JPH09196914A - 全血サンプルを使用して血小板を同定および定量し、血小板の活性化状態を測定する高感度で正確かつ精密な自動化方法 - Google Patents
全血サンプルを使用して血小板を同定および定量し、血小板の活性化状態を測定する高感度で正確かつ精密な自動化方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 自動化血液装置を使って、全血サンプル中の
血小板を同定・定量し、血小板の活性化状態を測定する
高感度で正確な方法及びシステムを提供する。 【解決手段】 ａ）散乱角の関数として単位散乱角あた
りの散乱光強度を表す前方光散乱パターンをつくるた
め、集束光源に１度に１個の細胞を通過させて該サンプ
ルを分析する、ただし、上記の光散乱強度は、２つの光
学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔にわたって、該
サンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な
２つの散乱強度測定値をもたらすように増加された第１
および第２の光学チャンネル信号値で測定され、第１光
学チャンネル信号値は高角度検出器のゲイン増加から得
られ、第２の光学チャンネル信号値は低角度検出器のゲ
イン増加から得られる；そしてｂ）該サンプル中の血小
板を非血小板から区別し、体積対屈折率マップ内におけ
る光散乱で得られた血小板信号の存在により血小板パラ
メーターを測定する；ステップを含んでなる自動化方
法。
血小板を同定・定量し、血小板の活性化状態を測定する
高感度で正確な方法及びシステムを提供する。 【解決手段】 ａ）散乱角の関数として単位散乱角あた
りの散乱光強度を表す前方光散乱パターンをつくるた
め、集束光源に１度に１個の細胞を通過させて該サンプ
ルを分析する、ただし、上記の光散乱強度は、２つの光
学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔にわたって、該
サンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な
２つの散乱強度測定値をもたらすように増加された第１
および第２の光学チャンネル信号値で測定され、第１光
学チャンネル信号値は高角度検出器のゲイン増加から得
られ、第２の光学チャンネル信号値は低角度検出器のゲ
イン増加から得られる；そしてｂ）該サンプル中の血小
板を非血小板から区別し、体積対屈折率マップ内におけ
る光散乱で得られた血小板信号の存在により血小板パラ
メーターを測定する；ステップを含んでなる自動化方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、自動血液学システ
ムを使用した血小板の分析および定量の改善された方法
に関する。特に、本発明は、正常および異常の血液サン
プルの両方に使用することができる、数あるパラメータ
ーの中でもとりわけ、血小板の総数、血小板の体積、血
小板の成分濃度または密度および血小板の乾燥質量を、
他の方法と比較してより高い正確度および精密さで測定
するための、高ゲイン(gain)方法に関する。
ムを使用した血小板の分析および定量の改善された方法
に関する。特に、本発明は、正常および異常の血液サン
プルの両方に使用することができる、数あるパラメータ
ーの中でもとりわけ、血小板の総数、血小板の体積、血
小板の成分濃度または密度および血小板の乾燥質量を、
他の方法と比較してより高い正確度および精密さで測定
するための、高ゲイン(gain)方法に関する。
【０００２】
【従来の方法および発明が解決しようとする課題】血小
板総数を測定するために、半および全自動化分析システ
ムが、現在、日常的に使用されているが、現在の自動化
された血小板の測定および定量法は、不正確であり、精
密さおよび再現性に欠けるという問題がなおも存在する
ことが当分野では認められる。これは、血小板減少症
（血小板の数の減少）、血小板増加症などの多数の血液
疾患および血栓障害に苦しむ人または患者から得られる
ような異常血液サンプルの分析において特に明らかであ
る。血小板計数の正確さを管理するうえでの困難および
挑戦に対するいくつかの理由は、１）患者の血小板の総
数および大きさの範囲が大きく変化する；２）血小板の
大きさが小さい；３）分析を受けるサンプルに血小板大
の妨害粒子が存在する；および４） in vitro 加齢時の
血小板の挙動；に起因すると考えられる。
板総数を測定するために、半および全自動化分析システ
ムが、現在、日常的に使用されているが、現在の自動化
された血小板の測定および定量法は、不正確であり、精
密さおよび再現性に欠けるという問題がなおも存在する
ことが当分野では認められる。これは、血小板減少症
（血小板の数の減少）、血小板増加症などの多数の血液
疾患および血栓障害に苦しむ人または患者から得られる
ような異常血液サンプルの分析において特に明らかであ
る。血小板計数の正確さを管理するうえでの困難および
挑戦に対するいくつかの理由は、１）患者の血小板の総
数および大きさの範囲が大きく変化する；２）血小板の
大きさが小さい；３）分析を受けるサンプルに血小板大
の妨害粒子が存在する；および４） in vitro 加齢時の
血小板の挙動；に起因すると考えられる。
【０００３】血小板の分析および定量は、特に、血液サ
ンプル中の血小板数が減少した、または低い、血小板減
少症患者の場合に特に困難であると考えられる。この症
状は、しばしば、血栓傾向の低い癌患者に通常使用され
る処置および治療から生じる。さらに、ある種の免疫疾
患、特に特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自
己免疫疾患に苦しむ人は、しばしば血小板損傷および破
壊を受け、その結果、血小板数が低下する。さらに、再
生不良性貧血に苦しむ人も、血小板数が低下する。例え
ば、正常な範囲の血小板数が約 150,000〜400,000 ／μ
l であるのに比較して、血小板減少症患者のサンプルで
は、血小板数がしばしば 50,000 ／μl未満である（J.C
Dacie および S.M. Lewis, 1984, Practical Haematol
ogy, 6th Edition, Churchill Livingstone, Londo
n）。
ンプル中の血小板数が減少した、または低い、血小板減
少症患者の場合に特に困難であると考えられる。この症
状は、しばしば、血栓傾向の低い癌患者に通常使用され
る処置および治療から生じる。さらに、ある種の免疫疾
患、特に特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自
己免疫疾患に苦しむ人は、しばしば血小板損傷および破
壊を受け、その結果、血小板数が低下する。さらに、再
生不良性貧血に苦しむ人も、血小板数が低下する。例え
ば、正常な範囲の血小板数が約 150,000〜400,000 ／μ
l であるのに比較して、血小板減少症患者のサンプルで
は、血小板数がしばしば 50,000 ／μl未満である（J.C
Dacie および S.M. Lewis, 1984, Practical Haematol
ogy, 6th Edition, Churchill Livingstone, Londo
n）。
【０００４】実際、血小板の正確な計数は、血小板減少
症患者に対して広く利用できる血小板置換療法の出現と
ともに、より一層重要になってきた。さらに、血小板機
能の種々のより精巧な研究（例えば、血小板の活性化お
よび／または接着性の測定）の開発および使用は、研究
室での血液学テストの欠くことのできない部分として、
正確かつ精密な血小板計数を必要とする。また、輸血用
に調製した血小板パックの品質保証は、正確な血小板計
数法が利用できて、適切であることを必要とする（R.K.
Wertzおよび J.A. Koepke, 1977, Am. J. Clin. Pat
h., 68(1):195-201 ）。
症患者に対して広く利用できる血小板置換療法の出現と
ともに、より一層重要になってきた。さらに、血小板機
能の種々のより精巧な研究（例えば、血小板の活性化お
よび／または接着性の測定）の開発および使用は、研究
室での血液学テストの欠くことのできない部分として、
正確かつ精密な血小板計数を必要とする。また、輸血用
に調製した血小板パックの品質保証は、正確な血小板計
数法が利用できて、適切であることを必要とする（R.K.
Wertzおよび J.A. Koepke, 1977, Am. J. Clin. Pat
h., 68(1):195-201 ）。
【０００５】当技術分野において必要とされるのは、正
常および異常の両方の血液サンプルに対する血小板のパ
ラメーターの検出、識別、定量および特性付けのより正
確かつ精密で感度の高い方法である。さらに、全血サン
プルを使用して行うことができる正確かつ精密な血小板
分析法があれば、いくつかの方法で必要とされる、分画
遠心分離または沈降法による血小板に富む血漿の最初の
調製が不要となる。そのような全血血小板分析法は、思
いもよらない血小板の異常性を診断したり、正常な人お
よび障害の発症時および病気の治療または進行中の患者
の血小板総数およびパラメーターをモニターするうえで
有用であると考えられる。さらに、特に血小板数の低い
場合は、信号の分解能および血小板の識別を改善するこ
とができる自動化システムでの使用法が当分野で必要と
される。記載した本発明は、当技術分野にそのような利
点および改善を提供するものである。
常および異常の両方の血液サンプルに対する血小板のパ
ラメーターの検出、識別、定量および特性付けのより正
確かつ精密で感度の高い方法である。さらに、全血サン
プルを使用して行うことができる正確かつ精密な血小板
分析法があれば、いくつかの方法で必要とされる、分画
遠心分離または沈降法による血小板に富む血漿の最初の
調製が不要となる。そのような全血血小板分析法は、思
いもよらない血小板の異常性を診断したり、正常な人お
よび障害の発症時および病気の治療または進行中の患者
の血小板総数およびパラメーターをモニターするうえで
有用であると考えられる。さらに、特に血小板数の低い
場合は、信号の分解能および血小板の識別を改善するこ
とができる自動化システムでの使用法が当分野で必要と
される。記載した本発明は、当技術分野にそのような利
点および改善を提供するものである。
【０００６】現在、二つの完全に自動化された血小板計
数法および大きさの測定法が当分野で知られており、使
用されている。一つは開口インピーダンス法である。水
性懸濁液中の全血血小板を、二つの電極の間にある狭い
開口部を通過するときに検出する。通過により、その開
口部における電気インピーダンスは、懸濁媒体の電気イ
ンピーダンスに対し、血小板の体積に大体比例して増加
する。すなわち、血小板のパルスから血小板の総数およ
び血小板の体積が得られる。血小板は、開口インピーダ
ンス法で、その大きさに基づいて赤血球と区別される。
というのは、グループとしての血小板がグループとして
の赤血球より小さいからである。この方法のいくつかの
適用例において、血小板の数および大きさの測定は、血
小板の大きさの分布形状を数学的に分析することにより
改善される。これらの分布を常用対数曲線に適合させ、
適合させた曲線のパラメーターから血小板の総数および
大きさが得られる。この処理の意図するところは、存在
すると血小板体積の常用対数分布をゆがめる粒子破片お
よび小さい赤血球を排除することであるが、そのような
汚染粒子および細胞がいつも排除されるわけではない。
数法および大きさの測定法が当分野で知られており、使
用されている。一つは開口インピーダンス法である。水
性懸濁液中の全血血小板を、二つの電極の間にある狭い
開口部を通過するときに検出する。通過により、その開
口部における電気インピーダンスは、懸濁媒体の電気イ
ンピーダンスに対し、血小板の体積に大体比例して増加
する。すなわち、血小板のパルスから血小板の総数およ
び血小板の体積が得られる。血小板は、開口インピーダ
ンス法で、その大きさに基づいて赤血球と区別される。
というのは、グループとしての血小板がグループとして
の赤血球より小さいからである。この方法のいくつかの
適用例において、血小板の数および大きさの測定は、血
小板の大きさの分布形状を数学的に分析することにより
改善される。これらの分布を常用対数曲線に適合させ、
適合させた曲線のパラメーターから血小板の総数および
大きさが得られる。この処理の意図するところは、存在
すると血小板体積の常用対数分布をゆがめる粒子破片お
よび小さい赤血球を排除することであるが、そのような
汚染粒子および細胞がいつも排除されるわけではない。
【０００７】第二の完全に自動化された方法は、レーザ
ー光散乱法である。この方法では、水性懸濁液中の全血
血小板を、それらがレーザービームを遮り、こうして入
射光が固有の角度で散乱して、光学検出器が置いてある
行路に入るときに検出する。血小板の体積は散乱強度に
比例すると考えられるので、血小板信号パルスから体積
情報および総数が得られる。そのような光散乱法を行う
ために設計され、使用されている自動フローサイトメト
リー機器の例としては、Ｈ・TMシステム機器（TECHNICO
N Ｈ・TMシステム、例えば、Ｈ・TM１、Ｈ・TM２、Ｈ・
TM３などの商標で、その譲受人により市販されてい
る。）および ORTHO ELT-8（Ortho Diagnostics ）があ
る。
ー光散乱法である。この方法では、水性懸濁液中の全血
血小板を、それらがレーザービームを遮り、こうして入
射光が固有の角度で散乱して、光学検出器が置いてある
行路に入るときに検出する。血小板の体積は散乱強度に
比例すると考えられるので、血小板信号パルスから体積
情報および総数が得られる。そのような光散乱法を行う
ために設計され、使用されている自動フローサイトメト
リー機器の例としては、Ｈ・TMシステム機器（TECHNICO
N Ｈ・TMシステム、例えば、Ｈ・TM１、Ｈ・TM２、Ｈ・
TM３などの商標で、その譲受人により市販されてい
る。）および ORTHO ELT-8（Ortho Diagnostics ）があ
る。
【０００８】ORTHO ELT-8 システムでは、血小板が、一
つの円錐角に対する散乱強度の違いにより単純に赤血球
から区別される。TECHNICON Ｈ・TMシステムでも、血小
板は、一つの円錐角に対する散乱強度に基づいて大きさ
が測定される。しかし、それらは、一対の適切に選択さ
れた検出器に入る固有の散乱強度に基づいて赤血球と区
別される。血小板の散乱強度分布は常用対数的である
が、第二のレーザー光散乱法は、得られたデータを常用
対数曲線を使用して適合させることによって、計数また
は大きさの測定を改善するものではない。この方法で
は、粒子破片が、散乱強度が選択された閾値以下になる
信号を含んでいる。
つの円錐角に対する散乱強度の違いにより単純に赤血球
から区別される。TECHNICON Ｈ・TMシステムでも、血小
板は、一つの円錐角に対する散乱強度に基づいて大きさ
が測定される。しかし、それらは、一対の適切に選択さ
れた検出器に入る固有の散乱強度に基づいて赤血球と区
別される。血小板の散乱強度分布は常用対数的である
が、第二のレーザー光散乱法は、得られたデータを常用
対数曲線を使用して適合させることによって、計数また
は大きさの測定を改善するものではない。この方法で
は、粒子破片が、散乱強度が選択された閾値以下になる
信号を含んでいる。
【０００９】上述したように、開口インピーダンス法
は、血小板を、粒子の大きさおよび血小板の大きさの常
用対数分布に基づいて赤血球および粒子破片から区別す
るものである。血小板と他の粒子の大きさが重複する場
合、これらの区別は不鮮明となり、その方法で最善を尽
くすことは、精々、この不十分さを認識することであ
る。さらに、光散乱法は、二次元の境界に基づいて血小
板を赤血球から区別するものであり、赤血球が小さくな
るとき、または分解してばらばらになる場合には交差す
る可能性がある。すなわち、この場合も、異なる細胞集
団間の区別が不鮮明になる。
は、血小板を、粒子の大きさおよび血小板の大きさの常
用対数分布に基づいて赤血球および粒子破片から区別す
るものである。血小板と他の粒子の大きさが重複する場
合、これらの区別は不鮮明となり、その方法で最善を尽
くすことは、精々、この不十分さを認識することであ
る。さらに、光散乱法は、二次元の境界に基づいて血小
板を赤血球から区別するものであり、赤血球が小さくな
るとき、または分解してばらばらになる場合には交差す
る可能性がある。すなわち、この場合も、異なる細胞集
団間の区別が不鮮明になる。
【００１０】血小板を識別するための第三の半自動化法
は、レーザー光散乱と蛍光とを組み合わせて血小板を赤
血球および粒子破片から区別することを含む。水性懸濁
液中の全血血小板を、血小板に特異的な抗体（ＣＤ４２
Ａなど）で標識する。抗体は次いで、フルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識試薬に結
合される。標識した血小板は、入射光を散乱し、Becton
Dickinson FACScan (Becton Dickinson) などの蛍光フ
ローサイトメーターを通過するときに蛍光を発する。血
小板および血小板大の粒子は、二次元散乱パターン（前
方散乱および横散乱）に基づいて赤血球と区別される。
これらの「門をくぐった(gated) 」細胞は、さらに、蛍
光強度に基づいて分類され、血小板のみが著しい蛍光を
示す（W.Groner ら、1994, Blood, No. 10 Supplement,
687a; R. Dickerhofおよび A.von Ruecker, 1995, Cli
n. Lab. Hematol., 17:163-172）。
は、レーザー光散乱と蛍光とを組み合わせて血小板を赤
血球および粒子破片から区別することを含む。水性懸濁
液中の全血血小板を、血小板に特異的な抗体（ＣＤ４２
Ａなど）で標識する。抗体は次いで、フルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識試薬に結
合される。標識した血小板は、入射光を散乱し、Becton
Dickinson FACScan (Becton Dickinson) などの蛍光フ
ローサイトメーターを通過するときに蛍光を発する。血
小板および血小板大の粒子は、二次元散乱パターン（前
方散乱および横散乱）に基づいて赤血球と区別される。
これらの「門をくぐった(gated) 」細胞は、さらに、蛍
光強度に基づいて分類され、血小板のみが著しい蛍光を
示す（W.Groner ら、1994, Blood, No. 10 Supplement,
687a; R. Dickerhofおよび A.von Ruecker, 1995, Cli
n. Lab. Hematol., 17:163-172）。
【００１１】上記した最後二つの方法は、血小板を他の
血液細胞型および破片と区別することができるが、血小
板の絶対総数を与えるものではない。さらに、それらの
方法は、血小板の大きさを測定するものではない。なぜ
ならば、それらの方法をキャリブレートする簡単な方法
およびこの目的でその方法を行う装置がないからであ
る。さらに、標識技術は、多くの労力を必要とし、比較
的高価である。
血液細胞型および破片と区別することができるが、血小
板の絶対総数を与えるものではない。さらに、それらの
方法は、血小板の大きさを測定するものではない。なぜ
ならば、それらの方法をキャリブレートする簡単な方法
およびこの目的でその方法を行う装置がないからであ
る。さらに、標識技術は、多くの労力を必要とし、比較
的高価である。
【００１２】血液サンプル中の血小板を区別し、定量す
ることの他に、血小板の活性化（または活性化状態）を
測定するための、簡単でコストが低く、正確かつ再現性
のある方法が必要である。血小板の活性化状態は、下記
に述べるように、血小板機能の重要なパラメーターであ
る。
ることの他に、血小板の活性化（または活性化状態）を
測定するための、簡単でコストが低く、正確かつ再現性
のある方法が必要である。血小板の活性化状態は、下記
に述べるように、血小板機能の重要なパラメーターであ
る。
【００１３】活性化した血小板は、うっ血および血栓に
おいて欠くことのできない役割を果たすので、血小板の
活性化は、血小板の基本的な機能特性である。血管の損
傷が生じると、損傷部位の内皮下表面が露出され、その
結果、活性化した血小板が内皮下表面に付着する。この
後、血小板顆粒の放出、血小板の凝集および血栓の生成
が続く。血栓は、フィブリン、血小板凝集体および赤血
球で構成される。
おいて欠くことのできない役割を果たすので、血小板の
活性化は、血小板の基本的な機能特性である。血管の損
傷が生じると、損傷部位の内皮下表面が露出され、その
結果、活性化した血小板が内皮下表面に付着する。この
後、血小板顆粒の放出、血小板の凝集および血栓の生成
が続く。血栓は、フィブリン、血小板凝集体および赤血
球で構成される。
【００１４】活性化した血小板は、付着過程に関連する
表面糖タンパク質を発現する点で、静止血小板と異な
る。また、活性化した血小板は、顆粒成分を放出し、円
盤状から球状への形状変化および凝集などの過程を経
る。膨潤も形状変化に伴う。血栓症は、血管の損傷に対
する正常な応答の一部である。しかし、末梢血管疾患
（D.V. Devine ら、1993, Arteriosclerosis and Throm
bosis, 13:857-62）、心臓虚血（D. McTavish ら、199
0, Drugs, 40:238; G. DiMinno ら、1985, J. Clin. In
vest., 75:328）、糖尿病（D. Tschoepe ら、1991, Sem
inars in Thrombosis and Hemostasis, 17:433-438 ）
および狭心症（R.C. Becker ら、1994, Coronary Arter
y Dis., 5:339 ）などの症状では、負の作用により、血
栓活性の増加も生じる。また、血液バンクの血小板の濃
縮物は保存中に活性化され、その結果、その効力の一部
を失うことが知られている（H.M. Rinder および E.L.
Snyder, 1992, Blood Cells, 18:445 ）。さらに、血液
透析および血液の体外循環を含む外科的処置は、血小板
の活性化を生じることが知られている（例えば、J.C.Re
verter ら、1994, J. Lab. Clin. Med., 124:79; Y.T.
Wachtfogel ら、1993, J. Thoracic and Cardiovascula
r Surg.,106:1-10; R.E. Scharfら、1992, Arterioscle
rosis and Thrombosis, 12:1475-1487)。従って、血小
板の活性化状態を ex vivoで確認し、モニターすること
ができれば、本発明によってもたらされる有益で有用な
スクリーニング法が得られる。
表面糖タンパク質を発現する点で、静止血小板と異な
る。また、活性化した血小板は、顆粒成分を放出し、円
盤状から球状への形状変化および凝集などの過程を経
る。膨潤も形状変化に伴う。血栓症は、血管の損傷に対
する正常な応答の一部である。しかし、末梢血管疾患
（D.V. Devine ら、1993, Arteriosclerosis and Throm
bosis, 13:857-62）、心臓虚血（D. McTavish ら、199
0, Drugs, 40:238; G. DiMinno ら、1985, J. Clin. In
vest., 75:328）、糖尿病（D. Tschoepe ら、1991, Sem
inars in Thrombosis and Hemostasis, 17:433-438 ）
および狭心症（R.C. Becker ら、1994, Coronary Arter
y Dis., 5:339 ）などの症状では、負の作用により、血
栓活性の増加も生じる。また、血液バンクの血小板の濃
縮物は保存中に活性化され、その結果、その効力の一部
を失うことが知られている（H.M. Rinder および E.L.
Snyder, 1992, Blood Cells, 18:445 ）。さらに、血液
透析および血液の体外循環を含む外科的処置は、血小板
の活性化を生じることが知られている（例えば、J.C.Re
verter ら、1994, J. Lab. Clin. Med., 124:79; Y.T.
