JP2008156556A

JP2008156556A - 蛍光色素及びその製造方法

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Publication number: JP2008156556A
Application number: JP2006349504A
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Inventors: Shinichiro Isobe; 信一郎礒部; Shuntaro Mataga; 駿太郎又賀
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Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2006-12-26
Publication date: 2008-07-10
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Abstract

【課題】蛍光色素の水溶性を向上させ、標識時の蛍光強度を向上させること。
【解決手段】本発明の蛍光色素は、共役系を有し、１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体から成る有機EL色素であり、リンカーを介してあるいは直接に結合した窒素カチオン含有基を有する。その高い水溶性により、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。
【選択図】図２

Description

本発明は、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類等の生体分子の検出に用いる蛍光色素であって、固体状態で発光し、水溶性を有する蛍光色素及びその製造方法に関する。

近年、ヒトゲノムの全容が明らかにされ、遺伝子治療、遺伝子診断などを目的としたポストゲノム研究が盛んに行われている。例えば、DNA解析は、DNAマイクロアレイ基盤上に固定されたプローブDNAと、蛍光色素等で標識されたサンプルDNAとをハイブリダイズさせて二本鎖を形成させ、サンプルDNAの検出を行っている。これは蛍光色素で標識した核酸をPCR伸長し、基盤上でハイブリダイゼーションを行った後に測定する手法である。最近では、より多くのアミノ基を有するプライマーを用いた手法、DNAにアミノ基を導入する手法がとられている。

標識には、蛍光色素が広く使用されており、高い蛍光強度を有すること、乾燥状態（固体状態）でも発光すること、そして水溶性を有することなどが要求されている。蛍光色素としては、例えば、Cy3やCy5が使用されている（例えば、非特許文献１）。
Science 283,1,January,1999,83-87

しかしながら、乾燥状態でも発光する蛍光色素は油溶性であり、水溶性が低いという問題がある。そのため、試料溶液に蛍光色素が十分溶解することができず、標識率が上がらない結果、十分な蛍光強度が得られないという問題があった。

上記の課題を解決するため、本発明者は鋭意努力した結果、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体から成る有機EL色素に窒素カチオン含有基を導入することにより、蛍光色素の水溶性を向上させ、標識時の蛍光強度を大幅に向上させることが可能なことを見出して本発明を完成させたものである。
すなわち、本発明に係る一の蛍光色素は、以下の一般式（１）、（２）又は（３）で表されるアゾール誘導体から成ることを特徴とする。

ここで、(1)及び(3)ではR₁は、そして(2)ではR₁とR₄の一方は、一般式L-Mで示され、Mは、置換基を有しても良いピリジニウム基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基を示し、Lは、直接結合あるいは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種以上の官能基からなり、Mと発色部とを連結するリンカー、(2)のR₁とR₄の残部、そしてR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有していてもよい炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-は、ハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。

また、上記のR₂とR₃には、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種を用いることができる。

また、上記のR₂とR₃には、スルホニル基を有するアリール基を用いることができる。

また、上記のリンカーLには、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）を用いることができ、その場合、蛍光色素は以下の方法により製造することができる。すなわち、本発明の蛍光色素の製造方法は、以下の一般式（９）、（１０）又は（１１）で表されるハロアルキル体と、アミン化合物とを反応させる工程を含むことを特徴とするものである。

ここで、式中、(9)及び(11)ではR₁は、そして(10)ではR₁とR₄の一方は、一般式 -(CH₂)n-X（nは１〜４の整数、Xはハロゲン原子）で示されるハロアルキル基、(10)のR₁とR₄の残部及びR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有していてもよい炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-はハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。

また、本発明に係る別の蛍光色素は、以下の一般式（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）で表されるイミダゾール誘導体から成ることを特徴とする蛍光色素である。

ここで、(4)、(6)及び(7)のR₁とR₄の一方、そして(5)及び(8)のR₁、R₄及びR₅のいずれか一つは、一般式L-Mで示され、Mは、置換基を有しても良いピリジニウム基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基を示し、Lは、直接結合あるいは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種以上の官能基からなり、Mと発色部とを連結するリンカー、(4)、(6)及び(7)のR₁とR₄の残部、(5)及び(8)のR₁、R₄及びR₅の残部、そしてR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、R'、R"は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-は、ハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。

また、上記のリンカーLには、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）を用いることができ、その場合、蛍光色素は以下の方法により製造することができる。すなわち、本発明の蛍光色素の製造方法は、以下の一般式で表されるハロアルキル体と、アミン化合物とを反応させる工程を含むことを特徴とするものである。

ここで、式中、(12)、(14)及び(15)のR₁とR₄の一方、そして(13)及び(16)のR₁、R₄及びR₅のいずれか一つは、一般式 -(CH₂)n-X（nは１〜４の整数、Xはハロゲン原子）で示されるハロアルキル基、(12)、(14)及び(15)のR₁とR₄の残部、そして(13)及び(16)のR₁、R₄及びR₅の残部、そしてR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、R'、R"は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-はハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。

