JPS63250397A - 核酸重量体の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、核Ｍ重ω体を電気泳動法又は液体クロマトグ
ラフィ法により分離する方法に関し、更に詳しくは、電
気泳動法あるいは液体クロマトグラフィの移動液に核酸
塩基間に挿入し得る化学物質を添加し、又はその固定相
に固定化することにより塩基配列の異なる核酸重量体を
分離する方法に関する。

（従来の技術） 核酸物質を分離・分析する方法は、これまでに電気泳動
法及び液体クロマトグラフィの手法が有効な方法として
用いられてきた。これらの方法は核酸重量体の重合度、
及びその重量体中に含まれる核酸塩基の種類及びその数
により分離が行なわれる。すなわち、核酸は核酸塩基、
炭水化物及びリン１ｇＩＩ基からなり、核酸の重合度が
異なると、その核酸中に含まれるリン酸基の数、及び核
酸塩基の数が異なる。このため例えば電気泳動法や、イ
オン交換クロマトグラフィにおいては、Ｍｌ中に存在す
るリン酸基の電気的性質の相違を利用することにより、
核酸の分離を行うことができる。この場合、分離は核酸
中のリン酸基の数によって決定される。一方、例えば逆
相液体クロマトグラフィにおいては、核酸中に含まれる
核酸塩基の疎水的性質を利用して分離が行われるため、
分離は核酸塩基の種類と数により決定されることになる
。

しかしながら、電気的性質の相違を利用した分離方法で
ある電気泳動法やイオン交換りＯマドグラフィにおいて
は、同じ数の型口体は同じ数のリン酸基を有しているた
めに電気的性質の相違が認められず、それらの分離が達
成できないという欠点を持っていた。また、核酸の疎水
的性質を利用した分離方法である逆相クロマトグラフィ
においては、核酸中に含まれる核酸塩基の数と種類が同
じであれば、核酸塩基配列の異なった核酸用固体間の相
違は小さく分離が困難であった。

これまでに核酸の分離法の１つとして用いられてきた電
気泳動法は、通常、核酸の巨大分子の分離に使用されて
おり、僅かな塩基配列を認識して分離を遂行することは
困難であった。更に、高速液体クロマトグラフィ法では
、比較的低分子重量体の分離法として、いくつかの報告
がなされているが、これらは核酸配列の異なる類似の核
ＷＩ重量体間の分離を達成していない。

このように、核酸の最大の特徴がその塩基配列にあるに
も拘わらず、上述した手法によればこれを認識したうえ
で核酸の配列異性体の分離・分析を行うことは極めて困
難であった。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、核酸重量体の塩基配列を認識し、配列
異性体を効率良く分離１分析する方法を提供することに
ある。

（問題点を解決するための手段） すなわち、本発明は、電気泳動法又は液体クロマトグラ
フィにより核ｌ！！重量体を分離するに際し、核酸塩基
間と相互作用を有するアントラセン骨格又はアクリジン
骨格を有する化合物を用いることを要旨とする核酸重量
体の分離方法である。

以下その詳細について説明する。

（作用） 本発明でいう核酸重量体とは、核酸塩基、炭水化物及び
リン酸基からなる核酸のオリゴマー及び重合体を意味す
る。

該核酸塩基と相互作用を有する化合物（以下インターカ
レーターと略す）としては、アントラセン骨格又はアク
リジン骨格を有するものであれば既知及び新規化合物を
問わない。このインターカレーターは核酸塩基配列に対
して選択性を有するもので、特定の塩基配列をもつ部位
とより強く結合する性質を有している。

この本発明の核酸１１体とインターカレーターとの相互
作用は一般にπ−π相互作用として知られるもので、核
酸塩基の持つπ電子密度とインターカレーターの芳香環
上のπ電子密度とが異なることにより電子雲同志の相互
作用が生まれる。電子密度はインターカレーターの芳香
環に結合している置換基の種類や周囲の状況により異な
るが、核酸塩基の配列により強い相互作用を生じる。ま
たπ−π相互作用以外にも、イオン基（カルボキシル基
、スルホン酸基、アミノ基など）や極性基（カルボニル
基、アミド基、水酸基、エーテル結合など）によるイオ
ン的相互作用、疎水性相互作用などの相互作用にも影響
を受けると考えられる。

従って、特定の塩基配列をもつ部位は他の配列をもつ部
位に比べ該インターカレーターとの会合体として存在す
る割合が高くなり、両者部位での性質に相違が生ずると
になる。この性質の相違を分離手段としての電気泳動法
や液体クロマトグラフィ法に適用すれば、例えば電気泳
動法においては、その核ｗａｔａｍ体に独自の実効移動
度の変化をもたらし、一方散体クロマトグラフイ法にお
いては、カラム充填剤との相互作用である分配係数など
の変化、例えば疎水性相互作用の変化により、溶出位置
の変化をもたらす。

本発明の核Ｗ１重量体とインターカレーターとの相互作
用の形成のための方法としては、移動相にインターカレ
ーターを添加する、インターカレーターを固定相に固定
化するなどがあげられる。前者の方法では、インターカ
レーターの添加濃度を調整することにより、核酸塩基と
の相互作用の強さを制御でき、簡便な良い方法である。

