JP7014549B2

JP7014549B2 - 蛍光色素

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Publication number: JP7014549B2
Application number: JP2017172360A
Authority: JP
Inventors: 信一郎礒部; 洋平松岡
Original assignee: 信一郎礒部
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2037-09-07
Also published as: JP2019048908A

Description

本発明は、核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類等の生体分子の検出に用いる蛍光色素に関する。

ニューバイオケミストリー分野では、現在特定遺伝子解析、遺伝子治療、テーラーメイド医療を目的とした研究が盛んに行われている。この分野では有機蛍光試薬を用いる研究が殆どであり蛍光色素が存在しなければ、ＤＮＡ解析や抗体を含むタンパク質を用いた解析技術は完成しなかったと言われている。これらの分野で主に使用されている既存の蛍光試薬として、シアニン骨格を有するＣｙ色素やローダミン骨格を有するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒなどの有機蛍光色素が多く用いられている（例えば、非特許文献１）。

しかしながら、上記の既存の蛍光色素は、固体状態でも発光する利点を有するが、非常に高価であるため、生体分子の検出方法が高コストにならざるを得ないという問題がある。これに対し、本出願人は、アゾール誘導体からなる有機ＥＬ色素を蛍光色素として用いることを提案しており、これによれば、検出方法の低コスト化が可能で、固体状態でも高い蛍光強度を得ることが可能である（特許文献１）。

国際公開第２００５／０６２０４６号

Science 283,1,January,1999,83-87

しかしながら、より一層の検出感度向上のために、より高い蛍光強度を有する蛍光色素が必要とされている。

そこで、本発明は、低コスト化が可能で、固体状態でもより高い蛍光強度を有する蛍光色素を提供することを目的とした。

上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ベンゾチアジアゾール誘導体から成る蛍光色素が高い蛍光強度を有することを見出して本発明を完成させたものである。すなわち、本発明の一態様に係る蛍光色素は、以下の一般式（１）で表されるベンゾチアジアゾール誘導体から成ることを特徴とする。

ここで、一般式（１）中、Ｘは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示し、Ｙは一般式Ｌ_１－Ｍ_１で示され、Ｍ_１は、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示し、Ｌ_１は、Ｍ_１と中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、または、－（ＣＨ＝ＣＲ_１）_ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ_２）_ｎ－（ｎは１～６の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒ_２）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ_２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ_２－、－Ａｒ－（Ａｒは芳香族炭化水素基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲ_２－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ_１は水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒ_２は炭素数１～４のアルキル基である。

本発明の蛍光色素は、固体状態でも高い量子収率を有しており、マイクロアレイなどの基盤上もしくはビーズ上の乾燥状態でも高い蛍光強度を与える。また、Ｃｙ色素等の従来の蛍光色素に比べ安価に製造可能であるので、より低コストで生体分子の検出を行うことが可能となる。

合成例２の蛍光色素の粉末の発光状態を示す写真である。合成例３の蛍光色素の粉末の発光状態を示す写真である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
実施の形態１
本実施の形態に係る蛍光色素はベンゾチアジアゾール誘導体であり、以下の一般式（１）で表わすことができる。

一般式（１）中、Ｘは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示す。芳香族炭化水素基としては単環または多環のアリール基であり、例えば、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントラセニル基等を挙げることができる。置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、ジアルキルアミノ基、芳香族炭化水素基または複素環基を挙げることができる。該置換基としてのアルキル基は、置換または無置換の炭素数１～２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基である。また、該置換基としてのアルケニル基は、無置換の炭素数２～２０の直鎖状もしくは分岐状のアルケニル基である。また、該置換基としてのアルキニル基は、無置換の炭素数２～２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキニル基である。また、該置換基としてのアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、該置換基としてのアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、該置換基としてのジアルキルアミノ基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基を有するアミノ基である。また、該置換基としての芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基である。また、該置換基としての複素環基は、例えばチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基である。Ｘは、好ましくは、置換基を有するフェニル基であり、置換基としては、アルコキシ基またはアルキル基であり、具体例としては、ｐ－メトキシフェニル基、ｐ－エトキシフェニル基、ｐ－プロポキシフェニル基、ｐ－ブトキシフェニル基、ｐ－ペントキシフェニル基、ｐ－ヘキシルオキシフェニル基、ｐ－ヘプチルオキシフェニル基、ｐ－オクチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、ジエトキシフェニル基、ジプロポキシフェニル基、ジブトキシフェニル基、ジペントキシフェニル基、ジヘキシルオキシフェニル基、ｐ－メチルフェニル基、ｐ－エチルフェニル基、ｐ－プロピルフェニル基、ｐ－ブチルフェニル基、ｐ－ペンチルフェニル基、ｐ－ヘキシルフェニル基、ｐ－ヘプチルフェニル基、ｐ－オクチルフェニル基、ジメチルフェニル基、ジエチルフェニル基、ジプロピルフェニル基、ジブチルフェニル基、ジペンチルフェニル基、ジヘキシルフェニル基等を挙げることができる。