本発明の蛍光色素は、共役系を有し、１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体から成る有機EL色素であり、リンカーを介して結合した窒素カチオン含有基を有する。その高い水溶性により、生体分子に対する標識率を向上させることができ、高感度の生体分子の検出が可能となる。これにより使用する標識色素の量を大幅に低減できることから、標的分子の検出費用を大幅にコストダウンすることも可能となる。また、有機EL色素は固体状態（固体及び半固体を含む）で高い量子収率を有しているので、マイクロアレイなどの基盤上、もしくはビーズ上の乾燥状態でも高い蛍光強度を与える。また、有機EL色素はCy3やCy5に比べ安価であるので、より低コストで生体分子の検出を行うことができる。また、有機EL色素の置換基を変えることにより励起波長及び発光波長を変化させることができるので、蛍光波長の選択の自由度が増加し、レッド、オレンジ、イエロー、グリーン、ブルーなど多くの蛍光波長を用いることができる。これにより、ストークスシフトの大きい（励起波長と蛍光波長の差が大きい）２種以上の蛍光色素を用いることが可能となり、一つの試料中に含まれる複数の標的核酸を同時に検出することも可能となる。また、Cy3やCy5は冷凍保存する必要があるのに対し、有機EL色素は化学的に安定であり、常温での長期保存に耐えることができるので、取り扱いが容易である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の蛍光色素の発色部は、共役系を有し、１種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体から成る有機EL色素である。

アゾール誘導体から成る蛍光色素は、以下の一般式（１）、（２）、（３）で示すことができる。

ここで、(1)及び(3)ではR₁は、そして(2)ではR₁とR₄の一方は、一般式L-Mで示され、Mは、ピリジニウム基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基を示し、Lは、直接結合あるいは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種以上の官能基からなり、Mと発色部とを連結するリンカーを示す。リンカーを用いることが好ましい。リンカーは、発色部と標識対象である生体分子との間の立体障害を緩和させ、結合部と生体分子の標識部位との結合を容易にするので、より高い標識率を与えることが可能だからである。

また、(2)のR₁とR₄の残部及びR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示す。上記のアルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、例えばピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の脂肪族炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。好ましくは、R₂、R₃が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である。あるいは、好ましくは、R₂、R₃が、スルホニル基を有するアリール基である。

また、Xは置換基を有していてもよい炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示す。

また、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、その脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。

また、An^-は、Cl^-、Br^-、I^-等のハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。

アゾール誘導体として、ジアゾール誘導体の例を示したが、以下の一般式で表されるトリアゾール誘導体を用いることもできる。トリアゾール誘導体を用いても、ジアゾール誘導体の場合と同様の効果を得ることができる。

ここで、(17)及び(19)ではR₁は、そして(18)ではR₁とR₇の一方は、一般式L-Mで示され、Mは、ピリジニウム基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基を示し、Lは、直接結合あるいは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種以上の官能基からなり、Mと発色部とを連結するリンカーを示す。リンカーを用いることが好ましい。

また、(18)のR₁とR₇の残部及びR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示す。上記のアルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、例えばピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の脂肪族炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。好ましくは、R₂、R₃が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である。あるいは、好ましくは、R₂、R₃が、スルホニル基を有するアリール基である。

イミダゾール誘導体から成る蛍光色素は、以下の一般式で示すことができる。

ここで、(4)、(6)及び(7)のR₁とR₄の一方、そして(5)及び(8)のR₁、R₄及びR₅のいずれか一つは、一般式L-Mで示され、Mは、ピリジニウム基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基を示し、Lは、直接結合あるいは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種以上の官能基からなり、Mと発色部とを連結するリンカーを示す。リンカーを用いることが好ましい。

また、(4)、(6)及び(7)のR₁とR₄の残部、(5)及び(8)のR₁、R₄及びR₅の残部、そしてR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示す。上記のアルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、例えばピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の脂肪族炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。好ましくは、R₂、R₃が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である。あるいは、好ましくは、R₂、R₃が、スルホニル基を有するアリール基である。

また、R'、R"は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、その脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。

上記のアゾール誘導体及びイミダゾール誘導体のいずれにおいても、リンカーは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種の官能基のみで構成しても良く、あるいは２種以上の官能基を含む構成とすることもできる。また、選択した一の官能基を２個以上含む構成とすることもできる。

例えば、１種の官能基のみで構成する場合、-CONH-、-O-、-COO-又は-(CH₂)_n-、より好ましくは、-COO-又は-(CH₂)_n-、さらに好ましくは、-(CH₂)_n-である。ここで、-(CH₂)_n-のnは１もしくは２が好ましい。

また、２種以上の官能基で構成する場合、以下の態様とすることができる。
（１）２種の官能基で構成する場合
-CONH-COO-、-CH₂-O-又は-CH₂-NR- が好ましい。
（２）３種以上の官能基で構成する場合
（i）以下の一般式(I)で表されるものを用いることができる。
-(CHR')p-X-(CHR")q- （I）
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも１種の官能基を用いることができ、好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-、より好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-を用いることができる。また、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基から成る脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、４級アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか１種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。pとqはそれぞれ独立に０から２０の整数、好ましくは０から１０の整数、より好ましくは０から５の整数であり、p+q≧1である。
リンカーの具体例を挙げると、-(CH₂)p-CONH-(CH₂)q-、-(CH₂)p-COO-(CH₂)q-、
-(CH₂)p-CH(-R'-SO₃H)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CH(-R'-N⁺H₃)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CH(-R'-COOH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CH(-R'-OH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-(O-CH-)n-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CONH(-R'-SO₃H)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CONH(-R'-SO₃H)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CONH(-R'-N⁺H₃)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CONH(-R'-OH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-CONH(-R'-COOH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-COO-R'(-SO₃H)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-COO-R'(-OH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-COO-R'(-N⁺H₃)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-COO-R'(-COOH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-Ar-(CH₂)q-、-(CH₂)p-(Ar-COO)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-(Ar-SO₃H)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-(Ar-N⁺H₃)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-(Ar-OH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-(Ar-COOH)-(CH₂)q-、-(CH₂)p-NR-(CH₂)q-、-(CH₂)p-O-(CH₂)q-、-(CH₂)p-S-(CH₂)q-、-(CH₂)p-HN-C(=NH)-NH- (CH₂)q-、-(CH₂)p-CO-Ar-NR-(CH₂)q-等を挙げることができる。より好ましくは、-(CH₂)p-CONH-(CH₂)q-又は-(CH₂)p-COO-(CH₂)q-である。
(ii)また、以下の一般式(II)で表されるものを用いることもできる。
-Y-(CHR₃)r-Z- （II）
ここで、Y及びZは、それぞれ独立に、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種の官能基であり、好ましくは、YとZがそれぞれ、-CONH-と-COO-、-COO-と-COO-、-COO-と-NR- の組み合わせ、より好ましくは-COO-と-COO-、-COO-と-NR- の組み合わせである。また、R3は、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基から成る脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか１種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレン基であり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。rは０から２０の整数、好ましくは０から１０の整数、より好ましくは０から５の整数である。このスペーサー部の具体例を挙げると、-CONH-(CH₂)r-COO-、-CONH-CH(-R₃-OH)-COO-、-CONH-CH(-R₃-COOH)-COO-、-CONH-CH(R₃-SO₃H)-COO-、-COO-(CH₂)r-COO- 等を挙げることができる。

