Citómetro C: Excitación por láser de
criptón a 488 nm con baja potencia y haz simple: El sistema era un
FACScan (Beckton Dickinson Inc., Cowley, UK) que incorpora un láser
de ion argón (máximo 15 mW de salida), ajustado a la línea de 488
nm. Se recogieron emisiones de dispersión de luz directa, de
dispersión de luz a 90º y de fluorescencia para 1 x 10^{4} células
usando el parámetrode dispersión de luz directa como la señal
maestra. Los elementos ópticos del sistema estándar proporcionaron
los parámetros del PMT, FL1 (azul)/FL2 (verde)/FL3 (rojo) con el
análisis de pulsos realizado sobre las señales que originan el
FL3.
Citómetro D: Excitación por láser de
triple haz a 633 nm con media potencia, a 488 nm con media potencia
y a multilínea UV con media potencia: El sistema fue un clasificador
celular FACS Vantage (Beckton Dickinson Inc., Cowley, UK) que
incorpora un láser Coherent Enterprise II que emite simultáneamente
a longitudes de onda multilínea UV (intervalo de
350-360 nm) y 488 nm con los haces preparados como
no colineales usando separadores dicroicos. Se usaron elementos
ópticos que combinan los haces para alinear el haz UV con el emitido
por un láser de helio-neón Spectra Physics
127-35 (máximo 35 mW de salida), que emite a 633 nm
con una separación temporal de aproximadamente 25 \mus de la del
haz primario a 488 nm. Se recogieron emisiones de dispersión de luz
directa, de dispersión de luz a 90º y de fluorescencia para 1 x
10^{4}células usando el parámetrode dispersión de luz directa,
como la señal maestra para el haz primario a 488 nm, mientras que la
dispersión lateral se recogió a través de un filtro de paso de banda
de 488/10 nm. Los elementos ópticos de análisis fueron: i) las
señales que originan el haz primario analizadas a FL1 (filtro FITC,
filtro de barrera de 530/30 nm) después de transmisión en los
dicroicos SP610 y SP560, o a FL2 (filtros de barrera de 585/42 nm o
575/26 nm) después de transmisión en un dicroico SP610 y de
reflexión en un dicroico SP560, o en FL3 (filtros de barrera de
LP175 nm) después de reflexión en un dicroico SP610; ii) las señales
que originan el haz retardado analizadas en FL4 (filtro de barrera
de LP695 nm) o en FL5 (filtro de barrera de DF424/44 nm) después
transmisión o reflexión en dicroicos LP640 nm respectivamente. Se
analizaron la dispersión de luz directa y la dispersión de la luz a
90º para excluir todos los restos celulares. Todos los parámetros se
analizaron usando un software CellQuest (Becton Dickinson).
A pesar de que la excitación de DRAQ5 sea óptima
a la longitud de onda del láser de 647 nm, los estudios preliminares
indicaron que la sonda podría ser excitada sub-óptimamente a
longitudes de onda más bajas, incluyendo la multilínea UV 488 nm,
514 nm y 633 nm. En esta invención se ha buscado evaluar DRAQ5 como
una sonda de DNA para uso en citometría de flujo comparando las
configuraciones de los cuatro diferentes citómetros.
Citómetro A: Excitación por láser de
criptón a 647 nm con alta potencia y haz simple.
Citómetro B: Excitación por láser de haz
dual a 633 nm con baja potencia y a 488 nm con alta potencia.
Citómetro C: Excitación por láser de
criptón a 488 nm con baja potencia y haz simple.
Citómetro D: Excitación por láser de
triple haz a 633 nm con media potencia, a 488 nm con media potencia
y a multilínea UV con media potencia.
La Fig. 5 demuestra que usando un láser HeNe de
baja potencia (Citómetro B), no tiene lugar una separación completa
de las señales de autofluorescencia y de DRAQ5 para las células
viables HL-60 tratadas con concentraciones de DRAQ5
bajas, no saturantes. Estudios posteriores (no se muestran datos)
indican que se podría alcanzar la separación completa después de dos
horas de incubación con DRAQ5 20 \muM. Sin embargo, incluso bajo
estas condiciones limitantes de excitación la señal de DRAQ5
derivada a 633 nm muestra una clara relación líneal
dosis-respuesta (véase el gráfico insertado de la
Fig. 5) que llega hasta aproximadamente 2,5 \muM, comparable con
la linealidad obtenida para la excitación óptima a 647 nm (usando el
Citómetro A) y la detección a las longitudes de onda > 780
nm.