また、Ｙは一般式Ｌ_１－Ｍ_１で示され、Ｍ_１は、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、ピリミジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示す。該置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホニル基、ジアルキルアミノ基、芳香族炭化水素基または複素環基を挙げることができる。該置換基としてのアルキル基は、置換または無置換の炭素数１～２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基である。また、該置換基としてのアルケニル基は、無置換の炭素数２～２０の直鎖状もしくは分岐状のアルケニル基である。また、該置換基としてのアルキニル基は、無置換の炭素数２～２０の直鎖状もしくは分岐状のアルキニル基である。また、該置換基としてのアルコキシ基は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、該置換基としてのアルキルエステル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキルエステルである。また、該置換基としてのジアルキルアミノ基は、炭素数１から６の直鎖状又は分岐状のアルキル基を有するアミノ基である。また、該置換基としての芳香族炭化水素基は単環又は多環を含むアリール基である。また、該置換基としての複素環基は、例えばチエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基またはキノリル基である。Ｍ_１は、好ましくは、置換基を有してもよいピリジニウム基または置換基を有してもよい芳香族炭化水素基であり、より好ましくは無置換のピリジニウム基または無置換のフェニル基である。

また、Ｌ_１は、Ｍ_１と中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、または、－（ＣＨ＝ＣＲ_１）_ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ_２）_ｎ－（ｎは１～６の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒ_２）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ_２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ_２－、－Ａｒ－（Ａｒは芳香族炭化水素基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲ_２－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ_１は水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒ_２は炭素数１～４のアルキル基である。Ｌ_１は、好ましくは直接結合、－（ＣＨ＝ＣＲ_１）_ｎ－（ｎは１～６の整数）、または－（ＣＨ_２）_ｎ－（ｎは１～６の整数）である。

また、上記の一般式（１）で示される蛍光色素は、生体分子に結合する反応性基を含んでいてもよい。反応性基は共有結合またはイオン結合により生体分子と結合する。

上記の共有結合として、例えばアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、またはグアニジン結合を形成する場合、反応性基には、生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基、カルボキシル基またはヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、無水マレイン酸基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル化したカルボニル基（以下、活性エステル基ともいう）等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基、または活性エステル基である。これら反応性基と反応する窒素カチオン含有基または芳香族炭化水素基の官能基としては、例えばカルボキシル基を用いることができる。例えば、活性エステル基には、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルやマレイミドエステルを用いることができる。Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドを用い、縮合剤としてＤＣＣを用いることによりＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子が結合する。また、カルボジイミド基には、Ｎ，Ｎ‘－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により蛍光色素と生体分子とを結合させることができる。

また、蛍光色素が活性エステル基を含む場合、Ｙは一般式Ｌ_１－Ｍ_１－Ｌ_２で表すこともできる。ここで、Ｌ_２は、Ｍ_１と前記活性エステル基とを連結するリンカーであって、直接結合または－（ＣＨ_２）_ｑ－（ｑは１～６の整数）である。好ましくは、Ｌ_２は、－（ＣＨ_２）_ｑ－である。

また、イオン結合を形成する反応性基には、アニオン性基やカチオン性基を用いることができる。アニオン性基としては、例えばスルホニル基やカルボキシル基を用いることができる。これらのアニオン性基は、生体分子のカチオン性基、例えばアミノ基とイオン結合する。また、カチオン性基としては、４級アンモニウム基やピリジニウム基等の窒素カチオン含有基を用いることができる。これらカチオン性基は、生体分子のアニオン性基、例えばカルボキシル基とイオン結合する。

本実施の形態に係る蛍光色素は、固体状態でも高い蛍光強度を有している。

実施の形態２
本実施の形態に係る蛍光色素は、活性シリル基を含む以外は、実施の形態１に係るベンゾチアジアゾール誘導体と同様の構成を有している。以下、相違する部分について説明し、重複する部分については説明を省略する。

活性シリル基は、一般式Ｓｉ（Ｒ_３）_ｕ（ＯＲ_４）_３－ｕで表すことができる。Ｒ_３とＲ_４は炭素数１～４のアルキル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、より好ましくはメチル基またはエチル基である。また、ｕは０または１である。

Ｙは一般式Ｌ_１－Ｍ_１－Ｑ－Ｚで示される。Ｑはアミド結合、メチルアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合およびポリオキシエチレン結合から選択される１種の結合であり、好ましくは、アミド結合、メチルアミド結合またはポリオキシエチレン結合である。また、ポリオキシエチレン結合は、－（Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｔ－で表すことができ、ｔは１～１０の整数、好ましくは１～５の整数である。