また、リンカーにペプチドリンカーを用いることもできる。ペプチドリンカーとしては、それぞれ、-C(-R₁)-CONH-C(-R₂)-、-C(-R₁)-CONH-C(-R₂)-CONH-C(-R₃)-、-C(-R₁)-CONH-C(-R₂)-CONH-C(-R₃)-CONH-C(-R₄)-で表されるジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドを用いることが好ましい。ここで、R₁、R₂、R₃、R₄は、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、アルコール基、インドール基、ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、グアニジン基、チオエーテル基、アルキルチオール基、イミダゾール基又はアルキルアミノ基等の置換基を表す。これらペプチドは、ホモ又はヘテロペプチドであって良い。具体例を挙げると、Ala-Ser、Glu-Ala、Glu-Ala-Leu、Gly-Pro、Gly-Pro-Asn、Ile-Val、Ile-Val-Met等を用いることができる。

また、本発明の蛍光色素に生体分子に結合する結合部を設けることもできる。結合部は例えば窒素カチオン含有基に設けることができる。結合部は、生体分子と結合する反応性基を有し、その反応性基は共有結合又はイオン結合により生体分子と結合する。

共有結合として、例えばアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、又はグアニジン結合を形成する場合、反応性基には、生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基、カルボキシル基又はヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基又は活性エステル化したカルボニル基である。これら反応性基と反応する窒素カチオン含有基の官能基としては、例えばカルボキシル基を用いることができる。例えば、活性エステル化したカルボニル基には、N−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルやマレイミドエステルを用いることができる。N−ヒドロキシ−スクシンイミドを用い、縮合剤としてDCCを用いることによりN−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子が結合する。また、カルボジイミド基には、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）や1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル）カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子とを結合させることができる。

また、イオン結合を形成する反応性基には、アニオン性基やカチオン性基を用いることができる。アニオン性基としては、例えばスルホニル基やカルボキシル基を用いることができる。これらのアニオン性基は、生体分子のカチオン性基、例えばアミノ基とイオン結合する。また、カチオン性基としては、４級アンモニウム基やピリジニウム基等の窒素カチオン含有基を用いることができる。これらカチオン性基は、生体分子のアニオン性基、例えばカルボキシル基とイオン結合する。なお、本発明においては、発色部に結合した窒素カチオン含有基が反応性基としてのカチオン性基を兼ねることができる。

本発明のアゾール誘導体及びイミダゾール誘導体において、リンカーと窒素カチオン含有性基の組合せは特に限定されないが、リンカーには-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）を用い、窒素カチオン含有性基には、ピリジニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基又は４級アミノ基を用いることが好ましい。

リンカーに-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）を用いるアゾール誘導体は、例えば以下の方法により製造することができる。すなわち、以下の一般式で表されるアゾール誘導体のハロアルキル体と、アミン化合物とを反応させることにより製造することができる。

ここで、式中、(9)及び(11)ではR₁は、そして(10)ではR₁とR₄の一方は、一般式 (CH₂)n-X（nは１〜４の整数、Xはハロゲン原子）で示されるハロアルキル基であり、好ましくは-CH₂Cl、-CH₂Br又は-CH₂Iである。

また、(10)のR₁とR₄の残部及びR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示す。上記のアルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、例えばピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の脂肪族炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。好ましくは、R₂、R₃が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である。あるいは、好ましくは、R₂、R₃が、スルホニル基を有するアリール基である。

また、Xは置換基を有していても良い炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示す。

また、イミダゾール誘導体から成る蛍光色素の場合、以下の一般式で表されるハロアルキル体と、アミン化合物とを反応させることにより製造することができる。

ここで、(12)、(14)及び(15)のR₁とR₄の一方、そして(13)及び(16)のR₁、R₄及びR₅のいずれか一つは、一般式 (CH₂)n-X（nは１〜４の整数、Xはハロゲン原子）で示されるハロアルキル基であり、好ましくは-CH₂Cl、-CH₂Br又は-CH₂Iである。