Wachtfogel ら、1993, J. Thoracic and Cardiovascula
r Surg.,106:1-10; R.E. Scharfら、1992, Arterioscle
rosis and Thrombosis, 12:1475-1487)。従って、血小
板の活性化状態を ex vivoで確認し、モニターすること
ができれば、本発明によってもたらされる有益で有用な
スクリーニング法が得られる。
【００１５】血小板の活性化は、蛍光フローサイトメト
リーを使用して研究されている（例えば、S.J. Shattil
ら、1987, Blood, 70:307; C.S. Abramsら、1990, Bloo
d, 75:128; L. Corash, 1990, Blood Cells, 16:97-10
8）。蛍光法を使用すると、血小板が、糖タンパク質に
特異的な蛍光結合抗体で標識され、糖タンパク質は、血
小板活性化の結果として血小板表面上に発現され、また
コンホメーション的に変化する。フローサイトメーター
で計数される蛍光陽性事象の数は、活性化した血小板の
数を表し、事象あたりの蛍光強度は、一つの細胞表面に
対する標識部位の数を表す。この方法は特異的であり、
感度が高いが、いくつかの点では不利でもある。すなわ
ち、高価であり、サンプルの調製に時間がかかり、デー
タの分析が自動化されていない。さらに、蛍光陽性閾値
を設定するための標準的方法は何も確立されていない。
これは、一部には閾値位置の不確定性のためであり、一
部には実験的設計の相違性のためである。
リーを使用して研究されている（例えば、S.J. Shattil
ら、1987, Blood, 70:307; C.S. Abramsら、1990, Bloo
d, 75:128; L. Corash, 1990, Blood Cells, 16:97-10
8）。蛍光法を使用すると、血小板が、糖タンパク質に
特異的な蛍光結合抗体で標識され、糖タンパク質は、血
小板活性化の結果として血小板表面上に発現され、また
コンホメーション的に変化する。フローサイトメーター
で計数される蛍光陽性事象の数は、活性化した血小板の
数を表し、事象あたりの蛍光強度は、一つの細胞表面に
対する標識部位の数を表す。この方法は特異的であり、
感度が高いが、いくつかの点では不利でもある。すなわ
ち、高価であり、サンプルの調製に時間がかかり、デー
タの分析が自動化されていない。さらに、蛍光陽性閾値
を設定するための標準的方法は何も確立されていない。
これは、一部には閾値位置の不確定性のためであり、一
部には実験的設計の相違性のためである。
【００１６】血小板の活性化は、密度勾配分析によって
も研究されている（B. van Oost ら、1983, Blood, 62:
433-38）。血小板の密度は、それらが活性化されると低
下する。それは、第一に膨潤のためであり、第二に、血
小板細胞質より密度が高いα−および高密度−顆粒の放
出のためである（S. Holmeら、1981, J. Lab. Clin.Me
d., 97:610-22; S. Holme ら、1988, J.Lab. Clin.Me
d., 112:223-231)。その結果、活性化した血小板サンプ
ルは、密度勾配分離において、非活性化サンプルの場合
よりも低密度血小板の割合が高い。密度勾配分離法は時
間を要し、熟練した技術者を必要とする。さらに、密度
勾配画分の各々における血小板の数を測定するために、
細胞計数器が必要である。
も研究されている（B. van Oost ら、1983, Blood, 62:
433-38）。血小板の密度は、それらが活性化されると低
下する。それは、第一に膨潤のためであり、第二に、血
小板細胞質より密度が高いα−および高密度−顆粒の放
出のためである（S. Holmeら、1981, J. Lab. Clin.Me
d., 97:610-22; S. Holme ら、1988, J.Lab. Clin.Me
d., 112:223-231)。その結果、活性化した血小板サンプ
ルは、密度勾配分離において、非活性化サンプルの場合
よりも低密度血小板の割合が高い。密度勾配分離法は時
間を要し、熟練した技術者を必要とする。さらに、密度
勾配画分の各々における血小板の数を測定するために、
細胞計数器が必要である。
【００１７】従って、血小板の活性化を測定するため
の、新規で、安価かつ感度の高い吸収光散乱法を提供す
る本発明は、当技術分野に進歩と利益を提供するもので
ある。血小板の活性化を測定する本発明方法は自動化さ
れ、従って臨床用途に対して効率的であり、時間の節約
になる。
の、新規で、安価かつ感度の高い吸収光散乱法を提供す
る本発明は、当技術分野に進歩と利益を提供するもので
ある。血小板の活性化を測定する本発明方法は自動化さ
れ、従って臨床用途に対して効率的であり、時間の節約
になる。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、全血サンプル
における血小板の定量および分析のための、感度が高
く、正確かつ精密な方法を提供し、特に、血小板の数お
よび／または識別に悪影響を及ぼす、血液状態が異常な
人の血液サンプルの分析に有用である。本発明はまた、
血小板の識別および分析のための、迅速で簡単かつ安価
な方法、システムおよび装置を提供する。
における血小板の定量および分析のための、感度が高
く、正確かつ精密な方法を提供し、特に、血小板の数お
よび／または識別に悪影響を及ぼす、血液状態が異常な
人の血液サンプルの分析に有用である。本発明はまた、
血小板の識別および分析のための、迅速で簡単かつ安価
な方法、システムおよび装置を提供する。
【００１９】本発明の目的は、血小板の総数、大きさ、
成分濃度および乾燥質量などの血小板データを集めるた
めの自動血液学システムを使用した、血小板分析の改善
された方法を提供することである。本発明の別の目的
は、より多くの血小板分析データを提供し、血液サンプ
ルの血小板以外のものを血小板と区別するための蛍光強
度、散乱強度および開口インピーダンスを使用する方法
よりも安価かつ容易に結果を与える、血小板計数精度に
対する高ゲインまたは高増幅方法および装置を提供する
ことである。
成分濃度および乾燥質量などの血小板データを集めるた
めの自動血液学システムを使用した、血小板分析の改善
された方法を提供することである。本発明の別の目的
は、より多くの血小板分析データを提供し、血液サンプ
ルの血小板以外のものを血小板と区別するための蛍光強
度、散乱強度および開口インピーダンスを使用する方法
よりも安価かつ容易に結果を与える、血小板計数精度に
対する高ゲインまたは高増幅方法および装置を提供する
ことである。
【００２０】本発明のさらに別の目的は、血小板の総数
が約 1,000から約 50,000 個／μlである血液サンプル
に対して、高感度で正確な血小板の計数、信号分解およ
び識別法を提供することである。特に、本発明は、血小
板減少症サンプルに対する改善された血小板計数精度を
提供する。
が約 1,000から約 50,000 個／μlである血液サンプル
に対して、高感度で正確な血小板の計数、信号分解およ
び識別法を提供することである。特に、本発明は、血小
板減少症サンプルに対する改善された血小板計数精度を
提供する。
【００２１】本発明のさらに別の目的は、血小板大の領
域における粒子型分布の輪郭が十分に描かれた詳細な描
写を提供するサイトグラム（細胞所見）結果を得ること
である。
域における粒子型分布の輪郭が十分に描かれた詳細な描
写を提供するサイトグラム（細胞所見）結果を得ること
である。
【００２２】本発明の別の目的は、血小板の計数および
分析の改善された方法を行うために、少なくとも二つの
チャンネルを付加することによる、現在の自動血液分析
器を改変および改善するための手段を提供することであ
る。その改変または改善は、本発明の方法および装置の
性能を達成するために、現在のシステムに Mie散乱理論
をベースとした信号分析をプラスしたものに、低散乱角
／高ゲイン増幅チャンネルおよび高散乱角／高ゲイン増
幅チャンネルを付加するものである。
分析の改善された方法を行うために、少なくとも二つの
チャンネルを付加することによる、現在の自動血液分析
器を改変および改善するための手段を提供することであ
る。その改変または改善は、本発明の方法および装置の
性能を達成するために、現在のシステムに Mie散乱理論
をベースとした信号分析をプラスしたものに、低散乱角
／高ゲイン増幅チャンネルおよび高散乱角／高ゲイン増
幅チャンネルを付加するものである。
【００２３】本発明の別の目的は、小赤血球および赤血
球断片の同定および定量を可能とすることである。
球断片の同定および定量を可能とすることである。
【００２４】本発明のさらに別の発明は、血小板成分濃
度（ＭＰＣ）の測定による血小板の活性化度の測定を提
供することである。本発明によれば、ＭＰＣ値は、血小
板の活性化状態と関連する。
度（ＭＰＣ）の測定による血小板の活性化度の測定を提
供することである。本発明によれば、ＭＰＣ値は、血小
板の活性化状態と関連する。
【００２５】本発明のさらに別の目的は、血小板の活性
化性を予示する血小板の乾燥質量の測定を提供すること
である。
化性を予示する血小板の乾燥質量の測定を提供すること
である。
【００２６】本発明の別の目的は、in vitro血液サンプ
ル年齢の測定を可能にする血小板成分濃度の測定を提供
することである。
ル年齢の測定を可能にする血小板成分濃度の測定を提供
することである。
【００２７】さらに別の目的および本発明によって得ら
れる利点は、以下の詳細な記載から明らかである。
れる利点は、以下の詳細な記載から明らかである。
【００２８】
【図面の説明】添付する図面は、本発明をさらに説明
し、種々の発明を明らかにすることによりその理解を助
けるものである。下記に記載する散乱／散乱サイトグラ
ムは、本発明による自動血液分析器の電気−光検出シス
テムを使用する血小板の測定および分析に本発明の装置
および方法を使用して得られたものである。下記に示す
図において、ＲＢＣは赤血球数（106 ／μl ）であり、
ＰＬＴは血小板数（103 ／μl ）であり、ＭＰＶは平均
血小板体積（10-15l (fl) ）であり、ＭＰ＋ＣはＭＰＣ
に等しく、平均血小板成分濃度（g/dl）であり、ＭＰ＋
ＭはＭＰＭに等しく、平均血小板乾燥質量（pg) であ
る。
し、種々の発明を明らかにすることによりその理解を助
けるものである。下記に記載する散乱／散乱サイトグラ
ムは、本発明による自動血液分析器の電気−光検出シス
テムを使用する血小板の測定および分析に本発明の装置
および方法を使用して得られたものである。下記に示す
図において、ＲＢＣは赤血球数（106 ／μl ）であり、
ＰＬＴは血小板数（103 ／μl ）であり、ＭＰＶは平均
血小板体積（10-15l (fl) ）であり、ＭＰ＋ＣはＭＰＣ
に等しく、平均血小板成分濃度（g/dl）であり、ＭＰ＋
ＭはＭＰＭに等しく、平均血小板乾燥質量（pg) であ
る。
【００２９】図１は、散乱／散乱サイトグラム上での血
小板体積（Ｖ）対屈折率（ｎ）（すなわち、Ｖ／ｎ）の
マップを示す。サイトグラムに示す各曲線は、分析で測
定され、図３の記載で確認される特定の粒子型を表す。
小板体積（Ｖ）対屈折率（ｎ）（すなわち、Ｖ／ｎ）の
マップを示す。サイトグラムに示す各曲線は、分析で測
定され、図３の記載で確認される特定の粒子型を表す。
【００３０】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、各々、ｎ−ペ
ンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプタンの油滴の散乱
／散乱サイトグラムを示す。サイトグラムに示す各曲線
は、分析で測定され、図３の記載で確認される特定の粒
子型を表す。
ンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプタンの油滴の散乱
／散乱サイトグラムを示す。サイトグラムに示す各曲線
は、分析で測定され、図３の記載で確認される特定の粒
子型を表す。
【００３１】図３は、種々の粒子、すなわち、赤血球、
大きい血小板、赤血球ゴースト、血小板、赤血球断片、
および原点の破片の、粒子型マッピング散乱／散乱サイ
トグラムにおける位置を示す。この記載は、図４、５、
６、８および１３に示すサイトグラムにも適用される。
大きい血小板、赤血球ゴースト、血小板、赤血球断片、
および原点の破片の、粒子型マッピング散乱／散乱サイ
トグラムにおける位置を示す。この記載は、図４、５、
６、８および１３に示すサイトグラムにも適用される。
【００３２】図４は、本発明の血小板測定法およびシス
テムを使用した正常なサンプル結果を示す代表的サイト
グラムおよびヒストグラムを示す。
テムを使用した正常なサンプル結果を示す代表的サイト
グラムおよびヒストグラムを示す。
【００３３】図５Ａは、赤血球希釈剤（例えば、TECHNI
CON RBC 希釈剤）に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液
サンプルにおける血小板の分析から得られた代表的サイ
トグラムを示す。図５Ｂは、等張性リン酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ）に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルに
おける血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを
示す。なお、サンプルは、たとえ室温で保存していなか
ったとしても、室温で分析される。
CON RBC 希釈剤）に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液
サンプルにおける血小板の分析から得られた代表的サイ
トグラムを示す。図５Ｂは、等張性リン酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ）に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルに
おける血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを
示す。なお、サンプルは、たとえ室温で保存していなか
ったとしても、室温で分析される。
【００３４】図６Ａは、赤血球希釈剤（例えば、TECHNI
CON RBC 希釈剤）に懸濁したＡＣＤ−抗凝固血液サンプ
ルの分析から得られた代表的サイトグラムを示す。図６
Ｂは、等張性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁したＡＣ
Ｄ−抗凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイ
トグラムを示す。
CON RBC 希釈剤）に懸濁したＡＣＤ−抗凝固血液サンプ
ルの分析から得られた代表的サイトグラムを示す。図６
Ｂは、等張性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁したＡＣ
Ｄ−抗凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイ
トグラムを示す。
【００３５】図７Ａは、正常な血液ドナーサンプルの平
均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）対時間を示す代表的グラフ
である。ＭＰＭは、室温で保存した 24 時間齢の正常な
サンプル対１時間齢の正常なサンプルに対して測定し
た。図７Ｂは、異常な血液ドナーサンプルの平均血小板
乾燥質量対時間の代表的グラフを示す。ＭＰＭは、室温
で保存した 28 時間齢の異常なサンプル対４時間齢の異
常なサンプルに対して測定した。
均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）対時間を示す代表的グラフ
である。ＭＰＭは、室温で保存した 24 時間齢の正常な
サンプル対１時間齢の正常なサンプルに対して測定し
た。図７Ｂは、異常な血液ドナーサンプルの平均血小板
乾燥質量対時間の代表的グラフを示す。ＭＰＭは、室温
で保存した 28 時間齢の異常なサンプル対４時間齢の異
常なサンプルに対して測定した。
【００３６】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、いくつかの自
動化法、すなわち本発明のＰＬＴＩシステム（図８
Ａ）、TECHNICON Ｈ・TM２システム（図８Ｂ）および C
oulter STKS システム（図８Ｃ）によって得た異常サン
プルの血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。
動化法、すなわち本発明のＰＬＴＩシステム（図８
Ａ）、TECHNICON Ｈ・TM２システム（図８Ｂ）および C
oulter STKS システム（図８Ｃ）によって得た異常サン
プルの血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。
【００３７】図９Ａ〜９Ｄは、TECHNICON Ｈ・TM２シス
テムまたは Coulter STKS システムを使用して得た平均
血小板体積（ＭＰＶ）対異常血小板（ＰＣＴ）数の測定
（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。図９Ａは、４時間
齢の異常血液サンプルを使用してTECHNICON Ｈ・TM２シ
ステムから得た結果を示す。図９Ａでは、ｒ＝0.59、Sy
x ＝0.88（ｒは相関係数であり、Syx 推定値の標準誤差
である）、勾配＝0.14、および切片＝4.5 である。図９
Ｂは、 28 時間齢の異常な血液サンプルを使用してTECH
NICON Ｈ・TM２システムから得た結果を示す。図９Ｂで
は、ｒ＝0.72、Syx ＝0.54、勾配＝0.13、および切片＝
3.29である。図９Ｃは、４時間齢の異常な血液サンプル
を使用して Coulter STKS システムから得た結果を示
す。図９Ｃでは、ｒ＝0.13、Syx ＝0.95、勾配＝0.02、
および切片＝8.06である。図９Ｄは、 28 時間齢の異常
な血液サンプルを使用して Coulter STKS システムから
得た結果を示す。図９Ｄでは、ｒ＝0.66、Syx ＝1.09、
勾配＝0.18、および切片＝6.31である。
テムまたは Coulter STKS システムを使用して得た平均
血小板体積（ＭＰＶ）対異常血小板（ＰＣＴ）数の測定
（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。図９Ａは、４時間
齢の異常血液サンプルを使用してTECHNICON Ｈ・TM２シ
ステムから得た結果を示す。図９Ａでは、ｒ＝0.59、Sy
x ＝0.88（ｒは相関係数であり、Syx 推定値の標準誤差
である）、勾配＝0.14、および切片＝4.5 である。図９
Ｂは、 28 時間齢の異常な血液サンプルを使用してTECH
NICON Ｈ・TM２システムから得た結果を示す。図９Ｂで
は、ｒ＝0.72、Syx ＝0.54、勾配＝0.13、および切片＝
3.29である。図９Ｃは、４時間齢の異常な血液サンプル
を使用して Coulter STKS システムから得た結果を示
す。図９Ｃでは、ｒ＝0.13、Syx ＝0.95、勾配＝0.02、
および切片＝8.06である。図９Ｄは、 28 時間齢の異常
な血液サンプルを使用して Coulter STKS システムから
得た結果を示す。図９Ｄでは、ｒ＝0.66、Syx ＝1.09、
勾配＝0.18、および切片＝6.31である。
【００３８】図１０Ａおよび１０Ｂは、本発明の新規な
ＰＬＴ１システムおよび方法を使用して得た異常な血小
板減少症の血液サンプルに対する平均血小板体積（ＭＰ
Ｖ）対血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,000／
μl ）を示す。図１０Ａは、４時間齢の異常な血液サン
プルを使用してＰＬＴ１システムから得た結果を示す。
図１０Ａでは、ｒ＝0.32、Syx ＝0.89、勾配＝0.06、お
よび切片＝10.02 である。図１０Ｂは、 28 時間齢の異
常な血液サンプルを使用してＰＬＴ１システムから得た
結果を示す。図１０Ｂでは、ｒ＝0.32、Syx ＝1 、勾配
＝0.07、および切片＝11.79 である。
ＰＬＴ１システムおよび方法を使用して得た異常な血小
板減少症の血液サンプルに対する平均血小板体積（ＭＰ
Ｖ）対血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,000／
μl ）を示す。図１０Ａは、４時間齢の異常な血液サン
プルを使用してＰＬＴ１システムから得た結果を示す。
図１０Ａでは、ｒ＝0.32、Syx ＝0.89、勾配＝0.06、お
よび切片＝10.02 である。図１０Ｂは、 28 時間齢の異
常な血液サンプルを使用してＰＬＴ１システムから得た
結果を示す。図１０Ｂでは、ｒ＝0.32、Syx ＝1 、勾配
＝0.07、および切片＝11.79 である。
【００３９】図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、種々の
自動化法、すなわち、TECHNICON Ｈ・TM２システム、 C
oulter STKS システムおよび本発明のＰＬＴ１システム
を使用して得た、異常な血液サンプルに対して行った平
均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）総数の測定
を示す。図１１Ａは、１時間齢の正常な血液サンプルを
使用してTECHNICON Ｈ・TM２システムから得た結果を示
す。図１１Ｂは、１時間齢の正常な血液サンプルを使用
して Coulter STKS システムから得た結果を示す。図１
１Ｃは、１時間齢の正常な血液サンプルを使用して本発
明のＰＬＴ１システムから得た結果を示す。
自動化法、すなわち、TECHNICON Ｈ・TM２システム、 C
oulter STKS システムおよび本発明のＰＬＴ１システム
を使用して得た、異常な血液サンプルに対して行った平
均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）総数の測定
を示す。図１１Ａは、１時間齢の正常な血液サンプルを
使用してTECHNICON Ｈ・TM２システムから得た結果を示
す。図１１Ｂは、１時間齢の正常な血液サンプルを使用
して Coulter STKS システムから得た結果を示す。図１
１Ｃは、１時間齢の正常な血液サンプルを使用して本発
明のＰＬＴ１システムから得た結果を示す。
【００４０】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＰＬＴ１の方法
およびシステムを使用した異常なサンプルに対する平均
血小板乾燥質量（ＭＰＭ）および平均血小板成分濃度
（ＭＰＣ）の精度データを示す。図１２Ａは、室温で保
存し、分析した、 28 時間齢の異常なサンプル対４時間
齢の異常なサンプルに対するＭＰＭの精度データを示
す。図１２Ａでは、ｒ＝0.75、Syx ＝0.13、勾配＝0.7
4、切片＝0.49、４時間齢のサンプルの平均値＝2.04、
および 28 時間齢のサンプルの平均値＝1.99である。図
１２Ｂは、室温での 28 時間齢の異常なサンプル対４時
間齢の異常なサンプルに対するＭＰＣの精度データを示
す。図１２Ｂでは、ｒ＝0.35、Syx ＝1.3 、勾配＝0.3
、切片＝12、４時間齢のサンプルの平均値＝22.1、お
よび 28 時間齢のサンプルの平均値＝18.7である。
およびシステムを使用した異常なサンプルに対する平均
血小板乾燥質量（ＭＰＭ）および平均血小板成分濃度
（ＭＰＣ）の精度データを示す。図１２Ａは、室温で保
存し、分析した、 28 時間齢の異常なサンプル対４時間
齢の異常なサンプルに対するＭＰＭの精度データを示
す。図１２Ａでは、ｒ＝0.75、Syx ＝0.13、勾配＝0.7
4、切片＝0.49、４時間齢のサンプルの平均値＝2.04、
および 28 時間齢のサンプルの平均値＝1.99である。図
１２Ｂは、室温での 28 時間齢の異常なサンプル対４時
間齢の異常なサンプルに対するＭＰＣの精度データを示
す。図１２Ｂでは、ｒ＝0.35、Syx ＝1.3 、勾配＝0.3
、切片＝12、４時間齢のサンプルの平均値＝22.1、お
よび 28 時間齢のサンプルの平均値＝18.7である。
【００４１】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、異常な
血小板減少症サンプル＃70に対して表８で示した結果に
対応する血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。図
１３Ａは、本発明のＰＬＴ１分析法を使用して得たヒス
トグラム結果を示し、図１３Ｂは、TECHNICON Ｈ・TM２
システムによる分析を使用して得たヒストグラム結果を
示し、図１３Ｃは、 Coulter STKS システムによる分析
法を使用して得たヒストグラム結果を示す。
血小板減少症サンプル＃70に対して表８で示した結果に
対応する血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。図
１３Ａは、本発明のＰＬＴ１分析法を使用して得たヒス
トグラム結果を示し、図１３Ｂは、TECHNICON Ｈ・TM２
システムによる分析を使用して得たヒストグラム結果を
示し、図１３Ｃは、 Coulter STKS システムによる分析
法を使用して得たヒストグラム結果を示す。
【００４２】図１４Ａ〜１４Ｄは、本発明による新規な
光散乱法と血小板の活性化を測定するための蛍光法を比
較して示す。図１４Ａ〜Ｄは、本発明の新規な光散乱法
（図１４Ｃおよび１４Ｄ）および蛍光法（図１４Ａおよ
び１４Ｂ）が、クエン酸ナトリウム処理した血液サンプ
ルおよびＥＤＴＡ処理した血液サンプルの両方に対して
同様のトロンビン用量−血小板活性化の関係を記録する
ことを示す。本発明方法の用量反応曲線は、ＭＰＣ増加
による標準様式（図１４Ｃ）およびＭＰＣ減少による
「逆の(upside down) 」様式で示す。逆および標準の様
式による曲線は共に同じ結果を示すが、前者の方向は、
二つの方法の結果を目でより直接的に比較することがで
きる（すなわち、図１４Ｂは、図１４Ｄと直接比較する
ことができる）。
光散乱法と血小板の活性化を測定するための蛍光法を比
較して示す。図１４Ａ〜Ｄは、本発明の新規な光散乱法
（図１４Ｃおよび１４Ｄ）および蛍光法（図１４Ａおよ
び１４Ｂ）が、クエン酸ナトリウム処理した血液サンプ
ルおよびＥＤＴＡ処理した血液サンプルの両方に対して
同様のトロンビン用量−血小板活性化の関係を記録する
ことを示す。本発明方法の用量反応曲線は、ＭＰＣ増加
による標準様式（図１４Ｃ）およびＭＰＣ減少による
「逆の(upside down) 」様式で示す。逆および標準の様
式による曲線は共に同じ結果を示すが、前者の方向は、
二つの方法の結果を目でより直接的に比較することがで
きる（すなわち、図１４Ｂは、図１４Ｄと直接比較する
ことができる）。
【００４３】
【作用】本発明は、自動血液分析システムで使用するた
めの、血小板を定量し、特性付けする、感度および精度
の高い方法を提供する。本発明はさらに、記載した血小
板の定量および特性付けを行うための装置を提供する。
本明細書で用いる場合、血小板をしばしば「ＰＬＴ」と
略称する。本明細書でしばしば使用する他の略号は次の
通りである。すなわち、ＲＢＣは赤血球であり、ＭＰＭ
は平均血小板乾燥質量であり、ＭＰＶは平均血小板体積
であり、ＭＰＣは平均血小板成分濃度であり、ＴＣＰは
血小板減少症であり、ＴＣＰＳは血小板減少症患者から
得た異常な血液サンプルに使用する名称であり、ＭＣＶ
は平均細胞体積であり、ＭＣＨＣは平均細胞ヘモグロビ
ン濃度であり、ＨＣＴはヘマトクリットである。
めの、血小板を定量し、特性付けする、感度および精度
の高い方法を提供する。本発明はさらに、記載した血小
板の定量および特性付けを行うための装置を提供する。
本明細書で用いる場合、血小板をしばしば「ＰＬＴ」と
略称する。本明細書でしばしば使用する他の略号は次の
通りである。すなわち、ＲＢＣは赤血球であり、ＭＰＭ
は平均血小板乾燥質量であり、ＭＰＶは平均血小板体積
であり、ＭＰＣは平均血小板成分濃度であり、ＴＣＰは
血小板減少症であり、ＴＣＰＳは血小板減少症患者から