Las figuras 6a y 6b demuestran que se puede usar
un láser HeNe de baja potencia (Citómetro B) para identificar la
fluorescencia asociada a DRAQ5 en las células cargadas con
fluoresceína analizadas en una configuración de haz dual. Las
figuras 6c y 6d demuestran que es posible la
co-excitación de DRAQ5 y fluoresceína usando un haz
simple de longitud de onda de 488 nm (Citómetro B). Hay una clara
separación de señales, debida a los distintos espectros no
solapantes, a pesar de la señal de baja intensidad derivada de la
excitación sub-óptima de DRAQ5.
Se ha intentado demostrar la utilidad de DRAQ5 en
un citómetro de simple haz (esto es FACScan™; Citómetro C). Las
figuras 7a-7d presentan resultados típicos que
demuestran la capacidad de DRAQ5 para identificar las células
nucleadas en poblaciones complejas. La Fig. 7a muestra la detección
de la distribución del ciclo celular frente a la expresión del
antígeno de superficie celular para las células intactas. La Fig. 7b
muestra la discriminación de los subconjuntos según el potencial de
tinción mientras que las figuras 7c y 7d demuestran la aplicación de
DRAQ5 para detectar las células nucleadas en la sangre entera y en
la sangre lisada. Los factores relativos a la capacidad de DRAQ5
para teñir los núcleos se analizan en la tabla. Usando células
asíncronas cultivadas viables (Preparación 1) la DRAQ5 tiñó
rápidamente las células de una manera reproducible y generó la
fluorescencia distinta de la autofluorescencia de fondo. Los valores
grandes de sd se derivan de la dispersión de las células a lo largo
del ciclo celular. El valor medio refleja el contenido medio de DNA
celular como se evidencia por el incremento de 1,7 veces para las
poblaciones de G2 paradas. El procesado de las células para el
análisis del antígeno de superficie (Preparación 2) no afecta a las
características anteriores. El aislamiento de las células sanguíneas
mononucleares intactas (Preparaciones 3 y 4) proporciona muestras
que se pueden teñir dentro de un intervalo de densidad celular
conveniente y se pueden procesar para el análisis del antígeno de
superficie. En las preparaciones 3 y 4 se ha observado de forma
consistente un mejor potencial de tinción de los monocitos frente a
los linfocitos (1,14-1,4 veces) lo que indica que el
potencial de tinción de las células viables se puede usar como un
factor para la discriminación de las subpoblaciones. Los resultados
para la sangre entera muestran que las células nucleadas (incluyendo
los granulocitos) se pueden teñir hasta un grado similar en
presencia (Preparación 5) de glóbulos rojos (RBC) o después de la
lisis y fijación media de los RBC (Preparación 6).
La Fig. 8 resume las diferencias, dependientes de
la concentración de DRAQ5, en la tinción por DRAQ5 de las
poblaciones celulares viables obtenidas usado los métodos de
preparación 1 y 2 (véanse las notas al pie de la tabla). Las
poblaciones muestran curvas de titulación similares, teniendo lugar
la saturación de una manera que refleja el contenido relativo de DNA
(para un tipo dado de células, por ejemplo SUD4) o el potencial de
tinción nuclear (por ejemplo, linfocitos frente a monocitos) a
concentraciones \geq 10 \muM.
La Fig. 9 demuestra la utilidad de DRAQ5 para la
detección de la expresión específica del ciclo celular de una
proteína intracelular, en células fijadas, detectada usando
anticuerpos marcados con fluorocromo activados por longitudes de
onda de 488 nm (FITC) y multilínea UV (Citómetro D). Las figuras
10a-10f muestran que en una configuración de triple
haz (Citómetro D) es posible demostrar la fluorescencia de DRAQ5
activada por dos haces separados con discriminación sobre un tercero
para el seguimiento de los sucesos del ciclo celular relativamente
raros tales como la alta expresión de ciclina B1 en G2/M de los
cultivos asíncronos.
Por tanto, la Fig. 5 muestra el análisis por
citometría de flujo de la acumulación de DRAQ5, durante un periodo
de exposición de una hora, en células HL60 viables. Los histogramas
de distribución de frecuencias corresponden a una excitación a
longitud de onda de 633 nm de baja potencia usando el Citómetro B.