また、(12)、(14)及び(15)のR₁とR₄の残部、(13)及び(16)のR₁、R₄及びR₅の残部及びR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示す。上記のアルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、例えばピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の脂肪族炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。好ましくは、R₂、R₃が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である。あるいは、好ましくは、R₂、R₃が、スルホニル基を有するアリール基である。

ここで、ハロアルキル体は、アゾール誘導体又はイミダゾール誘導体のヒドロキシ体にハロゲン化剤を反応させる方法を用いることにより得ることができる。ハロゲン化剤には、塩化チオニル、塩化ホスホリル、三塩化リン、五塩化リン、塩化スルフリル、塩素、臭化チオニル、臭素等を用いることができ、好ましくは塩化チオニル又は塩化ホスホリルである。

また、ハロアルキル体と反応させるアミン化合物には、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、n-プロピルアミン、n-ブチルアミン等の脂肪族一級アミン、ベンジルアミン、ジフェニルアミン、アニリン等の芳香族一級アミン、ジメチルアミン、ジエタノールアミン、ジ-n-プロピルアミン、ジ-n-ブチルアミン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン等の脂肪族二級アミン、ジフェニルアミン、N-メチルアニリン等の芳香族二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、トリ-n-プロピルアミン、トリ-n-ブチルアミン、N-メチルモルホリン、N-メチルピペリジン、N-メチルピロリジン等の脂肪族三級アミン、N,N-ジメチルアニリン等の芳香族三級アミン、ピリジン類、ピペラジン類、イミダゾール類、チアゾール類、オキサゾール類、キノリン類、ベンゾイミダゾール類、ベンゾチアゾール類、ベンゾオキサゾール類等を用いることができる。芳香族アミンのベンゼン環、そしてピリジン類、イミダゾール類、チアゾール類、オキサゾール類、キノリン類、ベンゾイミダゾール類、ベンゾチアゾール類、ベンゾオキサゾール類に、アルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、スルホン酸基が結合したものを用いることもできる。好ましいアミン化合物は、ピリジン類、ピペリジン類又はピペラジン類である。

また、本発明のアゾール誘導体は、別の方法を用いて製造することもできる。すなわち、本発明の蛍光色素の別の製造方法は、還元アミノ化反応により、アゾール誘導体のβ−ジケトン体と１級アミンとを反応させてジアゾロピリジン体を製造する工程を含むものである。この反応には、例えば、以下の一般式で表されるアゾール誘導体のβ−ジケトン体を用いることができる。また、１級アミンには、脂肪族１級アミノメチル基を置換基として含む、オキサゾール類、チアゾール類、カルバゾール類、イミダゾール類、トリアジン類、ピロール類、ピラジン類、テトラジン類、アゼパン類、アゼピン類、ピリジン類、ピペリジン類、ピペラジン類、キノリン類、ベンゾイミダゾール類、ベンゾチアゾール類又はベンゾオキサゾール類を用いることができ、さらにこれら化合物は、アルキル基、ハロアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基又はスルホン酸基が結合していても良い。

ここで、R₁、R₂は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示す。上記のアルキル基は、例えば炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。また、上記のアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基又はフェノキシ基である。また、上記のアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、上記の芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基又はナフチル基であり、より好ましくはフェニル基である。また、上記の複素環基は、例えばピロール基、フラン基、チオフェン基、イミダゾール基、オキサゾール基、チアゾール基、ピラゾール基、ピリジン基又はキノリン基であり、より好ましくはフラン基、イミダゾール基又はチオフェン基である。また、上記の脂肪族炭化水素基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基である。好ましくは、R₁、R₂が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である。あるいは、好ましくは、R₁、R₂が、スルホニル基を有するアリール基である。また、Xは置換基を有していても良い炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示す。

本発明の蛍光色素は、標識された固体あるいは半固体状態の生体分子の蛍光を測定する検出方法であれば、あらゆる生体分子の検出方法に適用することができる。従来の蛍光色素に代えて用いることにより、高感度で、化学的に安定で操作性に優れ、さらに低コストの検出方法を提供することができる。本発明の蛍光色素は、生体分子試料に蛍光色素を直接反応させて標識しても良く、あるいは生体分子試料と、本発明の蛍光色素で標識されたプローブとを反応させて標識する方法を用いることもできる。さらに、本発明の蛍光色素で標識した生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する方法を用いることもできる。例えば、核酸を検出対象とするDNAマイクロアレイ法や、プライマーやターミネータを用いるPCR法に用いることができる。

また、タンパク質を検出対象とする場合、通常、電気泳動後のタンパク質の検出には染色色素が用いられている。泳動後のゲル中に、染色色素、例えばクーマシーブリリアントブルー（CBB）を浸透させてタンパク質を染色し、UVを照射して発光させる方法が用いられる。しかしながら、従来の染色色素を用いる方法は簡便であるが、感度が100ng程度と低く微量のタンパク質の検出には適さない。また、ゲルを介して染色色素を浸透させるため、染色に長時間を要するという問題もある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いると高感度であり、微量タンパク質の検出には好適である。さらに、サイズ分離したタンパク質を質量分析して同定することもできる。

