ES2344709T3 - Reactivo de lisis para recuento simultaneo de diferentes tipos de celulas sanguineas en una muestra de sangre. - Google Patents
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Abstract
Un reactivo que comprende: - un compuesto estabilizador de la hemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol, derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos; - al menos dos sales de amonio cuaternario; - 1,3-dimetilurea y/o sales de la misma; y - un tampón orgánico.
Description
Reactivo de lisis para recuento simultáneo de
diferentes tipos de células sanguíneas en una muestra de sangre.
La presente invención se refiere a un reactivo
para uso en la enumeración electrónica y discriminación volumétrica
simultánea automática, por ejemplo por recuento Coulter, de
diferentes tipos de células sanguíneas, tales como leucocitos,
trombocitos, etc., en la sangre. Adicionalmente, la presente
invención se refiere a un aparato de recuento Coulter (impedancia)
que contiene el reactivo, por ejemplo un aparato de recuento Coulter
con un cartucho desechable para caracterización de las células
suspendidas en un líquido, especialmente un cartucho desechable
autónomo para análisis de un solo uso, por ejemplo para análisis de
un solo uso de una pequeña cantidad de sangre entera.
La información acerca del contenido de
leucocitos (glóbulos blancos de la sangre), sus subpoblaciones y
trombocitos (plaquetas) es una herramienta importante para el
médico a fin de diagnosticar diferentes enfermedades y monitorizar
el tratamiento. Adicionalmente, la concentración de hemoglobina,
relacionada directamente con el número de eritrocitos, en la
muestra de sangre es también de gran importancia.
Por ello, se ha dedicado mucho esfuerzo a lo
largo de los años al desarrollo de sistemas automáticos de recuento
de las células de la sangre. Los sistemas automáticos de recuento de
las células de la sangre pueden dividirse en dos grupos
principales: aquéllos que se basan en el principio de clasificación
de las células por impedancia (igual al principio Coulter) y
aquéllos que se basan en el principio de la citometría de flujo).
Ejemplos de tales sistemas automáticos son Coulter AcT Diff basado
en clasificación de células por impedancia y Bayer ADVIA 120 basado
en citometría de flujo. Ambos principios pueden combinarse con
técnicas espectrofotométricas para análisis de componentes
adicionales en la sangre, tales como la hemoglobina.
US 4.962.038 describe un sistema de reactivos
que contiene un diluyente de la sangre y un agente de lisis para
enumeración rutinaria de los valores tradicionales del hemograma y
la determinación de leucocitos. El diluyente de la sangre comprende
hidrocloruro de procaína, ADA, diacetato de clorhexidina,
1-hidroxipiridina-2-tiona,
y dimetilolurea, y el agente de lisis comprende al menos una sal de
amonio cuaternario y un cianuro de metal alcalino.
US 4.745.071 describe un agente diluyente, un
agente de lisis, y un detergente para diferenciación entre y
enumeración de linfocitos, neutrófilos y leucocitos. El diluyente de
la sangre comprende 1,3-dimetilurea,
1-hidroxipiridina-2-tiona,
y ADA, el agente de lisis comprende una sal individual de amonio
cuaternario y cianuro de potasio, y el detergente comprende, además
de los componentes del diluyente, un agente humectante de
diazopón.
US 5.227.304 describe una solución diluyente en
combinación con una solución detergente para enumeración rutinaria
de las células de la sangre, una muestra de la sangre se divide en
una parte alícuota de glóbulos rojos para enumeración de los
glóbulos rojos de la sangre (eritrocitos) junto con plaquetas
(trombocitos), y una parte alícuota de glóbulos blancos para
enumeración de los glóbulos blancos de la sangre (leucocitos) y
hemoglobina. Además de las soluciones descritas, es necesaria una
solución de lisis (como se describe en US 4.745.071, véase arriba)
para enumeración de la parte alícuota de las células blancas. La
solución diluyente comprende imidazol, dimetilurea, EDTA, omadina
sódica, triadina-10, y triadina-3, y
la solución detergente comprende triadina-10,
omadina sódica, y Brij 35.
US 5.958.781 describe un método para
determinación de hemoglobina y leucocitos con un diluyente que
comprende EDTA, imidazol, y una mezcla de
hexahidro-1,3,5-tris(2-hidroxietil)-s-triazina
y 2-piridinatiol-1-óxido de sodio y
un ácido de lisis que comprende al menos una sal de amonio
cuaternario y una sal de hidroxilamina.
US 4.286.963 describe un disolvente lítico y un
método para lisis rápida de los glóbulos rojos de la sangre en
sangre entera para una determinación diferencial de poblaciones de
leucocitos linfoides y mieloides, y medida de hemoglobina,
particularmente para uso en sistemas de recuento automático de
partículas. El diluyente es una mezcla de al menos una sal de
amonio cuaternario que tiene propiedades tensioactivas, y un aditivo
en proporciones adecuadas, tamponada a un pH ácido de 3,5 a 5,0. El
aditivo incluye 2-fenoxietanol y otros alcanoles de
cadena corta sustituidos con un fenilo o fenoxi, así como ciertos
compuestos polihidroxilados.
Tradicionalmente, los eritrocitos y trombocitos
se cuantifican en una muestra de sangre después de la adición de
una solución diluyente, en tanto que se añade un agente de lisis a
la misma o a una muestra de sangre separada para liberar
hemoglobina de los eritrocitos y permitir la cuantificación de los
leucocitos junto con un análisis de la hemoglobina. Un análisis
total a la vez de eritrocitos, trombocitos, leucocitos y
hemoglobina, requiere por tanto varios pasos.