Símbolos: \medcirc, \blacktriangle, y \oblong, representan 0,
5 y 10 \muM de DRAQ5 respectivamente. Gráfico insertado:
linealidad de dosis DRAQ5/respuesta usando dos citómetros diferentes
(especialmente B y A con coeficientes de correlación de 0,96 y 0,97
para excitaciones a 633 nm y 647 nm respectivamente).
Las figuras 6a a 6d muestran el análisis por
citometría de flujo por haz dual (Citómetro B) para la detección de
la fluorescencia asociada a DRAQ5 en células HL60 viables marcadas
con fluoresceína. Gráficos representativos de dos variables por
citometría de flujo de las señales de fluorescencia de la célula
entera en verde (FL2-altura; fluoresceína) frente a
rojo intenso/infrarrojo inferior (FL1-altura;
DRAQ5). Los paneles a y b muestran la excitación por haz dual de
fluoresceína (488 nm) y DRAQ5 (633 nm a baja potencia). Panel a: FDA
(0,2 \muM durante 10 min solo); panel b, células pretratadas con
DRAQ5 5 \muM durante 1 hora antes del tratamiento con FDA. Los
paneles c y d repiten las mismas condiciones de tratamiento celular
excepto el uso de la excitación por simple haz a 488 nm para la
fluoresceína y DRAQ5. Las cifras indican el porcentaje de sucesos
elegidos dentro de las regiones del cuadrante.
Las figuras 7a a 7d muestran el análisis por
citometría de flujo de haz simple (Citómetro C) de la fluorescencia
de DRAQ5 (FL3-área) frente a la fluorescencia de anticuerpos
(monitorización por FL2-altura de los
anti-CD19 marcados con ficoeritrina o monitorización
por FL1-altura de los anti-CD45
marcados con FITC) para células humanas cultivadas y derivadas de la
sangre. Las suspensiones celulares (2,5 x 10^{5}/ml) se
mantuvieron en solución salina tamponada con fosfato que contiene
seroalbúmina bovina al 1%. Las subpoblaciones celulares
mononucleares de sangre humana, obtenidas usando separación estándar
por gradiente de Ficoll, se identificaron y separaron de acuerdo con
sus características de dispersión directa y lateral de la luz. Se
excluyeron los dobletes por análisis de pulsos separando sobre los
valores de los parámetros FL3-área normal frente a los valores de
los parámetros FL3-anchura. Panel a: células
cultivadas asíncronas de linfoma SUD4. Panel b: subpoblaciones
celulares mononucleares de sangre obtenidas usando separación
estándar por gradiente de Ficoll. Panel c: sangre entera (activada
en sucesos con CD45+). Panel d: sangre entera lisada. Subpoblaciones
marcadas con flechas: G1, S y G2/M representan fases del ciclo
celular; L, linfocitos; M, monocitos; G, granulocitos, N, núcleos
que carecen de membranas plasmáticas.
La Fig. 8 muestra una cuantificación citométrica
baja de haz simple (Citómetro C) de la intensidad de fluorescencia
de células humanas cultivadas y derivadas de la sangre expuestas a
DRAQ5 a temperatura ambiente durante 5 min. Los datos son la media
de los valores (\pm SD) y representan los resultados de un
experimento típico. Símbolos: \medcirc, células de linfoma SUD4
asíncronas cultivadas; \Box, células SUD4 expuestas a
VP-16 0,25 \muM durante 18 h para detener las
células en las fases S y G2 del ciclo celular; \bullet,
linfocitos; \oblong, monocitos.
La Fig. 9 muestra el análisis por citometría de
flujo de haz dual (Citómetro D) de la expresión de la ciclina B1
específica del ciclo celular. Las células SUD4 fijadas, digeridas
con RNasa A y teñidas con DRAQ5 (FL3: excitación a 488 nm) se
obtuvieron de un cultivo asíncrono expuesto a VP-16
0,25 \muM durante 18 h para acumular las células en G2/M. Se hizo
seguimiento de la proteína ciclina B1 expresada en la fase G2/M por
inmunofluorescencia indirecta usando un segundo anticuerpo marcado
con AMCA (FL5-altura; excitación a multilínea UV)
para detectar la unión de la IgG monoclonal de ratón
anti-ciclina B1 (GNS1). Los paneles a y c muestran
los anticuerpos controles (IgG no específica más el segundo
anticuerpo). Los paneles b y d muestran los resultados para el
anticuerpo específico más el segundo anticuerpo. Los anticuerpos se
obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. Subpoblaciones marcadas
con flechas: G1, S y G2/M representan fases del ciclo celular: la
flecha sin letras muestra la posición esperada de las células que
expresan altos niveles de ciclina B1 y localizada en G2/M del ciclo
celular.