一方接者の固定化方法としては、例えば物理的吸着、イ
オン的吸着などによる固定相表面の被覆や、イオン結合
、共有結合等による固定相表面への直接導入法などがあ
る。吸着等による方法は、簡単に固定相表面に目的物質
を導入することができ、更に強固な結合を有する化学結
合による導入は、固定相の安定性において有利であり、
又迅速に分析を遂行できる利点を有している。本発明で
はこれらのいずれの方法を用いることができる。

（実施例） 以下、細管式等速電気泳動、及び、高速液体クロマトグ
ラフィに応用した実施例を用い本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

実施例１ 細管式等速電気泳動法において、リーディング溶液には
５ｍｍｏ　Ｉ　／ｄｒｄｍＭ及び７．５ｍｍｏｌ／ｄｍ
イミダゾールを含む５０％メタノール水溶液を、ターミ
ナル溶液には１Ｑｍｍｏ　１／ｄＴｄのＮ−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパン−３
−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）水溶液を用いた。

核酸重量体としてグアニイル−（３−，５−）−シチジ
ン（以下ＧｐＣと略す）、シチジニルー（３−，５Ｍ−
グアノシン（以下ＣｐＧと略す）及びウリジニルー（３
”、５”）−アデノシン（以下ＵｐＡと略す）を、イン
ターカレーターとして、キナクリンを用い、リーディン
グ溶液中のキナクリン濃度を変えて核酸重量体の分離を
行った。結果を表１に示す。

細管式等速電気泳動法において、分析試料の定性指標に
は一般に次式で定義されるＰＵ値が用いられる。すなわ
ち、 ここで、ＰＳｉは試料中の１成分の電位勾配、ＰＬはリ
ーディングイオンの電位勾配、ＰＴはターミナルイオン
の電位勾配である。表１に示すように、キナクリンを添
加しない場合、ＣｐＧ。

ＧｐＣ，ＵｐＡの３種のりボヌクレオシドモノリン酸の
ＰＵ１直は等しい。しかしながら、５ｍｍｏｌ／ｄｍ及
び１０ｍｍｏ　Ｉ　／ｄ　ｒｄキナクリンをリーディン
グ溶液に添加すると３種のＰＬＪ値に差が生じ、１０ｍ
ｍｏ　ｌ　／ｄ　ｒｄのキナクリンを添加した場合、配
列異性体であるＣｐＧとＧｐＣの完全分離が達成された
。

実施例２ 実施例１と同様に、細管式等速電気泳動法において、リ
ーディング溶液中のインターカレーターとして、１．５
−ビス［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］ア
ントラセン−９，１０−ジオンを用いた。結果を表２に
示す。

表２ インターカレーターの濃度増加とともに、ＣｐＧ。

Ｇｌ）Ｃ，ＵｐＡ３ＭＪのリボジヌクレオシドモノリン
酸のＰＵ値の差が増大した。ＰＵｆｒｉの増大の序列は
ＣｐＧ＞ＧｐＣ＞ＵｐＡであった。

実施例３ 高速液体クロマトグラフィにおいて、６，９−ジクロロ
−２−メトキシアクリジンとステアリルアミンの反応に
より合成した２−メトキシ−６−クロロ−９−ステアリ
ルアミノアクリジン（３）をインターカレーターとして
オクタデシル基を結合した充填剤の表面に固定化被覆し
た。このようにして得られた表面被覆充填剤を内径４１
ｍ、長さ１０ｃ１１のステンレスカラムに充填してジヌ
クレオチドの液体クロマトグラフィ分析に用いた。アセ
トニトリルａ度６％、０．０１ｍｏ　Ｉ／ｄｍのリンｉ
１！緩衝液を溶離液に用い、流速０．５ｍｌ／分で通液
しＣｐＧ、ＧｐＣ，ＩＪρＡ及びＡＩＪ（アゾニイル−
（３”、５′）−ウリジン）の４種のりボヌクレオシド
モノリン酸を２７０ｎｍでの紫外部吸収測定により分析
した。この結果を表３に示すが、配列異性体であるＧｐ
ＣとＣｐＧの完全分離が達成された。

（発明の効果） 核酸物質の分離方法である電気泳動法及び液体クロマト
グラフィ法を用い、その移動液中に、又は固定相に核Ｍ
塩基と相互作用を有する化合物を添加、又は固定化する
ことにより、核ｍ塩基配列の異なった核Ｍ１ｍ体を効果
的に分離することができた。以上の説明から明らかなよ
うに僅かな塩基配列の相違を認識した上で、それぞれの
核酸重量体を分離することが可能となる。本発明を利用
することにより、従来の分離方法に比べて配列異性体の
分離が的確に、しかも分析最適条件の決定がよりｒＩＪ
単に遂行できることになる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 電気泳動法又は液体クロマトグラフィにより核酸重量体
   を分離するに際し、核酸塩基間と相互作用を有するアン
   トラセン骨格又はアクリジン骨格を有する化合物を用い
   ることを特徴とする核酸重量体の分離方法。