De acuerdo con ello, existe necesidad de
desarrollar un reactivo que combine la función de un diluyente y un
agente de lisis, y que permita simultáneamente una enumeración
manual o automática de las diversas células de la sangre tales
como, v.g., trombocitos y leucocitos, junto con un análisis de
hemoglobina.
\newpage
Una identificación y cuantificación simultáneas
de leucocitos y trombocitos utilizando un solo reactivo combinado,
requeriría que un agente de lisis pueda lisar los eritrocitos sin
afectar significativamente a los trombocitos. Típicamente, los
agentes de lisis conocidos reducen fuertemente el tamaño de los
trombocitos, por lo cual, en conexión con la cuantificación, las
señales generadas por los residuos de los trombocitos se solapan con
el nivel de ruido de fondo de las partículas. Adicionalmente, se
cree que el ruido de fondo es generado en gran parte por residuos
procedentes de las membranas de los eritrocitos. Cuanto más se
reduce el nivel de ruido de fondo, tanto más exactamente pueden
identificarse y cuantificarse las partículas de trombocitos.
Los agentes de lisis conocidos contienen
típicamente una sal cianuro y, debido a la toxicidad del cianuro de
hidrógeno, tales agentes deben tener un pH alcalino. A un pH
superior a 8, el tamaño de, v.g., los trombocitos cambia
drásticamente. A fin de obtener un análisis simultáneamente exacto y
preciso de todas las células de la sangre arriba mencionadas, junto
con un análisis de la hemoglobina, el valor de pH de un sistema
combinado de reactivos tiene que ser próximo a la neutralidad, es
decir, muy inferior a 8. Previamente se ha descrito que un medio
utilizado para enumeración de los trombocitos precisa tener, además
de una osmolalidad adecuada, un pH en el intervalo de
6,5-7,6 (US 5.935.857, US 4.745.071, US 4.185.964) a
fin de preservar el volumen celular de los trombocitos.
La presente invención se refiere a un reactivo
que comprende un compuesto estabilizador de la hemoglobina/ligando
de metahemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol,
derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos, al menos dos
sales de amonio cuaternario, 1,3-dimetilurea y/o
sales de la misma; y un tampón orgánico. El reactivo es útil como
diluyente y agente de lisis combinado, permitiendo un recuento o
análisis simultáneo de diversas células de la sangre así como
análisis de la hemoglobina.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona un método para determinar el contenido de células de la
sangre en una muestra de sangre que comprende los pasos de: mezclar
una muestra de sangre con un reactivo de acuerdo con la invención;
y analizar el contenido de la muestra de sangre por empleo del
principio de Coulter.
Aspectos adicionales de la invención resultarán
evidentes a partir de la descripción que sigue.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un reactivo que combina la función de un diluyente y un
agente de lisis, y que simultáneamente permite un recuento o
análisis manual o automático de diversas células de la sangre y
análisis de la hemoglobina. De este modo se hace posible la
integración de dilución y lisis de una muestra de sangre en un solo
paso.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar un reactivo que preserva el volumen de los trombocitos
y mejora la descomposición de los residuos indeseables celulares de
los glóbulos rojos de la sangre (eritrocitos), reduciendo con ello
el ruido de fondo y facilitando un análisis o recuento mejorado y
más preciso de los trombocitos simultáneamente con otras células de
la sangre.
El reactivo de acuerdo con la presente invención
contiene un medio acuoso. Sorprendentemente, los autores de la
invención han encontrado sorprendentemente, que los objetos arriba
mencionados y otros se cumplen por un reactivo que comprende,
preferiblemente con adición de otros compuestos mencionados más
adelante, un compuesto estabilizador de la hemoglobina/ligando de
metahemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol,
derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos, al menos dos
sales de amonio cuaternario, 1,3-dimetilurea y/o
sales de la misma; y un tampón orgánico.
Es una ventaja importante de la presente
invención que si bien el reactivo afecta a diversos tipos de células
de la sangre, v.g. los eritrocitos son eliminados sustancialmente,
los leucocitos disminuyen de volumen y los trombocitos disminuyen
también de volumen, la composición del reactivo de lisis de acuerdo
con la invención está controlada exactamente de tal modo que la
disminución de volumen de los trombocitos no es importante para la
posibilidad de que los trombocitos se cuenten en un contador
Coulter. Se ha comprobado que las partes identificadas de los
residuos de los trombocitos estaban relacionadas con el contenido
original de los trombocitos en las muestras de sangre de acuerdo
con métodos comparativos. Esto se describe adicionalmente más
adelante en el Ejemplo 1.
Con objeto de cuantificar correcta y fácilmente
el contenido de hemoglobina en las muestras de sangre, este analito
tiene que liberarse de los eritrocitos (lisis) y convertirse
preferiblemente en un complejo adecuado. El complejo tiene que ser
adecuado desde un punto de vista espectrofotométrico. Las especies
principales de hemoglobina presentes en la sangre se transforman en
la metahemoglobina complejada correspondiente en dos pasos. El
primer paso de oxidación se realiza en la presente invención por
oxidación de desoxi-hemoglobina y oxihemoglobina
por la acción de las sales de amonio cuaternario y oxígeno. La
especie de hemoglobina oxidada, es decir metahemoglobina, se
compleja en el segundo paso de acuerdo con la invención con
imidazol, dando como resultado un complejo
metahemoglobina-imidazol, que es estable y tiene
propiedades espectrofotométricas bien definidas. El complejo puede
cuantificarse por tanto espectrofotométricamente utilizando
longitudes de onda específicas, v.g., 545 y 880 nm. La primera
longitud de onda cuantifica el complejo y la última compensa la
turbidez de la muestra de sangre y otras absorbancias, que no son
atribuibles al contenido de hemoglobina.