得た異常な血液サンプルに使用する名称であり、ＭＣＶ
は平均細胞体積であり、ＭＣＨＣは平均細胞ヘモグロビ
ン濃度であり、ＨＣＴはヘマトクリットである。
【００４４】本発明に使用するのに適する現在ある自動
血液分析システムとしては、その譲受人によりTECHNICO
N Ｈ・TM１、Ｈ・TM２、Ｈ・TM３などの商標で市販され
ているＨ・TMシステムがある。そのようなシステムで
は、血小板（または粒子）の検出は、光散乱を測定する
ことにより電子光学的に、また電気インピーダンスを測
定することにより電気的に行われる。当業者に対して、
本発明を得るために該システムに成される変更を明確に
記載するために、TECHNICON Ｈ・TM自動分析システムの
操作原理を赤血球および血小板分析に関してここに記載
する。これらのシステムでは、赤血球および血小板を、
ヘリウム−ネオンレーザー光源、フローセルおよび二つ
の光学検出器を含む単一の光学測定チャンネルで一緒に
分析する。その通常の操作法の一部として、自動システ
ムでは、２μl の全血を、本明細書で説明する Mie散乱
理論を使用して適切に分析することができるように、赤
血球を等容的に丸くする試薬溶液であるTECHNICON Ｈ・
TMシステムＲＢＣ希釈剤 1.25 mlに懸濁する。本発明の
血小板分析法およびシステムに使用するのに適する赤血
球を丸くする試薬および希釈剤は、米国特許 No. 5,28
4,771、5,360,739 および 5,411,891（以上、S.S. Fan
ら）；米国特許 No. 5,350,695および 5,438,003（以
上、G. Colellaら）；ならびに米国特許 No. 4,575,490
および 4,412,004（以上、Kim および Ornstein ）に記
載されている。
血液分析システムとしては、その譲受人によりTECHNICO
N Ｈ・TM１、Ｈ・TM２、Ｈ・TM３などの商標で市販され
ているＨ・TMシステムがある。そのようなシステムで
は、血小板（または粒子）の検出は、光散乱を測定する
ことにより電子光学的に、また電気インピーダンスを測
定することにより電気的に行われる。当業者に対して、
本発明を得るために該システムに成される変更を明確に
記載するために、TECHNICON Ｈ・TM自動分析システムの
操作原理を赤血球および血小板分析に関してここに記載
する。これらのシステムでは、赤血球および血小板を、
ヘリウム−ネオンレーザー光源、フローセルおよび二つ
の光学検出器を含む単一の光学測定チャンネルで一緒に
分析する。その通常の操作法の一部として、自動システ
ムでは、２μl の全血を、本明細書で説明する Mie散乱
理論を使用して適切に分析することができるように、赤
血球を等容的に丸くする試薬溶液であるTECHNICON Ｈ・
TMシステムＲＢＣ希釈剤 1.25 mlに懸濁する。本発明の
血小板分析法およびシステムに使用するのに適する赤血
球を丸くする試薬および希釈剤は、米国特許 No. 5,28
4,771、5,360,739 および 5,411,891（以上、S.S. Fan
ら）；米国特許 No. 5,350,695および 5,438,003（以
上、G. Colellaら）；ならびに米国特許 No. 4,575,490
および 4,412,004（以上、Kim および Ornstein ）に記
載されている。
【００４５】次いで、この懸濁物の約 10 μl の流れ
を、屈折率の適合する試薬流体、すなわちTECHNICON Ｈ
・TMシステムＲＢＣ／Basophil界面活性剤シースで覆
う。ＲＢＣ／Basophilシースは、血球と直接相互作用し
ない「受身(passive) 」試薬であるが、その代わりに、
その流れを取り囲み、フローセルの中心に置く。また、
分析のための単一粒子の列を提供する。例えば、ＲＢＣ
／Basophil界面活性剤シース試薬組成物は、無機塩、例
えば、塩化ナトリウム 7.7 g/l、リン酸ナトリウム二塩
基性 2.4 g/l、リン酸ナトリウム一塩基性 0.3 g/lな
ど；ポリエトキシレート非イオン性非溶血性界面活性剤
Pluronic P-105 1.0 g/l ；３，３’−チオジプロピオ
ン酸 0.10 g/l などの酸化防止剤；および Proclin 150
（ 0.40 g/l ）などの抗菌性試薬を含み、ｐＨは約 7.0
〜7.5 であり、容量オスモル濃度は約 285〜305 mOsmol
/kg である。
を、屈折率の適合する試薬流体、すなわちTECHNICON Ｈ
・TMシステムＲＢＣ／Basophil界面活性剤シースで覆
う。ＲＢＣ／Basophilシースは、血球と直接相互作用し
ない「受身(passive) 」試薬であるが、その代わりに、
その流れを取り囲み、フローセルの中心に置く。また、
分析のための単一粒子の列を提供する。例えば、ＲＢＣ
／Basophil界面活性剤シース試薬組成物は、無機塩、例
えば、塩化ナトリウム 7.7 g/l、リン酸ナトリウム二塩
基性 2.4 g/l、リン酸ナトリウム一塩基性 0.3 g/lな
ど；ポリエトキシレート非イオン性非溶血性界面活性剤
Pluronic P-105 1.0 g/l ；３，３’−チオジプロピオ
ン酸 0.10 g/l などの酸化防止剤；および Proclin 150
（ 0.40 g/l ）などの抗菌性試薬を含み、ｐＨは約 7.0
〜7.5 であり、容量オスモル濃度は約 285〜305 mOsmol
/kg である。
【００４６】懸濁物中の赤血球および血小板は、覆われ
た細胞流がフローセルを通過するとき、入射レーザー光
の一部を散乱する。二つの検出器は、入射軸に対して特
定の角度間隔で散乱した光を感知する。検出器の信号
は、正常なサンプルの場合、赤血球によって生じる平均
信号が、赤血球に関連した信号振幅の範囲の中央になる
ように増幅される。本発明によれば、光散乱強度が、二
つの光学チャンネルで二つの円錐角間隔にわたって、サ
ンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な２
つの散乱強度測定値を得るために、増加された第一およ
び第二の光学チャンネル信号ゲイン(gain)で測定され
る。第一の光学チャンネル信号値は、高角度検出器のゲ
インの増加から得られ、第二の光学チャンネル信号値
は、低角度検出器のゲインの増加から得られ、それによ
って、低角度出力および高角度出力の新規な高ゲイン型
が得られる。また、本発明によれば、そのシステムによ
り、約 5〜20度、より好ましくは 7〜15度、最も好まし
くは 5〜15度の散乱度による信号が散乱／散乱サイトグ
ラムのＸ−軸に示される。さらに、そのシステムによ
り、約 1〜7 度、より好ましくは 1〜5 度、最も好まし
くは 2〜3 度の散乱度による信号が散乱／散乱サイトグ
ラムのＹ−軸に示される。これらの信号を使用すると、
本明細書にさらに記載するように、赤血球の体積および
ヘモグロビン濃度などのパラメーターが測定される。
た細胞流がフローセルを通過するとき、入射レーザー光
の一部を散乱する。二つの検出器は、入射軸に対して特
定の角度間隔で散乱した光を感知する。検出器の信号
は、正常なサンプルの場合、赤血球によって生じる平均
信号が、赤血球に関連した信号振幅の範囲の中央になる
ように増幅される。本発明によれば、光散乱強度が、二
つの光学チャンネルで二つの円錐角間隔にわたって、サ
ンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な２
つの散乱強度測定値を得るために、増加された第一およ
び第二の光学チャンネル信号ゲイン(gain)で測定され
る。第一の光学チャンネル信号値は、高角度検出器のゲ
インの増加から得られ、第二の光学チャンネル信号値
は、低角度検出器のゲインの増加から得られ、それによ
って、低角度出力および高角度出力の新規な高ゲイン型
が得られる。また、本発明によれば、そのシステムによ
り、約 5〜20度、より好ましくは 7〜15度、最も好まし
くは 5〜15度の散乱度による信号が散乱／散乱サイトグ
ラムのＸ−軸に示される。さらに、そのシステムによ
り、約 1〜7 度、より好ましくは 1〜5 度、最も好まし
くは 2〜3 度の散乱度による信号が散乱／散乱サイトグ
ラムのＹ−軸に示される。これらの信号を使用すると、
本明細書にさらに記載するように、赤血球の体積および
ヘモグロビン濃度などのパラメーターが測定される。
【００４７】赤血球は、通常、両凹の平円盤状であり、
その散乱特性は、上記光学システムのフローセルを横切
るときの方向に敏感である。信号強度に対する粒子方向
の影響を取り除くために、赤血球は、TECHNICON Ｈ・TM
システムＲＢＣ希釈剤（例えば、米国特許 No.4,575,49
0 および 4,412,004（Kim および Ornstein ））にいれ
て球状にする。さらに、球状化した粒子（球状化した赤
血球など）に対して角散乱強度プロフィルを提供する M
ie散乱理論により、散乱強度は屈折率および細胞体積に
敏感であることが予示される。すなわち、体積は同じで
あるが、屈折率の異なる二つの粒子は、散乱プロフィル
が異なる。赤血球の屈折率は、細胞ごとに変わる細胞の
ヘモグロビン濃度に直線的に依存するので（R. Barerお
よび S.Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microsco
pical Science, 95:399-423）、一つの円錐角間隔にわ
たる散乱強度の測定は、たとえ球状の赤血球であって
も、細胞体積を唯一決定するものではない。従って、赤
血球の体積を唯一決定するために、散乱強度を、少なく
とも二つの離れた円錐角間隔にわたって測定する必要が
ある。細胞ヘモグロビン濃度は、二つの角度による測定
の副次的結果として求められる。
その散乱特性は、上記光学システムのフローセルを横切
るときの方向に敏感である。信号強度に対する粒子方向
の影響を取り除くために、赤血球は、TECHNICON Ｈ・TM
システムＲＢＣ希釈剤（例えば、米国特許 No.4,575,49
0 および 4,412,004（Kim および Ornstein ））にいれ
て球状にする。さらに、球状化した粒子（球状化した赤
血球など）に対して角散乱強度プロフィルを提供する M
ie散乱理論により、散乱強度は屈折率および細胞体積に
敏感であることが予示される。すなわち、体積は同じで
あるが、屈折率の異なる二つの粒子は、散乱プロフィル
が異なる。赤血球の屈折率は、細胞ごとに変わる細胞の
ヘモグロビン濃度に直線的に依存するので（R. Barerお
よび S.Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microsco
pical Science, 95:399-423）、一つの円錐角間隔にわ
たる散乱強度の測定は、たとえ球状の赤血球であって
も、細胞体積を唯一決定するものではない。従って、赤
血球の体積を唯一決定するために、散乱強度を、少なく
とも二つの離れた円錐角間隔にわたって測定する必要が
ある。細胞ヘモグロビン濃度は、二つの角度による測定
の副次的結果として求められる。
【００４８】Mie 理論を使用するアルゴリズムにより、
一定の体積および屈折率を有する粒子に関連する角散乱
パターンが得られる。問題の赤血球の大きさおよび濃度
の範囲（すなわち、各々、約 30 〜 180 fl および約 1
9 〜 49 g/dl）にわたって、１） 2〜3 度および 5〜15
度の一対の散乱強度と、２）赤血球の体積および濃度と
の間に１対１の対応が存在することが決定された（米国
特許 No.4,735,504 (Tycko) ）。TECHNICON Ｈ・TMシス
テムの場合、その組の対応が二次元マトリックスの形で
表される。マトリックスの指数は、Ｘ−およびＹ−チャ
ンネル信号値を含み、マトリックスのエントリーが関連
する体積および濃度である。球状粒子に対する電磁気散
乱理論（すなわち、Mie 理論）は、例えば、M. Kerker,
1969, The Scattering of Light, Academic Pressに詳
細に記載されている。
一定の体積および屈折率を有する粒子に関連する角散乱
パターンが得られる。問題の赤血球の大きさおよび濃度
の範囲（すなわち、各々、約 30 〜 180 fl および約 1
9 〜 49 g/dl）にわたって、１） 2〜3 度および 5〜15
度の一対の散乱強度と、２）赤血球の体積および濃度と
の間に１対１の対応が存在することが決定された（米国
特許 No.4,735,504 (Tycko) ）。TECHNICON Ｈ・TMシス
テムの場合、その組の対応が二次元マトリックスの形で
表される。マトリックスの指数は、Ｘ−およびＹ−チャ
ンネル信号値を含み、マトリックスのエントリーが関連
する体積および濃度である。球状粒子に対する電磁気散
乱理論（すなわち、Mie 理論）は、例えば、M. Kerker,
1969, The Scattering of Light, Academic Pressに詳
細に記載されている。
【００４９】そのシステムでは、Mie の表に自動的に当
てはめる前に、予め定めた信号閾値を越える全粒子を血
液細胞として計数する。その際、上記の二つの円錐角に
よる測定値を使用して、赤血球または血小板のいずれか
に指定する。二種類の粒子は、体積／屈折率空間の別個
の領域を占め、赤血球の方がかなり大きく、またはかな
り高い屈折率を有する。しかし、これらのシステムで現
在使用されている信号ゲインは、血小板と非血小板（赤
血球ゴースト、赤血球断片および細胞破片など）との区
別がはっきりしない。さらに、大きさの違いを利用して
血小板を他の粒子と区別する現在の開口インピーダンス
法は、体積が血小板の体積と似ている赤血球断片または
破片と血小板とを十分区別するものではない。
てはめる前に、予め定めた信号閾値を越える全粒子を血
液細胞として計数する。その際、上記の二つの円錐角に
よる測定値を使用して、赤血球または血小板のいずれか
に指定する。二種類の粒子は、体積／屈折率空間の別個
の領域を占め、赤血球の方がかなり大きく、またはかな
り高い屈折率を有する。しかし、これらのシステムで現
在使用されている信号ゲインは、血小板と非血小板（赤
血球ゴースト、赤血球断片および細胞破片など）との区
別がはっきりしない。さらに、大きさの違いを利用して
血小板を他の粒子と区別する現在の開口インピーダンス
法は、体積が血小板の体積と似ている赤血球断片または
破片と血小板とを十分区別するものではない。
【００５０】これに対して、現在の電子光学装置は、一
つの角間隔測定値を利用して血小板の体積を測定するも
のである。現在のＨ・TMシステムでは、血小板の体積
は、 5〜15度の散乱強度に比例すると考えられる。実
際、本明細書に記載するように、この強度は、血小板膨
潤により in vitro サンプル年齢とともに減少する（実
施例１参照）。その結果、報告される平均血小板体積
は、真の平均血小板体積の増加とともに減少する。ま
た、単一角による方法は、実際は同じ体積であるが、密
度（すなわち、屈折率）は異なる粒子に対して種々の体
積を報告する可能性がある。さらに、電子光学装置およ
び開口インピーダンス装置は共に、血小板減少症サンプ
ルのＭＰＶ値を低く報告する場合が多い。なぜならば、
これらの異常サンプルでは、典型的には、低信号の破片
が全粒子数のかなりの部分を含むからである。
つの角間隔測定値を利用して血小板の体積を測定するも
のである。現在のＨ・TMシステムでは、血小板の体積
は、 5〜15度の散乱強度に比例すると考えられる。実
際、本明細書に記載するように、この強度は、血小板膨
潤により in vitro サンプル年齢とともに減少する（実
施例１参照）。その結果、報告される平均血小板体積
は、真の平均血小板体積の増加とともに減少する。ま
た、単一角による方法は、実際は同じ体積であるが、密
度（すなわち、屈折率）は異なる粒子に対して種々の体
積を報告する可能性がある。さらに、電子光学装置およ
び開口インピーダンス装置は共に、血小板減少症サンプ
ルのＭＰＶ値を低く報告する場合が多い。なぜならば、
これらの異常サンプルでは、典型的には、低信号の破片
が全粒子数のかなりの部分を含むからである。
【００５１】本発明者らは、例えばTECHNICON Ｈ・TM分
析システムなどの自動分析システムにおいて行うため
の、より高感度で正確かつ精密な血小板分析を達成する
ための努力の一部として、TECHNICON Ｈ・TM１を使用す
るテストステーションを採用し、本発明に記載した方法
およびシステム（Ｘ−およびＹ−赤血球光学チャンネル
信号増幅の増加（信号ゲインの増幅）を含む）を使用し
て血小板データを集めるために、本明細書に記載するよ
うに適合させた。
析システムなどの自動分析システムにおいて行うため
の、より高感度で正確かつ精密な血小板分析を達成する
ための努力の一部として、TECHNICON Ｈ・TM１を使用す
るテストステーションを採用し、本発明に記載した方法
およびシステム（Ｘ−およびＹ−赤血球光学チャンネル
信号増幅の増加（信号ゲインの増幅）を含む）を使用し
て血小板データを集めるために、本明細書に記載するよ
うに適合させた。
【００５２】血小板を識別する本発明の分析を行うため
の新しく適合させた自動システムを、本明細書では、本
発明のＰＬＴ１システムおよび方法と呼ぶ。血小板を正
確に分析するために、Mie 散乱理論を使用して、本明細
書に記載した適切な増幅増加要因を見いだした。最初
に、Mie 解析のために体積および屈折率範囲を選択し
た。選択した体積範囲は、約 1〜60 fl （fl＝10
-15l）、好ましくは 1〜30 fl であった。この範囲は、
正常な全てのサンプルおよびほとんどの異常なサンプル
の血小板の大きさをカバーするように選択した（J. M.
Paulus, 1975, Blood, 46(3):321-336）。選択した屈折
率の範囲は、約 1.340〜1.400 、好ましくは 1.350〜1.
400 であった。下限は、血小板の屈折率がその血漿媒体
よりも高い（そうでないと、目に見えない）という観察
に基づいており、血漿の屈折率は、典型的には約 1.345
より大きい（屈折率測定法により測定）。上限は、ほと
んどの血小板が、赤血球より密度が小さい（すなわち、
屈折率がより低い）という観察に基づいている。赤血球
の屈折率は、1.390 より下がることはめったにない（細
胞ヘモグロビン濃度は 23 g/dl）。上限は、好ましく
は、いくつかの赤血球と密度が同じ位である血小板の小
さい断片を説明するために、約 1.400に広げた。これら
の体積および屈折率の範囲ならびに Mie理論に基づき、
本発明に従って、標準的なＨ・TMシステムのＸ−チャン
ネル信号を約 8〜15倍、好ましくは約 12 倍に増加また
は増幅し、Ｙ−信号は、約 20 〜 35 倍、好ましくは約
30 倍に増加または増幅した。
の新しく適合させた自動システムを、本明細書では、本
発明のＰＬＴ１システムおよび方法と呼ぶ。血小板を正
確に分析するために、Mie 散乱理論を使用して、本明細
書に記載した適切な増幅増加要因を見いだした。最初
に、Mie 解析のために体積および屈折率範囲を選択し
た。選択した体積範囲は、約 1〜60 fl （fl＝10
-15l）、好ましくは 1〜30 fl であった。この範囲は、
正常な全てのサンプルおよびほとんどの異常なサンプル
の血小板の大きさをカバーするように選択した（J. M.
Paulus, 1975, Blood, 46(3):321-336）。選択した屈折
率の範囲は、約 1.340〜1.400 、好ましくは 1.350〜1.
400 であった。下限は、血小板の屈折率がその血漿媒体
よりも高い（そうでないと、目に見えない）という観察
に基づいており、血漿の屈折率は、典型的には約 1.345
より大きい（屈折率測定法により測定）。上限は、ほと
んどの血小板が、赤血球より密度が小さい（すなわち、
屈折率がより低い）という観察に基づいている。赤血球
の屈折率は、1.390 より下がることはめったにない（細
胞ヘモグロビン濃度は 23 g/dl）。上限は、好ましく
は、いくつかの赤血球と密度が同じ位である血小板の小
さい断片を説明するために、約 1.400に広げた。これら
の体積および屈折率の範囲ならびに Mie理論に基づき、
本発明に従って、標準的なＨ・TMシステムのＸ−チャン
ネル信号を約 8〜15倍、好ましくは約 12 倍に増加また
は増幅し、Ｙ−信号は、約 20 〜 35 倍、好ましくは約
30 倍に増加または増幅した。
【００５３】これらの信号ゲイン増幅では、細胞破片、
赤血球断片および赤血球ゴーストなどの妨害物質から血
小板を区別するのに、例えば 2〜3 度および例えば 5〜
15度の光散乱強度で十分であった。また、赤血球もその
方法ではっきり見分けられた。なぜならば、それらの信
号が飽和チャンネルＸ＝99、Ｙ＝99で現れたからであ
る。従って、本発明に対して記載された組合せ散乱測定
により、現在の自動化方法よりも正確な血小板数が得ら
れ、特に、典型的には妨害物質の断片が増加する血小板
減少症サンプルの場合はそうである。さらに、本発明に
より得られる散乱／散乱サイトグラムにより、サンプル
に含まれる血小板の数、平均の大きさおよび平均の屈折
率の視覚評価が可能である。サイトグラムにより、サン
プルに存在する可能性がある他の血小板大の粒子の数お
よび種類の視覚評価も得られる。
赤血球断片および赤血球ゴーストなどの妨害物質から血
小板を区別するのに、例えば 2〜3 度および例えば 5〜
15度の光散乱強度で十分であった。また、赤血球もその
方法ではっきり見分けられた。なぜならば、それらの信
号が飽和チャンネルＸ＝99、Ｙ＝99で現れたからであ
る。従って、本発明に対して記載された組合せ散乱測定
により、現在の自動化方法よりも正確な血小板数が得ら
れ、特に、典型的には妨害物質の断片が増加する血小板
減少症サンプルの場合はそうである。さらに、本発明に
より得られる散乱／散乱サイトグラムにより、サンプル
に含まれる血小板の数、平均の大きさおよび平均の屈折
率の視覚評価が可能である。サイトグラムにより、サン
プルに存在する可能性がある他の血小板大の粒子の数お
よび種類の視覚評価も得られる。
【００５４】さらに、本発明の別の発明では、本発明独
自のものである二角散乱測定により、顆粒を放出した血
小板（すなわち、活性化した血小板）を、放出していな
いものと区別することができる。というのは、活性形の
血小板の屈折率は、非活性形のものより低いからであ
る。この区別は、現在の自動装置では行われない。
自のものである二角散乱測定により、顆粒を放出した血
小板（すなわち、活性化した血小板）を、放出していな
いものと区別することができる。というのは、活性形の
血小板の屈折率は、非活性形のものより低いからであ
る。この区別は、現在の自動装置では行われない。
【００５５】さらに、本発明の血小板測定システムは、
高増幅により、血小板に対して Mie理論分析を行うこと
ができ、それにより、経験的観察よりも理論に基づく体
積および屈折率の情報が得られる。ＰＲＬ１テストステ
ーションシステムでは、本発明により測定される５個の
パラメーターが、赤血球数（ＲＢＣ数、106/μl ）、血
小板数（ＰＬＴ数、103/μl ）、平均血小板体積（ＭＰ
Ｖ、fl）、平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ、pg）および平
均血小板成分濃度または密度（ＭＰＣ、g/dl）であっ
た。
高増幅により、血小板に対して Mie理論分析を行うこと
ができ、それにより、経験的観察よりも理論に基づく体
積および屈折率の情報が得られる。ＰＲＬ１テストステ
ーションシステムでは、本発明により測定される５個の
パラメーターが、赤血球数（ＲＢＣ数、106/μl ）、血
小板数（ＰＬＴ数、103/μl ）、平均血小板体積（ＭＰ
Ｖ、fl）、平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ、pg）および平
均血小板成分濃度または密度（ＭＰＣ、g/dl）であっ
た。
【００５６】理解されるように、本明細書に記載した自
動テストシステムで血小板を測定し、テストするための
方法が新しく発見される以前は、ＭＰＭおよびＭＰＣの
分析用測定パラメーターは、従来公知で使用されていた
自動血小板分析・測定方法およびシステムでは得られな
かった。すなわち、本発明の方法およびシステムによ
り、血小板数、平均血小板体積、平均血小板乾燥質量お
よび平均血小板成分濃度など、サンプルの正確で完全な
血小板分析が得られる。さらに、本発明は、下記にさら
に記載するように、完全な血小板分析を与えると同時
に、サンプルの赤血球数も提供する。
動テストシステムで血小板を測定し、テストするための
方法が新しく発見される以前は、ＭＰＭおよびＭＰＣの
分析用測定パラメーターは、従来公知で使用されていた
自動血小板分析・測定方法およびシステムでは得られな
かった。すなわち、本発明の方法およびシステムによ
り、血小板数、平均血小板体積、平均血小板乾燥質量お
よび平均血小板成分濃度など、サンプルの正確で完全な
血小板分析が得られる。さらに、本発明は、下記にさら
に記載するように、完全な血小板分析を与えると同時
に、サンプルの赤血球数も提供する。
【００５７】本発明の高増幅法を、血小板の計数および
測定の正確さ、感度、ならびに定性的および定量的再現
性に関して、他の方法と比較した。比較しうる他の方法
としては、散乱強度法（例えば、TECHNICON Ｈ・TM２シ
ステム、Bayer Corporation,Tarrytown, NY）、開口イ
ンピーダンス法（例えば、Coutler STKS Modelシステ
ム、Coulte Electronics, Dade, Fla ）、位相差顕微鏡
法、および組織学的血液塗抹評価があった。
測定の正確さ、感度、ならびに定性的および定量的再現
性に関して、他の方法と比較した。比較しうる他の方法
としては、散乱強度法（例えば、TECHNICON Ｈ・TM２シ
ステム、Bayer Corporation,Tarrytown, NY）、開口イ
ンピーダンス法（例えば、Coutler STKS Modelシステ
ム、Coulte Electronics, Dade, Fla ）、位相差顕微鏡
法、および組織学的血液塗抹評価があった。
【００５８】ＰＬＴ１の高増幅システム 本発明の一態様によれば、本発明の血小板を区別・定量
する方法およびシステムは、新しく決定された高増幅法
を使用する。本発明に対して独自に開発された測定を、
改良したTECHNICON Ｈ・TM１システムにおいて行った。
これは、血小板に関するパラメーターを独自に測定およ
び定量することができ、現在の自動システムおよび装置
と区別されるので、ＰＬＴ１モデルまたは模範システム
／方法と名付けた。赤血球分析に対しては、ＰＬＴ１シ
ステムのＸ−チャンネル信号を公称値の約 12 倍に増幅
し、Ｙ−チャンネル信号を約 30 倍に増幅した。
する方法およびシステムは、新しく決定された高増幅法
を使用する。本発明に対して独自に開発された測定を、
改良したTECHNICON Ｈ・TM１システムにおいて行った。
これは、血小板に関するパラメーターを独自に測定およ
び定量することができ、現在の自動システムおよび装置
と区別されるので、ＰＬＴ１モデルまたは模範システム
／方法と名付けた。赤血球分析に対しては、ＰＬＴ１シ
ステムのＸ−チャンネル信号を公称値の約 12 倍に増幅
し、Ｙ−チャンネル信号を約 30 倍に増幅した。
【００５９】すなわち、上述したように、本発明によ
り、約 1〜30 fl の球および約 1.350〜1.400 の屈折率
に対して Mie散乱理論表を作成した。その表は、赤血球
分析に対して使用したものと同じ様式である。その表に
対応する体積／屈折率（Ｖ／ｎ）マップを図１に示す。
Ｘ−およびＹ−チャンネルゲインを、ｎ−ペンタン（ｎ
＝1.3577）、ｎ−ヘキサン（ｎ＝1.3776）およびｎ−ヘ
プタン（ｎ＝1.3884）の小滴懸濁物を使用して標準化し
た。各炭化水素 50 mlを 1 ml のＲＢＣ／Basoシース試
薬とともに 10 秒間撹拌し、サンプルを直接、サイトメ
トリーにより分析した。すなわち、サンプルをさらに希
釈することなくフローセルに通した。３種類の炭化水素
の各々に対する表から誘導される一定の屈折率の曲線を
含む体積／屈折率マップを、小滴によって形成される実
際の曲線とともに記録スクリーンに示した。各炭化水素
の実際の曲線が表から誘導される関連曲線と重なるまで
信号ゲインを調節し、必要であればサンプルを再分析し
た。得られたパターンの例を図２に示す。すなわち、本
発明によれば、血小板は、体積／屈折率マップ内での存