ここで、タンパク質には、アルブミン、グロブリン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、そしてコラーゲン等の単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、リボタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質等の複合タンパク質のいずれも検出対象とすることができる。例えば、リンタンパク質、糖タンパク質、総タンパク質の染色色素に対応させて３種の蛍光色素を用い、二次元電気泳動で分離したタンパク質試料において、リンタンパク質、糖タンパク質及び総タンパク質を染色することができる。また、TOF-Mass等の質量分析を行うことにより、タンパク質を同定できるので、特殊なタンパク質を生成させる、ガンやウィルスによる感染症などの疾病の診断や治療に応用することが可能である。また、コラーゲンは、動物の結合組織を構成するタンパク質であり、独特の繊維状構造をとる。すなわち、３本のポリペプチド鎖からなり、そのペプチド鎖が寄り集まって三重鎖を形成する。コラーゲンは、一般に極めて免疫原性が低いタンパク質であり、食品、化粧品、医薬品等の分野で広く利用されている。しかし、コラーゲンのペプチド鎖に蛍光色素を導入しても、従来の蛍光色素ではその安定性が十分とは言えず、より安定な蛍光色素が必要とされている。そこで、本発明の蛍光色素を用いてコラーゲンを標識することにより、安定かつ高感度な検出を行うことが可能となる。

また、タンパク質と特異的に結合する抗体を本発明の蛍光色素で標識することにより、タンパク質を標識することもできる。例えば、IgG抗体をペプシンで処理するとF(ab')₂と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとFab'と呼ばれるフラグメントが得られる。Fab'フラグメントは1つもしくは2つのチオール基（-SH）を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、本発明の蛍光色素に反応性基としてマレイミド基を導入し、フラグメントのチオール基と反応させることにより抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性（抗原捕捉能）を失うことがない。

なお、本発明の蛍光色素でアプタマーを標識することもできる。アプタマーはオリゴ核酸からなり、塩基配列に依存して種々の特徴ある立体構造をとることができるので、その立体構造を介してタンパク質を含むあらゆる生体分子に結合することができる。この性質を利用し、本発明の蛍光色素で標識したアプタマーを特定のタンパク質に結合させ、被検出物質との結合によるそのタンパク質の構造変化に伴う蛍光変化から間接的に被検出物質を検出することができる。

また、本発明の蛍光色素を用いて金属イオンの検出を行うこともできる。体内のDNAやタンパク質などの安定性や高次構造の維持、機能発現、そして生体内のすべての化学反応を司る酵素の活性化など、生体内で起こるあらゆる生命現象に金属イオンは関与している。そのため、生体内での金属イオンの動きをリアルタイムで観察できる金属イオンセンサは医療分野を初めとしてその重要性が叫ばれている。従来、生体分子に蛍光色素を導入した金属イオンセンサが知られている。例えば、K⁺イオン存在化において、K⁺イオン取り込んで特殊な構造をとる配列を有する核酸を利用する金属イオンセンサが提案されている（J. AM. CHEM. SOC. 2002, 124, 14286-14287）。エネルギートランスファーを起こす蛍光色素を核酸の両端に導入する。通常は色素間距離があるためエネルギートランスファーは起きない。しかし、K⁺イオン存在下では核酸が特殊な形をとる結果、蛍光色素がエネルギートランスファーを起こす距離に近接することで、蛍光を観察することができる。また、ペプチドに蛍光色素を導入した亜鉛イオンセンサも提案されている（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3053-3054）。これらの従来の蛍光色素に代えて本発明の蛍光色素を用いることにより、従来に比べ高感度で取り扱いが容易な金属イオンセンサを提供することが可能となる。なお、生体内に存在する金属イオンであれば、すべての金属イオンを検出することが可能である。

また、本発明の蛍光色素を用いて、細胞内のシグナル観察を行うこともできる。内部シグナルや環境情報に対する細胞の応答には、イオンから酵素へと多大な分子が関与している。シグナル伝達過程では特殊なプロテインキナーゼが活性化し、特殊な細胞タンパク質のリン酸化を導くことで様々な細胞応答の初期応答を担っていることが知られている。ヌクレオチドの結合と加水分解はこれらの活性に重大な役割を果たしており、ヌクレオチド誘導体を用いることで、シグナル伝達挙動を素早く観察することが出来る。例えば、プロテインキナーゼC（PKC）は細胞膜におけるシグナル伝達において重要な役割を果たしている。このCa²⁺依存セリン／スレオニンプロテインキナーゼはジアシルグリセロールやフォスファティジルセリンの様な膜構成脂質上で活性化され、イオンチャネルや細胞骨格タンパク質に存在するセリンやスレオニンをリン酸化することで膜表面電化を変えシグナル伝達を行っている。これらを生細胞において動的に観察することで細胞のシグナル伝達の観察を行うことができる。

ここで、ヌクレオチド誘導体は酵素の基質や阻害剤として供給され、孤立性タンパク質の構造と力学の探査、膜結合タンパク酵素の再構成、ミトコンドリアのようなオルガネラ、除膜筋線維のような組織のヌクレオチド結合タンパク質部分に、結合してその調節を行っている。また、最近ではG-タンパク質の阻害剤や活性体のようなシグナル伝達に影響を与える化合物の存在も解ってきている。このヌクレオチド誘導体に本発明の有機EL色素からなる標識色素を導入することで、これらの細胞内シグナル伝達の動的観察を高感度で、かつ取り扱い容易に行うことが可能となる。

また、本発明の蛍光色素を、組織又は細胞試料中の標的核酸や標的タンパク質の発現レベルの検討に用いる組織又は細胞の染色色素としても用いることができる。すなわち、本発明の染色色素を真核細胞の染色に用いると、乾燥状態でも蛍光を発することから標識後の保存などの点で従来の色素よりも優れた性能を示す。また、真核細胞のみならず、細胞骨格用色素としても十分に用いることが可能である。この他、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、ソリゾーム、脂質二重膜などの標識に用いることが可能である。これら、標識された細胞等は、湿潤及び乾燥のあらゆる条件下で観測が可能であるため、汎用性が大きい。観測に際しては、蛍光顕微鏡などを用いることができる。