Así pues, la acción de las sales de amonio
cuaternario es doble: lisar los eritrocitos y hacer posible la
oxidación de la hemoglobina. Un inconveniente de la utilización de
sales de amonio cuaternario es su acción simultánea de lisis sobre
los leucocitos y los trombocitos. Esta acción es compensada por la
presencia de 1,3-dimetilurea en la presente
invención. La 1,3-dimetilurea ayuda a la
preservación de, en particular, los leucocitos y trombocitos y la
identificación de los tres tipos subcelulares linfocitos, monocitos
y granulocitos. De acuerdo con ello, el reactivo de acuerdo con la
presente invención mejora la preservación del volumen de los
trombocitos mejorando así la posibilidad de recuento de los
trombocitos, v.g. por lisis de los trombocitos en menor grado
(véase Fig. 1).
La membrana celular de los eritrocitos se
desintegra completamente durante la acción del reactivo de lisis.
Dado que los eritrocitos no contienen orgánulo celular alguno, los
pequeños residuos de la membrana celular son los únicos restos de
este tipo de célula sanguínea. Este residuo contribuye
significativamente a la generación de ruido de fondo de los
sistemas automáticos de recuento de células sanguíneas basados en
clasificación de las células por impedancia.
Es una importante ventaja de la presente
invención que el reactivo aumenta la descomposición de los residuos
celulares indeseables procedentes de los glóbulos rojos de la sangre
(eritrocitos), reduciendo con ello el ruido de fondo y facilitando
un análisis o recuento mejorado y más preciso de los
trombocitos.
El compuesto estabilizador de la hemoglobina en
el reactivo se selecciona del grupo constituido por imidazol,
derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos, y puede
encontrarse en una concentración comprendida en el intervalo de 10
mmol/l a 100 mmol/l, tal como desde 25 mmol/l a 75 mmol/l, desde 40
mmol/l a 60 mmol/l, y con preferencia aproximadamente 50 mmol/l. El
compuesto estabilizador de la hemoglobina es preferiblemente
imidazol en una concentración de 50 mmol/l.
Las células de la sangre en una muestra de
sangre son lisadas por al menos dos sales de amonio cuaternario.
Las sales de amonio cuaternario adecuadas para uso en la presente
invención tienen la fórmula:
donde R_{1} es un radical
alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena larga que tiene de 10 a 18
átomos de carbono, R_{2}, R_{3} y R_{4} son radicales
alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena corta que tienen de 1 a 6
átomos de carbono o simplemente hidrógeno, y X^{-} es un ion
formador de sal tal como Cl^{-}, Br^{-}, I^{-},
PO_{4}^{3-},
CH_{3}SO_{4}^{-}.
Se prefiere una combinación de cloruro de
dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio, pero
otras sales de amonio cuaternario pueden ser por ejemplo bromuro de
tetradeciltrimetilamonio o bromuro de
hexadecildimetiletilamonio.
La concentración total de las al menos dos sales
de amonio cuaternario en el reactivo puede estar comprendida en el
intervalo de 1,0 mmol/l a 10 mmol/l, tal como desde 3,0 mmol/l a 9,0
mmol/l, desde 4,5 mmol/l a 8,5 mmol/l, y preferiblemente 6,5
mmol/l.
En una reacción preferida de la invención, las
al menos dos sales de amonio cuaternario son una combinación de
cloruro de dodeciltrimetilamonio y bromuro de
hexadeciltrimetilamonio en concentraciones de 5,6 mmol/l y 0,9
mmol/l, respectivamente.
Como se ha descrito arriba, la
1,3-dimetilurea actúa sustancialmente como un agente
estabilizador de las células y antibacteriano. La concentración de
1,3-dimetilurea y/o sales de la misma en el reactivo
de acuerdo con la presente invención puede estar comprendida en el
intervalo de 10 mmol/l a 25 mmol/l tal como desde 12 mmol/l a 23
mmol/l, desde 14 mmol/l a 20 mmol/l, desde 16 mmol/l a 18 mmol/l, y
con preferencia aproximadamente 17 mmol/l. En una realización
preferida de la invención, la 1,3-dimetilurea se
encuentra en una concentración de 17 mmol/l.
El reactivo de acuerdo con la presente invención
comprende adicionalmente un tampón orgánico; este tampón orgánico
es un compuesto tal como ADA (ácido
N-(2-acetamido)iminodiacético), HEPES (ácido
2-(4(2-hidroxietil)-1-piperazina)etanosulfónico),
MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico)
y PIPES (ácido
piperazina-N,N'-bis(2-etano-sulfónico)
o combinaciones de los mismos y/u otros tampones orgánicos. Las
concentraciones adecuadas de ADA; HEPES; MOPS y PIPES o
combinaciones de los mismos en el reactivo pueden estar
comprendidas en el intervalo de 2 mmol/l a 8 mmol/l, tal como desde
4 mmol/l a 6 mmol/l, desde 5 mmol/l a 5,6 mmol/l, y preferiblemente
5,3 mmol/l. En una realización preferida de la invención,
el tampón orgánico es ADA con una concentración
comprendida en el intervalo de 2 mmol/l a 8 mmol/l, tal como
preferiblemente desde 4 mmol/l a 6 mmol/l, preferiblemente desde 5
mmol/l a 5,6 mmol/l, y aún más preferiblemente 5,3 mmol/l.