また、ＺはＱと活性シリル基とを連結するリンカーであり、直接結合あるいは－（ＣＨ_２）_ｒ－（ｒは１～１０の整数）または－（Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ－（ｓは１～１０の整数）である。ｒは好ましくは１～８、より好ましくは１～４である。また、ｓは好ましくは１～８、より好ましくは１～４である。

本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の方法を用いて製造できる。すなわち、前記Ｍ_１が、スクシンイミジルエステル基、アルコラート基、アミノ基、メルカプト基、および末端ヒドロキシ基含有ポリオキシエチレン基からなる群から選択される１種の反応性基を有し、Ｍ_１含有蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させることで製造できる。

上記の反応性基を有するＭ_１は、シランカップリング剤と反応し共有結合を形成する。共有結合としては、上記のアミド結合、エーテル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合、ポリオキシエチレン結合等を挙げることができる。

シランカップリング剤には、アミノアルキルシラン、グリシジルオキシアルキルシラン、メルカプトシラン、イソチオシアネート、イソシアネートシラン、ハロゲン化シラン等を用いることができる。好ましくは、アミノアルキルシランである。アミノアルキルシランの具体例としては、３－アミノプロピルトリエトキシシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、３－アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシラン等を挙げることができるが、好ましくは３－アミノプロピルトリメトキシシランである。また、グリシジルオキシアルキルシランの具体例としては、ジエトキシ（３－グリシジルオキシプロピル）メチルシラン、３－グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、３－グリシジルオキシプロピル（ジメトキシ）メチルシラン、トリエトキシ（３－グリシジルオキシプロピル）シラン等を挙げることができる。また、メルカプトシランには、３－メルカプトプロピルメチルメトキシシランや３－メルカプトプロピルトリメトキシシランを挙げることができる。また、イソシアネートシランには、３－イソシアネートプロピルトリエトキシシランや３－イソシアネートプロピルトリメトキシシランを挙げることができる。また、イソチオシアネートには、３－チオシアナトプロピルトリエトキシシランを挙げることができる。また、ハロゲン化シランには、（３－ブロモプロピル）トリメトキシシラン、３－トリメトキシシリルプロピルクロライド、３－クロロプロピルジメトキシメチルシラン、３－ヨードプロピルトリメトキシシラン等を挙げることができる。

アミド結合を形成する場合、シランカップリング剤にはアミノアルキルシランを用い、Ｍ_１の反応性基としては、スクシンイミジルエステル基を用いることができる。また、エーテル結合を形成する場合、シランカップリング剤にはハロゲン化アルキルシランを用い、Ｍ_１の反応性基としては、アルコラート基を用いることができる。また、チオウレア結合を形成する場合、シランカップリング剤にはイソチオシアネートシランを用い、Ｍ_１の反応性基としては、アミノ基を用いることができる。また、ジスルフィド結合を形成する場合、シランカップリング剤にはメルカプトシランを用い、Ｍ_１の反応性基としては、メルカプト基を用いることができる。また、ポリオキシエチレン結合を形成する場合、シランカップリング剤にはグリシジルオキシアルキルシランを用い、Ｍ_１の反応性基としては、末端ヒドロキシ基含有ポリオキシエチレン基を用いることができる。

Ｍ_１含有蛍光色素とシランカップリング剤との反応は、溶媒にジクロロメタン、クロロホルム、ＤＭＦ等を用い、室温から６０℃の温度で、混合攪拌することにより行うことができる。必要に応じて溶媒を減圧等により除去して反応物を取り出すことができる。

本実施の形態に係る活性シリル基を含む蛍光色素を用いることで、固体状態でも高い蛍光強度を有する蛍光シリカ粒子を製造することができる。蛍光シリカ粒子を製造する方法は、シランカップリング剤を用いてシリカ粒子を製造する方法であれば特に限定されない。例えば、特開２００６－５１４７０８号公報に記載されているように、アルコキシシリル基含有有機ＥＬ色素を水溶液と混合して密集蛍光コアを形成し、その密集蛍光コアとシリカ前駆体を混合して密集コア上にシリカ殻を形成する方法を用いることができる。

（用途）
本発明の蛍光色素は、標識された固体あるいは半固体状態の生体分子の蛍光を測定する検出方法であれば、あらゆる生体分子の検出方法に適用することができる。従来の蛍光色素に代えて用いることにより、高感度で、化学的に安定で操作性に優れ、さらに低コストの検出方法を提供することができる。本発明の蛍光色素は、生体分子試料に蛍光色素を直接反応させて標識しても良く、あるいは生体分子試料と、本発明の蛍光色素で標識されたプローブとを反応させて標識する方法を用いることもできる。さらに、本発明の蛍光色素で標識した生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する方法を用いることもできる。例えば、核酸を検出対象とするＤＮＡマイクロアレイ法や、プライマーやターミネータを用いるＰＣＲ法に用いることができる。