在により、非血小板から特定して区別され、血小板の屈
折率の特徴的なガウス分布に基づいてさらに区別され
る。
り、約 1〜30 fl の球および約 1.350〜1.400 の屈折率
に対して Mie散乱理論表を作成した。その表は、赤血球
分析に対して使用したものと同じ様式である。その表に
対応する体積／屈折率（Ｖ／ｎ）マップを図１に示す。
Ｘ−およびＹ−チャンネルゲインを、ｎ−ペンタン（ｎ
＝1.3577）、ｎ−ヘキサン（ｎ＝1.3776）およびｎ−ヘ
プタン（ｎ＝1.3884）の小滴懸濁物を使用して標準化し
た。各炭化水素 50 mlを 1 ml のＲＢＣ／Basoシース試
薬とともに 10 秒間撹拌し、サンプルを直接、サイトメ
トリーにより分析した。すなわち、サンプルをさらに希
釈することなくフローセルに通した。３種類の炭化水素
の各々に対する表から誘導される一定の屈折率の曲線を
含む体積／屈折率マップを、小滴によって形成される実
際の曲線とともに記録スクリーンに示した。各炭化水素
の実際の曲線が表から誘導される関連曲線と重なるまで
信号ゲインを調節し、必要であればサンプルを再分析し
た。得られたパターンの例を図２に示す。すなわち、本
発明によれば、血小板は、体積／屈折率マップ内での存
在により、非血小板から特定して区別され、血小板の屈
折率の特徴的なガウス分布に基づいてさらに区別され
る。
【００６０】ＰＬＴ１法によって行うことができるＲＢ
Ｃ計数は、Ｈ・TMシステムと同様に、製造元の説明書に
従ってTECHNICON キャリブレーターにより検定した。希
釈に関与するＲＢＣ計数のキャリブレーション係数は、
血小板の計数にも適用した（例えば、Ｈ・TMシステムと
同様に）。サンプル中の血小板および赤血球が同じ希釈
率に付されるからである。しかし、本発明によれば、比
較しうる自動方法とは対照的に、独立した血小板計数キ
ャリブレーション係数はＰＬＴ１システムおよび方法に
は適用されなかった。従って、ＰＬＴ１と他の方法との
血小板計数の相違が、比較のための人為的なキャリブレ
ーション係数によりおおい隠されることはない。
Ｃ計数は、Ｈ・TMシステムと同様に、製造元の説明書に
従ってTECHNICON キャリブレーターにより検定した。希
釈に関与するＲＢＣ計数のキャリブレーション係数は、
血小板の計数にも適用した（例えば、Ｈ・TMシステムと
同様に）。サンプル中の血小板および赤血球が同じ希釈
率に付されるからである。しかし、本発明によれば、比
較しうる自動方法とは対照的に、独立した血小板計数キ
ャリブレーション係数はＰＬＴ１システムおよび方法に
は適用されなかった。従って、ＰＬＴ１と他の方法との
血小板計数の相違が、比較のための人為的なキャリブレ
ーション係数によりおおい隠されることはない。
【００６１】ＰＬＴ１システムは、ＲＢＣ／ＰＬＴチャ
ンネルの水力学、気体力学、化学、反応時間および計数
時間を使用して全血サンプルを処理するために設計され
ている。また、血小板チャンネル信号は、ＲＢＣ／ＰＬ
Ｔチャンネルで使用されるものと同じ二つの光学検出器
から得られる。しかし、上述したように血小板を測定・
定量するために得られた高められた信号ゲイン増幅は、
ＰＬＴ１システム独自のものであり、現在当分野で使用
されているシステムおよび方法の一部ではない。以下に
記載し、例示するように、そのシステムに対して得られ
た信号が分析される。
ンネルの水力学、気体力学、化学、反応時間および計数
時間を使用して全血サンプルを処理するために設計され
ている。また、血小板チャンネル信号は、ＲＢＣ／ＰＬ
Ｔチャンネルで使用されるものと同じ二つの光学検出器
から得られる。しかし、上述したように血小板を測定・
定量するために得られた高められた信号ゲイン増幅は、
ＰＬＴ１システム独自のものであり、現在当分野で使用
されているシステムおよび方法の一部ではない。以下に
記載し、例示するように、そのシステムに対して得られ
た信号が分析される。
【００６２】信号は、 １）Ｖ／ｎマップの外にある場
合（これらは「その他」を表す）；２）検出器を飽和さ
せる場合（Ｘ＝99、Ｙ＝99）（これらはＰＢＣを表
す）；または ３）Ｘ＜80、Ｙ＝99のチャンネルにある
場合（これらは「その他」を表す）、非血小板（すなわ
ち、ＲＢＣまたは「その他」）であることを表す。マッ
プ上と原点付近のマップの左側の信号は、細胞破片を表
す。チャンネルＸ＜80、Ｙ＝99にあるものを含むより大
きい信号は、赤血球ゴーストを表す。飽和信号は、ＲＢ
Ｃおよび非常に大きい血小板によるものである。マップ
の下部および右側の信号もＲＢＣ断片によるものである
（図３参照）。
合（これらは「その他」を表す）；２）検出器を飽和さ
せる場合（Ｘ＝99、Ｙ＝99）（これらはＰＢＣを表
す）；または ３）Ｘ＜80、Ｙ＝99のチャンネルにある
場合（これらは「その他」を表す）、非血小板（すなわ
ち、ＲＢＣまたは「その他」）であることを表す。マッ
プ上と原点付近のマップの左側の信号は、細胞破片を表
す。チャンネルＸ＜80、Ｙ＝99にあるものを含むより大
きい信号は、赤血球ゴーストを表す。飽和信号は、ＲＢ
Ｃおよび非常に大きい血小板によるものである。マップ
の下部および右側の信号もＲＢＣ断片によるものである
（図３参照）。
【００６３】マップの残りの信号は、次のように分析さ
れる。最初に、このシステムでは、Ｘ＝18以上のチャン
ネルの信号の平均屈折率および標準偏差（ＳＤ）を、Mi
e 変換表を使用して計算する。破片が混入する可能性が
あるので、この部分の分析からＶ／ｎマップ上のＸ＝18
以下のチャンネルの信号を排除する。次いで、屈折率の
値が平均の約＋2 〜−1.8 ＳＤである粒子信号を血小板
として指定する。粒子信号の残りは「その他」として指
定する。これにより３種類の粒子、すなわちＰＬＴ
（Ｐ）、ＲＢＣ（Ｒ）および「その他」（Ｏ）の計数が
得られる。このシステムによって検出された粒子の数
（Ｖsig と言う）は、分析した粒子数より大きい。従っ
て、Ｐ、ＲおよびＯは、各々の種類の実際の生の計数値
というより各種類の粒子の相対数を表す。生の計数を得
るためには、このシステムでは下記の変換を行う。
れる。最初に、このシステムでは、Ｘ＝18以上のチャン
ネルの信号の平均屈折率および標準偏差（ＳＤ）を、Mi
e 変換表を使用して計算する。破片が混入する可能性が
あるので、この部分の分析からＶ／ｎマップ上のＸ＝18
以下のチャンネルの信号を排除する。次いで、屈折率の
値が平均の約＋2 〜−1.8 ＳＤである粒子信号を血小板
として指定する。粒子信号の残りは「その他」として指
定する。これにより３種類の粒子、すなわちＰＬＴ
（Ｐ）、ＲＢＣ（Ｒ）および「その他」（Ｏ）の計数が
得られる。このシステムによって検出された粒子の数
（Ｖsig と言う）は、分析した粒子数より大きい。従っ
て、Ｐ、ＲおよびＯは、各々の種類の実際の生の計数値
というより各種類の粒子の相対数を表す。生の計数を得
るためには、このシステムでは下記の変換を行う。
【００６４】
【式１】
【００６５】Ｎr＝(Ｒ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×Ｖsig；ＮP＝
(Ｐ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×Ｖsig；Ｎo＝(Ｏ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×
Ｖsig； ［式中、Ｎr は生の赤血球計数値であり、ＮP は生の血
小板計数値であり、Ｎoは生の「その他」の計数値であ
り、Ｖsig は検出した粒子の総数である。］次いで、生
の計数値を「コインシデンス」、すなわち、検出器が一
つの粒子として計数する、検出器チャンネルにおける２
個以上の粒子の同時存在、に対して補正する。「その
他」は、コインシデンスに関してはＰＬＴとして挙動す
ると考えられるので、コインシデンス補正計算ではそれ
らとともに分類する。コインシデンス頻度は、当業者で
あれば理解されるように、ポアソンの統計学によって正
確に予測される。補正された生のＲＢＣ、ＰＬＴおよび
「その他」の計数値は、ＲＢＣ’、ＰＬＴ’および「そ
の他」’と呼ぶ。最後に、ＲＢＣキャリブレーション係
数をＲＢＣ’、ＰＬＴ’および「その他」’に適用し
て、次の値：ＲＢＣ（106/μl ）、ＰＬＴ（103/μl ）
および「その他」（103/μl ）を得る。
(Ｐ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×Ｖsig；Ｎo＝(Ｏ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×
Ｖsig； ［式中、Ｎr は生の赤血球計数値であり、ＮP は生の血
小板計数値であり、Ｎoは生の「その他」の計数値であ
り、Ｖsig は検出した粒子の総数である。］次いで、生
の計数値を「コインシデンス」、すなわち、検出器が一
つの粒子として計数する、検出器チャンネルにおける２
個以上の粒子の同時存在、に対して補正する。「その
他」は、コインシデンスに関してはＰＬＴとして挙動す
ると考えられるので、コインシデンス補正計算ではそれ
らとともに分類する。コインシデンス頻度は、当業者で
あれば理解されるように、ポアソンの統計学によって正
確に予測される。補正された生のＲＢＣ、ＰＬＴおよび
「その他」の計数値は、ＲＢＣ’、ＰＬＴ’および「そ
の他」’と呼ぶ。最後に、ＲＢＣキャリブレーション係
数をＲＢＣ’、ＰＬＴ’および「その他」’に適用し
て、次の値：ＲＢＣ（106/μl ）、ＰＬＴ（103/μl ）
および「その他」（103/μl ）を得る。
【００６６】改善されたＰＬＴ１自動法およびシステム
の体積および屈折率の動的範囲を効果的に拡張して、と
きどき出現するＸ＝99、Ｙ＝99の飽和チャンネルにある
大きくて密度の高いＰＬＴを処理することができると考
えられる。ＰＬＴ１は、これらを赤血球として同定す
る。これは、現在のＨ・TMシステム Mie変換表の下限を
Ｖ＜8 flおよびｎ＜1.400 まで拡張することにより行う
ことができる。ＰＬＴ１システムで使用されるＲＢＣ／
ＰＬＴチャンネル増幅は、拡張された表の適用に対し
て、より大きい血小板信号の十分な分解を提供するの
で、正確なＶおよびｎ値が得られる。
の体積および屈折率の動的範囲を効果的に拡張して、と
きどき出現するＸ＝99、Ｙ＝99の飽和チャンネルにある
大きくて密度の高いＰＬＴを処理することができると考
えられる。ＰＬＴ１は、これらを赤血球として同定す
る。これは、現在のＨ・TMシステム Mie変換表の下限を
Ｖ＜8 flおよびｎ＜1.400 まで拡張することにより行う
ことができる。ＰＬＴ１システムで使用されるＲＢＣ／
ＰＬＴチャンネル増幅は、拡張された表の適用に対し
て、より大きい血小板信号の十分な分解を提供するの
で、正確なＶおよびｎ値が得られる。
【００６７】本発明のＰＬＴ１システムは、Mie の表に
基づいて、平均血小板体積（ＭＰＶ、fl）および平均屈
折率を計算するものである。そのシステムはまた、下記
に説明するように、屈折率および体積の平均から平均血
小板成分濃度（ＭＰＣ、g/dl）および平均血小板乾燥質
量（ＭＰＭ、ｐｇ）も誘導する。
基づいて、平均血小板体積（ＭＰＶ、fl）および平均屈
折率を計算するものである。そのシステムはまた、下記
に説明するように、屈折率および体積の平均から平均血
小板成分濃度（ＭＰＣ、g/dl）および平均血小板乾燥質
量（ＭＰＭ、ｐｇ）も誘導する。
【００６８】
【式２】
【００６９】 ＭＰＣ(g/dl)＝平均屈折率−1.333)/(0.0018/(g/dl)) ［式中、1.333 は水の屈折率であり、0.0018（g/dl）は
平均の屈折率（ＲＩ）増加である。］ 当業者であれば理解されるように、または下記でさらに
示すように、ＲＩ増加の値は、細胞間の変数としてのそ
れを排除するため、この式では定数として処理される。
平均の屈折率（ＲＩ）増加である。］ 当業者であれば理解されるように、または下記でさらに
示すように、ＲＩ増加の値は、細胞間の変数としてのそ
れを排除するため、この式では定数として処理される。
【００７０】
【式３】ＭＰＭ(pg)＝ＭＰＣ(g/dl)×ＭＰＶ(fl)/100
(注: g/dl＝100 × pg/fl) 平均の屈折率増加の値は、血小板乾燥質量の主な成分が
タンパク質（57 %）、脂質（19 %）および炭水化物（8.
5 % ）であることに基づいている（Wintrobe's Clinica
l Hematology, Ninth Edition, 1993, page 515 ）。こ
れらの成分の屈折率増加は、各々、0.00187/(g/dl)、0.
0017/(g/dl) および 0.00143/(g/dl) である（S.H. Arm
strongら、1947, J.A.C.S., 69:1747-1753; R. Barerお
よび S. Joseph, 1954, Quartely Journal of Microsco
pical Science, 95:399-423 ）。これらの成分の相対的
濃度を使用して平均の屈折率増加を血小板に当てはめる
と、0.0018/(g/dl) の値が得られる。それらの少量成分
のうち、いくつかは屈折率増加がより大きく、いくつか
は増加がより小さい。これらの成分の平均の増加が、当
てはめた値をかなり変化させるとは予想されない。な
お、0.0018/(g/dl) は、公知文献によって、原形質にも
当てはめられた値である（R. Barerおよび S. Joseph,
1954, Quarterly Journal of Microscopical Science,
95:399-423）。本発明のシステムは、ＲＢＣおよびＰＬ
Ｔ計数、ＭＰＶ、ＭＰＣおよびＭＰＭを記録することの
他に、血小板体積、血小板成分濃度および血小板乾燥質
量のヒストグラムを示す（図４）。
(注: g/dl＝100 × pg/fl) 平均の屈折率増加の値は、血小板乾燥質量の主な成分が
タンパク質（57 %）、脂質（19 %）および炭水化物（8.
5 % ）であることに基づいている（Wintrobe's Clinica
l Hematology, Ninth Edition, 1993, page 515 ）。こ
れらの成分の屈折率増加は、各々、0.00187/(g/dl)、0.
0017/(g/dl) および 0.00143/(g/dl) である（S.H. Arm
strongら、1947, J.A.C.S., 69:1747-1753; R. Barerお
よび S. Joseph, 1954, Quartely Journal of Microsco
pical Science, 95:399-423 ）。これらの成分の相対的
濃度を使用して平均の屈折率増加を血小板に当てはめる
と、0.0018/(g/dl) の値が得られる。それらの少量成分
のうち、いくつかは屈折率増加がより大きく、いくつか
は増加がより小さい。これらの成分の平均の増加が、当
てはめた値をかなり変化させるとは予想されない。な
お、0.0018/(g/dl) は、公知文献によって、原形質にも
当てはめられた値である（R. Barerおよび S. Joseph,
1954, Quarterly Journal of Microscopical Science,
95:399-423）。本発明のシステムは、ＲＢＣおよびＰＬ
Ｔ計数、ＭＰＶ、ＭＰＣおよびＭＰＭを記録することの
他に、血小板体積、血小板成分濃度および血小板乾燥質
量のヒストグラムを示す（図４）。
【００７１】ＰＬＴ１システムおよび方法は、現在のTE
CHNICON Ｈ・TMシステムで使用されるＲＢＣ／ＰＬＴチ
ャンネル法で使用するのと同じ化学試薬を使用すること
ができ、使用される球状化試薬は、血小板に悪影響を及
ぼしたり、作用したりしない。さらに、本発明に従って
Ｋ3 ＥＤＴＡ抗凝固剤中に採取し、分析した血小板に対
して、さらに球状化を施す必要はない。例えば、図５Ａ
は、抗凝固のためにＫ3 ＥＤＴＡに入れ、次いでＲＢＣ
希釈溶液に再懸濁した血小板に対して、本発明のＰＬＴ
１システムおよび方法により作成したＰＬＴ１散乱／散
乱サイトグラムを示す。当分野で報告されているよう
に、不完全とはいえ、Ｋ3 ＥＤＴＡは血小板を球状化す
る（S. Holmeおよび S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin.
Med., 96:480-493, G.V.R. Born, 1970, J. Physiol.,
209:487-511 ）。図５Ｂは、同じサンプルを等張性リン
酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁した同一サンプルの第二の
アリコートに対するＰＬＴ１散乱／散乱サイトグラムを
示す。図５Ａおよび５Ｂを比較して分かるように、本発
明の方法およびシステムから得られた二つのサイトグラ
ムの外観は同じである。さらに、記録されたパラメータ
ーの値も、装置の誤差範囲内で同じである。これらの結
果は、本発明方法に対しては、正確なＲＢＣ計数および
血小板パラメーター結果を得るのに、赤血球球状化試薬
は必要ないことを示す。
CHNICON Ｈ・TMシステムで使用されるＲＢＣ／ＰＬＴチ
ャンネル法で使用するのと同じ化学試薬を使用すること
ができ、使用される球状化試薬は、血小板に悪影響を及
ぼしたり、作用したりしない。さらに、本発明に従って
Ｋ3 ＥＤＴＡ抗凝固剤中に採取し、分析した血小板に対
して、さらに球状化を施す必要はない。例えば、図５Ａ
は、抗凝固のためにＫ3 ＥＤＴＡに入れ、次いでＲＢＣ
希釈溶液に再懸濁した血小板に対して、本発明のＰＬＴ
１システムおよび方法により作成したＰＬＴ１散乱／散
乱サイトグラムを示す。当分野で報告されているよう
に、不完全とはいえ、Ｋ3 ＥＤＴＡは血小板を球状化す
る（S. Holmeおよび S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin.
Med., 96:480-493, G.V.R. Born, 1970, J. Physiol.,
209:487-511 ）。図５Ｂは、同じサンプルを等張性リン
酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁した同一サンプルの第二の
アリコートに対するＰＬＴ１散乱／散乱サイトグラムを
示す。図５Ａおよび５Ｂを比較して分かるように、本発
明の方法およびシステムから得られた二つのサイトグラ
ムの外観は同じである。さらに、記録されたパラメータ
ーの値も、装置の誤差範囲内で同じである。これらの結
果は、本発明方法に対しては、正確なＲＢＣ計数および
血小板パラメーター結果を得るのに、赤血球球状化試薬
は必要ないことを示す。
【００７２】さらに、図６Ａおよび６Ｂは、同じドナー
の血小板を評価する、ＰＬＴ１によって作成した対応す
る一対の散乱／散乱サイトグラムであり、ただし抗凝固
剤として市販の酸／クエン酸／デキストロース（ＡＣ
Ｄ）溶液を使用した。Ｋ3 ＥＤＴＡの作用とは対照的
に、ＡＣＤは、血小板を球状化しないことが知られてい
る（S. Holmeおよび S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin.
Med., 96:480-493; G.V.R.Born, 1970, J. Physiol., 2
09:487-511; G.V.R. Bornら、1978, J. Physiol.,208:1
93-212; M. Frojmovicおよび R. Panjwani, 1976, Biop
hys. J., 16:1071-1089 ）。この場合も、サイトグラム
の外観は同じであったが、ＡＣＤに懸濁したサンプル
は、Ｋ3 ＥＤＴＡに懸濁したサンプルに対して得られた
ものよりも拡散の度合いが大きいサイトグラムになっ
た。この拡散特性は、球状でない血小板がフローセル内
で無秩序に配向していることによるが、本発明のシステ
ムおよび方法を使用して得られる結果の感度および正確
さに悪影響を及ぼすものではない。これらの結果は、そ
の赤血球希釈剤が血小板を球状化するものでなく、実
際、血小板の球状化は、本発明においては結果の正確さ
に必要でないことを示す。
の血小板を評価する、ＰＬＴ１によって作成した対応す
る一対の散乱／散乱サイトグラムであり、ただし抗凝固
剤として市販の酸／クエン酸／デキストロース（ＡＣ
Ｄ）溶液を使用した。Ｋ3 ＥＤＴＡの作用とは対照的
に、ＡＣＤは、血小板を球状化しないことが知られてい
る（S. Holmeおよび S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin.
Med., 96:480-493; G.V.R.Born, 1970, J. Physiol., 2
09:487-511; G.V.R. Bornら、1978, J. Physiol.,208:1
93-212; M. Frojmovicおよび R. Panjwani, 1976, Biop
hys. J., 16:1071-1089 ）。この場合も、サイトグラム
の外観は同じであったが、ＡＣＤに懸濁したサンプル
は、Ｋ3 ＥＤＴＡに懸濁したサンプルに対して得られた
ものよりも拡散の度合いが大きいサイトグラムになっ
た。この拡散特性は、球状でない血小板がフローセル内
で無秩序に配向していることによるが、本発明のシステ
ムおよび方法を使用して得られる結果の感度および正確
さに悪影響を及ぼすものではない。これらの結果は、そ
の赤血球希釈剤が血小板を球状化するものでなく、実
際、血小板の球状化は、本発明においては結果の正確さ
に必要でないことを示す。
【００７３】本明細書に記載したように、本発明は、た
とえ血小板が完全に球状化されていなくて、いろいろな
種類、数および屈折率の顆粒を含んでいても、赤血球と
同様に、球状化した血小板が選択された測定条件下で均
一な球として「有効に」挙動することを初めて示すもの
である。本発明以前には、この分析法は、球状で均一な
粒子に対してのみ有効であると考えられた（例えば、米
国特許 No. 4,735,504(D.H. Tycko) 参照）。
とえ血小板が完全に球状化されていなくて、いろいろな
種類、数および屈折率の顆粒を含んでいても、赤血球と
同様に、球状化した血小板が選択された測定条件下で均
一な球として「有効に」挙動することを初めて示すもの
である。本発明以前には、この分析法は、球状で均一な
粒子に対してのみ有効であると考えられた（例えば、米
国特許 No. 4,735,504(D.H. Tycko) 参照）。
【００７４】本発明の別の態様は、赤血球分析に適する
同一かまたは類似した角間隔を使用して、血小板分析の
ための２角散乱測定にMie 散乱理論を適用することであ
る。本発明以前、当業者は、赤血球分析に使用した選択
された一対の円錐角範囲はこの種の細胞に特異的である
ことに気づいていた。なぜなら、赤血球の場合でさえ、
すべての対の角度が正確な分析をもたらしたわけではな
いからである（米国特許 No. 4,735,504 (Tycko)参
照）。さらに、Tycko の分析は、球状の赤血球に対して
のみ有効であることを示した。赤血球は、典型的には血
小板の約 10 倍大きく（すなわち、赤血球のＭＣＶが 8
5 flであるのに対して、血小板のＭＣＶは 8.5 fl であ
る。）、従って、赤血球は分析に対してかなり大きい信
号を生じる。また、本明細書に記載した本発明が行われ
るまで、当業者は、均一で完全に球状である粒子に対し
ては２角間隔で十分であることを知っていたが、球状が
不完全である粒子は、分析に少なくとも３角間隔が必要
であると考えられた。本発明は、以前は赤血球分析に対
してのみ使用された上記パラメーター（すなわち、一対
の円錐角および２角間隔）が、血小板など、通常の体積
範囲が約 2〜20 fl である、球状が不完全で均一でない
粒子の正確かつ高感度の定量および測定に対しても有効
であることを初めて示したものである。
同一かまたは類似した角間隔を使用して、血小板分析の
ための２角散乱測定にMie 散乱理論を適用することであ
る。本発明以前、当業者は、赤血球分析に使用した選択
された一対の円錐角範囲はこの種の細胞に特異的である
ことに気づいていた。なぜなら、赤血球の場合でさえ、
すべての対の角度が正確な分析をもたらしたわけではな
いからである（米国特許 No. 4,735,504 (Tycko)参
照）。さらに、Tycko の分析は、球状の赤血球に対して
のみ有効であることを示した。赤血球は、典型的には血
小板の約 10 倍大きく（すなわち、赤血球のＭＣＶが 8
5 flであるのに対して、血小板のＭＣＶは 8.5 fl であ
る。）、従って、赤血球は分析に対してかなり大きい信
号を生じる。また、本明細書に記載した本発明が行われ
るまで、当業者は、均一で完全に球状である粒子に対し
ては２角間隔で十分であることを知っていたが、球状が
不完全である粒子は、分析に少なくとも３角間隔が必要
であると考えられた。本発明は、以前は赤血球分析に対
してのみ使用された上記パラメーター（すなわち、一対
の円錐角および２角間隔）が、血小板など、通常の体積
範囲が約 2〜20 fl である、球状が不完全で均一でない
粒子の正確かつ高感度の定量および測定に対しても有効
であることを初めて示したものである。
【００７５】現在の自動化法（TECHNICON Ｈ・TMシステ
ムおよび米国特許 No. 4,735,504 (Tycko) に記載の方
法など）は、赤血球体積および細胞ヘモグロビン濃度の
定量など、赤血球の分析に対してのみ設計されたもので
ある。これに対して、本発明のＰＬＴ１法は、本明細書
に記載し、例示するように、血小板および赤血球の同時
分析を有益に行うことができる。一般に、ＰＬＴ１法
は、自動化法、例えばＨ・TMシステムを、本発明の新規
方法に従って、共通の光学システムでの血小板および赤
血球の同時定量に、いかなる定量の正確さおよび感度も
犠牲にすることなく適合させることができることを初め
て示したものである。血小板および赤血球の別々の Mie
理論分析を、本発明に従って、一対の光学検出器により
集めた信号に対して行うことができる。全血サンプル中
の血小板は、信号増幅条件下、ＰＬＴ１システムおよび
方法で血小板細胞型に特に適した Mie散乱理論表を使用
して分析され、一方、全血サンプル中の赤血球は、増幅
条件下、赤血球に適した Mie散乱表を使用して分析され
るからである。
ムおよび米国特許 No. 4,735,504 (Tycko) に記載の方
法など）は、赤血球体積および細胞ヘモグロビン濃度の
定量など、赤血球の分析に対してのみ設計されたもので
ある。これに対して、本発明のＰＬＴ１法は、本明細書
に記載し、例示するように、血小板および赤血球の同時
分析を有益に行うことができる。一般に、ＰＬＴ１法
は、自動化法、例えばＨ・TMシステムを、本発明の新規
方法に従って、共通の光学システムでの血小板および赤
血球の同時定量に、いかなる定量の正確さおよび感度も
犠牲にすることなく適合させることができることを初め
て示したものである。血小板および赤血球の別々の Mie
理論分析を、本発明に従って、一対の光学検出器により
集めた信号に対して行うことができる。全血サンプル中
の血小板は、信号増幅条件下、ＰＬＴ１システムおよび
方法で血小板細胞型に特に適した Mie散乱理論表を使用
して分析され、一方、全血サンプル中の赤血球は、増幅
条件下、赤血球に適した Mie散乱表を使用して分析され
るからである。
【００７６】本発明のＰＬＴ１法およびシステムのみに
より、平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）の自動測定を、個
々の細胞基準でまたはサンプル平均のいずれかで行うこ
とができる。原則的には、ＭＰＭ（ただし、細胞１個ず
つの乾燥質量またはその分布ではない）は、平均血小板
成分濃度、ＭＰＶおよび血小板の水分（％）の測定値か
ら次のように求めることができる
より、平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）の自動測定を、個
々の細胞基準でまたはサンプル平均のいずれかで行うこ
とができる。原則的には、ＭＰＭ（ただし、細胞１個ず
つの乾燥質量またはその分布ではない）は、平均血小板
成分濃度、ＭＰＶおよび血小板の水分（％）の測定値か
ら次のように求めることができる
【００７７】
【式４】
【００７８】ＭＰＭ(pg)＝血小板の平均全質量(pg)×(1
00−水分％)/100 ［式中、血小板の平均全質量（pg）＝血小板の平均密度
（g/ml＝pg/fl ）ｘＭＰＶ（fl）］ しかし、これらの測定には、血小板の密度の測定（D.G.