Además de su efecto de tamponamiento, ADA
contribuye a minimizar el crecimiento bacteriano por sus propiedades
quelantes de iones metálicos. Por último, ADA ayuda adicionalmente
a las sales de amonio cuaternario en la reducción de los residuos
de glóbulos rojos de la sangre a un tamaño que minimiza la
interferencia con la cuantificación de las partículas de
trombocitos próxima al ruido de fondo como se ha descrito
arriba.
Como se ha mencionado arriba, existe necesidad
de compensar la acción de las sales de amonio cuaternario sobre los
trombocitos y leucocitos. En suma, la presencia de
1,3-dimetilurea contribuye a la preservación de los
trombocitos y las subpoblaciones de leucocitos.
En una realización preferida, el reactivo de
acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente
procaína, hidrocloruro de procaína u otras sales de la misma. El
hidrocloruro de procaína actúa sustancialmente como un agente
estabilizador de las células, y la concentración de hidrocloruro de
procaína y/o sales del mismo en el reactivo puede estar comprendida
en el intervalo de 0,2 mmol/l a 1,6 mmol/l, tal como desde 0,4
mmol/l a 1,4 mmol/l, desde 0,6 mmol/l a 1,2 mmol/l, desde 0,8 mmol/l
a 1,0 mmol/l, y preferiblemente 0,9 mmol/l.
Adicionalmente, para obtener una enumeración
correcta de los trombocitos, debe preservarse el volumen celular. A
un valor de pH elevado, el tamaño de los residuos de los trombocitos
decrece adicionalmente, con lo cual los trombocitos generan señales
que se solapan parcialmente con las señales de ruido de fondo,
haciendo más inexacta la cuantificación de los mismos. El pH del
reactivo de acuerdo con la presente invención puede ajustarse por
tanto a un valor adecuado comprendido en el intervalo de 6 a 8, tal
como preferiblemente en un intervalo de 6,5 a 7,5, y de modo más
preferible aproximadamente 7,1 con ácido sulfúrico u otros ácidos
adecuados, tales como ácido clorhídrico y ácido fosfórico. Una
persona experta en la técnica reconocerá que cuando una combinación
específica de sustancias en el reactivo da lugar a un valor de pH
inferior al valor de pH deseado, entonces puede utilizarse en su
lugar una sustancia alcalina tal como una base inorgánica, v.g.
hidróxido de sodio, para ajustar el valor de pH. La osmolalidad
puede ajustarse al intervalo de 200 mosmol/l hasta 400 mosmol/l,
tal como preferiblemente desde 250 mosmol/l a 380 mosmol/l, más
preferiblemente desde 300 mosmol/l a 350 mosmol/l, y aún más
preferiblemente 330 mosmol/l con una sal inorgánica, tal como
cloruro de sodio, y/o sulfato de sodio. En una realización
preferida de la invención, la osmolalidad del reactivo se ajusta con
cloruro de sodio y sulfato de sodio. La muestra de sangre puede
contener EDTA (ácido etilenodiaminatetraacético), sales del mismo,
o cualquier otro compuesto anticoagulante adecuado tal como heparina
para prevenir la coagulación de la muestra de sangre.
En una realización específica de la invención,
el reactivo de acuerdo con la invención comprende imidazol en una
concentración de 50 mmol/l; cloruro de dodeciltrimetilamonio en una
concentración de 5,6 mmol/l; bromuro de hexadeciltrimetilamonio en
una concentración de 0,9 mmol/l; 1,3-dimetilurea en
una concentración de 17 mmol/l; ADA (ácido
N-2-(acetamido)iminodiacético) en una
concentración de 5,3 mmol/l; y agua desionizada, en donde el pH se
ajusta a 7,1 con ácido sulfúrico diluido y la osmolalidad se ajusta
con cloruro de sodio y sulfato de sodio.
En otra realización específica de la invención,
el reactivo de acuerdo con la invención comprende imidazol en una
concentración de 50 mmol/l; cloruro de dodeciltrimetilamonio en una
concentración de 5,6 mmol/l; bromuro de hexadeciltrimetilamonio en
una concentración de 0,9 mmol/l; 1,3-dimetilurea en
una concentración de 17 mmol/l; ADA (ácido
N-2-(acetamido)iminodiacético) en una
concentración de 5,3 mmol/l; hidrocloruro de procaína en una
concentración de 0,9 mmol/l; y agua desionizada; en donde el pH se
ajusta a 7,1 con ácido sulfúrico diluido y la osmolalidad se ajusta
con cloruro de sodio y sulfato de sodio.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método de determinación del contenido de células de la sangre
tales como, v.g., trombocitos, leucocitos, subpoblaciones de
leucocitos, es decir linfocitos, monocitos, granulocitos, y
hemoglobina, en una muestra de sangre, v.g. una muestra de sangre
ex-vivo, comprendiendo el método los pasos de:
- i)
- mezcladura de una muestra de sangre, v.g. una muestra de sangre ex-vivo, con un reactivo de acuerdo con la invención, y
- ii)
- análisis del contenido de la muestra de sangre, v.g., enumeración de leucocitos, linfocitos, monocitos, granulocitos y trombocitos, por empleo del principio de Coulter.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular, la invención se
refiere a un método de determinación del contenido de trombocitos,
leucocitos y/o una o más subpoblaciones de leucocitos tales como,
v.g., linfocitos, monocitos y/o granulocitos. Es importante indicar
que el análisis de los diversos tipos de células puede hacerse
simultáneamente. El método de acuerdo con la invención puede
comprender adicionalmente un paso iii) análisis del contenido de la
muestra de sangre por cuantificación espectrofotométrica del
contenido de hemoglobina.
