CN104956220A

CN104956220A - 锂测量方法

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Publication number: CN104956220A
Application number: CN201280076921.5A
Authority: CN
Inventors: 岩渕拓也; 小田嶋次胜; 铃木裕子
Original assignee: METALLOGENICS Co Ltd
Current assignee: METALLOGENICS Co Ltd
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: ES2670501T3; EP2927683A1; US20150276583A1; JP5222432B1; EP2927683A4; CN104956220B; JP2014095567A; WO2014073119A1; EP2927683B1; US9689794B2

Abstract

本发明提供一种锂离子测量和检查方法，其将活体样本或环境样本等的水溶液作为被检测物，且将锂试剂组合物作为显色反应试液，通过目测或者使用简单的比色计进行观测。一种锂测量方法，其特征在于：将被检测物和锂试剂组合物相接触，该锂试剂组合物的特点在于它就是包含以将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的结构式【化1】

Description

锂测量方法

技术领域

本发明涉及一种锂测量方法，其用于测量包含尿、血清、血浆、血液试验样本在内的活体样本，或含有饮用水的环境样本等水溶液中的锂。

背景技术

一直以来含有锂的情绪稳定剂由于可有效治疗躁郁症、癫痫、两极症而被广泛使用，但用药时必须将血清中的锂浓度控制在适当范围内。

通常，大多和两极症(躁郁症)的治疗药物、或者抗抑郁药一起开具碳酸锂片(口服用药)的药方作为情绪稳定剂。如果开药方时碳酸锂(Li₂CO₃)不接近达到锂中毒的血中浓度，就无法显现出用药效果，由于治疗区域和中毒区域极其相近，因此必须指定药物血中浓度监控作为必要项目(TDM)。

更详细说来，通常，服药患者的样本血浆内的锂浓度必须调节为0.6～1.2mEq/L，但如果血清中的锂浓度小于等于0.6mEq而过少，则没有情绪稳定效果，反之，用药超量，其浓度超过1.5mEq/L，再过量用药则会导致锂中毒，出现包括震颤、语言障碍、眼球震颤、肾功能障碍、痉挛在内的危重副作用。如果发现潜在的这些病兆时，应中止治疗，再测量血浆或者血清中的锂浓度，采取缓和锂中毒的措施。

如此看来，锂盐的情绪稳定剂虽然对抑郁症、两极症、癫痫等患者具有治疗等效果，但过量用药时会产生重大副作用，因此用药时，必须时常将血清中的锂浓度监控在0.6～1.2mEq/L内，这是必需事项。

据此，一直以来需要对血清中的锂进行定量测量，正在推进开发一种液状试剂组合物，其用于可以实现锂的比色测定的临床检查。

作为该现有技术，在专利文献1中公示出一种试剂组合物，其用来测量使用有穴状配体离子载体的生物学检测物中的锂浓度。

而且，在专利文献2中公示出一种分析试剂，就是具有吡咯环的大环状化合物，与在吡咯环的β位上键合有8个溴(Br)原子的锂离子进行反应。

再者，作为非专利文献1公示如下：使用将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的化合物，可以检测出和分离出锂离子。

【现有技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】日本专利特开平7-113807号公报

【专利文献2】欧洲专利1283986号公报(B1)

【专利文献3】日本专利5100903号公报

【非专利文献1】分析化学Vol.51,No.9,PP.803-807(2002)[F28四苯基卟啉的合成和应用于分离出和检测出锂离子]小柳健治、田端正明

发明内容

对现有的锂试剂组合物大家都略知一二，其组合是剧毒物，或原药供给不稳定且价格高，原药几乎都不溶解于水，或者一旦溶解于水中就失去活性不会显色，显色反应迟钝。

旨在克服这些问题的专利文献2中所公示的技术，存在如下问题点：可以实现显色法，但显色敏感度过大，因而需要对检测物进行稀释处理，试剂组合物的规格大于等于pH11，因而容易会由于空气中的CO₂产生变质，测量数据不稳定，进而，一旦大于等于pH11，就只能使用氢氧化钠或氢氧化钾之类浓厚的氢氧化物溶液，无法将pH值维持在固定值，而且，这些是有毒物，对于使用者而言也是有所忌讳的，操作起来很麻烦，在实际保存方面不具有通用性而需要专用容器，为了弥补这些缺陷而需要大型机械装置和专用设备，欠缺通用性。因此，还存在难以适用于现场监控、POCT(Point Of Care Testing)的问题。