Las figuras 10a a 10f muestran el análisis por
citometría de flujo de triple haz (Citómetro D) de células de
linfoma SUD4 asíncronas fijadas y teñidas con DRAQ5 y digeridas con
RNasa A. La fluorescencia de DRAQ5 (altura del pulso) se monitorizó
por FL3 (excitación a 488 nm) y FL4 (excitación a 633 nm). La
proteína Cdc2 independiente del ciclo celular y la proteína ciclina
B1 expresada en la fase G2/M se monitorizaron por
inmunofluorescencia indirecta usando un segundo anticuerpo marcado
con FITC (FL1-altura; excitación a 488 nm) para
detectar la unión de la IgG policlonal de conejo
anti-Cdc2 p34 (H-297), y el segundo
anticuerpo marcado con AMCA (FL5-altura; excitación
a multilínea UV) para detectar la unión de la IgG monoclonal de
ratón anti-ciclina B1 (GNS1). Los anticuerpos se
obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. Paneles: a y b, DNA
frente a Cdc-2 p34; c y d, DNA frente a ciclina B1;
e y f, histogramas de DNA para longitudes de onda de excitación en
el azul y en el rojo respectivamente. Subpoblaciones marcadas con
flechas: G1, S y G2/M representan fases del ciclo celular: HCyB,
células que expresan altos niveles de ciclina B1 localizadas en G2/M
del ciclo celular.
\newpage
Los picos de absorbancia observados para las
longitudes de onda < 400 nm dan a entender que debería ser
posible la excitación del cromóforo a longitudes de onda en el UV
cercano, (no se muestran datos). Se ha demostrado que los núcleos
teñidos con DRAQ5 de células vivas se pueden excitar en la región
del UV cercano del espectro como se muestra por el uso de la
citometría de flujo en multilínea UV (Citómetro D; figuras
11a-11c). Aunque la excitación con UV es menos
eficiente que a la longitud de onda de 647 nm (Fig. 11b) y la
detección requiere el aumento de la amplificación de la señal del
fotomultiplicador, las intensidades de fluorescencia reflejan
claramente la distribución del contenido del DNA celular (Fig. 11c).
Esto demuestra que en las combinaciones de triple haz, la DRAQ5
puede proporcionar una señal discriminatoria de DNA derivada de
longitudes de onda de excitación en el intervalo UV y visible.
Las figuras 11a-11c muestran la
excitación de DRAQ5 a 488 nm (panel a), 647 nm (panel b), o
multilínea UV (intervalo 350-360 nm; panel c) en
células de linfoma SUD4 intactas para emisión a longitudes de onda
>695 nm y analizadas por citometría de flujo con haz múltiple
(Citómetro D). Las líneas en negrita reflejan el contenido de DNA
celular de las células teñidas con DRAQ5, las líneas simuladas
representan las células control no teñidas, las líneas de puntos
representan microperlas de referencia teñidas con aloficocianina
(APC) de referencia usadas como estándares excitables a 647 nm.
La capacidad para discriminar células viables
intactas de las que sufren las diferentes etapas de la muerte
celular se puede conseguir a través de la acumulación celular
diferencial de sondas químicas que incluyen ciertos fluorocromos. Un
tipo particular de muerte celular, denominado apoptosis, tiene
etapas iniciales fácilmente discernibles que pueden ocurrir en las
células intactas. La discriminación se usa extensamente tanto en los
ensayos biológicos como en los clínicos. Por ejemplo, los ensayos
por citometría de flujo pueden permitir la identificación,
cuantificación, análisis, preparación o exclusión de subconjuntos
celulares. La absorción y retención de la sonda depende de múltiples
factores, incluyendo la integridad de la membrana plasmática (por
ejemplo, que afecta a la entrada de la sonda) y el comportamiento
intracelular de la sonda (por ejemplo, la unión de la sonda al DNA
nuclear). Los ensayos fluorométricos actuales de la muerte celular
pueden usar la capacidad de las células viables intactas para
permanecer sin teñirse debido a la exclusión de la sonda (por
ejemplo, la tinción fluorescente del DNA con yoduro de propidio)
mientras que las células con membranas afectadas permiten el acceso
de la sonda al DNA nuclear. Las células que están sufriendo las
primeras etapas de la muerte celular apoptótica se pueden
identificar por la unión a la superficie celular del compuesto
químico marcado con el fluorocromo, anexina V, pero no muestran
ninguna pérdida de la integridad de la membrana. Las últimas etapas
de la muerte celular y apoptosis, cuando las membranas plasmáticas
llegan a romperse, están asociadas con una alta unión a la anexina V
y alta tinción del DNA con yoduro de propidio.