Adicionalmente, en el método de acuerdo con la
invención la relación en volumen entre sangre y reactivo puede
estar comprendida en el intervalo de 1:10.000 a 1:200, tal como
desde 1:1000 a 1:300, desde 1:600 a 1:400, desde 1:550 a 1:450, y
preferiblemente 1:500. La relación seleccionada depende de las
concentraciones de los compuestos en el reactivo, las
concentraciones de células de la sangre y las características de
eficiencia deseadas del análisis.
Por ejemplo, el reactivo de acuerdo con la
presente invención puede estar contenido en un cartucho utilizado
en un aparato para enumeración de células en una muestra de sangre,
v.g. una muestra de sangre ex-vivo, comprendiendo
el cartucho un alojamiento con una cámara de mezcla y una cámara de
recogida separadas por una pared que tiene un orificio para el paso
de las células entre la cámara de mezcla y la cámara de recogida.
Están provistos medios de caracterización de las células para
caracterizar las células que pasan a través del orificio. El
aparato comprende una estación de acoplamiento para alojar el
cartucho de manera desechable, comprendiendo la estación de
acoplamiento conectores, v.g., conectores eléctricos y/o de fluido,
para conexión operativa con los medios de caracterización de las
células cuando el cartucho está alojado en la estación de
acoplamiento.
En una realización preferida de la invención, el
paso i) del método de acuerdo con la invención se realiza en un
cartucho adecuado para uso en un aparato para enumeración de células
en una muestra de sangre, en cuyo cartucho está presente el
reactivo en una cámara de retención que está conectada con una
cámara de mezcla en la cual el reactivo se mezcla con la muestra de
sangre; y el paso ii) se realiza por pasada subsiguiente de las
muestras de sangre que contienen las células a través de un orificio
posicionado entre la cámara de mezcla y la cámara de recogida, con
lo cual el contenido de la sangre se analiza por empleo del
principio de Coulter por medios de caracterización de las
células.
Adicionalmente, en una realización preferida, el
paso iii) del método de acuerdo con la invención se realiza en una
cámara de dosificación volumétrica conectada a la cámara de recogida
y adaptada para cuantificación espectrofotométrica.
Adicionalmente, el reactivo de acuerdo con la
presente invención puede emplearse en un aparato convencional para
el recuento y la determinación del contenido de células de la sangre
y hemoglobina en muestras de sangre, v.g. muestras de sangre
ex-vivo.
El reactivo puede utilizarse adicionalmente como
revestimiento para mejorar el efecto capilar de un tubo o
dispositivo semejante a un tubo. Se ha demostrado que un
revestimiento que comprende el reactivo de acuerdo con la presente
invención mejora el efecto capilar de un tubo o dispositivo
semejante a un tubo hidrófobo. El reactivo se aplica como
revestimiento sobre una superficie por evaporación del reactivo
sobre la superficie a revestir. De acuerdo con ello, un aspecto
adicional de la presente invención es un revestimiento que comprende
un reactivo de acuerdo con la invención.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de un reactivo como se define arriba para la determinación del
contenido de uno o más tipos de células en una muestra de sangre. En
una realización particular, la invención se refiere al uso para la
determinación de trombocitos, leucocitos y/o una o más
subpoblaciones de leucocitos tales como, v.g., linfocitos,
monocitos y/o granulocitos en la misma muestra de sangre. Es
importante indicar que la determinación de los diversos tipos de
células puede realizarse simultáneamente. Como se ha expuesto
anteriormente, una realización específica de la invención se refiere
al uso del reactivo para la determinación de todos los tipos de
células y subpoblaciones arriba mencionados. Además, otra ventaja es
que el mismo reactivo es adecuado para uso en la determinación del
contenido de hemoglobina en la muestra de sangre; es decir que, por
el uso de un único reactivo, se obtiene información relevante del
contenido de sangre.
En este contexto, el término "determinación
simultánea" hace referencia a una determinación simultánea en un
solo análisis sobre una y la misma muestra de sangre. De acuerdo con
ello, una muestra de sangre se mezcla con un reactivo de acuerdo
con la invención y las diversas subpoblaciones de células de la
sangre pueden determinarse simultáneamente en un solo análisis.
Fig. 1 es un histograma que compara el reactivo
de acuerdo con la presente invención y otro sistema de un solo
reactivo con respecto a su capacidad para contar los
trombocitos.
Fig. 2 ilustra esquemáticamente un cartucho que
aloja el reactivo de acuerdo con la presente invención para
análisis de una muestra de sangre.
Fig. 3 muestra un aparato para análisis del
contenido de una muestra de sangre utilizando un cartucho que aloja
el reactivo de acuerdo con la presente invención.