然而，所述专利文献1中目的在于定量锂的试剂组合物，其使用了和本发明完全不同的化合物，只能够在pH12条件下使用，如上所述，一旦大于等于pH11，就只能使用氢氧化钠或氢氧化钾之类浓厚的氢氧化物溶液，因为这些是有毒物，对于使用者而言操作起来很麻烦，再者，为了弥补这些缺陷而需要使用大型的专用设备，因而欠缺通用性。

而且，在作为非专利文献1的小柳等作者的论文中指出，使用F28四苯基卟啉可分离和检测出锂离子，但如果不使用油性且作为剧毒物的氯仿进行溶媒萃取，就无法检测和分离出锂。总之，不经过繁杂的预处理就无法直接定量出水溶液中的锂，特别是，无法迅速且定量测量出血清中的锂。如此一来，使用F28四苯基卟啉难以检测出水溶液中的锂，定量性测量浓度也非易事，迄今为止还无法实现。

现有锂试剂组合物需要生化学自动分析仪之类配备电源的大型计测设备。为了克服这些缺陷，本发明者们开发出专利文献3的技术。专利文献3是可以测量出活体样本或环境样本等水溶液中的锂浓度(定量)的锂试剂组合物，使用以在常温、常压下的用手操作法为基础的比色计之类的小型设备就可以测量或目测检测出来，但这只是根据同一色调的浓淡程度来检测出浓度等级，在具有意义的锂浓度范围内还缺乏明晰度，例如，根据朱红色和红色之类的红色浓淡来进行比较，对于疑似锂中毒的患者，例如，急救护送患者等的应急检查，即在适用于不使用设备的快速检查方面还存在检测明晰度的问题。

本发明鉴于如上所述的问题点研发而成，提供一种方法，其将尿、血清、血浆、血液等活体样本或环境样本等水溶液作为被检测物，将锂试剂组合物作为显色反应试液，通过目测或者简单的比色计来测量和检查锂浓度，特别针对医疗现场的应急检查，可明确且简便迅速地进行锂检测、测量和检查。

为了解决上述课题，本发明是一种锂测量方法，其特征在于：将被检测物和锂试剂组合物相接触，该锂试剂组合物的特点在于它就是包含以将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的结构式

【化1】

所表示的化合物、pH调节剂以及pH缓冲剂在内的水溶液；对该反应液照射白色光，或者暴露在光中，通过目测来检测出应时而生的明显的色调变化，或者使用比色计来检测出其敏感度。

进一步的，所述显色的色调在不存在锂错合物时呈现绿色，随着锂错合物数量增加，则从黄色经由橙色再变化为红色。

进一步的，所述色调的变化会发生在锂浓度为0.0mM到4.5mM的范围内。

进一步的，所述被检测物是尿、血清、血浆、血液等活体样本或者血浆试验样本。

进一步的，所述被检测物是环境样本。

即，本发明的锂试剂组合物是将以将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的所述结构式所表示的化合物作为螯合剂，构成包含与水混合而成的有机溶剂、pH调节剂在内的水溶液，将包含血清和血浆等的血液源性样本、尿、细胞萃取液等生物学性样本、环境样本等作为检测物，与锂试剂组合物相接触，通过生成检测物中的锂离子和螯合呈色错合物，由于锂浓度依存性从黄色呈色为红色。进而，本发明是一种锂测量方法，其特征在于：对该反应检测液照射特定光量，暴露在光中后显现出未反应的螯合配位基的光化学互变异体，由于其浓度依存性而呈色为绿色，出于此原理，结果是在被检测液中的锂浓度为0.0mM到4.5mM的范围内，呈色明显从绿色经由黄色再变化为红色，通过目测来检测出，或者使用比色计来简便地检测出此时的明显的色调变化，将血清以及血浆试验样本之类的水溶液作为被检测物。

发明效果

根据本发明的锂测量方法，将被检测物和锂试剂组合物相接触，该锂试剂组合物的特点在于它就是包含以所述将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的结构式所示的化合物F28四苯基卟啉、pH调节剂以及pH缓冲剂在内的水溶液；对该反应液照射白色光(只要会发生反应也可以使用单色光)，或者暴露在光中，则在被检测物中的锂浓度为0.0mM到4.5mM的范围内，可以发现该反应液的呈色由于锂浓度依存性从鲜艳的绿色经由黄色再变化为红色，通过目测或者比色计来读取其呈色变化，可测量出混入有被检测物的水溶液中所含的锂浓度。

即，如上所述，由于显色鲜艳，以目测方式可以迅速检测出或者判定出作为活体样本的血清检测物的锂浓度，使用普及型的分光光度计也可以迅速定量出作为活体样本的血清检测物的锂浓度，相应信息也可以作为例如TDM治疗的管理指标。而且，还可以应用于临床化学自动分析装置，在短时间内可以对多个检测物进行定量分析。