また、臨床段階で人体より採取された組織は、ミクロトームなどの機器を用いて薄膜にスライスした後、染色されている。ここでは、Cy色素及びAlexa色素が用いられている。しかしながら、既存の色素は安定性が非常に悪く、再診断の際には、再びサンプルを作製する必要がある。また、作製されたサンプルは標本として保存することが不可能である。しかし、上記の従来の色素に比べ本発明の蛍光色素は、非常に安定な色素であるので、染色した組織を標本として保存することが可能である。

また、ガンや感染症等の診断には、抗体の特異的認識能を利用したイムノアッセイが用いられている。イムノアッセイは、標識抗体を用いて目的の抗原を検出する方法であり、標識物質に酵素を用いる酵素イムノアッセイ（ELISA法）や標識物質に蛍光色素を用いる蛍光イムノアッセイ（FIA法）等が用いられている。ELISA法は、最終的な検出は標識物質である酵素の反応によって生じるさまざまなシグナル（発色、発光、化学発光等）を検出及び定量することにより行う。一方、FIA法は、標識物質である蛍光色素に励起光を照射し、それによる蛍光を検出及び定量することにより行う。FIA法は蛍光色素を用いるため鮮明なコントラストを有し定量性に優れ、またELISA法に比べ、より短時間での検出が可能でかつ操作も簡便であるという特徴を有している。しかしながら、従来の蛍光色素は標識率が低いという問題がある。例えば、抗体に対して２００倍モル程度の蛍光色素を用いているが、この条件下においても標識率は５０−６０％程度であった。そのため、蛍光色素を大量に使用する必要があるため検出費用が高コストになったり、未反応の蛍光色素を除去するための処理工程が必要となり検出に長時間を要するという問題があった。これに対し、本発明の蛍光色素を用いることにより、標識率を向上させることができるので、より高感度の検出を行うことが可能となる。

また、本発明の蛍光色素を化粧用組成物に用いることもできる。蛍光色素を含む化粧用組成物は、夜間や室内における演出用の化粧としてだけでなく、蛍光色素の明色化効果を利用して、ファンデーションや毛髪の染色剤等に用いられている。ここで、明色化効果とは、蛍光色素が紫外光を吸収して可視光を放出して、皮膚や毛髪に明るさや鮮やかさを与える効果をいう。日本の室内照明には、昼光色や白色の蛍光灯が使われているが、これらの蛍光灯からの光は、青や緑が主であり赤が少ない。そのため、女性の化粧肌は青白くくすんで見えるという問題がある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いることにより、例えば、橙色の光を放出する蛍光色素を用い、鮮やかな赤味の色を発色させてくすみの解消を図ることが可能である。また、毛髪の染色に用いると、蛍光色素は可視領域の放出光線により毛髪の色を変えるだけでなく、毛髪の輝きを増加させることも可能である。

また、本発明の蛍光色素をマーキング剤に用いることもできる。本発明の蛍光色素を含むマーキング剤は、通常の可視光下では不可視であるが、紫外線等の励起光を照射することにより蛍光色素を発光させて視認することができる。この性質を利用し、犯罪防止や犯罪捜査を目的として、物品や人体等の識別や物質の検出等に使用することができる。マーキング剤の対象物には、偽造や盗難等の犯罪の防止や犯罪捜査の対象となる物品や人体が含まれる。例えば、紙幣、小切手、株券、各種証明書等の重要文書や、自動車、オートバイ、自転車、美術品、家具、ブランド品、衣服等の物品、人体の皮膚、頭髪、爪等の身体表面部分、潜在指紋等の遺留物質等を挙げることができる。さらに、対象物を構成する材料に関しては、上質紙、ＯＣＲ紙、ノーカーボン紙、アート紙等の紙や、塩化ビニル、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等のプラスチックや、金属や、ガラスや、セラミックスや、羊毛、木綿、絹、麻等の天然繊維や、再生セルロース繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリアミド繊維、ポリエステル繊維等の合成繊維や、人体皮膚や体液中のタンパク質等を挙げることができる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例により限定されるものではない。
合成例１．
以下に、窒素カチオン含有基としてピリジニウム基を有するオキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジンの反応例を示す。

次いで、オキサジアゾロピリジンエチルエステル体(4)をNaBH₄存在下、還元反応を行い、ヒドロキシメチル体（5)を得、これと塩化チオニルを反応させチアジアゾロピリジンクロロメチル体(6)を得、これにピリジンを反応させて窒素カチオン体（7）を合成した。以下に反応例を示す。

スキーム２．

以下に、合成手順を示す。
（１）クロロメチル体(6)の合成
50 mL 三口フラスコでピリジンヒドロキシメチル体（5) 100 mg (0.35 mmol)をSOCl₂ 20 mLに溶解した。その後、60℃で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、SOCl₂を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−ヘキサン＝8：2）で単離精製し、クロロメチル体(6)を72 mg (収率62%)得た。

（２）窒素カチオン体(7)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンクロロメチル体(6) 80 mg (0.23 mmol)をピリジン 20 mLに溶解した。その後、50℃で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、ピリジンを留去した。残渣をエタノールで再結晶し、窒素カチオン体(7)を53 mg (収率54%)得た。
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 9.11 (d, 2H,), δ 8.71 (t, 1H,), δ 8.21-8.27 (m, 4H), δ 7.54-7.74 (m, 8H), δ 6.24 (s, 2H).