Fig. 4 muestra un histograma favorable para el
recuento de leucocitos y subpoblaciones de leucocitos, obtenido por
utilización del reactivo descrito en la Tabla 2.
Fig. 5 muestra un histograma favorable para el
recuento de trombocitos, obtenido por utilización del reactivo
descrito en la Tabla 4.
Fig. 6 muestra un histograma favorable para el
recuento de leucocitos y las subpoblaciones de leucocitos, obtenido
por utilización del reactivo descrito en la Tabla 4; el histograma
es el mismo que en Fig. 5, pero con un eje Y diferente.
\newpage
La composición de la realización actualmente más
preferida del reactivo de inventiva se indica en la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó 1 litro de reactivo con una
composición de acuerdo con la Tabla 2. La osmolalidad final del
reactivo preparado era 330 mosmol/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los tests utilizando un
reactivo de acuerdo con la invención como se describe en la Tabla 2
se correlacionaron posteriormente con resultados de tests utilizando
un sistema comparativo, el sistema Beckman Coulter AcT Diff. El
resultado del test incluye cuantificación de leucocitos (con
inclusión de las tres subpoblaciones linfocitos, monocitos, y
granulocitos), trombocitos y hemoglobina. Se analizaron un total de
53 muestras de sangre humana entera, donde se mezclaron 3 \mul de
sangre con 1,5 ml de reactivo, lo que corresponde a una relación
sangre:reactivo en volumen de 1:500. Los tests se compararon con
tests realizados en el sistema Beckman Coulter AcT Diff. Las
correlaciones resultantes se muestran en la Tabla 3 para diversos
intervalos de concentración del contenido de leucocitos (con
inclusión de las tres subpoblaciones de leucocitos, monocitos, y
granulocitos), trombocitos y hemoglobina en las muestras de sangre.
Como puede verse por la tabla, las mismas demuestran una
correlación excelente.
Fig. 1 muestra un histograma que compara el
número de partículas contadas en dos muestras de la misma sangre.
Las muestras de sangre se prepararon con un reactivo de acuerdo con
la presente invención y un sistema de reactivo simple conocido
(0,704 gramos de cloruro de dodeciltrimetilamonio, 0,150 gramos de
bromuro de hexadeciltrimetilamonio y 1,796 gramos de
1,2,4-triazol disuelto en 360 ml de Diluide III
Diff. ((J.T. Baker prod. no. 3963)) y 116 ml de agua desionizada,
respectivamente. Las dos muestras de sangre preparadas se analizaron
utilizando un cartucho como se describe a continuación. Se empleó
equipo electrónico especial para registrar el tamaño de las células
en un gran número de intervalos.
En Fig. 1, el gráfico A muestra el resultado del
test obtenido con la muestra de sangre con el reactivo conocido,
mientras que B muestra el resultado del test obtenido con la muestra
de con el reactivo de acuerdo con la invención. P designa el
intervalo de tamaños de los trombocitos, que está comprendido entre
aproximadamente 1,5 \mum y aproximadamente 4 \mum. N designa el
ruido de fondo. Se observa que el número contado de trombocitos
utilizando el reactivo de acuerdo con la presente invención es mayor
que el número de trombocitos contado utilizando el reactivo
conocido, lo que se cree está causado por una preparación más
cuidadosa de los trombocitos por el reactivo de acuerdo con la
invención. Así pues, se obtiene una preservación mejorada de los
trombocitos, y por tanto un análisis más preciso y exacto de la
muestra de sangre.
Fig. 2 ilustra esquemáticamente un cartucho
desechable 1 que contiene un reactivo de acuerdo con la presente
invención. El cartucho se utiliza en un aparato para análisis del
contenido de la muestra de sangre que comprende una estación de
acoplamiento y un lector. El cartucho comprende un alojamiento con
una cámara de mezcla 2 y una cámara de recogida 4 separadas por una
pared que contiene un orificio 6 para el paso de las células entre
la cámara de mezcla y la cámara de recogida. El reactivo está
alojado en una cámara de retención 8, y están provistos medios 10
de caracterización de las células para caracterizar las células que
pasan a través del orificio. Adicionalmente, el cartucho comprende
una cámara de medición volumétrica 12 conectada a la cámara de
recogida. Una parte del cartucho, v.g. la cámara de mezcla 2, la
cámara de recogida 4 y/o la cámara de medición volumétrica 12,
puede estar adaptada para cuantificación espectrofotométrica del
contenido de hemoglobina. En la realización que se muestra, la
cámara de medición volumétrica 12 está adaptada para cuantificación
espectrofotométrica del contenido de hemoglobina en la sangre.
El aparato para análisis del contenido de la
muestra de sangre se ilustra en Fig. 3 y comprende una estación de
acoplamiento y un lector para recibir de modo desechable el
cartucho, comprendiendo la estación de acoplamiento conectores (no
representados), v.g. conectores eléctricos y/o de fluido, para
conexión operativa con los medios de caracterización de las células
cuando el cartucho está alojado en la estación de acoplamiento.
Fig. 4 muestra un histograma favorable para el
recuento de trombocitos, leucocitos y subpoblaciones de leucocitos,
obtenido por el uso del reactivo descrito en la Tabla 2. A designa
la parte del histograma que corresponde a los leucocitos, B, C y D
corresponden respectivamente a linfocitos, monocitos y
granulocitos.