また、タンパク質を検出対象とする場合、通常、電気泳動後のタンパク質の検出には染色色素が用いられている。泳動後のゲル中に、染色色素、例えばクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を浸透させてタンパク質を染色し、ＵＶを照射して発光させる方法が用いられる。しかしながら、従来の染色色素を用いる方法は簡便であるが、感度が１００ｎｇ程度と低く微量のタンパク質の検出には適さない。また、ゲルを介して染色色素を浸透させるため、染色に長時間を要するという問題もある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いると高感度であり、微量タンパク質の検出には好適である。さらに、サイズ分離したタンパク質を質量分析して同定することもできる。

ここで、タンパク質には、アルブミン、グロブリン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、そしてコラーゲン等の単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、リボタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質等の複合タンパク質のいずれも検出対象とすることができる。例えば、リンタンパク質、糖タンパク質、総タンパク質の染色色素に対応させて３種の蛍光色素を用い、二次元電気泳動で分離したタンパク質試料において、リンタンパク質、糖タンパク質及び総タンパク質を染色することができる。また、ＴＯＦ－Ｍａｓｓ等の質量分析を行うことにより、タンパク質を同定できるので、特殊なタンパク質を生成させる、ガンやウィルスによる感染症などの疾病の診断や治療に応用することが可能である。また、コラーゲンは、動物の結合組織を構成するタンパク質であり、独特の繊維状構造をとる。すなわち、３本のポリペプチド鎖からなり、そのペプチド鎖が寄り集まって三重鎖を形成する。コラーゲンは、一般に極めて免疫原性が低いタンパク質であり、食品、化粧品、医薬品等の分野で広く利用されている。しかし、コラーゲンのペプチド鎖に蛍光色素を導入しても、従来の蛍光色素ではその安定性が十分とは言えず、より安定な蛍光色素が必要とされている。そこで、本発明の蛍光色素を用いてコラーゲンを標識することにより、安定かつ高感度な検出を行うことが可能となる。

また、タンパク質と特異的に結合する抗体を本発明の蛍光色素で標識することにより、タンパク質を標識することもできる。例えば、ＩｇＧ抗体をペプシンで処理するとＦ（ａｂ’)₂と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとＦａｂ’と呼ばれるフラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは1つもしくは２つのチオール基（－ＳＨ）を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、本発明の蛍光色素に反応性基としてマレイミド基を導入し、フラグメントのチオール基と反応させることにより抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性（抗原捕捉能）を失うことがない。

なお、本発明の蛍光色素でアプタマーを標識することもできる。アプタマーはオリゴ核酸からなり、塩基配列に依存して種々の特徴ある立体構造をとることができるので、その立体構造を介してタンパク質を含むあらゆる生体分子に結合することができる。この性質を利用し、本発明の蛍光色素で標識したアプタマーを特定のタンパク質に結合させ、被検出物質との結合によるそのタンパク質の構造変化に伴う蛍光変化から間接的に被検出物質を検出することができる。

また、本発明の蛍光色素を用いて金属イオンの検出を行うこともできる。体内のＤＮＡやタンパク質などの安定性や高次構造の維持、機能発現、そして生体内のすべての化学反応を司る酵素の活性化など、生体内で起こるあらゆる生命現象に金属イオンは関与している。そのため、生体内での金属イオンの動きをリアルタイムで観察できる金属イオンセンサは医療分野を初めとしてその重要性が叫ばれている。従来、生体分子に蛍光色素を導入した金属イオンセンサが知られている。例えば、Ｋ^＋イオン存在化において、Ｋ^＋イオン取り込んで特殊な構造をとる配列を有する核酸を利用する金属イオンセンサが提案されている（J. AM. CHEM. SOC. 2002, 124, 14286-14287）。エネルギートランスファーを起こす蛍光色素を核酸の両端に導入する。通常は色素間距離があるためエネルギートランスファーは起きない。しかし、Ｋ^＋イオン存在下では核酸が特殊な形をとる結果、蛍光色素がエネルギートランスファーを起こす距離に近接することで、蛍光を観察することができる。また、ペプチドに蛍光色素を導入した亜鉛イオンセンサも提案されている（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3053-3054）。これらの従来の蛍光色素に代えて本発明の蛍光色素を用いることにより、従来に比べ高感度で取り扱いが容易な金属イオンセンサを提供することが可能となる。なお、生体内に存在する金属イオンであれば、すべての金属イオンを検出することが可能である。