合成例２．
以下に、窒素カチオン含有基として3-ヒドロキシピリジニウム基を用いた場合の反応例を示す。チアジアゾロピリジンクロロメチル体(6)に3-ヒドロキシピリジンを反応させて窒素カチオン体（9）を合成した。

6 9
スキーム３．

以下に、合成手順を示す。
チアジアゾロピリジンクロロメチル体(6) (0.3 mmol, 106mg)と3-Hydroxypyridine (0.3 mmol, 32mｇ)をCHCl₃ 5mlで溶解後、一晩加熱還流を行った。反応終了後、沈殿を吸引濾過し真空乾燥させた。反応終了後、吸引濾過し濾物を真空乾燥し、目的物を得た。
¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 8.64 (s, 1H), δ 8.55 (d, 1H), δ 8.33-8.36 (m, 2H), δ 8.12 (dd, 1H), δ 7.98 (dd, 1H), δ 7.56-7.72 (m, 8H), δ 6.11 (s, 2H).

合成例３．
以下に、窒素カチオン含有基として3-エチルエステルピリジニウム基を用いた場合の反応例を示す。チアジアゾロピリジンクロロメチル体(6)に3-エチルエステルピリジンを反応させて窒素カチオン体（13）を合成した。

スキーム４．

スキーム５．

以下に、合成手順を示す。
（１）3-エチルエステルピリジンの合成
窒素気流下、THF 30mLに溶解したヒドロキシピリジン (10) (500 mg、5.26 mmol)を-15℃まで冷却した。そこへNaH (5026 mmol, 126 mg)を少量ずつ数回に分けて添加した。NaHを全て投入した後、１時間攪拌した。その後、0℃まで温度を上昇させブロモ酢酸エチル(880 mg、5.26 mmol)をゆっくりと添加した。添加終了後、室温で２時間攪拌を行った。反応終了後、少量の水を加えて残留したNaHを分解した。THFを減圧留去し、残渣をクロロホルムへ溶解した。これに水を加え洗浄を２回行った。水を分離した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、クロロホルムを減圧下、留去しエステル体(12)を得た。

（２）窒素カチオン体（13）の合成
チアジアゾロピリジンクロロメチル体(6) (62 mg、0.18 mmol)と大過剰のピリジンエチルエステル体 (ratio: 5.0−15)とをEtOH 15 mlで溶解させ、5日間加熱還流を行った。反応終了後吸引濾過を行い、濾物を水に溶かし、CHCl₃で抽出を行った。濃縮、乾燥後、目的物(13)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃): δ 8.45-8.46 (m, 3H), δ 8.06 (s, 1H), δ 7.52-7.64 (m, 10H), δ 6.56 (s, 2H), δ 5.19 (s, 2H), δ 4.24 (q, 2H), δ 1.29 (t, 3H).

合成例４．
以下に、窒素カチオン含有基として活性エステルと結合した3-エチルエステルピリジニウム基を用いた場合の反応例を示す。チアジアゾロピリジンクロロメチル体(6)に3-エチルエステルピリジン活性エステル体（14）を反応させて窒素カチオン体（15）を合成した。

スキーム６．

以下に、合成手順を示す。
チアジアゾロピリジンクロロメチル体(6) (100 mg、0.3 mmol)と3-エチルエステルピリジン活性エステル体（14） (0.9 mmol, 206 mg)とをToluene 5mlに溶解させ、一晩加熱還流を行った。反応終了後、吸引濾過を行い、濾物を真空乾燥させ、窒素カチオン体（15）を得た。反応は定量的である。
¹H-NMR (CDCl₃): δ 9.33 (s, 1H), δ 9.07 (d, 1H), δ 8.35-8.51 (m, 4H), δ 7.50-7.67 (m, 8H), δ 6.46 (s, 2H), δ 3.32 (t, 2H), δ 3.10 (t, 2H), δ 2.80 (s, 4H).

合成例５．
以下に、ピリジニウム基を導入する別の反応例を示す。オキサジアゾール誘導体のジケトン体（16）に3-ピコリルアミン（17）を反応させてピリジン置換体（18）を合成した。このピリジン置換体（18）にヨウ化メチルを反応させて、窒素カチオン体を得た。

スキーム７．

以下に、合成手順を示す。
ジケトン体（16） (200 mg, 0.7 mmol)と3-picolylamine（17） (10 mmol, 1ml)をDioxane 25mlで溶解後、2時間加熱還流を行った。反応終了後、減圧留去した後、Hexane:AcOEt = 4:1の展開溶媒でシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製を行い、目的物を分取した。さらにEthanolで再結晶し、ピリジン置換体（18）を収率40%で得た。
¹H-NMR (CDCl₃): δ 8.86 (s, 1H), δ 8.75-8.77 (m, 2H), δ 8.57 (d, 1H), δ 7.89 (d, 1H), δ 7.42-7.63 (m, 9H).
ピリジン置換体（18）をヨウ化メチルと反応させ、窒素カチオン体を得た。

合成例６．
ピリジン置換体（18）に活性エステルのブロモ体を反応させて、窒素カチオン体（22）を得た。

スキーム８．

以下に、合成手順を示す。

化合物(18)(0.5 mmol、175 mg)、臭素化活性エステル体(0.5 mmol, 125 mg)をToluene 6 mlで溶解後、室温で一晩攪拌した。反応終了後吸引濾過を行い、濾物を真空乾燥して目的物(22)を得た。
¹H-NMR (CDCl₃): δ 9.82 (d, 1H,), δ 9.47 (s, 1H,), δ 8.74-75 (m, 2H), δ 8.38 (d, 1H), δ 7.95 (d, 1H), δ 7.53-7.63 (m, 8H,), δ 5.52 (s, 2H,), δ 3.52 (s, 2H), δ 2.71 (s, 4H).