\newpage
Se preparó un reactivo con una composición de
acuerdo con la Tabla 4. La osmolalidad final del reactivo preparado
era 330 mosmol/l.
Los resultados de los tests obtenidos por
utilización de un reactivo de acuerdo con la invención, como se
describe en la Tabla 4, a fin de determinar el contenido de las
diversas células de la sangre pueden verse en Fig. 5, que muestra
un histograma favorable para el recuento de trombocitos, y en Fig. 6
que muestra un histograma favorable para recuento de leucocitos y
subpoblaciones de leucocitos. Fig. 5 y Fig. 6 son el único y mismo
histograma, excepto que el eje Y es diferente; para mostrar más
claramente los diferentes subtipos de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, se ha demostrado que un
revestimiento que comprende el reactivo de acuerdo con la presente
invención mejora el efecto capilar de un tubo o dispositivo
semejante a un tubo hidrófobo. El reactivo se aplica como
revestimiento sobre una superficie por evaporación del reactivo en
la superficie a revestir. El efecto puede explicarse considerando
la naturaleza anfifílica de los componentes del reactivo en
consideración. Las partes moleculares hidrófobas de éstos se
adhieren a la superficie hidrófoba del tubo dando como resultado
una orientación de las partes moleculares hidrófilas de los
componentes del reactivo fuera de la superficie del tubo. La
entrada de una muestra hidrófila, v.g. una muestra de sangre, se
verá facilitada subsiguientemente por interacción con las partes
moleculares hidrófilas de los componentes orientados del reactivo.
La mejora del efecto capilar, es decir la velocidad incrementada de
entrada de, v.g., una muestra de sangre, es debida por consiguiente
principalmente a la hidrofilización de las superficies hidrófobas en
el tubo capilar por el reactivo.
El efecto capilar mejorado utilizando un
reactivo de acuerdo con la presente invención se observó por
comparación de la velocidad de entrada de las muestras de sangre en
tubos capilares estándar de vidrio (Microcaps). Los tubos capilares
se trataron con un reactivo de acuerdo con el Ejemplo 1 y se
hicieron comparaciones con un tratamiento similar utilizando una
solución de 3% (peso/volumen) de Brij 35 en agua desionizada - un
compuesto bien conocido muy eficiente para mejora del carácter
hidrófilo.
A) se llenaron 10 Microcaps de vidrio con un
volumen de 20 \mul, longitud 64 mm (Drummond Inc., prod. no.
1-000-0200) con un reactivo (como se
describe en el Ejemplo 1); y
B) se llenaron otras 10 Microcaps de vidrio con
Brij 35 (3% peso/volumen, Sigma prod. no. 228340050) en agua
desionizada.
Se vaciaron las 20 Microcaps posteriormente
poniéndolas en contacto con una toallita de papel, y se dejaron
secar durante una noche a la temperatura ambiente.
Al día siguiente, se comparó la velocidad de
entrada de las Microcaps sin tratamiento con la velocidad de
entrada de las Microcaps tratadas con A) y B), respectivamente.
Véase la Tabla 5.
La velocidad de entrada se determinó
introduciendo el extremo de cada tipo de Microcap en una muestra de
sangre venosa (EDTA) y midiendo la altura de sangre en cada
Microcap después de 3 segundos.
Las Microcaps tratadas con reactivo del Ejemplo
1 se llenaban con sangre con una velocidad del mismo orden que las
llenadas con Brij 35.
Claims (32)
1. Un reactivo que comprende:
- -
- un compuesto estabilizador de la hemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol, derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos;
- -
- al menos dos sales de amonio cuaternario;
- -
- 1,3-dimetilurea y/o sales de la misma; y
- -
- un tampón orgánico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la concentración del compuesto estabilizador de
hemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol,
derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos en el reactivo
está comprendida en el intervalo de 10 mmol/l a 100 mmol/l, tal como
desde 25 mmol/l a 75 mmol/l, desde 40 mmol/l a 60 mmol/l, y
preferiblemente 50 mmol/l.
3. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en donde el compuesto estabilizador de hemoglobina es
imidazol en una concentración de 50 mmol/l.
4. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde las al menos dos sales de
amonio cuaternario comprenden una combinación de cloruro de
dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio.
5. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la concentración total de las
al menos dos sales de amonio cuaternario en el reactivo está
comprendida en el intervalo de 1,0 mmol/l a 10 mmol/l, tal como
desde 3,0 mmol/l a 9,0 mmol/l, desde 4,5 mmol/l a 8,5 mmol/l, y
preferiblemente 6,5 mmol/l.
6. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde las al menos dos sales de
amonio cuaternario son una combinación de cloruro de
dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio en
concentraciones de 5,6 mmol/l y 0,9 mmol/l, respectivamente.
7. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la concentración de
1,3-dimetilurea y/o sales de la misma en el reactivo
está comprendida en el intervalo de 10 mmol/l a 25 mmol/l, tal como
desde 12 mmol/l a 23 mmol/l, desde 14 mmol/l a 20 mmol/l, desde 16
mmol/l a 18 mmol/l, y preferiblemente
17 mmol/l.
17 mmol/l.
8. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la
1,3-dimetilurea y/o sales de la misma es
1,3-dimetilurea en una concentración de 17
mmol/l.
9. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el reactivo comprende
adicionalmente procaína, hidrocloruro de procaína u otras sales de
la misma.
10. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación
9, en donde la concentración de hidrocloruro de procaína en el
reactivo está comprendida en el intervalo de 0,2 mmol/l a 1,6
mmol/l, tal como desde 0,4 mmol/l a 1,4 mmol/l, desde 0,6 mmol/l a
1,2 mmol/l, desde 0,8 mmol/l a 1,0 mmol/l, y preferiblemente 0,9
mmol/l.
11. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el tampón orgánico es un
compuesto tal como ADA (ácido
N-2-(acetamido)iminodiacético), HEPES (ácido
2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazina)etanosulfónico),
MOPS (ácido
3-(N-morfolino)propano-sulfónico),
PIPES (ácido
piperazina-N,N'-bis(2-etano-sulfónico)
o combinaciones de los mismos, con una concentración comprendida en
el intervalo de 2 mmol/l a 8 mmol/l, tal como desde 4 mmol/l a 6
mmol/l, desde 5 mmol/l a 5,6 mmol/l, y preferiblemente 5,3
mmol/l.
12. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el tampón orgánico es ADA
(ácido N-2-(acetamido)iminodiacético) con una
concentración comprendida en el intervalo de 2 mmol/l a 8 mmol/l,
tal como desde 4 mmol/l a 6 mmol/l, desde 5,0 mmol/l a 5,6 mmol/l, y
preferiblemente 5,3 mmol/l.
13. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el tampón orgánico es ADA
(ácido N-2-(acetamido)iminodiacético) con una
concentración de 5,3 mmol/l.
14. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la osmolalidad del reactivo
se ajusta con al menos una sal inorgánica, tal como cloruro de
sodio, y/o sulfato de sodio.
15. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la osmolalidad del reactivo
se ajusta con cloruro de sodio y sulfato de sodio.
16. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 14 y 15, en donde la osmolalidad del reactivo está
comprendida en el intervalo de 200 mosmol/l a 400 mosmol/l, tal como
desde 250 mosmol/l a 380 mosmol/l, desde 300 mosmol/l a 350
mosmol/l, y preferiblemente 330 mosmol/l.
17. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el pH del reactivo se ajusta
con un ácido, y el pH del reactivo está comprendido en el intervalo
de 6 a 8, tal como desde 6,5 a 7,5, y preferiblemente 7,1.
18. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende imidazol en una
concentración de 50 mmol/l; cloruro de dodeciltrimetilamonio en una
concentración de 5,6 mmol/l; bromuro de hexadeciltrimetilamonio en
una concentración de 0,9 mmol/l; 1,3-dimetilurea en
una concentración de 17 mmol/l; ADA (ácido
N-2-(acetamido)iminodiacético) en una
concentración de 5,3 mmol/l; hidrocloruro de procaína en una
concentración de 0,9 mmol/l; y agua desionizada;
en donde el pH se ajusta a 7,1 con ácido
sulfúrico diluido y la osmolalidad se ajusta con cloruro de sodio y
sulfato de sodio.
19. Un revestimiento que comprende un reactivo
como se define en cualquiera de las reivindicaciones
1-18.
20. Un método de determinación del contenido de
células de la sangre en una muestra de sangre, comprendiendo el
método los pasos de:
- i)
- mezclar una muestra de sangre con un reactivo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-18, y
- ii)
- analizar el contenido de la muestra de sangre por empleo del principio de Coulter.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Un método de acuerdo con la reivindicación
20, en donde el contenido de trombocitos se determina por el paso
ii).
22. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 20 y 21, en donde el contenido de leucocitos se
determina por el paso ii).
23. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 20-22, en donde una o más
subpoblaciones de leucocitos tales como, v.g., los linfocitos,
monocitos y/o macrófagos se determinan por el paso ii).
24. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 20-23, en donde el método comprende
adicionalmente
- iii)
- analizar el contenido de la muestra de sangre por cuantificación espectrofotométrica del contenido de hemoglobina.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 20-24, en donde la relación en
volumen sangre:reactivo está comprendida en el intervalo de
1:10.000 a 1:200, tal como desde 1:1000 a 1:300, desde 1:600 a
1:400, desde 1:550 a 1:450, y con preferencia aproximadamente
1:500.
26. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 20-25, en donde
el paso i) se realiza en un cartucho adecuado
para uso en un aparato para recuento de células en una muestra de
sangre, en cuyo cartucho el reactivo está presente en una cámara de
recogida que está conectada con una cámara de mezcla en la cual el
reactivo se mezcla con la muestra de sangre; y
el paso ii) se realiza haciendo pasar
subsiguientemente la muestra de sangre que comprende las células a
través de un orificio posicionado entre la cámara de mezcla y una
cámara de recogida, con lo cual el contenido de la sangre se
analiza por empleo del principio de Coulter por medios de
caracterización de células.
27. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 24-26, en donde el paso iii) se
realiza en una cámara de dosificación volumétrica conectada a la
cámara de recogida y adaptada para cuantificación
espectrofotométrica.
28. Uso de un reactivo como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1-18, para
determinación del contenido de trombocitos en una muestra de
sangre.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28 para
la determinación simultánea del contenido de leucocitos en la misma
muestra de sangre.
30. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 28 y 29 para determinación simultánea de una o más
subpoblaciones de leucocitos en la misma muestra de sangre.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, en
donde la subpoblación de leucocitos incluye linfocitos, monocitos
y/o granulocitos.
32. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 27-29 para determinación del
contenido de hemoglobina en la misma muestra de sangre.
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