JP5122967B2 - 血液サンプル中の異なる種類の血液細胞の同時計数のための溶解試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、血液中の異なる種類の血液細胞、例えば白血球、血小板などの例えばコールター計数(Coulter counting)による同時自動電子計数及び容積測定弁別(volumetric discrimination)用の試薬に関する。さらに、本発明は、前記試薬を含むコールター(インピーダンス)計数装置、例えば液体中に懸濁された細胞の特徴づけのための使い捨てカートリッジ、特に単回使用分析用、例えば少量の全血の単回使用分析用の内蔵使い捨てカートリッジを用いるコールター計数装置に関する。
白血球、それらの亜集団(subpopulations)及び血小板の含量(content)の情報は、種々の疾患を診断し、治療を監視するために、医師にとって重要な道具である。さらに、血液サンプル中の赤血球の数に直接関係するヘモグロビンの濃度も、非常に重要である。
よって、自動血液細胞計数システムの開発のために、多くの努力が長年にわたってなされてきた。自動血液細胞計数システムは、2つの主要な群:インピーダンス細胞サイジング原理(コールター原理に等しい)によるもの、及びフローサイトメトリー原理によるものに分けることができる。このような自動システムの例は、インピーダンス細胞サイジングに基づくCoulter AcT Diff、及びフローサイトメトリーに基づくBayer ADVIA 120である。これらの原理はどちらも、血液中のさらなる成分、例えばヘモグロビンの分析のための分光光度技術と組み合わせることができる。
よって、希釈剤と溶解剤の機能を組み合わせ、種々の血液細胞、例えば血小板及び白血球の手動又は自動の計数を、ヘモグロビンの分析と共に同時に可能にする試薬の開発が必要とされている。
本発明は、イミダゾール、イミダゾール誘導体及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるヘモグロビン安定化/メトヘモグロビンリガンド化合物と、少なくとも2種の第四級アンモニウム塩と、1,3-ジメチルウレア及び/又はその塩と、有機緩衝剤とを含む試薬に関する。この試薬は、種々の血液細胞の計数又は分析とヘモグロビンの分析とを同時に可能にする組み合わせの希釈及び溶解剤として有用である。
本発明のさらなる態様は、以下の記載から明らかになる。
本発明は、希釈剤と溶解剤の機能を組み合わせた、種々の血液細胞の手動又は自動の計数又は分析とヘモグロビンの分析とを同時に可能にする試薬を提供することを目的とする。これにより、血液サンプルの希釈と溶解とを1つの単独工程に統合することができる。
を有する。
i) 血液サンプル、例えばエクスビボ血液サンプルを、本発明による試薬と混合する工程と、
ii) コールター原理を用いて血液サンプルの内容を分析する、例えば白血球、リンパ球、単球、顆粒球及び血小板を計数する工程と
を含む。
図1は、本発明による試薬と別の単独試薬システムとを、血小板を計数するそれらの能力について比較したヒストグラムである。
図2は、血液サンプルの分析のための本発明による試薬を収容するカートリッジの模式図である。
図4は、表2に示す試薬を用いて得られた、白血球及び白血球亜集団を計数するための好ましいヒストグラムを示す。
図5は、表4に示す試薬を用いて得られた、血小板を計数するための好ましいヒストグラムを示す。
図6は、表4に記載の試薬を用いて得られた、白血球及び白血球亜集団を計数するための好ましいヒストグラムを示す。このヒストグラムは図5と同じであるが、Y軸が異なる。
本発明の試薬の、現在最も好ましい実施形態の組成を、表1に列挙する。
本発明による試薬を用いた試験結果と、比較方法を用いた試験結果との相関関係
表2の組成により1リットルの試薬を調製した。調製した試薬の最終浸透圧は、330ミリオスモル/Lであった。
本発明による試薬
試薬を、表4による組成で調製した。調製した試薬の最終浸透圧は、330ミリオスモル/Lであった。
本発明の試薬をコーティングとして用いることによる毛管効果の増強
驚くべきことに、本発明による試薬を含むコーティングは、疎水性チューブ又はチューブ様デバイスの毛管効果を増強することが示されている。試薬は、コーティングされる表面上での試薬の蒸発により、表面上を被覆する。効果は、試薬成分の両親媒性の性質を考慮に入れて説明できる。これらの分子の疎水性部分は、チューブの疎水性表面に接着し、試薬成分の分子の親水性部分がチューブ表面から出て(out)配向することになる。その後、親水性サンプル、例えば血液サンプルの注入は、配向された試薬成分の分子の親水性部分との相互作用により促進される。毛管効果の増強、すなわち例えば血液サンプルの注入の速度の増大は、主に、試薬による毛管内の疎水性表面の親水化による。
B) 別の10個のガラスマイクロキャップを、Briij 35 (3%重量/容量、Sigma prod.no. 228340050)の脱イオン水溶液で満たした。
次の日、処理していないマイクロキャップの注入速度を、A)及びB)でそれぞれ処理したマイクロキャップの注入速度と比較した。表5を参照。
注入の速度は、各種のマイクロキャップの末端を静脈(EDTA)血液サンプルに入れ、3秒後の各マイクロキャップ中の血液の高さを測定することにより測定した。
実施例1の試薬で処理したマイクロキャップには、Brij 35を満たしたものと同じオーダーの速度で血液が満たされた。
4 回収チャンバ
6 オリフィス
8 保持チャンバ
10 細胞特徴づけ手段
12 容量測定チャンバ
Claims (32)
- − イミダゾール、イミダゾール誘導体及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるヘモグロビン安定化化合物と、
− 少なくとも2種の第四級アンモニウム塩と、
− 1,3-ジメチルウレア及び/又はその塩と、
− 有機緩衝剤と
を含む試薬。 - 試薬中のイミダゾール、イミダゾール誘導体及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるヘモグロビン安定化化合物の濃度が、10 mmol/L〜100 mmol/Lの範囲である請求項1に記載の試薬。
- 前記ヘモグロビン安定化化合物が、48〜52 mmol/Lの範囲の濃度でのイミダゾールである請求項1又は2に記載の試薬。
- 前記少なくとも2種の第四級アンモニウム塩が、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドの組み合わせを含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の試薬。