Peningtonら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376;
L. Corashら、1977, Blood, 49(1):71-85; C.B. Thomps
on ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519;および L.
Corashら、1984,Blood, 64(1):185-193）と、水分％の
測定（F. Gorstein ら、1967, J. Lab. and Clin. Me
d., 70:938-950）の両方が必要であり、これらの測定
は、退屈で時間がかかり、高処理量の自動化には適さな
い。
00−水分％)/100 ［式中、血小板の平均全質量（pg）＝血小板の平均密度
（g/ml＝pg/fl ）ｘＭＰＶ（fl）］ しかし、これらの測定には、血小板の密度の測定（D.G.
Peningtonら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376;
L. Corashら、1977, Blood, 49(1):71-85; C.B. Thomps
on ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519;および L.
Corashら、1984,Blood, 64(1):185-193）と、水分％の
測定（F. Gorstein ら、1967, J. Lab. and Clin. Me
d., 70:938-950）の両方が必要であり、これらの測定
は、退屈で時間がかかり、高処理量の自動化には適さな
い。
【００７９】ＰＬＴ１システムおよび方法によって測定
した平均ＭＰＭ値は、血小板の密度、ＭＰＶおよび血小
板の水分％の確立された平均値に基づく間接的な推定値
と比較することができる。一般に、ＡＣＤ中で抗凝固さ
れ、ストラクタン(stractan)勾配上で分離される血小板
の場合、血小板の平均密度は約 1.065 g/ml であり（D.
G. Peningtonら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376;
L. Corashら、1977,Blood, 49(1):71-85; C.B. Thomps
on ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519;および L.
Corashら、1984, Blood, 64(1):185-193）、ＭＰＶは
約 6.5 fl （E.A. Trowbridge ら、1985, Clin. Phys.
Physiol. Meas., 6(3):221-238; L. Corash ら、1977,
Blood, 49(1):71-85; C.B. Thompson ら、1982, Br. J.
Hematol., 50:509-519 ）であることが当技術分野では
認められている。しかし、従来技術から誘導されるＭＰ
Ｖ値は、球状ポリスチレンビーズでキャリブレートされ
た装置によって行われる開口インピーダンス測定に基づ
くものである。従って、球状でないＡＣＤ血小板に対す
るＭＰＶ推定値は、決まって低い（N.B. Grover ら、19
69, Biophys. J., 9:1398; J. Hurley, 1974, Biophys.
J., 10:74）。他の全てが等しいとすると、Ｋ3 ＥＤＴ
Ａ−血小板に対する開口インピーダンス測定（すなわ
ち、球状化した血小板）の方が正確である。これらの型
の測定により、新しい（約１時間齢）サンプルに対して
は、約 8.5 fl のＭＰＶ値が得られる（E.A. Trowbridg
e ら、1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-2
38）。
した平均ＭＰＭ値は、血小板の密度、ＭＰＶおよび血小
板の水分％の確立された平均値に基づく間接的な推定値
と比較することができる。一般に、ＡＣＤ中で抗凝固さ
れ、ストラクタン(stractan)勾配上で分離される血小板
の場合、血小板の平均密度は約 1.065 g/ml であり（D.
G. Peningtonら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376;
L. Corashら、1977,Blood, 49(1):71-85; C.B. Thomps
on ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519;および L.
Corashら、1984, Blood, 64(1):185-193）、ＭＰＶは
約 6.5 fl （E.A. Trowbridge ら、1985, Clin. Phys.
Physiol. Meas., 6(3):221-238; L. Corash ら、1977,
Blood, 49(1):71-85; C.B. Thompson ら、1982, Br. J.
Hematol., 50:509-519 ）であることが当技術分野では
認められている。しかし、従来技術から誘導されるＭＰ
Ｖ値は、球状ポリスチレンビーズでキャリブレートされ
た装置によって行われる開口インピーダンス測定に基づ
くものである。従って、球状でないＡＣＤ血小板に対す
るＭＰＶ推定値は、決まって低い（N.B. Grover ら、19
69, Biophys. J., 9:1398; J. Hurley, 1974, Biophys.
J., 10:74）。他の全てが等しいとすると、Ｋ3 ＥＤＴ
Ａ−血小板に対する開口インピーダンス測定（すなわ
ち、球状化した血小板）の方が正確である。これらの型
の測定により、新しい（約１時間齢）サンプルに対して
は、約 8.5 fl のＭＰＶ値が得られる（E.A. Trowbridg
e ら、1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-2
38）。
【００８０】血小板の球状化の他に、Ｋ3 ＥＤＴＡが血
小板を膨潤させるか否かに関しては、当業者の間で一致
していない（例えば、S. Hlomeおよび S. Murphy, 198
0, J.Lab. Clin. Med., 96:480-493; E.A. Trowbridge
ら、1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-23
8; G.V.R. Born, 1970, J. Physiol., 209:487-511; G.
V.R.. Born ら、1978, J. Physiol., 280:193-212参
照）。Ｋ3 ＥＤＴＡ血小板の密度勾配測定では、1.060
g/mlの平均密度が得られることが報告されている（H.H.
K. Watson および C.A. Ludlam, 1986, Br. J. Hemato
l., 62:117-124 ）。この値をＡＣＤ−血小板に対する
1.065 g/ml の値と比較すると、Ｋ3 ＥＤＴＡは約 8 %
だけ血小板を膨潤させることが示唆される。これに基づ
くと、膨潤していない」血小板に対するＭＰＶは 7.8 f
l である（これは、thrombocrit 測定に基づく公表値
（S. Karpatkinおよび A. Charmatz, 1969, J. Clin. I
nvest., 48:1073-1082）および視覚顕微鏡検査（M. Fro
jmovicおよび R. Panjwani, 1976,Biophys. J., 16:107
1-1089 ）とかなりよく一致する。）。ＭＰＶ範囲とし
て 7.8〜8.5 flを使用すると、全血小板の平均質量は
8.31 pg〜9.05 pg である。血小板の水分含量％は、74.
6 %〜77 %の範囲であると推定される（F. Gorstein
ら、1967, J. Lab. Clin. Med., 70:938-950; S. Karpa
tkin, 「血小板の組成物」, Hematology, 2nd Ed. 197
7, McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178 ）。この結果、
1.91 pg 〜 2.30 pgのＭＰＭ範囲が得られる。ＰＬＴ１
を使用して得られる 2.02 pgの平均値は、この範囲内で
ある。これに対して、公表された最も高いＭＰＭ値の
2.8 pg （S. Karpatkin, 「血小板の組成物」, Hematol
ogy, 2nd Ed. 1977, McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178
）は、この範囲からかなり外れている。さらに、この
値は、恐らく物理的根拠に基づくものではない。という
のは、それが、赤血球の成分濃度範囲である 35 g/dl〜
38 g/dl （ＭＣＨＣの場合は 32 g/dl〜35 g/dl ）と重
複する 32.9 g/dl〜35.9 g/dl の成分濃度範囲に一致す
るからである（J.W. Harris および R.W. Kellermeyer,
1972, The Red Cell, 2nd Ed., Harvard University P
ress, p.282 ）。従って、平均密度の血小板は、正常な
赤血球集団の低密度画分内に見いだされるはずである。
しかし、実際は、通常の実施によって示されるように、
こうではない。
小板を膨潤させるか否かに関しては、当業者の間で一致
していない（例えば、S. Hlomeおよび S. Murphy, 198
0, J.Lab. Clin. Med., 96:480-493; E.A. Trowbridge
ら、1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-23
8; G.V.R. Born, 1970, J. Physiol., 209:487-511; G.
V.R.. Born ら、1978, J. Physiol., 280:193-212参
照）。Ｋ3 ＥＤＴＡ血小板の密度勾配測定では、1.060
g/mlの平均密度が得られることが報告されている（H.H.
K. Watson および C.A. Ludlam, 1986, Br. J. Hemato
l., 62:117-124 ）。この値をＡＣＤ−血小板に対する
1.065 g/ml の値と比較すると、Ｋ3 ＥＤＴＡは約 8 %
だけ血小板を膨潤させることが示唆される。これに基づ
くと、膨潤していない」血小板に対するＭＰＶは 7.8 f
l である（これは、thrombocrit 測定に基づく公表値
（S. Karpatkinおよび A. Charmatz, 1969, J. Clin. I
nvest., 48:1073-1082）および視覚顕微鏡検査（M. Fro
jmovicおよび R. Panjwani, 1976,Biophys. J., 16:107
1-1089 ）とかなりよく一致する。）。ＭＰＶ範囲とし
て 7.8〜8.5 flを使用すると、全血小板の平均質量は
8.31 pg〜9.05 pg である。血小板の水分含量％は、74.
6 %〜77 %の範囲であると推定される（F. Gorstein
ら、1967, J. Lab. Clin. Med., 70:938-950; S. Karpa
tkin, 「血小板の組成物」, Hematology, 2nd Ed. 197
7, McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178 ）。この結果、
1.91 pg 〜 2.30 pgのＭＰＭ範囲が得られる。ＰＬＴ１
を使用して得られる 2.02 pgの平均値は、この範囲内で
ある。これに対して、公表された最も高いＭＰＭ値の
2.8 pg （S. Karpatkin, 「血小板の組成物」, Hematol
ogy, 2nd Ed. 1977, McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178
）は、この範囲からかなり外れている。さらに、この
値は、恐らく物理的根拠に基づくものではない。という
のは、それが、赤血球の成分濃度範囲である 35 g/dl〜
38 g/dl （ＭＣＨＣの場合は 32 g/dl〜35 g/dl ）と重
複する 32.9 g/dl〜35.9 g/dl の成分濃度範囲に一致す
るからである（J.W. Harris および R.W. Kellermeyer,
1972, The Red Cell, 2nd Ed., Harvard University P
ress, p.282 ）。従って、平均密度の血小板は、正常な
赤血球集団の低密度画分内に見いだされるはずである。
しかし、実際は、通常の実施によって示されるように、
こうではない。
【００８１】別の発明では、本発明の方法およびシステ
ムによって提供される血小板活性の測定が臨床的に有用
である。現在、血小板の活性を予測するために、蛍光フ
ローサイトメトリー（G.I. Johnston ら、1987, Blood,
69(5):1401-1403; J.N. George ら、1986, J. Clin. I
nvest., 78:340-348）、血小板密度測定（D.G. Penning
ton ら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376; L. Cora
shら、1977, Blood, 49(1):71-85; A.J. Friedhoffら、
1978, Blood, 51(2):317-323; C.B. Thompsonら、1982,
Br. J. Hematol., 50:509-519; L. Croashら、1984, B
lood, 64(1):185-193）およびＭＰＶ測定（C.B. Thomps
on ら、1983, J. Lab. Clin. Med., 101:205-213 ）が
使用されている。上述したように、これらの方法の第一
である蛍光フローサイトメトリーは、退屈で時間がかか
り、高価である。第二の方法である血小板密度測定は、
さらに間接的でもある。第三の方法であるＭＰＶ測定
は、間接的であり、採取および保存条件により影響され
る。従って、血小板の活性を予測するための簡単、迅
速、安価かつ他の影響を受けない方法が当技術分野では
望ましい。
ムによって提供される血小板活性の測定が臨床的に有用
である。現在、血小板の活性を予測するために、蛍光フ
ローサイトメトリー（G.I. Johnston ら、1987, Blood,
69(5):1401-1403; J.N. George ら、1986, J. Clin. I
nvest., 78:340-348）、血小板密度測定（D.G. Penning
ton ら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376; L. Cora
shら、1977, Blood, 49(1):71-85; A.J. Friedhoffら、
1978, Blood, 51(2):317-323; C.B. Thompsonら、1982,
Br. J. Hematol., 50:509-519; L. Croashら、1984, B
lood, 64(1):185-193）およびＭＰＶ測定（C.B. Thomps
on ら、1983, J. Lab. Clin. Med., 101:205-213 ）が
使用されている。上述したように、これらの方法の第一
である蛍光フローサイトメトリーは、退屈で時間がかか
り、高価である。第二の方法である血小板密度測定は、
さらに間接的でもある。第三の方法であるＭＰＶ測定
は、間接的であり、採取および保存条件により影響され
る。従って、血小板の活性を予測するための簡単、迅
速、安価かつ他の影響を受けない方法が当技術分野では
望ましい。
【００８２】血小板の潜在的活性は、α−および高密度
顆粒の数および質量とともに増加する（L. Corash ら、
1977, Blood, 49(1):71-85および L. Corashら、1984,
Blood, 64(1):185-193）。血小板の乾燥質量は顆粒含量
と相関するので（前掲）、血小板の潜在的活性は、ＭＰ
Ｍとともに増加する。従って、本発明のＰＬＴ１方法の
一面は、血小板の活性を予測するための、簡単で正確か
つ安価な方法を提供する。さらに、ＭＰＭは、室温です
ら、分析前に約 24 時間まで保存しておいたサンプル中
でほとんど変化しないので、影響を受けないパラメータ
ーである。さらに、ＭＰＭは、相関係数（ｒ）に基づい
て、時間経過とともに予想通りに挙動する（表１参
照）。表１は、ＰＬＴ１システムおよび方法によって得
た、正常な血液ドナーサンプルのＭＰＭおよびＭＰＣ測
定値と時間および温度との関係を示す（室温で８時間対
１時間；室温で 24 時間対１時間；室温で８時間対４℃
で８時間；室温で 24 時間対４℃で 24 時間）。下記に
示す関連する表において、「ｒ」は相関計数であり、
「Syx 」は推定値の標準誤差であり、「Ｘ平均」は独立
変数に対する平均値であり、「Ｙ平均」は従属変数に対
する平均値である。すなわち、新しいサンプルに対して
さらに精密なＭＰＭ値を、加齢した、または保存したサ
ンプルの任意の in vitro サンプル年齢および保存温度
から外挿により得ることができる。例えば、室温で 24
時間につき 4 %の割合で減少し、24時間でのＭＰＭが
2.00 pgであるとすると、新鮮なサンプルのＭＰＭは 2.
08 pgとなる。ＰＬＴ１システムにより、ＡＣＤ−およ
びＫ3 ＥＤＴＡ抗凝固血液サンプルに対して本質的に同
じＭＰＭ値が記録されることは注目すべきことである
（表２ならびに図５Ａおよび５Ｂ）。これは、血小板が
ＡＣＤでは球状化されないが、Ｋ3ＥＤＴＡでは球状化
されるという点で驚くべきことである。従って、本発明
のＰＬＴ１法は多目的であり、両方の種類の抗凝固剤に
懸濁した血小板の分析に対して正確かつ信頼できるＭＰ
Ｍ結果を与える。
顆粒の数および質量とともに増加する（L. Corash ら、
1977, Blood, 49(1):71-85および L. Corashら、1984,
Blood, 64(1):185-193）。血小板の乾燥質量は顆粒含量
と相関するので（前掲）、血小板の潜在的活性は、ＭＰ
Ｍとともに増加する。従って、本発明のＰＬＴ１方法の
一面は、血小板の活性を予測するための、簡単で正確か
つ安価な方法を提供する。さらに、ＭＰＭは、室温です
ら、分析前に約 24 時間まで保存しておいたサンプル中
でほとんど変化しないので、影響を受けないパラメータ
ーである。さらに、ＭＰＭは、相関係数（ｒ）に基づい
て、時間経過とともに予想通りに挙動する（表１参
照）。表１は、ＰＬＴ１システムおよび方法によって得
た、正常な血液ドナーサンプルのＭＰＭおよびＭＰＣ測
定値と時間および温度との関係を示す（室温で８時間対
１時間；室温で 24 時間対１時間；室温で８時間対４℃
で８時間；室温で 24 時間対４℃で 24 時間）。下記に
示す関連する表において、「ｒ」は相関計数であり、
「Syx 」は推定値の標準誤差であり、「Ｘ平均」は独立
変数に対する平均値であり、「Ｙ平均」は従属変数に対
する平均値である。すなわち、新しいサンプルに対して
さらに精密なＭＰＭ値を、加齢した、または保存したサ
ンプルの任意の in vitro サンプル年齢および保存温度
から外挿により得ることができる。例えば、室温で 24
時間につき 4 %の割合で減少し、24時間でのＭＰＭが
2.00 pgであるとすると、新鮮なサンプルのＭＰＭは 2.
08 pgとなる。ＰＬＴ１システムにより、ＡＣＤ−およ
びＫ3 ＥＤＴＡ抗凝固血液サンプルに対して本質的に同
じＭＰＭ値が記録されることは注目すべきことである
（表２ならびに図５Ａおよび５Ｂ）。これは、血小板が
ＡＣＤでは球状化されないが、Ｋ3ＥＤＴＡでは球状化
されるという点で驚くべきことである。従って、本発明
のＰＬＴ１法は多目的であり、両方の種類の抗凝固剤に
懸濁した血小板の分析に対して正確かつ信頼できるＭＰ
Ｍ結果を与える。
【００８３】
【表１】
【００８４】ＭＰＣは、血小板の屈折率に比例し、屈折
率は血小板の密度に比例する。本発明方法に従って得た
ＭＰＣ値を、血小板アゴニストのトロンビンに対する正
常な血小板の用量反応に対する蛍光フローサイトメトリ
ーデータと比較した下記実施例４の結果は、ＭＰＣ値が
ＰＬＴ活性化状態と相関することを示す（図１４Ａ〜１
４Ｄ）。ＰＬＴ活性化を調べる本発明方法は、はるかに
安価で迅速であり、使用が非常に簡単である。さらに、
データ分析は容易に自動化される。さらに，本発明方法
を使用することにより得ることができる情報は、その方
法を行うために種々の機器を使用しても、本質的に機器
によって変わることはない。
率は血小板の密度に比例する。本発明方法に従って得た
ＭＰＣ値を、血小板アゴニストのトロンビンに対する正
常な血小板の用量反応に対する蛍光フローサイトメトリ
ーデータと比較した下記実施例４の結果は、ＭＰＣ値が
ＰＬＴ活性化状態と相関することを示す（図１４Ａ〜１
４Ｄ）。ＰＬＴ活性化を調べる本発明方法は、はるかに
安価で迅速であり、使用が非常に簡単である。さらに、
データ分析は容易に自動化される。さらに，本発明方法
を使用することにより得ることができる情報は、その方
法を行うために種々の機器を使用しても、本質的に機器
によって変わることはない。
【００８５】その方法は、クエン酸ナトリウムまたはエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（好ましくは、Ｋ3
ＥＤＴＡ）で抗凝固させた血液サンプルの分析に特に適
する。当業者であれば理解されるように、クエン酸ナト
リウムまたはＫ3 ＥＤＴＡの溶液は、血液サンプルと混
合することができ、あるいは、乾燥形態のクエン酸ナト
リウムまたはＫ3 ＥＤＴＡ（すなわち、粉末）を血液サ
ンプルに溶解して抗凝固剤として使用することができ
る。一般的指針として、 7 cc の管につき約 7〜14 mg
の粉末状のＫ3 ＥＤＴＡを使用する。クエン酸ナトリウ
ムは、慣例的には、管ごとに 2.0〜5 g/dl、好ましくは
3.2〜3.8 g/dlの溶液として使用し、最終的にはクエン
酸ナトリウム１部に対して全血が９部の割合にする。当
業者であればさらに理解されるように、Ｋ3 ＥＤＴＡ
が、自動血液分析に対して最も普通に使用される抗凝固
剤である。これに関しては有利なことに、本発明は、抗
体を使用する血小板および活性血小板の従来の測定法に
代わる価値ある方法を提供する。というのは、従来の方
法は、抗体と抗体が結合する分子構造との間のエピトー
プ結合部位の完全性に対して有害な作用を及ぼすために
ＥＤＴＡ含有溶液を使用することができないからであ
る。
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（好ましくは、Ｋ3
ＥＤＴＡ）で抗凝固させた血液サンプルの分析に特に適
する。当業者であれば理解されるように、クエン酸ナト
リウムまたはＫ3 ＥＤＴＡの溶液は、血液サンプルと混
合することができ、あるいは、乾燥形態のクエン酸ナト
リウムまたはＫ3 ＥＤＴＡ（すなわち、粉末）を血液サ
ンプルに溶解して抗凝固剤として使用することができ
る。一般的指針として、 7 cc の管につき約 7〜14 mg
の粉末状のＫ3 ＥＤＴＡを使用する。クエン酸ナトリウ
ムは、慣例的には、管ごとに 2.0〜5 g/dl、好ましくは
3.2〜3.8 g/dlの溶液として使用し、最終的にはクエン
酸ナトリウム１部に対して全血が９部の割合にする。当
業者であればさらに理解されるように、Ｋ3 ＥＤＴＡ
が、自動血液分析に対して最も普通に使用される抗凝固
剤である。これに関しては有利なことに、本発明は、抗
体を使用する血小板および活性血小板の従来の測定法に
代わる価値ある方法を提供する。というのは、従来の方
法は、抗体と抗体が結合する分子構造との間のエピトー
プ結合部位の完全性に対して有害な作用を及ぼすために
ＥＤＴＡ含有溶液を使用することができないからであ
る。
【００８６】本発明の別の発明は、ＭＰＭ値と病気の状
態および/ または病気の治療法との間の関係を評価する
ための方法および自動システムを提供することである
（実施例２参照）。本発明は、ＭＰＭを測定することに
よる、例えば患者の血小板顆粒含量に対する化学療法ま
たは放射線治療の効果を測定するための、便利な方法を
提供する。現在、血小板の末梢破壊を伴う血小板減少症
は正常よりも大きい血小板を生じ、一方、血小板新生の
低下による同じ症状は大きさが正常または小さい血小板
を生じると考えられる（J.D. Bessmanら、1982, Am. J.