また、本発明の蛍光色素を用いて、細胞内のシグナル観察を行うこともできる。内部シグナルや環境情報に対する細胞の応答には、イオンから酵素へと多大な分子が関与している。シグナル伝達過程では特殊なプロテインキナーゼが活性化し、特殊な細胞タンパク質のリン酸化を導くことで様々な細胞応答の初期応答を担っていることが知られている。ヌクレオチドの結合と加水分解はこれらの活性に重大な役割を果たしており、ヌクレオチド誘導体を用いることで、シグナル伝達挙動を素早く観察することが出来る。例えば、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は細胞膜におけるシグナル伝達において重要な役割を果たしている。このＣａ^２＋依存セリン／スレオニンプロテインキナーゼはジアシルグリセロールやフォスファティジルセリンの様な膜構成脂質上で活性化され、イオンチャネルや細胞骨格タンパク質に存在するセリンやスレオニンをリン酸化することで膜表面電化を変えシグナル伝達を行っている。これらを生細胞において動的に観察することで細胞のシグナル伝達の観察を行うことができる。

ここで、ヌクレオチド誘導体は酵素の基質や阻害剤として供給され、孤立性タンパク質の構造と力学の探査、膜結合タンパク酵素の再構成、ミトコンドリアのようなオルガネラ、除膜筋線維のような組織のヌクレオチド結合タンパク質部分に、結合してその調節を行っている。また、最近ではＧ－タンパク質の阻害剤や活性体のようなシグナル伝達に影響を与える化合物の存在も解ってきている。このヌクレオチド誘導体に本発明の有機ＥＬ色素からなる蛍光色素を導入することで、これらの細胞内シグナル伝達の動的観察を高感度で、かつ取り扱い容易に行うことが可能となる。

また、本発明の蛍光色素を、組織または細胞試料中の標的核酸や標的タンパク質の発現レベルの検討に用いる組織または細胞の染色色素としても用いることができる。すなわち、本発明の染色色素を真核細胞の染色に用いると、乾燥状態でも蛍光を発することから標識後の保存などの点で従来の色素よりも優れた性能を示す。また、真核細胞のみならず、細胞骨格用色素としても十分に用いることが可能である。この他、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、ソリゾーム、脂質二重膜などの標識に用いることが可能である。これら、標識された細胞等は、湿潤及び乾燥のあらゆる条件下で観測が可能であるため、汎用性が大きい。観測に際しては、蛍光顕微鏡などを用いることができる。

また、臨床段階で人体より採取された組織は、ミクロトームなどの機器を用いて薄膜にスライスした後、染色されている。ここでは、Ｃｙ色素及びＡｌｅｘａ色素が用いられている。しかしながら、既存の色素は安定性が非常に悪く、再診断の際には、再びサンプルを作製する必要がある。また、作製されたサンプルは標本として保存することが不可能である。しかし、上記の従来の色素に比べ本発明の蛍光色素は、非常に安定な色素であるので、染色した組織を標本として保存することが可能である。

また、ガンや感染症等の診断には、抗体の特異的認識能を利用したイムノアッセイが用いられている。イムノアッセイは、標識抗体を用いて目的の抗原を検出する方法であり、標識物質に酵素を用いる酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）や標識物質に蛍光色素を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ法）等が用いられている。ＥＬＩＳＡ法は、最終的な検出は標識物質である酵素の反応によって生じるさまざまなシグナル（発色、発光、化学発光等）を検出及び定量することにより行う。一方、ＦＩＡ法は、標識物質である蛍光色素に励起光を照射し、それによる蛍光を検出及び定量することにより行う。ＦＩＡ法は蛍光色素を用いるため鮮明なコントラストを有し定量性に優れ、またＥＬＩＳＡ法に比べ、より短時間での検出が可能でかつ操作も簡便であるという特徴を有している。本発明の蛍光色素を用いることにより、より高感度の検出を行うことが可能となる。

また、本発明の蛍光色素を化粧用組成物に用いることもできる。蛍光色素を含む化粧用組成物は、夜間や室内における演出用の化粧としてだけでなく、蛍光色素の明色化効果を利用して、ファンデーションや毛髪の染色剤等に用いられている。ここで、明色化効果とは、蛍光色素が紫外光を吸収して可視光を放出して、皮膚や毛髪に明るさや鮮やかさを与える効果をいう。日本の室内照明には、昼光色や白色の蛍光灯が使われているが、これらの蛍光灯からの光は、青や緑が主であり赤が少ない。そのため、女性の化粧肌は青白くくすんで見えるという問題がある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いることにより、例えば、橙色の光を放出する蛍光色素を用い、鮮やかな赤味の色を発色させてくすみの解消を図ることが可能である。また、毛髪の染色に用いると、蛍光色素は可視領域の放出光線により毛髪の色を変えるだけでなく、毛髪の輝きを増加させることも可能である。