Se pone aquí como ejemplo el uso de un derivado
N-óxido de DRAQ5 (DRAQ5NO) que proporciona una mejora de la
discriminación de las células vivas y muertas. El DRAQ5NO es capaz
de entrar dentro de las células viables intactas y de ser retenido
en ellas a un bajo nivel, proporcionando una discriminación positiva
de las células intactas. En combinación con una sonda secundaria
(por ejemplo anexina V) hay una mejor discriminación de las etapas
de la progresión celular a través del proceso de la muerte celular o
apoptosis. Las cuatro etapas, según los patrones de tinción son:
Etapa 1: DRAQ5NO positiva/anexina V negativa
(células viables intactas)
Etapa 2: DRAQ5NO positiva/anexina V positiva
(células en las etapas apoptóticas iniciales)
Etapa 3: DRAQ5NO altamente positiva/anexina V
positiva (últimas etapas apoptóticas/células muertas)
Etapa 4: DRAQ5NO negativa/anexina V positiva
(restos celulares no nucleados).
Las figuras 12a-12d y las figuras
13a-13d ilustran ejemplos, que usan una línea
celular de linfoma de células B humano capaz de progresión a través
de la apoptosis en respuesta al fármaco anti-cáncer
VP-16 (etopósido) para una exposición de 18 h a
concentración 0,25 \muM. Las células se prepararon por métodos
estándar para la unión de anexina V-FITC, se
expusieron simultáneamente a DRAQ5NO 50 \muM y después se
diluyeron 1:5 en solución salina tamponada con fosfato antes del
análisis por citometría de flujo usando el Citómetro D. El
instrumento se usó en un modo de láser dual con una excitación de
FITC a longitud de onda de 488 nm (monitorizada por el parámetro
FL1-H) y una excitación de DRAQ5NO a longitud de
onda de 633 nm (monitorizada por el parámetro
FL4-H). Las figuras 12a-12d muestran
las combinaciones de los tratamientos con reactivos (Anx = anexina
V-FITC; AQ5N = el derivado N-óxido de DRAQ5) para
las células control y las figuras 13a-13d muestran
la misma combinación de reactivos para los cultivos tratados con
VP-16 (esto es VP). Los resultados muestran el bajo
nivel de tinción por DRAQ5NO conseguido en las poblaciones de la
etapa 1 y el mayor nivel en las células de la etapa 3. La frecuencia
de las células que son positivas a la anexina V se aumenta por el
tratamiento con VP-16 pero comprende tres
poblaciones (etapas 2-4) discernibles usando el
análisis del cuadrante que se muestra en los gráficos. La mejora
proporcionada por el uso de DRAQ5NO es con respecto a dos
características. En primer lugar, las ventajosas propiedades
espectrales del derivado de DRAQ5 que permite la separación de los
sucesos de excitación de la sonda por el uso de dos láser y/o el
solapamiento espectral de las señales de emisión de la sonda muy
reducido. En segundo lugar, la discriminación positiva de las
células intactas de los restos celulares no nucleados.
Claims (27)
1. Un compuesto aislado de la siguiente
fórmula:
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo
heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la
forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o
inorgánico.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el
que X_{1} y X_{2} son
NH(CH_{2})_{2}NR^{1}R^{2}.
3. Un compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2,
en el que R^{1} y R^{2} son un alquilo
C_{1-4}.
4. Un compuesto según la reivindicación 3, en el
que R^{1} y R^{2} son metilo.