因此，虽然现有的锂浓度测量中还需要使用大型的专用设备，但根据本发明的测量方法，通过将尿、血清、血浆、血液等活体样本或环境样本等水溶液作为被检测物，且将锂试剂组合物作为显色反应试液，可以目测方式检测出其色调，或者使用简单的便携式比色计来计测出锂浓度，特别是在医疗现场进行应急检查时，采样血清作为被检测物后，立刻可以简便迅速地判定出锂浓度。

附图说明

图1是本发明的F28四苯基卟啉的适量浓度的参考计算图表。

图2是本发明中使用实施例1的紫外-可见分光光度计的实验结果曲线图。

图3是本发明的实施例1中各测光波长的锂浓度检量线的曲线图。

图4是本发明的实施例1中F28四苯基卟啉-锂错合物生成的光谱变化(显色反应)的曲线图。

图5是本发明的实施例1中血清样本测量值与原子吸光法(现有法)测量值的相关试验结果的曲线图。

图6是本发明中将管理血清作为样本且对使用自动分析装置得出的测量值进行比较的[表1]。

图7是示出本发明中通过副波长校正且对使用溶血血红蛋白得出的测量值产生影响的[表2]。

图8是根据现有技术以目测方式来判定锂浓度的[表3]。

图9是根据本发明以目测方式来判定锂浓度的[表4]。

图10是对本发明的检测物照射白色光的装置的概略图。

图11是在本发明的光化学互变异性化反应的结束时间时的照度影响的曲线图。

图12是F28四苯基卟啉源性的光化学互变异性体的电子吸收光谱的曲线图。

图13是对F28四苯基卟啉错合物进行光照射后的电子吸收光谱的曲线图。

具体实施方式

本发明者们积极研究出一种锂试剂组合物，其可更简单地定量测量出血清以及血浆中的锂浓度，在前述的非专利文献1中公示有制法，使用具有吡咯环的大环状化合物，着重于将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟且将氟设为28个的下述结构式(以下，称为F28四苯基卟啉)，并用于本发明的测量方法中。

【化1】

作为利用具有吡咯环的大环状化合物的锂试剂组合物，在前述专利文献2中，开发出一种分析试剂，其是具有吡咯环的大环状化合物，且在吡咯环的β位上键合有8个溴(Br)原子，与锂离子发生反应；但如果不是大于等于pH11的碱性，则难以与锂离子发生反应。另一方面，作为前述专利文献3中存在的F28四苯基卟啉，从pH5到pH12都发生了反应，因此本发明的测量方法中所使用的锂试剂组合物构成为将该F28四苯基卟啉作为螯合剂，可用于定量测量出水溶液系中的锂离子，而且，以目测方式也能够明确加以判定；首先，对于该锂定量测量试剂组合物加以说明。

活体样本或环境样本等水溶液中的锂离子与所述锂试剂组合物相接触，特别是将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的化合物设为螯合剂(显色剂)，形成锂螯合显色错合物，照射特定亮度的白色光，或者暴露在光中，由此只会使未反应的螯合配位基变化为结构异性体而成为光化学互变异性体。其结果，关于被检测物中的锂浓度，小于等于0.5mEq/L(＝mol/L)时呈绿色，0.5mEq/L到1.5mEq/L时呈黄色，大于等于1.5mEq/L时呈红色。该呈色变化与管理区域、中毒区域的临界值等级非常一致，以目测和比色方式就能够明确检测出来。

根据本发明中所使用的检测物，有如下发现：将上述锂试剂组合物中的F28四苯基卟啉的浓度设为0.1～1.0g/L，如果优选0.5g/L，则最适于用来辨别相当于管理区域和中毒区域的锂浓度。

对于本发明的pH调节剂，如果偏向于不足pH5.0的酸性，则作为本发明的显色剂(螯合剂)的F28四苯基卟啉化合物与锂离子不会键合，因而不会引起呈色变化，难以定量出锂。而且，如果pH值处于5～7之间，则所述显色剂与锂离子产生特异性反应，显色速度缓慢。

另一方面，如果pH值处于8～11，则所述显色剂与锂离子会快速产生反应，且可获得稳定的显色错合物。如果超过pH11偏向碱性，所述螯合剂、所生成的显色错合物的色调的长期稳定性欠佳。这是因为吸收了空气中的二氧化碳导致pH值容易发生变动。因此，将pH值设为7到12范围的pH调节剂作为锂试剂组合物的pH调节剂，或者必须使用作为pH调节剂的pH缓冲剂，优选使用设为pH8～11的pH调节剂、pH缓冲剂。