- 試薬中の前記少なくとも2種の第四級アンモニウム塩の合計濃度が、1.0 mmol/L〜10 mmol/Lの範囲である請求項1〜4のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記少なくとも2種の第四級アンモニウム塩が、5.4〜5.8 mmol/Lの範囲の濃度でのドデシルトリメチルアンモニウムクロリドと、0.87〜0.93 mmol/Lの範囲の濃度でのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドとの組み合わせである請求項1〜5のいずれか1項に記載の試薬。
- 試薬中の前記1,3-ジメチルウレア及び/又はその塩の濃度が、10 mmol/L〜25 mmol/Lの範囲である請求項1〜6のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記1,3-ジメチルウレア及び/又はその塩が、16.5〜17.5 mmol/Lの範囲の濃度での1,3-ジメチルウレアである請求項1〜7のいずれか1項に記載の試薬。
- プロカイン、塩酸プロカイン又はプロカインのその他の塩をさらに含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の試薬。
- 試薬中の塩酸プロカインの濃度が、0.2 mmol/L〜1.6 mmol/Lの範囲である請求項9に記載の試薬。
- 前記有機緩衝剤が、2 mmol/L〜8 mmol/Lの範囲の濃度でのADA (N-2-(アセトアミド)イミノ二酢酸)、HEPES (2-(4(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジン)エタンスルホン酸)、MOPS (3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、PIPES (ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)又はそれらの組み合わせのような化合物である請求項1〜10のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記有機緩衝剤が、2 mmol/L〜8 mmol/Lの範囲の濃度でのADA (N-2-(アセトアミド)イミノ二酢酸)である請求項1〜11のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記有機緩衝剤が、5.0〜5.6 mmol/Lの範囲の濃度でのADA (N-2-(アセトアミド)イミノ二酢酸)である請求項12に記載の試薬。
- 浸透圧が、少なくとも1種の無機塩、例えば塩化ナトリウム及び/又は硫酸ナトリウムで調整されている請求項1〜13のいずれか1項に記載の試薬。
- 浸透圧が、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムで調整されている請求項1〜14のいずれか1項に記載の試薬。
- 浸透圧が、200ミリオスモル/L〜400ミリオスモル/Lの範囲である請求項14又は15に記載の試薬。
- pHが酸で調整され、かつpHが6〜8の範囲である請求項1〜16のいずれか1項に記載の試薬。
- 48〜52 mmol/Lの濃度でのイミダゾール;5.4〜5.8 mmol/Lの濃度でのドデシルトリメチルアンモニウムクロリド;0.87〜0.93 mmol/Lの濃度でのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド;16.5〜17.5 mmol/Lの濃度での1,3-ジメチルウレア;5.0〜5.6 mmol/Lの濃度でのADA (N-2-(アセトアミド)イミノ二酢酸);0.87〜0.93 mmol/Lの濃度での塩酸プロカイン;及び脱イオン水を含み、
pHが希硫酸で7.1に調整され、かつ浸透圧が塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムで調整されている
請求項1〜17のいずれか1項に記載の試薬。 - 請求項1〜18のいずれか1項で定義される試薬を含むコーティング。
- i) 血液サンプルを請求項1〜18のいずれか1項で定義される試薬と混合する工程、及び
ii) コールター原理を用いて前記血液サンプルの内容を分析する工程
を含む、血液サンプル中の血液細胞の含量を測定する方法。 - 血小板の含量が工程ii)により測定される請求項20に記載の方法。
- 白血球の含量が工程ii)により測定される請求項20又は21に記載の方法。
- 1又は複数の白血球亜集団、例えばリンパ球、単球及び/又は顆粒球が工程ii)により測定される請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。
- iii) ヘモグロビン含量の分光光度定量により血液サンプルの内容を分析することをさらに含む請求項20〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 血液:試薬の容量比が、1:10000〜1:200の範囲である請求項20〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程i)が、血液サンプル中の細胞の計数用装置での使用に適するカートリッジ内で行われ、前記カートリッジ内で前記試薬は、前記試薬を前記血液サンプルと混合する混合チャンバと連結されている保持チャンバ内に存在し;かつ
前記工程ii)が、細胞を含む血液サンプルが前記混合チャンバと回収チャンバとの間に位置するオリフィスをその後通過することにより行われ、それにより、血液の内容が、細胞特徴づけ手段によりコールター原理を用いることによって分析される
請求項20〜25のいずれか1項に記載の方法。 - 前記工程iii)が、前記回収チャンバに連結されかつ分光光度定量に適合された容量測定チャンバ内で行われる請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜18のいずれか1項で定義される試薬の、血液サンプル中の血小板の含量を測定するための使用。
- 同じ血液サンプル中の白血球の含量の同時測定のための請求項28に記載の使用。
- 同じ血液サンプル中の1又は複数の白血球亜集団の同時測定のための請求項28又は29に記載の使用。
- 前記白血球亜集団が、リンパ球、単球及び/又は顆粒球を含む請求項30に記載の使用。
- 同じ血液サンプル中のヘモグロビン含量の測定のための請求項28又は29に記載の使用。
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