また、本発明の蛍光色素をマーキング剤に用いることもできる。本発明の蛍光色素を含むマーキング剤は、通常の可視光下では不可視であるが、紫外線等の励起光を照射することにより蛍光色素を発光させて視認することができる。この性質を利用し、犯罪防止や犯罪捜査を目的として、物品や人体等の識別や物質の検出等に使用することができる。マーキング剤の対象物には、偽造や盗難等の犯罪の防止や犯罪捜査の対象となる物品や人体が含まれる。例えば、紙幣、小切手、株券、各種証明書等の重要文書や、自動車、オートバイ、自転車、美術品、家具、ブランド品、衣服等の物品、人体の皮膚、頭髪、爪等の身体表面部分、潜在指紋等の遺留物質等を挙げることができる。さらに、対象物を構成する材料に関しては、上質紙、ＯＣＲ紙、ノーカーボン紙、アート紙等の紙や、塩化ビニル、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等のプラスチックや、金属や、ガラスや、セラミックスや、羊毛、木綿、絹、麻等の天然繊維や、再生セルロース繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリアミド繊維、ポリエステル繊維等の合成繊維や、人体皮膚や体液中のタンパク質等を挙げることができる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例により限定されるものではない。

合成例１
窒素カチオン含有ベンゾチアジアゾールの活性エステル体の合成について説明する。

（１）モノブロモ体の合成
ベンゾチアジアゾールのモノブロモ体の合成スキームを以下に示す。

３０ｍＬのナス型フラスコに化合物１（４，７－ジブロモ－２，１，３－ベンゾチアジアゾール）を１．０ｇ（３．４０２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボラン－２－イル)ピリジン０．７ｇ（３．４０２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れ、１，４－ジオキサン１０ｍＬ中、１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、２Ｍ炭酸カリウム水溶液２．６ｍＬ、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド０．０４８ｇ（０．０６８０４ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：０．０２）、を反応溶液に添加してアルゴン雰囲気下で２４時間反応させた。ＴＬＣ（酢酸エチル１００％）で反応が進行したのを確認後、水に反応溶液を入れ、クロロホルムで抽出した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、吸引濾過、減圧留去を行った。残渣を、シリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ、酢酸エチル１００％）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である化合物２を得た。収量は０．３ｇ、収率は３０％であった。

（２）ベンゾチアジアゾールのフェノキシ体の合成
ベンゾチアジアゾールのフェノキシ体の合成スキームを以下に示す。

５０ｍＬのナス型フラスコに化合物２を０．２ｇ（０．６８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、４－メトキシフェニルボロン酸０．１０３ｇ（０．６８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れ、トルエン１０ｍＬ、エタノール１４ｍＬ中、８５℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液０．７ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）０．０７２ｇ（０．０６２３ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：０．０９）、を反応溶液に添加してアルゴン雰囲気下で２４時間反応させた。ＴＬＣ（酢酸エチル１００％）で反応が進行したのを確認後、水に反応溶液を入れ、クロロホルムで抽出した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、吸引濾過、減圧留去を行った。残渣を、シリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ、酢酸エチル１００％）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である化合物３を得た。収量は０．０６５ｇ、収率は３０％であった。

（３）活性エステル体の合成
窒素カチオン含有ベンゾチアジアゾールの活性エステル体の合成スキームを以下に示す。

１５ｍＬのナス型フラスコに化合物３を０．０３ｇ（０．０９３９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、５－ブロモペンタン酸スクシンイミジルエステル０．２６ｇ（０．９３９ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れトルエン５ｍＬ中、１００℃に設定したオイルバスで反応を開始した。２４時間反応後、析出した結晶を吸引濾過後真空ポンプで乾燥させ目的物である化合物４を得た。収量は０．０３７ｇ、収率は６６％であった。

合成例２
フェニル基含有ベンゾチアジアゾールの活性エステル体の合成について説明する。

３０ｍＬのナス型フラスコに化合物1を１．０ｇ（３．４０ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボラン－２－イル)安息香酸メチル０．８９ｇ（３．４０ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れ、１，４－ジオキサン１０ｍＬ中、１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、２Ｍ炭酸カリウム水溶液２．６ｍＬ、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド０．０４８ｇ（０．０６８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：０．０２）、を反応溶液に添加してアルゴン雰囲気下で２４時間反応させた。ＴＬＣ（酢酸エチル１００％）で反応が進行したのを確認後、水に反応溶液を入れ、クロロホルムで抽出した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、吸引濾過、減圧留去を行った。残渣を、シリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ、酢酸エチル１００％）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である化合物５を得た。収量は０．３ｇ、収率は２８％であった。

（２）メチルエステル体の合成
ベンゾチアジアゾールのメチルエステル体の合成スキームを以下に示す。

５０ｍＬのナス型フラスコに化合物５を０．２ｇ（０．６８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、４－メトキシフェニルボロン酸０．１０３ｇ（０．６８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）を入れ、トルエン１０ｍＬ、エタノール１４ｍＬ中、８５℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液０．７ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）０．０７２ｇ（０．０６２３ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：０．０９）、を反応溶液に添加してアルゴン雰囲気下で２４時間反応させた。ＴＬＣ（酢酸エチル１００％）で反応が進行したのを確認後、水に反応溶液を入れ、クロロホルムで抽出した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させ、吸引濾過、減圧留去を行った。残渣を、シリカゲルカラムクロマト精製（Ｋａｎｔｏ６０Ｎ、酢酸エチル１００％）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である化合物６を得た。収量は０．０６５ｇ、収率は３０％であった。