5. Una composición acuosa que comprende un
compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un método para preparar un compuesto de la
siguiente fórmula:
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que R^{1} y R^{2} están unidos forma un anillo
heterocíclico, y donde el compuesto (I) está opcionalmente en la
forma de una sal de ácido derivada de un ácido orgánico o
inorgánico,
comprendiendo el método la etapa de hacer
reaccionar un compuesto de la siguiente
fórmula:
con
NH_{2}-A-NR^{1}R^{2}, donde A,
R^{1} y R^{2} son como se han definido antes, para proporcionar
un compuesto resultante, cuyo compuesto resultante puede además ser
tratado opcionalmente con un
ácido.
7. Un método según la reivindicación 6, que
comprende también la etapa de un tratamiento subsiguiente con
clorato de sodio y/o hidrógenosulfito de sodio.
8. Un complejo fluorescente que comprende un
ácido nucleico y un compuesto de la siguiente fórmula:
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo
heterocíclico,
o uno de sus derivados
N-óxidos,
y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido
está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un
ácido orgánico o
inorgánico.
9. Un complejo según la reivindicación 8, en el
que el ácido nucleico es DNA.
10. Un complejo según la reivindicación 9, en el
que el DNA está presente en una célula viva.
11. Un método para analizar una célula o material
biológico que contiene uno o más ácidos nucleicos, que comprende las
etapas de:
a) preparar una solución biológicamente
compatible que contiene un compuesto de la fórmula (I):
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo
heterocíclico,
o uno de sus derivados
N-óxidos,
y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido
está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un
ácido orgánico o
inorgánico;
b) tratar la célula o material biológico con la
solución biológicamente compatible;
c) excitar el compuesto (I) en la célula o
material biológico tratados con una fuente de luz; y
d) detectar la señal de fluorescencia
emitida.
12. Un método según la reivindicación 11, en el
que la fuente de luz proporciona una o más longitudes de onda en la
región espectral de las longitudes de onda de máxima absorción del
compuesto (I).
13. Un método según las reivindicaciones 11 ó 12,
en el que el compuesto (I) está presente en la célula o material
biológico con uno o más de otros fluorocromos o compuestos que
emiten luz.
14. Un método según la reivindicación 13, en el
que los fluorocromos emiten en la región UV o visible del
espectro.
15. Un método según las reivindicaciones 13 ó 14,
en el que uno o más de los otros fluorocromos se usan para detectar
la unión de la anexina V.
16. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, que comprende la etapa de análisis por
citometría de flujo.
17. El uso de un compuesto de la siguiente
fórmula:
\newpage
en la que cada uno de X_{1} y X_{2} son
independientemente
NH-A-NR^{1}R^{2}, y donde A es
un grupo alquileno C_{2-8} y R^{1} y R^{2} se
seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo
C_{1-4}, hidroxialquilo C_{2-4}
y aminoalquilo C_{2-4}, o R^{1} y R^{2} juntos
forman un grupo alquileno C_{2-6} que con el átomo
de nitrógeno al que están unidos R^{1} y R^{2} forma un anillo
heterocíclico,
o uno de sus derivados
N-óxidos,
y donde el compuesto (I) o su derivado N-óxido
está opcionalmente en la forma de una sal de ácido derivada de un
ácido orgánico o
inorgánico,
como un colorante del
DNA.
18. El uso de un compuesto según la
reivindicación 17, en un ensayo biológico.
19. El uso de un compuesto según la
reivindicación 18, en el que el compuesto está presente como un
derivado N-óxido.
20. El uso de un compuesto según la
reivindicación 18, en citometría.
21. El uso de un compuesto según la
reivindicación 20, en el que el compuesto está presente como un
derivado N-óxido.
22. El uso de un compuesto según las
reivindicaciones 20 ó 21, en el que la citometría es citometría de
flujo de haz simple o haz múltiple.
23. El uso de un compuesto según la
reivindicación 17, en microscopía.
24. El uso de un compuesto según la
reivindicación 23, en el que el compuesto está presente como un
derivado N-óxido.
25. El uso de un compuesto según las
reivindicaciones 23 ó 24, en el que la microscopía es microscopía
confocal de barrido con láser.
26. El uso de un compuesto según la
reivindicación 17, como un agente de tinción nuclear.
27. El uso de un compuesto según la
reivindicación 17, como un agente de formación de imágenes.
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---|---|---|---|
GB9813062 | 1998-06-18 | ||
GBGB9813062.8A GB9813062D0 (en) | 1998-06-18 | 1998-06-18 | An anthraquinone and its derivatives |
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