Clin. Pathol.,78:150-153; R.B. Nelson および D. K
ehl, 1981, Cancer, 48:954-956）。さらに、血小板サ
イズの増加は、心筋梗塞に関連する（A. Eldorら、198
2, Br. Med.J., 285:397-400; H.A. Cameronら、1983,
Br. Med. J., 287:449-451; J.F. Martin ら、1983, B
r. Med. J., 287:486-488）。ＭＰＶと血小板乾燥質量
との相関の点から見ると（L. Corash ら、1977, Blood,
49(1):71-85および L. Corashら、1984, Blod, 64(1):
185-193 ）、高ＭＰＭ値は破壊的血小板減少症と関連
し、低ＭＰＭ値は血小板新生の低下に関連することが予
想される。さらに、高ＭＰＭは、恐らく血栓の潜在性を
示す。
態および/ または病気の治療法との間の関係を評価する
ための方法および自動システムを提供することである
（実施例２参照）。本発明は、ＭＰＭを測定することに
よる、例えば患者の血小板顆粒含量に対する化学療法ま
たは放射線治療の効果を測定するための、便利な方法を
提供する。現在、血小板の末梢破壊を伴う血小板減少症
は正常よりも大きい血小板を生じ、一方、血小板新生の
低下による同じ症状は大きさが正常または小さい血小板
を生じると考えられる（J.D. Bessmanら、1982, Am. J.
Clin. Pathol.,78:150-153; R.B. Nelson および D. K
ehl, 1981, Cancer, 48:954-956）。さらに、血小板サ
イズの増加は、心筋梗塞に関連する（A. Eldorら、198
2, Br. Med.J., 285:397-400; H.A. Cameronら、1983,
Br. Med. J., 287:449-451; J.F. Martin ら、1983, B
r. Med. J., 287:486-488）。ＭＰＶと血小板乾燥質量
との相関の点から見ると（L. Corash ら、1977, Blood,
49(1):71-85および L. Corashら、1984, Blod, 64(1):
185-193 ）、高ＭＰＭ値は破壊的血小板減少症と関連
し、低ＭＰＭ値は血小板新生の低下に関連することが予
想される。さらに、高ＭＰＭは、恐らく血栓の潜在性を
示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】下記実施例により本発明を説明する。下記
実施例は、本発明の概念の理解をさらに容易にするため
のものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例は、本発明の概念の理解をさらに容易にするため
のものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８９】
【実施例】実施例１ 本実施例では、およそ７５種の正常血液サンプル（Baye
r Corporationのドナーから入手したもの）で試験した
本発明の高ゲイン（high-gain）ＰＬＴ１チャンネル及
び血小板分析方法の実施について記載する。本発明のＰ
ＬＴ１法及びシステムと、この分野で用いられているシ
ステム及び方法との比較のために、血小板サンプルをTE
CHNICON HTM2自動分析器、コールターSTKS分析器、及び
その改良型である、より正確なＰＬＴ１システムを用い
て分析した。視覚的な評価のために、染色した血液塗抹
標本のスライドも、それぞれのサンプルについて調製し
た。血小板数、ＭＰＶ値、及びＲＢＣ数は上記の分析法
で比較した。自動化方法論にとって新規であり、本発明
のＰＬＴ１システム及び方法によってこの分野に導入す
る２つのパラメーター、すなわち平均血小板乾燥質量
（ＭＰＭ）と平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）のためにも
データを集めた。
r Corporationのドナーから入手したもの）で試験した
本発明の高ゲイン（high-gain）ＰＬＴ１チャンネル及
び血小板分析方法の実施について記載する。本発明のＰ
ＬＴ１法及びシステムと、この分野で用いられているシ
ステム及び方法との比較のために、血小板サンプルをTE
CHNICON HTM2自動分析器、コールターSTKS分析器、及び
その改良型である、より正確なＰＬＴ１システムを用い
て分析した。視覚的な評価のために、染色した血液塗抹
標本のスライドも、それぞれのサンプルについて調製し
た。血小板数、ＭＰＶ値、及びＲＢＣ数は上記の分析法
で比較した。自動化方法論にとって新規であり、本発明
のＰＬＴ１システム及び方法によってこの分野に導入す
る２つのパラメーター、すなわち平均血小板乾燥質量
（ＭＰＭ）と平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）のためにも
データを集めた。
【００９０】全てのサンプルをＫ3ＥＤＴＡを含有する
吸引器の中に採取した。サンプルは、１時間の室温保存
の後、８時間の室温及び４℃保存の後、及び２４時間の
室温及び４℃保存の後に分析した。
吸引器の中に採取した。サンプルは、１時間の室温保存
の後、８時間の室温及び４℃保存の後、及び２４時間の
室温及び４℃保存の後に分析した。
【００９１】TECHNICON HTM2及びコールターSTKSシステ
ムを用いた血小板分析を実施するために、メーカーの説
明書に従ってシステムを標準化し、キャリブレートし
た。全てのサンプルを２回の反復実験に供し、分析し
た。更に、上記のようにして標準化し、キャリブレート
したＰＬＴ１試験システムでサンプルを２回の反復実験
に供し、分析した。
ムを用いた血小板分析を実施するために、メーカーの説
明書に従ってシステムを標準化し、キャリブレートし
た。全てのサンプルを２回の反復実験に供し、分析し
た。更に、上記のようにして標準化し、キャリブレート
したＰＬＴ１試験システムでサンプルを２回の反復実験
に供し、分析した。
【００９２】血液塗抹標本のフィルムスライドは、全て
のサンプルで２つずつ調製した。次いで市販のHema-Tek
2000 Slide Stainer（Bayer Corporation）によってス
ライドにライト−ギームザ染色を行った。スライドは血
小板計数及び相対的な大きさの基準のために保存した。
のサンプルで２つずつ調製した。次いで市販のHema-Tek
2000 Slide Stainer（Bayer Corporation）によってス
ライドにライト−ギームザ染色を行った。スライドは血
小板計数及び相対的な大きさの基準のために保存した。
【００９３】正常血液の分析及びＰＬＴ数の比較精度デ
ータの結果を表３に挙げる；ＭＰＶ比較精度データを表
４に挙げる；ＲＢＣ数の比較精度データを表５に挙げ
る；そしてＭＰＭとＭＰＣの精度データを表１に挙げ
る。
ータの結果を表３に挙げる；ＭＰＶ比較精度データを表
４に挙げる；ＲＢＣ数の比較精度データを表５に挙げ
る；そしてＭＰＭとＭＰＣの精度データを表１に挙げ
る。
【００９４】
【表３】
【表４】
【表５】
【００９５】ＰＬＴ数：本発明のＰＬＴ１法で得られる
血小板数は、共に広く受け入れられている血小板計数装
置であるＨ・TM２及びＳＴＫＳシステムでのカウント数
とよく合致していた。ＰＬＴ１法では血小板数のキャリ
ブレーション係数は用いられなかったが、Ｈ・TM２及び
ＳＴＫＳでのキャリブレーション係数はそれぞれ０．８
５及び１．０２であったことに留意すべきである。この
ことから、現在のＨ・TMシステムの技術では生の血小板
数に非常に多くの非血小板が含まれていることが示唆さ
れる。
血小板数は、共に広く受け入れられている血小板計数装
置であるＨ・TM２及びＳＴＫＳシステムでのカウント数
とよく合致していた。ＰＬＴ１法では血小板数のキャリ
ブレーション係数は用いられなかったが、Ｈ・TM２及び
ＳＴＫＳでのキャリブレーション係数はそれぞれ０．８
５及び１．０２であったことに留意すべきである。この
ことから、現在のＨ・TMシステムの技術では生の血小板
数に非常に多くの非血小板が含まれていることが示唆さ
れる。
【００９６】ＭＰＶ：現在のＭＰＶを測定するための方
法には、この分野で標準とすべきものと考えられるもの
はない。従って、各方法間の比較は血小板の質的な挙動
に関する。図４に、ＰＬＴ１法における典型的な正常サ
ンプルの血小板体積のヒストグラムを示す。これは血小
板体積の対数−正規分布を示し、公表されている結果と
一致する（J.M.Paulus, 1975, Blood, 46(3):321-33
6）。Ｈ・TM２及びＳＴＫＳシステムでの典型的な血小
板体積分布も対数−正規である。
法には、この分野で標準とすべきものと考えられるもの
はない。従って、各方法間の比較は血小板の質的な挙動
に関する。図４に、ＰＬＴ１法における典型的な正常サ
ンプルの血小板体積のヒストグラムを示す。これは血小
板体積の対数−正規分布を示し、公表されている結果と
一致する（J.M.Paulus, 1975, Blood, 46(3):321-33
6）。Ｈ・TM２及びＳＴＫＳシステムでの典型的な血小
板体積分布も対数−正規である。
【００９７】正常なサンプルでは、本発明のＰＬＴ１シ
ステム及び比較としてのコールターＳＴＫＳシステムを
用いて得られたＭＰＶ値は、共にＭＰＶが保存時間と共
に増加することを示したが、TECHNICON Ｈ・TM２システ
ムを用いて得られた値では減少を示した（表４参照）。
ＳＴＫＳ及びＰＬＴ１に対するＨ・TM２でのこのパター
ンは、Trowbridgeらによって報告されたコールターＳ＋
システムに対し、TECHNICON H6000TMシステムを用いて
得られたパターンと一致した（E.A.Trowbridgeら, 198
5, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-2382）。Tr
owbridgeらの論文で報告されたように、（TECHNICON Ｈ
・TM２システムと同様に）TECHNICON H6000TMシステム
では、血小板体積は高角度散乱強度に比例する（H6000
TMで５−１０度、及びＨ・TM２システムで５−１５
度）。本発明の詳細な説明で先に説明したように、Mie
散乱理論では、これらの角度への散乱は屈折率に敏感で
あることが示されている。血小板をex vivoで加齢する
と、水の取り込みのためにそれらは膨潤し、屈折性が低
くなる（S.HolmeとS.Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Me
d., 96:480-493）。この膨潤によって高角度散乱強度は
減少し、従ってＭＰＶが実際には増加しているときにH6
000TM及びＨ・TM２システムでＭＰＶの減少が報告され
ることになる。しかしながら、コールターＳ＋システム
及びコールターＳＴＫＳシステムによって、また他の開
口インピーダンス装置によって得られる測定値によれ
ば、血小板体積は電気的インピーダンスに比例する。従
って、これらの後者のシステムでは、細胞が膨潤するに
つれてインピーダンスが増加するため、膨潤に起因する
ＭＰＶの増加が正しく報告される。本発明のＰＬＴ１シ
ステムは、上記のように、Mie 散乱理論を用いて低−及
び高−角度散乱信号を体積及び屈折率に変換するため、
ＰＬＴ１システム及び方法でも膨潤に起因するＭＰＶの
増加が正しく報告される。
ステム及び比較としてのコールターＳＴＫＳシステムを
用いて得られたＭＰＶ値は、共にＭＰＶが保存時間と共
に増加することを示したが、TECHNICON Ｈ・TM２システ
ムを用いて得られた値では減少を示した（表４参照）。
ＳＴＫＳ及びＰＬＴ１に対するＨ・TM２でのこのパター
ンは、Trowbridgeらによって報告されたコールターＳ＋
システムに対し、TECHNICON H6000TMシステムを用いて
得られたパターンと一致した（E.A.Trowbridgeら, 198
5, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-2382）。Tr
owbridgeらの論文で報告されたように、（TECHNICON Ｈ
・TM２システムと同様に）TECHNICON H6000TMシステム
では、血小板体積は高角度散乱強度に比例する（H6000
TMで５−１０度、及びＨ・TM２システムで５−１５
度）。本発明の詳細な説明で先に説明したように、Mie
散乱理論では、これらの角度への散乱は屈折率に敏感で
あることが示されている。血小板をex vivoで加齢する
と、水の取り込みのためにそれらは膨潤し、屈折性が低
くなる（S.HolmeとS.Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Me
d., 96:480-493）。この膨潤によって高角度散乱強度は
減少し、従ってＭＰＶが実際には増加しているときにH6
000TM及びＨ・TM２システムでＭＰＶの減少が報告され
ることになる。しかしながら、コールターＳ＋システム
及びコールターＳＴＫＳシステムによって、また他の開
口インピーダンス装置によって得られる測定値によれ
ば、血小板体積は電気的インピーダンスに比例する。従
って、これらの後者のシステムでは、細胞が膨潤するに
つれてインピーダンスが増加するため、膨潤に起因する
ＭＰＶの増加が正しく報告される。本発明のＰＬＴ１シ
ステムは、上記のように、Mie 散乱理論を用いて低−及
び高−角度散乱信号を体積及び屈折率に変換するため、
ＰＬＴ１システム及び方法でも膨潤に起因するＭＰＶの
増加が正しく報告される。
【００９８】ＲＢＣ数：本発明のＰＬＴ１システムで測
定したＲＢＣ数は、共に受け入れられているＲＢＣ計数
装置であるTECHNICON Ｈ・TM２システム及びコールター
ＳＴＫＳシステムで測定したＲＢＣ数とよく合致してい
た。 ＭＰＭ：図４は、典型的でかつ代表的なＰＬＴ１血小板
乾燥質量ヒストグラムを示し、血小板乾燥質量がサンプ
ル内で対数−正規的に分布していることが示唆される。
このことは電子顕微鏡による研究の結果（G.F.BahrとE.
Zeitler, 1965,Lab. Invest., 14(6):217-239）及び密
度勾配測定に基づく結論（L.CorashとB.Shafer, 1982,
Blood, 60(1):166-171）と一致する。ＰＬＴ１システム
の測定によれば、室温に１時間保存した正常サンプルの
典型的なＭＰＭ値は２．０２ｐｇである。この値は、そ
れぞれ２．５、２．８、２．０６、２．１、２．０６ｐ
ｇである公表された値のほとんどと非常によく合致する
（G.F.BahrとE.Zeitler,1965,Lab. Invest., 14(6):217
-2393；F.Gorsteinら, 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:
938-950;S.Karpatkin, 1977, Hematology. 2nd Ed. Mc
Graw-Hill, N.Y., pp.1176-1178;T.C.Bithell, 1993の
中の“血小板の組成(Composition of platelets)”, Wi
ntrobe's Clinical Hematology, 9th Ed. Vol.1. Leaと
Febiger, Philadelphia, PA., pp.511-529の中の“血小
板と巨核球(Platelets and megakaryocytes)” ;及びE.
E.WoodsideとW.Kocholaty, 1960,Blood, 16:1173-118
3）。２４時間を超えるとＭＰＭ値はわずかに、すなわ
ち、サンプルを室温で保存した場合は３．５％、サンプ
ルを４℃で保存した場合は１．５％だけ落ちた（表
１）。
定したＲＢＣ数は、共に受け入れられているＲＢＣ計数
装置であるTECHNICON Ｈ・TM２システム及びコールター
ＳＴＫＳシステムで測定したＲＢＣ数とよく合致してい
た。 ＭＰＭ：図４は、典型的でかつ代表的なＰＬＴ１血小板
乾燥質量ヒストグラムを示し、血小板乾燥質量がサンプ
ル内で対数−正規的に分布していることが示唆される。
このことは電子顕微鏡による研究の結果（G.F.BahrとE.
Zeitler, 1965,Lab. Invest., 14(6):217-239）及び密
度勾配測定に基づく結論（L.CorashとB.Shafer, 1982,
Blood, 60(1):166-171）と一致する。ＰＬＴ１システム
の測定によれば、室温に１時間保存した正常サンプルの
典型的なＭＰＭ値は２．０２ｐｇである。この値は、そ
れぞれ２．５、２．８、２．０６、２．１、２．０６ｐ
ｇである公表された値のほとんどと非常によく合致する
（G.F.BahrとE.Zeitler,1965,Lab. Invest., 14(6):217
-2393；F.Gorsteinら, 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:
938-950;S.Karpatkin, 1977, Hematology. 2nd Ed. Mc
Graw-Hill, N.Y., pp.1176-1178;T.C.Bithell, 1993の
中の“血小板の組成(Composition of platelets)”, Wi
ntrobe's Clinical Hematology, 9th Ed. Vol.1. Leaと
Febiger, Philadelphia, PA., pp.511-529の中の“血小
板と巨核球(Platelets and megakaryocytes)” ;及びE.
E.WoodsideとW.Kocholaty, 1960,Blood, 16:1173-118
3）。２４時間を超えるとＭＰＭ値はわずかに、すなわ
ち、サンプルを室温で保存した場合は３．５％、サンプ
ルを４℃で保存した場合は１．５％だけ落ちた（表
１）。
【００９９】ＭＰＣ：図４はまた新鮮なサンプルにおけ
る、正常に分布している（すなわち、正常またはガウス
分布を示す）典型的、かつ代表的なＰＬＴ１血小板成分
濃度のヒストグラムを示す。これは、密度勾配測定の結
果（H.H.K.WatsonとC.A.Ludlam, 1986, Br. J. Hemato
l., 62:117-124; J.F.Martinら, 1983, Br. J. Hemato
l., 54:337-352）と一致する。室温で１時間保存したサ
ンプルにおいてＰＬＴ１システムを用いて得られたＭＰ
Ｃの平均値は２５．６ｇ／ｄｌであった。この値を公表
されている固体の％値と比較するためには、非−水性成
分の密度を決定することが必要である。記載したよう
に、血小板のタンパク質／脂質／炭水化物の相対組成は
５７／１９／８．５であり、これらの成分のそれぞれの
密度は、それぞれ１．３３ｇ／ｍｌ、０．９３ｇ／ｍｌ
及び１．５０ｇ／ｍｌである（R.BarerとS.Joseph, 195
4, “細胞化学の一般法(General Cytochemical Method
s)”, Quarterly Journal of Microscopical Science,
95:399-423）；ゆえに固体成分の平均密度は１．２６ｇ
／ｍｌである。従って、血小板１ｄｌ中で血小板成分２
５．６ｇの占める体積は以下のように計算される：
る、正常に分布している（すなわち、正常またはガウス
分布を示す）典型的、かつ代表的なＰＬＴ１血小板成分
濃度のヒストグラムを示す。これは、密度勾配測定の結
果（H.H.K.WatsonとC.A.Ludlam, 1986, Br. J. Hemato
l., 62:117-124; J.F.Martinら, 1983, Br. J. Hemato
l., 54:337-352）と一致する。室温で１時間保存したサ
ンプルにおいてＰＬＴ１システムを用いて得られたＭＰ
Ｃの平均値は２５．６ｇ／ｄｌであった。この値を公表
されている固体の％値と比較するためには、非−水性成
分の密度を決定することが必要である。記載したよう
に、血小板のタンパク質／脂質／炭水化物の相対組成は
５７／１９／８．５であり、これらの成分のそれぞれの
密度は、それぞれ１．３３ｇ／ｍｌ、０．９３ｇ／ｍｌ
及び１．５０ｇ／ｍｌである（R.BarerとS.Joseph, 195
4, “細胞化学の一般法(General Cytochemical Method
s)”, Quarterly Journal of Microscopical Science,
95:399-423）；ゆえに固体成分の平均密度は１．２６ｇ
／ｍｌである。従って、血小板１ｄｌ中で血小板成分２
５．６ｇの占める体積は以下のように計算される：
【０１００】２５．６ｇ×（１ｍｌ／１．２６ｇ）＝２
０．３ｍｌまたは０．２０３ｄｌ。ｄｌ当たりの残りの
体積（すなわち水）は：１．０００ｄｌ−０．２０３ｄ
ｌ＝０．７９７ｄｌ。１ｇ／ｍｌの密度では、この体積
の水の重量は７９．７ｇである。従って固体の％＝（２
５．６／（７９．７＋２５．６））×１００＝２４．３
％である。上記のように、もしＫ3ＥＤＴＡが血小板を
８％膨潤させているとすれば、固体の％＝２５．８％で
ある。この２４．３％から２５．８％の範囲は、公表さ
れている値、すなわち２３％から２５．４％の範囲に近
い（F.Gorsteinら, 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:938
-950;S.Karpatkin, Hematology. 2nd Ed. 1977. McGraw
-Hill, N.Y., pp.1176-1178の中の“血小板の組成(Comp
ositionof platelets)”）。
０．３ｍｌまたは０．２０３ｄｌ。ｄｌ当たりの残りの
体積（すなわち水）は：１．０００ｄｌ−０．２０３ｄ
ｌ＝０．７９７ｄｌ。１ｇ／ｍｌの密度では、この体積
の水の重量は７９．７ｇである。従って固体の％＝（２
５．６／（７９．７＋２５．６））×１００＝２４．３
％である。上記のように、もしＫ3ＥＤＴＡが血小板を
８％膨潤させているとすれば、固体の％＝２５．８％で
ある。この２４．３％から２５．８％の範囲は、公表さ
れている値、すなわち２３％から２５．４％の範囲に近
い（F.Gorsteinら, 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:938
-950;S.Karpatkin, Hematology. 2nd Ed. 1977. McGraw
-Hill, N.Y., pp.1176-1178の中の“血小板の組成(Comp
ositionof platelets)”）。
【０１０１】ＭＰＣは２４時間を超えると顕著に減少し
た；４℃で保存したサンプルでは１４％、室温で保存し
たサンプルでは２２％減少した（表１）。種々の時間及
び温度で測定したＭＰＣの統計を表６に表す。データか
らは、室温において、１、８、及び２４時間で分析した
サンプルのＭＰＣ値がそれぞれ１．５ＳＤ内で互いに重
ならないことが示される。よってそのＭＰＣを測定する
ことによって、サンプルが１、８または２４時間齢のも
のであるかどうかを８７％の信頼性で決定することがで
きる。そのために、ＭＰＣ値はin vitroでのサンプル年
齢をモニターするために使用することができる。ＭＣ
Ｖ、ＭＣＨＣ、ＨＣＴ及びＭＰＶのような種々の血液学
的パラメーターはサンプル年齢に敏感である。従って、
サンプル年齢の影響を無視し、また時間のたったサンプ
ルから正確で信頼し得るデータが得られなければ、大赤
血球増多症、血色素減少、貧血、また血小板血栓症のお
それと言ったような条件に関しては誤った結論が引き出
されることがある。従って、本発明の血小板分析並びに
計数方法及びシステムを用い、ＭＰＣ値を介してサンプ
ル年齢をモニターすることは、重要な臨床的価値がある
と考えられる。
た；４℃で保存したサンプルでは１４％、室温で保存し
たサンプルでは２２％減少した（表１）。種々の時間及
び温度で測定したＭＰＣの統計を表６に表す。データか
らは、室温において、１、８、及び２４時間で分析した
サンプルのＭＰＣ値がそれぞれ１．５ＳＤ内で互いに重
ならないことが示される。よってそのＭＰＣを測定する
ことによって、サンプルが１、８または２４時間齢のも
のであるかどうかを８７％の信頼性で決定することがで
きる。そのために、ＭＰＣ値はin vitroでのサンプル年
齢をモニターするために使用することができる。ＭＣ
Ｖ、ＭＣＨＣ、ＨＣＴ及びＭＰＶのような種々の血液学
的パラメーターはサンプル年齢に敏感である。従って、
サンプル年齢の影響を無視し、また時間のたったサンプ
ルから正確で信頼し得るデータが得られなければ、大赤
血球増多症、血色素減少、貧血、また血小板血栓症のお
それと言ったような条件に関しては誤った結論が引き出
されることがある。従って、本発明の血小板分析並びに
計数方法及びシステムを用い、ＭＰＣ値を介してサンプ
ル年齢をモニターすることは、重要な臨床的価値がある
と考えられる。
【０１０２】実施例２ 本実施例では、およそ７０種の異常血液サンプル（Memo
rial Sloan KetteringCancer Center(MSKCC), New York
から入手したもの）で試験した本発明の増加ゲイン（ex
panded gain）ＰＬＴチャンネル（ＰＬＴ１）及び血小
板分析法の実施について記載する。全てのサンプルは10
0,000／μｌ未満の血小板数を有し、実施例１に記載の
ように分析した。更に、自動血小板計数の妥当性が現時
点において全ての血小板減少症のサンプルではよく確立
されていないため、血小板数は位相差顕微鏡で測定した
（K.Mayerら, 1980, Am. J. Clin. Pathol., 74:135-15
0; P.J.CornbleetとS.Kessinger, 1985,Am. J. Clin. P
athol., 83:78-80）。サンプルは採取のおよそ４時間後
にBayer Corporationに運ばれ、到着後すぐに室温で分
析した。室温で２８時間保存した後、サンプルを再度分
析した。結果を下記及び表７及び図１２に示す。
rial Sloan KetteringCancer Center(MSKCC), New York
から入手したもの）で試験した本発明の増加ゲイン（ex
panded gain）ＰＬＴチャンネル（ＰＬＴ１）及び血小
板分析法の実施について記載する。全てのサンプルは10
0,000／μｌ未満の血小板数を有し、実施例１に記載の
ように分析した。更に、自動血小板計数の妥当性が現時
点において全ての血小板減少症のサンプルではよく確立
されていないため、血小板数は位相差顕微鏡で測定した
（K.Mayerら, 1980, Am. J. Clin. Pathol., 74:135-15
0; P.J.CornbleetとS.Kessinger, 1985,Am. J. Clin. P
athol., 83:78-80）。サンプルは採取のおよそ４時間後
にBayer Corporationに運ばれ、到着後すぐに室温で分
析した。室温で２８時間保存した後、サンプルを再度分
析した。結果を下記及び表７及び図１２に示す。
【０１０３】ＰＬＴ数：本発明のＰＬＴ１システム及び
方法を用いて得られた血小板数は、室温で４時間保存し
たサンプルについて位相差顕微鏡を用いて得られる血小
板数とよく合致した。ＰＬＴ１血小板数はまた、その一
つを下記の実施例３で更に記載した顕著な例外と共に、
TECHNICON H.TM2システムの計算値及びコールターSTKS
システムの計算値とも一致した。
方法を用いて得られた血小板数は、室温で４時間保存し
たサンプルについて位相差顕微鏡を用いて得られる血小
板数とよく合致した。ＰＬＴ１血小板数はまた、その一
つを下記の実施例３で更に記載した顕著な例外と共に、
TECHNICON H.TM2システムの計算値及びコールターSTKS
システムの計算値とも一致した。
【０１０４】ＭＰＶ：正常サンプルでは逆であるが、異
常サンプルでは、TECHNICON H.TMシステム及びコールタ
ーSTKSシステムの結果は、ＰＬＴ１を用いて得られた結
果とよりも、互いでよく一致していた。この理由は、代
表的な血小板体積ヒストグラムを比較すれば明らかにな
る。図８は、TECHNICON H.TM2システム及びコールターS
TKSシステムによって作成した血小板体積ヒストグラム
で、低いチャンネルにおいて妨害粒子が含まれることを
示す。これらの粒子は血小板体積の対数−正規分布を歪
め、システムをＭＰＶ値が報告できないものにする。反
対に、本発明のＰＬＴ１法では、その血小板体積の対数
−正規分布で示すように、これらのタイプの妨害粒子の
ほとんどが排除された。従って、ＰＬＴ１法では他のシ
ステムより高いＭＰＶ値が報告された。更に、図９Ａ−
９Ｄには、H.TM2システム及びコールターSTKSシステム
の測定値によれば、ＭＰＶはＰＬＴ数（20,000個／μｌ
まで）に直接関連していることが示されるが、一方図１
０Ａ及び１０Ｂには、ＰＬＴ１測定値によればＭＰＶ及
びＰＬＴ数は逆の関係があることが示される。更に、文
献の報告によれば、ＭＰＶとＰＬＴ数は、正常サンプル
及びほとんどの血小板減少症サンプルにおいて逆の関係
がある（J.D.Bessmanら, 1982, Am. J. Clin. Path., 7
8:150-153; J.LevinとJ.D.Bessman, 1983,J. Lab. Cli
n. Med., 101:295-307; J.D.Bessmanら, 1981, Am. J.