（３）カルボン酸体の合成
ベンゾチアジアゾールのカルボン酸体の合成スキームを以下に示す。

１００ｍＬのナス型フラスコに化合物６を０．５ｇ（１．３７ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、水酸化カリウムを０．１９ｇ（３．４２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：２．５）、水２０ｍＬを入れ、１，４－ジオキサン４０ｍＬ中、８５℃に設定したオイルバスで反応を開始した。3時間反応後、反応溶液を水に入れ、室温で攪拌しながらｐＨが１になるまで塩酸を加えた。析出した結晶を吸引濾過後、真空ポンプで乾燥させ目的物である化合物７を得た。収量は０．４７ｇ、収率は９８％であった。

（４）活性エステル体の合成
フェニル基含有ベンゾチアジアゾールの活性エステル体の合成スキームを以下に示す。

１００ｍＬのナス型フラスコに化合物７を０．４７ｇ（１．３４ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド０．２３ｇ（２．０１ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）、１，４－ジオキサン２０ｍＬを入れ室温で撹拌した。これに、１，４－ジオキサン１０ｍＬに溶解させたＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）０．３８ｇ（２．０１ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）を反応溶液に滴下した後、室温で２時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、反応溶液を水に入れクロロホルムで抽出した。有機層を水で二回程、洗浄した後、硫酸マグネシウム乾燥させ吸引濾過、減圧留去の順に処理を行った。残渣をクロロホルムで溶解させ、シリカゲルカラムクロマト精製（ワコーゲルＣ３００、クロロホルム１００％）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である化合物８を得た。収量は０．４２ｇ、収率は５３％であった。

合成例３
フェニル基含有ベンゾチアジアゾールの活性シリル体の合成について説明する。
フェニル基含有ベンゾチアジアゾールの活性シリル体の合成スキームを以下に示す。

１００ｍＬのナス型フラスコに化合物８を０．３ｇ（０．６５２ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．０）、３－アミノメチルプロピルトリエトキシシラン０．２３ｇ（０．９７８ｍｍｏｌ，ｒａｔｉｏ：１．５）、クロロホルム４０ｍＬを入れ室温で撹拌した。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）で反応が進行したのを確認後、反応溶液を減圧留去した。残渣をクロロホルムで溶解させ、シリカゲルカラムクロマト精製（ワコーゲルＣ３００、クロロホルム１００％）した後、減圧留去、真空乾燥させ目的物である化合物９を得た。収量は０．２ｇ、収率は６８％であった。

合成例４（比較例）
比較例として、４，７－ジ（メトキシフェニル）－１，２，５－オキサジアゾロピリジンのピリジニウム体の活性エステル体を用いた。

４－メトキシアセトフェノン１０を出発原料として用いて、酢酸中、硝酸と亜硝酸ナトリウムの存在下、３０℃で２日間反応を行い、Ｎ－オキシド体１１を収率７８％で得た。次に、アセトニトリル中、塩化第一銅次亜リン酸ナトリウムの存在下、８０℃で１４時間の還元反応を行いジケトン体１２を収率６２％で得た。さらに、エタノール中、４－ピコリルアミンの存在下、８０℃で２日間の反応を行い、ピリジニウム体を収率７０％で得た。トルエン中、１００℃で３日間、５－ブロモペンタン酸スクシンイミジルエステルと反応させ、ピリジニウム体の活性エステル体１３を収率７８％で得た。

（吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定）
合成した蛍光色素について、溶媒にＤＭＳＯを用いて、蛍光波長の測定および吸収波長の測定を行った。その結果を表１に示す。また、合成例２，３の化合物の粉末の発光状態を示す写真を図１，２に示す。

（結果）
合成例１～３の蛍光色素は、オキサジアゾロピリジン骨格を有する合成例４の蛍光色素に比べ、高い量子効率と蛍光強度を有することを確認した。これより、本発明の蛍光色素を用いることで、より一層の検出感度の向上が期待できる。