合成例７．
比較のため、窒素カチオン含有基を持たないオキサジアゾロピリジン活性エステル体(21)を合成した。以下に反応例を示す。

スキーム９．

（合成手順）
（１）カルボン酸体(20)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体（19) 100 mg (0.21 mmol)とセリン26 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝7：3）で単離精製し、カルボン酸体(20)を 79 mg (収率 81%)得た。

（２）活性エステル体(21)の合成
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(20) 70 mg (0.15mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝10：1）で単離精製し、活性エステル体(21)を 61 mg (収率 72%)得た。
¹H-NMR (CDCl₃): δ 8.91 (d, 1H), δ 8.68 (d, 2H), δ 7.56 (d, 2H), δ 7.13 (d, 2H), δ 7.05 (d, 2H), δ 5.26 (d, 1H), δ 3.89-4.04 (m, 8H), δ 2.944 (s, 4H).

（評価）
窒素カチオン体(7)のDMSO中及び水溶液中における励起及び蛍光スペクトルを測定した。比較として、窒素カチオン含有基を持たない活性エステル体(21)についても測定した。水溶液中での結果を図１と図２に、DMSO中での結果を図３と図４に示す。窒素カチオン体(7)は、活性エステル体(21)に比べ、DMSO中で約６．５倍、そして水溶液中で約１０倍の蛍光強度を有していた。また、窒素カチオン体(9)、(13)、（15）、（18）及び（22）のメチル化物についても同様の結果が得られた。これにより、本発明の蛍光色素を用いることにより、生体分子の高感度の検出が可能であることを確認できた。

本発明の一の蛍光色素の水溶液中での励起スペクトルの一例である。本発明の一の蛍光色素の水溶液中での蛍光スペクトルの一例である。本発明の一の蛍光色素のDMSO中での励起スペクトルの一例である。本発明の一の蛍光色素のDMSO中での蛍光スペクトルの一例である。

Claims

以下の一般式（１）、（２）又は（３）で表されるアゾール誘導体から成る蛍光色素。

（式中、(1)及び(3)ではR₁は、そして(2)ではR₁とR₄の一方は、一般式L-Mで示され、Mは、置換基を有しても良いピリジニウム基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基を示し、Lは、直接結合あるいは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種以上の官能基からなり、Mと発色部とを連結するリンカー、(2)のR₁とR₄の残部、そしてR₂及びR₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有していてもよい炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-は、ハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。）
上記のR₂とR₃が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である請求項１記載の蛍光色素。
上記のR₂とR₃が、スルホニル基を有するアリール基である請求項１記載の蛍光色素。
上記のリンカーLが、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）である請求項１から３のいずれか一つに記載の蛍光色素。
以下の一般式（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）で表されるイミダゾール誘導体から成る蛍光色素。

（式中、(4)、(6)及び(7)のR₁とR₄の一方、そして(5)及び(8)のR₁、R₄及びR₅のいずれか一つは、一般式L-Mで示され、Mは、置換基を有しても良いピリジニウム基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基を示し、Lは、直接結合あるいは、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO₂NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-（Rはアルキル基）、-Ar-（Arは芳香族炭化水素基）及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された１種以上の官能基からなり、Mと発色部とを連結するリンカー、(4)、(6)及び(7)のR₁とR₄の残部、(5)及び(8)のR₁、R₄及びR₅の残部、そしてR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、R'、R"は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-は、ハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。）
上記のR₂とR₃が、それぞれ独立に、チオフェン誘導体、フラン誘導体、ピロール誘導体、イミダゾール誘導体、オキサゾール誘導体、チジアゾール誘導体、ピラゾール誘導体、ピリジン誘導体及びキノリン誘導体からなる群から選択された１種である請求項５記載の蛍光色素。
上記のR₂とR₃が、スルホニル基を有するアリール基である請求項５記載の蛍光色素。
上記のリンカーLが、-(CH₂)n-（nは１〜４の整数）である請求項５から７のいずれか一つに記載の蛍光色素。
（式中、(9)及び(11)ではR₁は、そして(10)ではR₁とR₄の一方は、一般式 -(CH₂)n-X（nは１〜４の整数、Xはハロゲン原子）で示されるハロアルキル基、(10)のR₁とR₄の残部及びR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有しても良い芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、Xは置換基を有していても良い炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、セレン原子又はボロン原子を示し、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-はハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。）
以下の一般式（１２）、（１３）、（１４）、（１５）又は（１６）で表されるハロアルキル体と、アミン化合物とを反応させる工程を含む蛍光色素の製造方法。

（式中、(12)、(14)及び(15)のR₁とR₄の一方、そして(13)、(16)のR₁、R₄及びR₅のいずれか一つは、一般式 -(CH₂)n-X（nは１〜４の整数、Xはハロゲン原子）で示されるハロアルキル基、(12)、(14)及び(15)のR₁とR₄の残部、(13)、(16)のR₁、R₄及びR₅の残部、そしてR₂、R₃は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換基としてアルキル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、芳香族炭化水素基又は複素環基を有してもよい芳香族炭化水素基又は脂肪族炭化水素基又は複素環基を示し、R'、R"は芳香環を含んでも良いアルキル基からなる脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基、An^-はハロゲン化物イオン、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-又はPF₆ ^-を示す。）