Clin. Path., 76:289-293; C.Giles, 1981,Br. J. Hema
tol., 48:31-37）。従って文献の報告は本発明のＰＬＴ
１システムによって得られた結果と一致する。また、染
色した血液スライドフィルムでの顕微鏡による相対的な
大きさの測定では、ＴＣＰサンプルが正常サンプルより
も比較的大きな血小板を含有していることが示された。
正常サンプルでは、３つのシステム全てでＭＰＶとＰＬ
Ｔ数が逆に関連していることが示され（図１１）、この
分野でこれらによって報告されている知見と一致した。
常サンプルでは、TECHNICON H.TMシステム及びコールタ
ーSTKSシステムの結果は、ＰＬＴ１を用いて得られた結
果とよりも、互いでよく一致していた。この理由は、代
表的な血小板体積ヒストグラムを比較すれば明らかにな
る。図８は、TECHNICON H.TM2システム及びコールターS
TKSシステムによって作成した血小板体積ヒストグラム
で、低いチャンネルにおいて妨害粒子が含まれることを
示す。これらの粒子は血小板体積の対数−正規分布を歪
め、システムをＭＰＶ値が報告できないものにする。反
対に、本発明のＰＬＴ１法では、その血小板体積の対数
−正規分布で示すように、これらのタイプの妨害粒子の
ほとんどが排除された。従って、ＰＬＴ１法では他のシ
ステムより高いＭＰＶ値が報告された。更に、図９Ａ−
９Ｄには、H.TM2システム及びコールターSTKSシステム
の測定値によれば、ＭＰＶはＰＬＴ数（20,000個／μｌ
まで）に直接関連していることが示されるが、一方図１
０Ａ及び１０Ｂには、ＰＬＴ１測定値によればＭＰＶ及
びＰＬＴ数は逆の関係があることが示される。更に、文
献の報告によれば、ＭＰＶとＰＬＴ数は、正常サンプル
及びほとんどの血小板減少症サンプルにおいて逆の関係
がある（J.D.Bessmanら, 1982, Am. J. Clin. Path., 7
8:150-153; J.LevinとJ.D.Bessman, 1983,J. Lab. Cli
n. Med., 101:295-307; J.D.Bessmanら, 1981, Am. J.
Clin. Path., 76:289-293; C.Giles, 1981,Br. J. Hema
tol., 48:31-37）。従って文献の報告は本発明のＰＬＴ
１システムによって得られた結果と一致する。また、染
色した血液スライドフィルムでの顕微鏡による相対的な
大きさの測定では、ＴＣＰサンプルが正常サンプルより
も比較的大きな血小板を含有していることが示された。
正常サンプルでは、３つのシステム全てでＭＰＶとＰＬ
Ｔ数が逆に関連していることが示され（図１１）、この
分野でこれらによって報告されている知見と一致した。
【０１０５】現時点において、ＭＰＶは、種々の血液学
的障害を区別するために使用できるにも関わらず、血小
板分析では大抵無視されるパラメーターである（J.Zeig
lerら, 1978, Blood, 51(3):479-486; M.Kraytman, 197
3,Blood, 41(4):587-597;J.D.Bessmanら, 1982, Am. J.
Clin. Path., 78:150-153; J.LevinとJ.D.Bessman, 19
83,J. Lab. Clin. Med., 101:295-307; C.Giles, 1981,
Br. J. Hematol., 48:31-37; A.Eldorら, Br. Med. Jou
rnal, 1982, 285:397-400; H.A.Cameronら, Br. Med. J
ournal, 1983, 287:449-451; J.F.Martinら, Br. Med.
Journal, 1983, 287:486-488; G.A.Threatte, Clin. La
b. Med., 1993, 13(4):937-950）。この分野でＭＰＶ値
を軽視する理由は、本発明以前には、以下の起こり得る
理由でＭＰＶ値は信頼できないと考えられたことである
（E.A.Trowbridgeら, 1985, Clin. Phys. Physiol. Mea
s., 6(3):221-238; G.A.Threatteら, 1984, Am. J. Cli
n. Path., 81:769-772）： １）伝統的なTECHNICON H.TMシステム及び開口（apertu
re）インピーダンス装置でのＭＰＶ値において、しばし
ば血液サンプルの保存条件に起因する顕著な違いが得ら
れた（E.A.Trowbridgeら, 1985, Clin. Phys. Physiol.
Meas., 6(3):221-238; G.A.Threatte, 1993,Clin. La
b. Med., 13(4):937-950; U.Lippiら,1987, Am. J. Cli
n. Pathol., 87:391-393）； ２）伝統的なＨ・TMシステムでも開口インピーダンス装
置でも、上記のように血小板減少症サンプルでの正確な
ＭＰＶ値が報告されていない；及び ３）ＭＰＶは採取及び保存の条件に敏感である（C.B.Th
ompsonら, 1983, Am.J. Clin. Path., 80:327-332; S.M
urphyとF.H.Gardner, 1971,J. Clin. Invest., 50:370-
377; B.S.FullとM.B.Zucker, 1965, Proc. Soc. Exp. B
iol. Med., 120:296-301; J.G.WhiteとW.Krivit, 1967,
Blood, 30(5):625-635）。
的障害を区別するために使用できるにも関わらず、血小
板分析では大抵無視されるパラメーターである（J.Zeig
lerら, 1978, Blood, 51(3):479-486; M.Kraytman, 197
3,Blood, 41(4):587-597;J.D.Bessmanら, 1982, Am. J.
Clin. Path., 78:150-153; J.LevinとJ.D.Bessman, 19
83,J. Lab. Clin. Med., 101:295-307; C.Giles, 1981,
Br. J. Hematol., 48:31-37; A.Eldorら, Br. Med. Jou
rnal, 1982, 285:397-400; H.A.Cameronら, Br. Med. J
ournal, 1983, 287:449-451; J.F.Martinら, Br. Med.
Journal, 1983, 287:486-488; G.A.Threatte, Clin. La
b. Med., 1993, 13(4):937-950）。この分野でＭＰＶ値
を軽視する理由は、本発明以前には、以下の起こり得る
理由でＭＰＶ値は信頼できないと考えられたことである
（E.A.Trowbridgeら, 1985, Clin. Phys. Physiol. Mea
s., 6(3):221-238; G.A.Threatteら, 1984, Am. J. Cli
n. Path., 81:769-772）： １）伝統的なTECHNICON H.TMシステム及び開口（apertu
re）インピーダンス装置でのＭＰＶ値において、しばし
ば血液サンプルの保存条件に起因する顕著な違いが得ら
れた（E.A.Trowbridgeら, 1985, Clin. Phys. Physiol.
Meas., 6(3):221-238; G.A.Threatte, 1993,Clin. La
b. Med., 13(4):937-950; U.Lippiら,1987, Am. J. Cli
n. Pathol., 87:391-393）； ２）伝統的なＨ・TMシステムでも開口インピーダンス装
置でも、上記のように血小板減少症サンプルでの正確な
ＭＰＶ値が報告されていない；及び ３）ＭＰＶは採取及び保存の条件に敏感である（C.B.Th
ompsonら, 1983, Am.J. Clin. Path., 80:327-332; S.M
urphyとF.H.Gardner, 1971,J. Clin. Invest., 50:370-
377; B.S.FullとM.B.Zucker, 1965, Proc. Soc. Exp. B
iol. Med., 120:296-301; J.G.WhiteとW.Krivit, 1967,
Blood, 30(5):625-635）。
【０１０６】逆に、本発明に従ってＰＬＴ１を用いて得
られるＭＰＶの結果は、以下の理由によって価値があ
る： １）独立した方法、すなわちＰＬＴ１及び開口インピー
ダンスにより、種々の条件下で保存した正常サンプルで
得られた結果の質的及び量的な一致によって、ＰＬＴ１
と開口インピーダンスのＭＰＶ測定値が共により確実な
立場におかれる； ２）血小板減少症のサンプルでのＰＬＴ１のＭＰＶの結
果は、種々の条件下で報告されている文献の結果と質的
に一致する；そして ３）先に論じたように、ＰＬＴ１ではＭＰＣを測定する
ことによってＭＰＶに対するサンプルの保存の影響がモ
ニターされる。
られるＭＰＶの結果は、以下の理由によって価値があ
る： １）独立した方法、すなわちＰＬＴ１及び開口インピー
ダンスにより、種々の条件下で保存した正常サンプルで
得られた結果の質的及び量的な一致によって、ＰＬＴ１
と開口インピーダンスのＭＰＶ測定値が共により確実な
立場におかれる； ２）血小板減少症のサンプルでのＰＬＴ１のＭＰＶの結
果は、種々の条件下で報告されている文献の結果と質的
に一致する；そして ３）先に論じたように、ＰＬＴ１ではＭＰＣを測定する
ことによってＭＰＶに対するサンプルの保存の影響がモ
ニターされる。
【０１０７】
【表６】
【０１０８】ＲＢＣ数：ＰＬＴ１システムの結果は、TE
CHNICON H.TM2及びコールターSTKS法の分析から得られ
た結果とよく一致した。
CHNICON H.TM2及びコールターSTKS法の分析から得られ
た結果とよく一致した。
【０１０９】ＭＰＭ：病院サンプルでは血小板乾燥質量
は対数−正規分布しており、この分布は分析でわずか１
５０種の生の血小板の信号が得られるサンプルにおいて
も認めることができる（図８）。室温で４時間保存した
病院サンプルにおいては、典型的なＭＰＭ値は２．０４
ｐｇであり、これは実際上室温で１時間保存した正常サ
ンプルで得られる値に等しかった。従って、本発明のＰ
ＬＴ１システムを用いることにより、ＭＰＭは病院サン
プル及び正常サンプルの双方において同じ時間安定性を
示した。
は対数−正規分布しており、この分布は分析でわずか１
５０種の生の血小板の信号が得られるサンプルにおいて
も認めることができる（図８）。室温で４時間保存した
病院サンプルにおいては、典型的なＭＰＭ値は２．０４
ｐｇであり、これは実際上室温で１時間保存した正常サ
ンプルで得られる値に等しかった。従って、本発明のＰ
ＬＴ１システムを用いることにより、ＭＰＭは病院サン
プル及び正常サンプルの双方において同じ時間安定性を
示した。
【０１１０】図７は、室温で１時間保存したサンプルで
のＭＰＭ値（Ｘ軸）に対する、種々の時間及び温度条件
下での正常サンプルのＭＰＭ値（Ｙ軸）を示すグラフを
表す。２ｐｇ（正常での平均値）に集中するＭＰＭ値の
一つのクラスターが示される。図８は異常サンプル集団
での同様なグラフを示し、２つのクラスターの存在（一
つは２．０ｐｇに、一つは２．３ｐｇに集中している）
を示す。クラスターの違いは潜在的な血栓形成（thromb
otic）活性の差異に関連しているようである。病院サン
プル、すなわち異常サンプルでのより高いＭＰＭ値は、
これらの異常サンプルにおける血小板が正常サンプルの
ものよりもより強い潜在的活性があることを示してい
る。先に記載したように、本発明の血小板分析法及びこ
れから得られるＭＰＭ値から、高いＭＰＭ値と疾病状態
及び／または疾病治療の方法との関係を評価する手段が
提供される。
のＭＰＭ値（Ｘ軸）に対する、種々の時間及び温度条件
下での正常サンプルのＭＰＭ値（Ｙ軸）を示すグラフを
表す。２ｐｇ（正常での平均値）に集中するＭＰＭ値の
一つのクラスターが示される。図８は異常サンプル集団
での同様なグラフを示し、２つのクラスターの存在（一
つは２．０ｐｇに、一つは２．３ｐｇに集中している）
を示す。クラスターの違いは潜在的な血栓形成（thromb
otic）活性の差異に関連しているようである。病院サン
プル、すなわち異常サンプルでのより高いＭＰＭ値は、
これらの異常サンプルにおける血小板が正常サンプルの
ものよりもより強い潜在的活性があることを示してい
る。先に記載したように、本発明の血小板分析法及びこ
れから得られるＭＰＭ値から、高いＭＰＭ値と疾病状態
及び／または疾病治療の方法との関係を評価する手段が
提供される。
【０１１１】ＭＰＣ：室温で４時間保存した異常サンプ
ルは２２．１ｇ／ｄｌ（表６）の典型的なＭＰＣ値を有
し、室温で８時間保存した正常サンプルで測定した値よ
りも０．７ｇ／ｄｌ低かった。ＰＬＴ１を用いて得られ
たＭＰＣ値は病院サンプルで正常サンプルと同じ時間依
存性を示した。
ルは２２．１ｇ／ｄｌ（表６）の典型的なＭＰＣ値を有
し、室温で８時間保存した正常サンプルで測定した値よ
りも０．７ｇ／ｄｌ低かった。ＰＬＴ１を用いて得られ
たＭＰＣ値は病院サンプルで正常サンプルと同じ時間依
存性を示した。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】実施例３ 使用する測定法に関わらず、実施例２で記載した異常サ
ンプルのほとんどは類似した血小板数を与えるが、小数
の異常サンプルでは分析法に依存して大きく異なる結果
が得られた。血小板減少症のドナー由来のこうしたサン
プルの一つについて、本実施例で記載する。表８には血
小板数の比較データ（サンプルは自動システムで２回実
施した）を示し、図１３には３種の自動化方法のそれぞ
れで得られるヒストグラムを示す。それらに示されるよ
うに、本発明のＰＬＴ１システムのみが２つの測定値の
双方で位相差顕微鏡による計数値と一致する血小板数を
与えた。TECHNICON H.TM2の血小板計数値は位相差顕微
鏡での計数値のおよそ２倍であった。コールターSTKSシ
ステムは２つの値の一方のみで血小板計数値を正しく報
告し、他方では空白となった。また、コールターSTKS及
びTECHNICON H.TM2の体積ヒストグラムは、赤血球断片
の妨害が含まれるため、対数−正規分布ではなかった。
従って、これら２つのシステムでは、血液塗末標本の顕
微鏡観察に基づく実際の値よりも低いＭＰＶ値を与え
た。ＰＬＴ１法及びシステムによって作成された体積ヒ
ストグラムは対数−正規分布であり、報告されたＭＰＶ
は血小板減少症サンプルでレンジ内にあり、顕微鏡観察
と質的にも一致していた。更に、ＰＬＴ１システムによ
って測定された血小板成分濃度はほぼ正規分布し、かつ
血小板乾燥質量は対数正規分布しており、本発明によっ
て異常サンプル中で血小板として計数された粒子は、同
様に血小板の物理的性質を有することが証明された。
ンプルのほとんどは類似した血小板数を与えるが、小数
の異常サンプルでは分析法に依存して大きく異なる結果
が得られた。血小板減少症のドナー由来のこうしたサン
プルの一つについて、本実施例で記載する。表８には血
小板数の比較データ（サンプルは自動システムで２回実
施した）を示し、図１３には３種の自動化方法のそれぞ
れで得られるヒストグラムを示す。それらに示されるよ
うに、本発明のＰＬＴ１システムのみが２つの測定値の
双方で位相差顕微鏡による計数値と一致する血小板数を
与えた。TECHNICON H.TM2の血小板計数値は位相差顕微
鏡での計数値のおよそ２倍であった。コールターSTKSシ
ステムは２つの値の一方のみで血小板計数値を正しく報
告し、他方では空白となった。また、コールターSTKS及
びTECHNICON H.TM2の体積ヒストグラムは、赤血球断片
の妨害が含まれるため、対数−正規分布ではなかった。
従って、これら２つのシステムでは、血液塗末標本の顕
微鏡観察に基づく実際の値よりも低いＭＰＶ値を与え
た。ＰＬＴ１法及びシステムによって作成された体積ヒ
ストグラムは対数−正規分布であり、報告されたＭＰＶ
は血小板減少症サンプルでレンジ内にあり、顕微鏡観察
と質的にも一致していた。更に、ＰＬＴ１システムによ
って測定された血小板成分濃度はほぼ正規分布し、かつ
血小板乾燥質量は対数正規分布しており、本発明によっ
て異常サンプル中で血小板として計数された粒子は、同
様に血小板の物理的性質を有することが証明された。
【０１１４】
【表８】
【０１１５】実施例４ 本実施例では、in vitroでのトロンビンによる血小板の
活性化に対する用量応答性を測定するために実施した実
験について記載する。これらの実験において、血液サン
プルは非喫煙者で、アスピリン治療を行っていない正常
な成人ドナーから採取した。サンプルは抗凝固剤クエン
酸ナトリウム及びＫ3ＥＤＴＡの双方の中に採取した。
Ｋ3ＥＤＴＡを含有する抗凝固剤の使用に基づく結果
を、クエン酸ナトリウムを用いたものと比較すること
で、本発明の新規な方法を使用する血小板活性化研究に
おけるＫ3ＥＤＴＡの有用性が証明される。
活性化に対する用量応答性を測定するために実施した実
験について記載する。これらの実験において、血液サン
プルは非喫煙者で、アスピリン治療を行っていない正常
な成人ドナーから採取した。サンプルは抗凝固剤クエン
酸ナトリウム及びＫ3ＥＤＴＡの双方の中に採取した。
Ｋ3ＥＤＴＡを含有する抗凝固剤の使用に基づく結果
を、クエン酸ナトリウムを用いたものと比較すること
で、本発明の新規な方法を使用する血小板活性化研究に
おけるＫ3ＥＤＴＡの有用性が証明される。
【０１１６】トロンビンで誘起される血小板の活性化
は、フィコエリトリン結合モノクローナル抗体、ＣＤ６
２−ＰＥを用い、α−顆粒タンパク質（ＧＭＰ−１４
０）の細胞表面での発現の増加を蛍光フローサイトメト
リーで検出することによって測定した。ＧＭＰ−１４０
の発現はα−顆粒の放出と関連している。この分析は、
Michelsonらの記載したテトラペプチドであるグリシル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリン（ＧＰ
ＲＰ）の封入によって可能となる（A.D.Michelsonら, 1
991, Blood, 77:770-779）。ＧＰＲＰは血小板の凝集及
びフィブリンの凝固を阻害し、従って細胞ごとの分析が
可能になる。サンプル調製：
は、フィコエリトリン結合モノクローナル抗体、ＣＤ６
２−ＰＥを用い、α−顆粒タンパク質（ＧＭＰ−１４
０）の細胞表面での発現の増加を蛍光フローサイトメト
リーで検出することによって測定した。ＧＭＰ−１４０
の発現はα−顆粒の放出と関連している。この分析は、
Michelsonらの記載したテトラペプチドであるグリシル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリン（ＧＰ
ＲＰ）の封入によって可能となる（A.D.Michelsonら, 1
991, Blood, 77:770-779）。ＧＰＲＰは血小板の凝集及
びフィブリンの凝固を阻害し、従って細胞ごとの分析が
可能になる。サンプル調製：
【０１１７】全血を、０．３５％ウシ血清アルブミンを
含有するように補充したＰＢＳで１：１０に希釈した。
希釈した全血の一部（３００μｌ）を２．５ｍＭ ＧＰ
ＲＰ（最終濃度）の存在下で５分間インキュベートし
た。図１４Ａ−Ｄに示すように、α−トロンビンを最終
濃度０．００２Ｕ／ｍｌから０．０８７Ｕ／ｍｌで試験
サンプルに添加した。対照サンプルにはＰＢＳを添加し
た。サンプルを室温で１５分間インキュベートし、次い
で１％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で１：１に希
釈し、室温で３０分間インキュベートした。表面レセプ
ターＧＰ１ｂＩＸ（ＣＤ４２ａ、ＦＩＴＣ結合及びＣＤ
６２−ＰＥ）を標的とする飽和濃度の血小板特異的モノ
クローナル抗体を蛍光フローサイトメトリーで分析する
全てのサンプルに添加し、サンプルを１５分間インキュ
ベートした。この段階は、本発明に従って実施する方法
によって分析するサンプルでは省略した。サンプルを分
析する前に、ＰＢＳを最終希釈１：６００となるように
添加した。
含有するように補充したＰＢＳで１：１０に希釈した。
希釈した全血の一部（３００μｌ）を２．５ｍＭ ＧＰ
ＲＰ（最終濃度）の存在下で５分間インキュベートし
た。図１４Ａ−Ｄに示すように、α−トロンビンを最終
濃度０．００２Ｕ／ｍｌから０．０８７Ｕ／ｍｌで試験
サンプルに添加した。対照サンプルにはＰＢＳを添加し
た。サンプルを室温で１５分間インキュベートし、次い
で１％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で１：１に希
釈し、室温で３０分間インキュベートした。表面レセプ
ターＧＰ１ｂＩＸ（ＣＤ４２ａ、ＦＩＴＣ結合及びＣＤ
６２−ＰＥ）を標的とする飽和濃度の血小板特異的モノ
クローナル抗体を蛍光フローサイトメトリーで分析する
全てのサンプルに添加し、サンプルを１５分間インキュ
ベートした。この段階は、本発明に従って実施する方法
によって分析するサンプルでは省略した。サンプルを分
析する前に、ＰＢＳを最終希釈１：６００となるように
添加した。
【０１１８】サンプル分析 ４８８ｎｍで作動するアルゴンイオンレーザーを備えた
FACStation-CellQuestacquisition及び分析ソフトウェ
ア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いてＦＡＣ
Ｓｃａｎフローサイトメトリーでサンプルを分析した。
ＦＩＴＣ及びフィコエリトリンの蛍光は、それぞれ５２
５ｎｍ及び５７５ｎｍのバンド通過フィルターを用いて
検出した。血小板は、ＦＩＴＣ陽性度（緑色の蛍光、Ｆ
Ｌ１）と共に、側方散乱（ＳＳＣ）に対するその前方散
乱（ＦＳＣ）のプロファイルによって同定した。活性化
した血小板はＰＥ−陽性度（赤色の蛍光、ＦＬ２）、す
なわちＦＳＣ対ＦＬ２によって同定した。
FACStation-CellQuestacquisition及び分析ソフトウェ
ア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いてＦＡＣ
Ｓｃａｎフローサイトメトリーでサンプルを分析した。
ＦＩＴＣ及びフィコエリトリンの蛍光は、それぞれ５２
５ｎｍ及び５７５ｎｍのバンド通過フィルターを用いて
検出した。血小板は、ＦＩＴＣ陽性度（緑色の蛍光、Ｆ
Ｌ１）と共に、側方散乱（ＳＳＣ）に対するその前方散
乱（ＦＳＣ）のプロファイルによって同定した。活性化
した血小板はＰＥ−陽性度（赤色の蛍光、ＦＬ２）、す
なわちＦＳＣ対ＦＬ２によって同定した。
【０１１９】光散乱ゲート及びＦＩＴＣ陽性度によって
血小板を同定した後、活性化のマーカーであるＣＤ６２
の結合を、ＰＥ蛍光について５，０００個の血小板の挙
動を分析することによって決定した。イソタイプ抗体Ｉ
ｇＧを用いて測定した結合のバックグラウンドはそれぞ
れのサンプルから差し引いた。全てのサンプルについ
て、結果を平均蛍光強度（ＦＩ、任意の単位）で報告し
た。ＦＩもＭＰＣも任意の閾値の設定を必要としないこ
とから、ＦＩは陽性率（％）よりもＭＰＣとの比較によ
り適している。更に、採取から２時間以内に本発明の吸
収／光散乱法によってサンプルを分析した。
血小板を同定した後、活性化のマーカーであるＣＤ６２
の結合を、ＰＥ蛍光について５，０００個の血小板の挙
動を分析することによって決定した。イソタイプ抗体Ｉ
ｇＧを用いて測定した結合のバックグラウンドはそれぞ
れのサンプルから差し引いた。全てのサンプルについ
て、結果を平均蛍光強度（ＦＩ、任意の単位）で報告し
た。ＦＩもＭＰＣも任意の閾値の設定を必要としないこ
とから、ＦＩは陽性率（％）よりもＭＰＣとの比較によ
り適している。更に、採取から２時間以内に本発明の吸
収／光散乱法によってサンプルを分析した。
【０１２０】本発明の方法、及び蛍光フローサイトメト
リーの方法論を、添加したトロンビンに対する血小板の
活性化を測定することによって比較した（図１４Ａ−１
４Ｄ）。結果から、本発明の光散乱法は、クエン酸ナト
リウム（白丸）及びＫ3ＥＤＴＡ（白四角）で凝固防止
した血液サンプルの双方においてトロンビンの用量に関
連した血小板の活性化を突き止めている。示されるよう
に、トロンビン濃度が増すにつれ、ＭＰＣが減少する。
リーの方法論を、添加したトロンビンに対する血小板の
活性化を測定することによって比較した（図１４Ａ−１
４Ｄ）。結果から、本発明の光散乱法は、クエン酸ナト
リウム（白丸）及びＫ3ＥＤＴＡ（白四角）で凝固防止
した血液サンプルの双方においてトロンビンの用量に関
連した血小板の活性化を突き止めている。示されるよう
に、トロンビン濃度が増すにつれ、ＭＰＣが減少する。
【０１２１】実施例５ 本実施例ではin vitroでのＫ3ＥＤＴＡ中での血小板の
自動活性化を測定するために実施した実験について記載
する。これらの実験において、血液サンプルは正常な成
人ドナーから抗凝固剤Ｋ3ＥＤＴＡ中にとった。トロン
ビンによる活性化を行わず、指示された時間にパラホル
ムアルデヒドを添加する以外、実施例４に記載したよう
にしてサンプルを調製し、分析した。表９にＫ3ＥＤＴ
Ａの存在下での血小板の自動活性化の経時変化の結果を
示す。
自動活性化を測定するために実施した実験について記載
する。これらの実験において、血液サンプルは正常な成
人ドナーから抗凝固剤Ｋ3ＥＤＴＡ中にとった。トロン
ビンによる活性化を行わず、指示された時間にパラホル
ムアルデヒドを添加する以外、実施例４に記載したよう
にしてサンプルを調製し、分析した。表９にＫ3ＥＤＴ
Ａの存在下での血小板の自動活性化の経時変化の結果を
示す。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】表９は、ＥＤＴＡ中に保存したサンプル中
の血小板が経時で増大する自動活性化を起こすことを示
している。従って、血小板活性化の蛍光による、また光
散乱による測定は、in vitroでのサンプル年齢を考慮し
なければならない。
の血小板が経時で増大する自動活性化を起こすことを示
している。従って、血小板活性化の蛍光による、また光
散乱による測定は、in vitroでのサンプル年齢を考慮し
なければならない。
【０１２４】実施例６ 本実施例ではex vivoでの血小板の活性化状態を測定す
るために実施した実験について記載する。これらの実験
において、血液サンプルは正常なヒトドナー及び３名の
糖尿病患者のドナーから得た。サンプルは抗凝固剤Ｋ3
ＥＤＴＡ中に採取した。トロンビンもパラホルムアルデ
ヒドも添加しない以外、上記実施例４に記載したように
してサンプルを調製した。採取７時間後にサンプルを分
析した。これらの分析の結果を表１０に示す。
るために実施した実験について記載する。これらの実験
において、血液サンプルは正常なヒトドナー及び３名の
糖尿病患者のドナーから得た。サンプルは抗凝固剤Ｋ3
ＥＤＴＡ中に採取した。トロンビンもパラホルムアルデ
ヒドも添加しない以外、上記実施例４に記載したように
してサンプルを調製した。採取７時間後にサンプルを分
析した。これらの分析の結果を表１０に示す。
【０１２５】
【表１０】
【０１２６】表１０は、ＭＰＣ及びＦＩ測定の双方が、
ex vivoでの血小板の活性化を示している血液サンプル
（糖尿病患者１及び２）とそうでないもの（糖尿病患者
３）を区別していることを示す。図１４Ａ−１４Ｄの実
験に基づいて予想された値よりもＦＩは高く、ＭＰＣは
低いことがわかる。このことから、３つの糖尿病患者の
サンプルは全て活性化されているが、第三のサンプルは
最初の２つよりも活性化の度合が低いことが示唆され
る。正常な血液サンプルでのＭＰＣは、正常サンプルに
おいても、ＥＤＴＡ溶液中への採取の７時間後に測定し
たＭＰＣは新鮮なサンプルよりも低いことを示してい
る。ＮＤは未決定であることを示す。ＭＰＣ値の下降及
びＦＩの上昇の理由は、上記の実施例５で示したよう
に、ＥＤＴＡ中で保存した血小板が経時で進行的に自動
活性化することである。それにも関わらず、ＦＩと同様
に、ＭＰＣはin vivoでの血小板の活性化をするサンプ
ルとそうでないサンプルとを区別する。
ex vivoでの血小板の活性化を示している血液サンプル
（糖尿病患者１及び２）とそうでないもの（糖尿病患者
３）を区別していることを示す。図１４Ａ−１４Ｄの実
験に基づいて予想された値よりもＦＩは高く、ＭＰＣは
低いことがわかる。このことから、３つの糖尿病患者の
サンプルは全て活性化されているが、第三のサンプルは
最初の２つよりも活性化の度合が低いことが示唆され
る。正常な血液サンプルでのＭＰＣは、正常サンプルに
おいても、ＥＤＴＡ溶液中への採取の７時間後に測定し
たＭＰＣは新鮮なサンプルよりも低いことを示してい
る。ＮＤは未決定であることを示す。ＭＰＣ値の下降及
びＦＩの上昇の理由は、上記の実施例５で示したよう
に、ＥＤＴＡ中で保存した血小板が経時で進行的に自動
活性化することである。それにも関わらず、ＦＩと同様
に、ＭＰＣはin vivoでの血小板の活性化をするサンプ
ルとそうでないサンプルとを区別する。
【０１２７】ここに引用した全ての特許出願、発行され
た特許、発表された論文及び文献、及び教科書の内容
は、その全体を参考としてここに組み入れる。本発明の
範囲及び精神から逸脱することなく上記構成及び方法に
種々の変更を加えることができるため、上記の説明に含
まれ、添付図面に示され、あるいは請求の範囲で定義さ
れた全ての内容は例示として解釈され、制限的な意味を
もつものではない。
た特許、発表された論文及び文献、及び教科書の内容
は、その全体を参考としてここに組み入れる。本発明の
範囲及び精神から逸脱することなく上記構成及び方法に
種々の変更を加えることができるため、上記の説明に含
まれ、添付図面に示され、あるいは請求の範囲で定義さ
れた全ての内容は例示として解釈され、制限的な意味を
もつものではない。
【図１】 散乱／散乱サイトグラム上での血小板体積
（Ｖ）対屈折率（ｎ）のマップを示す。
（Ｖ）対屈折率（ｎ）のマップを示す。
【図２】 ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプ
タンの油滴の散乱／散乱サイトグラムを示す。
タンの油滴の散乱／散乱サイトグラムを示す。
【図３】 赤血球、大きい血小板、赤血球ゴースト、血
小板、赤血球断片、および原点の破片の、粒子型マッピ
ング散乱／散乱サイトグラムにおける位置を示す。
小板、赤血球断片、および原点の破片の、粒子型マッピ
ング散乱／散乱サイトグラムにおける位置を示す。
【図４】 本発明の血小板測定法およびシステムを使用
した正常なサンプル結果を示す代表的サイトグラムおよ
びヒストグラムを示す。
した正常なサンプル結果を示す代表的サイトグラムおよ
びヒストグラムを示す。
【図５】 Ａ. 赤血球希釈剤に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−
抗凝固血液サンプルにおける血小板の分析から得られた
代表的サイトグラムを示す。Ｂ. 等張性リン酸緩衝溶液
に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルにおける
血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを示す。
抗凝固血液サンプルにおける血小板の分析から得られた
代表的サイトグラムを示す。Ｂ. 等張性リン酸緩衝溶液
に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルにおける
血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを示す。
【図６】 Ａ. 赤血球希釈剤に懸濁したＡＣＤ−抗凝固
血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラムを
示す。Ｂ. 等張性リン酸緩衝溶液に懸濁したＡＣＤ−抗
凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラ
ムを示す。
血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラムを
示す。Ｂ. 等張性リン酸緩衝溶液に懸濁したＡＣＤ−抗
凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラ
ムを示す。
【図７】 Ａ. 正常な血液ドナーサンプルの平均血小板
乾燥質量（ＭＰＭ）対時間を示す代表的グラフである。
Ｂ. 異常な血液ドナーサンプルの平均血小板乾燥質量対
時間の代表的グラフを示す。
乾燥質量（ＭＰＭ）対時間を示す代表的グラフである。
Ｂ. 異常な血液ドナーサンプルの平均血小板乾燥質量対
時間の代表的グラフを示す。
【図８】 本発明のＰＬＴＩシステム（図８Ａ）、TECH
NICON Ｈ・TM２システム（図８Ｂ）および Coulter STK
S システム（図８Ｃ）によって得た異常サンプルの血小
板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。
NICON Ｈ・TM２システム（図８Ｂ）および Coulter STK
S システム（図８Ｃ）によって得た異常サンプルの血小
板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。
【図９】 TECHNICON Ｈ・TM２システムまたは Coulter
STKS システムを使用して得た平均血小板体積（ＭＰ
Ｖ）対異常血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,0
00／μl ）を示す。
STKS システムを使用して得た平均血小板体積（ＭＰ
Ｖ）対異常血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,0
00／μl ）を示す。
【図１０】 本発明の新規なＰＬＴ１システムおよび方
法を使用して得た異常な血小板減少症の血液サンプルに
対する平均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）数
の測定（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。
法を使用して得た異常な血小板減少症の血液サンプルに
対する平均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）数
の測定（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。
【図１１】 TECHNICON Ｈ・TM２システム、 Coulter S
TKS システムおよび本発明のＰＬＴ１システムを使用し
て得た、異常な血液サンプルに対して行った平均血小板
体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）総数の測定を示す。
TKS システムおよび本発明のＰＬＴ１システムを使用し
て得た、異常な血液サンプルに対して行った平均血小板
体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）総数の測定を示す。
【図１２】 ＰＬＴ１の方法およびシステムを使用した
異常なサンプルに対する平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）
および平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）の精度データを示
す。
異常なサンプルに対する平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）
および平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）の精度データを示
す。
【図１３】 異常な血小板減少症サンプル＃70に対して
表８で示した結果に対応する血小板体積（ＭＰＶ）ヒス
トグラムを示す。
表８で示した結果に対応する血小板体積（ＭＰＶ）ヒス
トグラムを示す。
【図１４】 本発明による新規な光散乱法と血小板の活
性化を測定するための蛍光法を比較して示す。
性化を測定するための蛍光法を比較して示す。
フロントページの続き (72)発明者 エドウァド、ジェイ、ヘズァリンタン アメリカ合衆国ニューヨーク州10509、ブ リュースタ、オウク・ストリート 35番 (72)発明者 イヴリン、サブリナー、チャプマン アメリカ合衆国ニューヨーク州10520、ク ロウトン・オン・ハドスン、セニック・ド ライヴ 19番ケイ (72)発明者 リン、パセルティナ アメリカ合衆国ニューヨーク州10950、マ ンロウ、ロウノウク・ドライヴ ４番
Claims (73)
- 【請求項１】 正常または異常の全血サンプルにおい
て、個々の細胞ベースで、他の細胞から血小板を正確に
区別するための、かつ定性的および定量的血小板パラメ
ーターを測定するための自動化方法であって、以下のス
テップ： ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度
を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた
光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプ
ルのアリコートを分析する、ただし、上記の光散乱強度
は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔に
わたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区別す
るのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすように増
加された第１および第２の光学チャンネル信号値で測定
され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高角度検出
器のゲインの増加から得られ、第２の光学チャンネル信
号値は低角度検出器のゲインの増加から得られる；そし
て ｂ）該サンプル中の血小板を非血小板から区別し、そし
て体積対屈折率マップ内における光散乱で得られた血小
板信号の存在により血小板パラメーターを測定する；を
含んでなる方法。 - 【請求項２】 血小板が血小板の屈折率の正規分布に基
づいて非血小板からさらに区別される、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 血小板の体積、血小板の成分濃度および
血小板の乾燥質量のパラメーターを測定し、さらに以下
のステップ： ｃ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイ
ン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換す
る； ｄ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する；そ
して ｅ）スッテプｃ）とｄ）の血小板成分濃度値と血小板体
積値の積として血小板乾燥質量を計算する；を含んでな
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 血小板数のパラメーターを測定し、以下
のステップ： ｆ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾
燥質量のヒストグラムを表示する；そして ｇ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることに
より、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定す
る；をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 ステップａ）において、高角度検出器の
ゲインの増加が約８から１５倍であり、そして低角度検
出器のゲインの増加が約２０から３５倍である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項６】 ステップａ）において、高角度検出器の
ゲインの増加が約１２倍であり、そして低角度検出器の
ゲインの増加が約３０倍である、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項７】 変換ステップｄ）の血小板成分濃度値
が、粒子信号の屈折率から水の屈折率を引き、その結果
を屈折率増加の平均でわり算して決定される、請求項３
に記載の方法。 - 【請求項８】 屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、請
求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 血小板が非球形である、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１０】 血小板がほぼ等容性(isovolumetric)
を保っている、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 赤血球数が高ゲインチャンネルＸ＝9
9，Ｙ＝99の信号を赤血球として数えることにより得ら
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 血小板の分析と赤血球の分析が同時に
行われる、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 体積および屈折率の範囲が、通常のゲ
イン条件下で大きい血小板の体積と屈折率の分析を得る
ために標準信号ゲイン条件下で使用される表を下方に拡
大することにより、大きくかつ高密度の血小板での第１
および第２光学チャンネルの飽和による誤差を避けるた
めに拡大される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 高角度検出器のゲインの増加が約１０
倍であり、そして低角度検出器のゲインの増加が約２５
倍である、請求項５または１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 ２つの光散乱測定値が血小板の活性化
状態を決めるのに使われ、その際、活性化された血小板
は活性化されていない血小板よりも測定可能に低い屈折
率と低い成分濃度（ＭＰＣ）を有する、請求項１または
３に記載の方法。 - 【請求項１６】 血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン
酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１７】 血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン
酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項１５に記載の
方法。 - 【請求項１８】 血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン
酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項１７に記載の
方法。 - 【請求項１９】 血小板が生体内または生体外で活性化
される、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２０】 血小板の活性化状態が血小板サンプル
のin vitro年齢の関数である、請求項１５に記載の方
法。 - 【請求項２１】 ステップｄ）で得られる血小板の成分
濃度値が室温または４℃において約１時間から約２４時
間貯蔵された血液サンプルのin vitro年齢を決定する、
請求項３に記載の方法。 - 【請求項２２】 ステップｅ）で得られる血小板の乾燥
質量、血小板数、および血小板の顆粒含量、またはこれ
らの組合せが癌治療または癌処置を受けている患者にお
ける前記の治療または処置の効果を決定する、請求項３
に記載の方法。 - 【請求項２３】 血小板数、血小板体積、血小板乾燥質
量、および血小板成分濃度のパラメーターを、個々の細
胞ベースで、正確に測定し、かつ正常または異常の全血
サンプル中の血小板を他の細胞から区別するための自動
化方法であって、以下のステップ： ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度
を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた
光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプ
ルのアリコートを分析する、ただし、上記の光散乱強度
は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔に
わたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区別す
るのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすように増
加された第１および第２の光学チャンネル信号値で測定
され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高角度検出
器のゲインの増加から得られ、第２の光学チャンネル信
号値は低角度検出器のゲインの増加から得られる； ｂ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイ
ン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換す
る； ｃ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する； ｄ）スッテプｂ）とｃ）の血小板成分濃度値と血小板体
積値の積として血小板乾燥質量を計算する； ｅ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾
燥質量のヒストグラムを表示する；そして ｆ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることに
より、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定す
る；を含んでなる方法。 - 【請求項２４】 ステップａ）において、高角度検出器
での増加が約８から１５倍であり、そして低角度検出器
での増加が約２０から３５倍である、請求項２３に記載
の方法。 - 【請求項２５】 ステップａ）において、高角度検出器
での増加が約１２倍であり、そして低角度検出器での増
加が約３０倍である、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 変換スッテプｃ）の血小板成分濃度値
が、計算した粒子信号の屈折率から水の屈折率を引き、
その結果を屈折率増加の平均でわり算して決定される、
請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２７】 屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、
請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 血小板が非球形である、請求項２３に
記載の方法。 - 【請求項２９】 血小板がほぼ等容性を保っている、請
求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 赤血球数が高ゲインチャンネルＸ＝9
9，Ｙ＝99の信号を赤血球として数えることにより得ら
れる、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項３１】 血小板の分析と赤血球の分析が同時に
行われる、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 体積および屈折率の範囲が、通常のゲ
イン条件下で大きい血小板の体積と屈折率の分析をえる
ために標準信号ゲイン条件下で使用される表を下方に拡
大することにより、大きくかつ高密度の血小板での第１
および第２光学チャンネルの飽和による誤差を避けるた
めに拡大される、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項３３】 高角度検出器の前記増加が約１０倍で
あり、そして低角度検出器の前記増加が約２５倍であ
る、請求項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 ２つの光散乱測定値が血小板の活性化
状態を決めるのに使われ、その際、活性化された血小板
は活性化されていない血小板よりも測定可能に低い屈折
率と低い成分濃度（ＭＰＣ）を有する、請求項２３に記
載の方法。 - 【請求項３５】 血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン
酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項２３に記載の
方法。 - 【請求項３６】 血小板がＥＤＴＡまたはクエン酸ナト
リウム中に集められる、請求項３４に記載の方法。 - 【請求項３７】 血小板がＥＤＴＡ中に集められる、請
求項３６に記載の方法。 - 【請求項３８】 血小板が生体内または生体外で活性化
される、請求項３４に記載の方法。 - 【請求項３９】 血小板の活性化状態が血小板サンプル
のin vitro年齢の関数である、請求項３４に記載の方
法。 - 【請求項４０】 ステップｃ）で得られる血小板の成分
濃度値が室温または４℃において約１時間から約２４時
間貯蔵された血液サンプルのin vitro年齢を決定する、
請求項２３に記載の方法。 - 【請求項４１】 ステップｄ）で得られる血小板の乾燥
質量、血小板数、および血小板の顆粒含量、またはこれ
らの組合せが癌治療または癌処置を受けている患者にお
ける前記の治療または処置の効果を決定する、請求項２
３に記載の方法。 - 【請求項４２】 血小板数、血小板体積、血小板乾燥質
量、および血小板成分濃度のパラメーターを正確に測定
し、かつ正常または異常の全血サンプル中の血小板を他
の細胞から区別するための自動化装置であって、以下の
手段： ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度
を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた
光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプ
ルのアリコートを分析する手段、ただし、上記の光散乱
強度は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間
隔にわたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区
別するのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすよう
に増加された第１および第２の光学チャンネル信号ゲイ
ンで測定され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高
角度検出器の高ゲイン出力から得られ、第２の光学チャ
ンネル信号値は低角度検出器の高ゲイン出力から得られ
る； ｂ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイ
ン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換す
る手段； ｃ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する手
段； ｄ）スッテプｂ）とｃ）の血小板成分濃度値と血小板体
積値の積の関数として血小板乾燥質量値を計算する手
段； ｅ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾
燥質量のヒストグラムを表示する手段；および ｆ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることに
より、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定する
手段；を含んでなる装置。 - 【請求項４３】 ステップａ）において、高角度検出器
の高ゲイン出力が約８から１５倍であり、そして低角度
検出器の高ゲイン出力が約２０から３５倍である、請求
項４２に記載の装置。 - 【請求項４４】 高角度検出器の高ゲイン出力が約１２
倍であり、そして低角度検出器の高ゲイン出力が約３０
倍である、請求項４３に記載の装置。 - 【請求項４５】 血小板成分濃度値変換手段が、計算し
た粒子信号の屈折率から水の屈折率を引き、その結果を
屈折率増加の平均でわり算して血小板成分濃度を決定す
る、請求項４２に記載の装置。 - 【請求項４６】 屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、
請求項４５に記載の装置。 - 【請求項４７】 血小板が非球形である、請求項４２に
記載の装置。 - 【請求項４８】 血小板がほぼ等容性を保っている、請
求項４２に記載の装置。 - 【請求項４９】 血小板を分析すると同時に赤血球数を
数える手段をさらに含む、請求項４２に記載の装置。 - 【請求項５０】 血小板の活性化状態を血小板成分濃度
に基づいて決定できる、請求項４２に記載の装置。 - 【請求項５１】 完全な赤血球分析と血小板分析が同時
に行われる、請求項１または２３に記載の方法。 - 【請求項５２】 完全な赤血球分析と血小板分析を同時
に行う手段をさらに含む、請求項４２に記載の装置。 - 【請求項５３】 正常または異常の全血サンプルにおい
て、個々の細胞ベースで、他の細胞から血小板を正確に
区別するための、かつ定性的および定量的血小板パラメ
ーターを測定するための自動化装置であって、以下の手
段： ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度
を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた
光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプ
ルのアリコートを分析する手段、ただし、上記の光散乱
強度は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間
隔にわたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区
別するのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすよう
に増加された第１および第２の光学チャンネル信号ゲイ
ンで測定され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高
角度検出器のゲインの増加から得られ、第２の光学チャ
ンネル信号値は低角度検出器のゲインの増加から得られ
る；および ｂ）該サンプル中の血小板を非血小板から区別し、そし
て体積対屈折率マップ内に置くことにより血小板パラメ
ーターを測定する手段；を含んでなる装置。 - 【請求項５４】 血小板の屈折率の正規分布に基づいて
血小板を非血小板からさらに区別する手段をさらに含
む、請求項５３に記載の装置。 - 【請求項５５】 血小板体積、血小板成分濃度および血
小板乾燥質量のパラメーターを測定し、以下の手段： ｃ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイ
ン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換す
る手段； ｄ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する手
段；および ｅ）スッテプｃ）とｄ）の血小板成分濃度値と血小板体
積値の積として血小板乾燥質量値を計算する手段；をさ
らに含んでなる、請求項５３に記載の装置。 - 【請求項５６】 血小板数のパラメーターを測定し、以
下の手段： ｆ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾
燥質量のヒストグラムを表示する手段；および ｇ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることに
より、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定する
手段；をさらに含んでなる、請求項５５に記載の装置。 - 【請求項５７】 ステップａ）において、高角度検出器
でのゲインの増加が約８から１５倍であり、そして低角
度検出器でのゲインの増加が約２０から３５倍である、
請求項５３に記載の装置。 - 【請求項５８】 ステップａ）において、高角度検出器
でのゲインの増加が約１２倍であり、そして低角度検出
器でのゲインの増加が約３０倍である、請求項５７に記
載の装置。 - 【請求項５９】 変換ｄ）の前記手段により決定される
血小板成分濃度値が、計算した粒子信号の屈折率から水
の屈折率を引き、その結果を屈折率増加の平均でわり算
して決定される、請求項５５に記載の装置。 - 【請求項６０】 屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、
請求項５９に記載の装置。 - 【請求項６１】 血小板が非球形である、請求項５３に
記載の装置。 - 【請求項６２】 血小板がほぼ等容性を保っている、請
求項６１に記載の装置。 - 【請求項６３】 高ゲインチャンネルＸ＝99，Ｙ＝99の
信号を赤血球として数えることにより赤血球数を得る手
段をさらに含む、請求項５３に記載の装置。 - 【請求項６４】 血小板の分析と赤血球の分析を同時に
行う手段をさらに含む、請求項６３に記載の装置。 - 【請求項６５】 通常のゲイン条件下で大きい血小板の
体積と屈折率の分析を得るために、標準信号ゲイン条件
下で使用される表を下方に拡大することにより、大きく
かつ高密度の血小板での第１および第２光学チャンネル
の飽和による誤差を避けるべく、体積および屈折率の範
囲を拡大する手段をさらに含む、請求項５３に記載の装
置。 - 【請求項６６】 高角度検出器のゲインの増加が約１０
倍であり、そして低角度検出器のゲインの増加が約２５
倍である、請求項６５に記載の装置。 - 【請求項６７】 ２つの光散乱測定値が血小板の活性化
状態を決めるのに使われ、その際、活性化された血小板
は活性化されていない血小板よりも測定可能に低い屈折
率と低い成分濃度を有する、請求項５５に記載の装置。 - 【請求項６８】 血小板がＥＤＴＡまたはクエン酸ナト
リウム中に集められる、請求項６７に記載の装置。 - 【請求項６９】 血小板がＥＤＴＡ中に集められる、請
求項６８に記載の装置。 - 【請求項７０】 血小板が生体内または生体外で活性化
される、請求項６７に記載の装置。 - 【請求項７１】 血小板の活性化状態が血小板サンプル
のin vitro年齢の関数である、請求項６７に記載の装
置。 - 【請求項７２】 手段ｄ）で得られる血小板の成分濃度
値が室温または４℃において約１時間から約２４時間貯
蔵された血液サンプルのin vitro年齢を決定する、請求
項５５に記載の装置。 - 【請求項７３】 手段ｅ）で得られる血小板の乾燥質量
値、血小板数、および血小板の顆粒含量、またはこれら
の組合せが癌治療または癌処置を受けている患者におけ
る前記の治療または処置の効果を決定する、請求項５５
に記載の装置。
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