本明細書は、下記の実施形態を含む。

１．
以下の一般式（１）で表されるベンゾチアジアゾール誘導体から成る蛍光色素。

一般式（１）中、Ｘは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示し、Ｙは一般式Ｌ _１－Ｍ _１で示され、Ｍ _１は、置換基を有してもよいピリジニウム基、２級アミニウム基、３級アミニウム基、４級アンモニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、イミダゾリウム基、チアゾリウム基、オキサゾリウム基、キノリウム基、ベンゾイミダゾリウム基、ベンゾチアゾリウム基又はベンゾオキサゾリウム基である窒素カチオン含有基、あるいは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示し、Ｌ _１は、Ｍ _１と中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合、または、－（ＣＨ＝ＣＲ _１） _ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ _２） _ｎ－（ｎは１～６の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒ _２）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ _２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ _２－、－Ａｒ－（Ａｒは芳香族炭化水素基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲ _２－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒ _１は水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒ _２は炭素数１～４のアルキル基である。
２．
活性エステル基を含み、前記Ｙが一般式Ｌ _１－Ｍ _１－Ｌ _２で示され、Ｌ _２は、Ｍ _１と前記活性エステル基とを連結するリンカーであって、直接結合または－（ＣＨ _２） _ｑ－（ｑは１～６の整数）である、上記１記載の蛍光色素。
３．
前記Ｍ _１が、前記置換基を有してもよいピリジニウム基である上記１または２に記載の蛍光色素。
４．
前記Ｍ _１が、前記置換基を有してもよい芳香族炭化水素基である上記１または２に記載の蛍光色素。
５．
活性シリル基を含み、前記Ｙが一般式Ｌ _１－Ｍ _１－Ｑ－Ｚで示され、Ｑはアミド結合、メチルアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合およびポリオキシエチレン結合から選択される１種の結合であり、ＺはＱと前記活性シリル基とを連結するリンカーであり、直接結合あるいは－（ＣＨ _２） _ｒ－（ｒは１～１０の整数）または－（Ｏ－ＣＨ _２ＣＨ _２） _ｓ－（ｓは１～１０の整数）である、上記１記載の蛍光色素。
６．
前記Ｍ _１が、前記置換基を有してもよい芳香族炭化水素基である上記５に記載の蛍光色素。

Claims

以下の一般式（１）で表されるベンゾチアジアゾール誘導体から成る蛍光色素。

一般式（１）中、Ｘは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示し、
Ｙは一般式Ｌ_１－Ｍ_１で示され、
Ｍ_１は、置換基を有してもよいピリジニウム基、あるいは置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示し、
Ｌ_１は、Ｍ_１と中心ベンゼン環とを連結するリンカーであり、直接結合であり、

更に、活性エステル基又は活性シリル基を含み、

活性エステル基を含む場合、前記Ｙが一般式Ｌ _１－Ｍ _１－Ｌ _２で示され、Ｌ _２は、Ｍ _１と前記活性エステル基とを連結するリンカーであって、直接結合または－（ＣＨ _２） _ｑ－（ｑは１～６の整数、ただし１を除く）であり、
活性エステル基は、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル又はマレイミドエステルから選択され、

活性シリル基を含む場合、前記Ｙが一般式Ｌ _１－Ｍ _１－Ｑ－Ｚで示され、Ｑはアミド結合、メチルアミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、チオウレア結合、ジスルフィド結合およびポリオキシエチレン結合から選択される１種の結合であり、ＺはＱと前記活性シリル基とを連結するリンカーであり、直接結合あるいは－（ＣＨ _２） _ｒ－（ｒは１～１０の整数）または－（Ｏ－ＣＨ _２ＣＨ _２） _ｓ－（ｓは１～１０の整数）であり、
活性シリル基は、一般式Ｓｉ（Ｒ _３） _ｕ（ＯＲ _４） _３－ｕで表され、Ｒ _３とＲ _４は炭素数１～４のアルキル基であり、ｕは０又は１である。
Ｍ _１は、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基を示す、請求項１記載の蛍光色素。
活性エステル基を含む場合、前記Ｙが一般式Ｌ _１－Ｍ _１－Ｌ _２で示され、Ｌ _２は、Ｍ _１と前記活性エステル基とを連結するリンカーであって、直接結合または－（ＣＨ _２） _ｑ－（ｑは４）である、請求項１又は２に記載の蛍光色素。
活性エステル基を含む場合、前記Ｙが一般式Ｌ _１－Ｍ _１－Ｌ _２で示され、Ｌ _２は、Ｍ _１と前記活性エステル基とを連結するリンカーであって、－（ＣＨ _２） _ｑ－（ｑは４）である、請求項１又は２に記載の蛍光色素。
活性シリル基を含む場合、前記Ｙが一般式Ｌ _１－Ｍ _１－Ｑ－Ｚで示され、Ｑはアミド結合、メチルアミド結合、ポリオキシエチレン結合から選択される１種の結合であり、ＺはＱと前記活性シリル基とを連結するリンカーであり、直接結合あるいは－（ＣＨ _２） _ｒ－（ｒは１～８の整数）または－（Ｏ－ＣＨ _２ＣＨ _２） _ｓ－（ｓは１～８の整数）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の蛍光色素。
活性シリル基は、一般式Ｓｉ（Ｒ _３） _ｕ（ＯＲ _４） _３－ｕで表され、Ｒ _３とＲ _４はメチル基、エチル基又はｎ－プロピル基である、請求項１～５のいずれか１項に記載の蛍光色素。