所述pH调节剂可使用含有氢氧化钠、氢氧化钾、氨的碱性剂，含有醋酸、磷酸、柠檬酸、碳酸、重碳酸、草酸、盐酸、硝酸的酸性剂，以及选自这些盐类的液剂，所述pH调节剂也可以是pH缓冲剂，可使用柠檬酸、碳酸、重碳酸、磷酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、氯化铵、氢氧化钠、氢氧化钾，至于优选的缓冲剂，可使用MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS以及选自这些盐类的液剂。

由于含有这些成分，所述锂试剂组合物处于pH5到pH12范围内，针对于锂，可产生特异性显色反应。

本发明的锂试剂组合物中所包含的溶剂，必须是与水混合而得的有机溶剂(极性溶媒)，但如果能够与作为被检测物的血清、血浆、或者细胞源性溶出液等的水溶液均匀混合，也可以是以有机溶媒为主的溶液，或者，也可以是添加有有机溶媒的水溶液。这是因为使用通用型自动分析装置、紫外可见分光光度计来测量检测物中的锂浓度时，该被检测物是水溶液，所以该试剂组合物最好同样也是水溶液。

所述有机溶剂可以是与水混合而得的有机溶剂(极性溶媒)，选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)等中。

关于本发明中所使用的试剂组合物，在成品中混入有稳定剂，在本发明中使用有界面活性剂作为稳定剂。该界面活性剂的作用在于可提高F28四苯基卟啉的分散性，进而可防止显色反应时产生样本源性悬浊，因此为了获得这些作用而必须混入稳定剂。

这些稳定剂是非离子性界面活性剂或者阴离子性界面活性剂，非离子性界面活性剂可使用山梨糖醇酐脂肪酸酯、季戊四醇脂肪酸部分酯、丙二醇单脂肪酸酯、甘油脂肪酸单酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚氧乙烯脂肪酸部分酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸部分酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、脂肪酸二乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、聚氧乙烯脂肪酸胺、辛基苯基聚氧乙烯醚(商标注册：Triton X-100)、p-壬基苯氧基聚缩水甘油、以及选自这些盐类的化合物。

至于优选的非离子性界面活性剂，可使用辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100(注册商标)等)、p-壬基苯氧基聚缩水甘油等。

而且，作为稳定剂的阴离子性界面活性剂存在有烷基硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯苯基醚硫酸酯盐、烷基苯磺酸盐、烷烃磺酸盐等。至于代表性界面活性剂，可使用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯钠、以及选自这些盐类的化合物。

使用本发明的锂试剂组合物，应避免样本中共存的锂离子以外的离子对锂浓度的测量造成妨碍，或者会抑制试剂组合物的氧化，为了加强其保存稳定性，可以含有一种或者多种掩盖剂。当然，如果锂以外的离子较少，就不必含有掩盖剂。

至于这些添加到锂试剂组合物中的掩盖剂，可使用三乙醇胺、乙二胺、N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、吡啶、2,2-联吡啶、丙二胺、二伸乙基三胺、二伸乙基三胺-N,N,N',N",N"-五醋酸(DTPA)、三伸乙基四胺、三伸乙基四胺-N,N,N',N",N"',N"'-六醋酸(TTHA)、1,10-菲绕啉、乙二胺四醋酸(EDTA)、O,O'-双(2-胺基苯基)乙二醇-N,N,N',N'-四醋酸(BAPTA)、N,N-双(2-羟乙基)甘胺酸(Glycine)、反式-1,2-二胺基环己烷-N,N,N',N'-四醋酸(CyDTA)、O,O'-双(2-胺基乙基)乙二醇-N,N,N',N'-四醋酸(EGTA)、N-(2-羟基)亚胺基二醋酸(HIDA)、亚胺基二醋酸(IDA)、氮川基三醋酸(NTA)、氮川基三甲基磷酸(NTPO)、以及选自这些盐类的化合物。优选最合适的三乙醇胺。

本发明的锂试剂组合物为了防止微生物腐化也可以包含防腐剂。防腐剂没有特别限定，可使用例如迭氮化钠、Procline(注册商标)等。防腐剂浓度也没有特别限定，使用迭氮化钠时，作为防腐剂通常所使用的浓度，例如相对于反应溶液最好为0.1重量％左右。当然，生产旨在长期保存的产品时，普遍是会添加防腐剂的。

而且，为了长期保存锂试剂组合物的性能，可以制成一种锂测量试剂套组，其于本发明的锂试剂组合物的组合之中，将所述pH调节剂和所述掩盖剂设为第一试剂，

将以所述将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的结构式

所表示的化合物、所述与水混合而得的有机溶剂、所述pH调节剂以及所述掩盖剂设为第二试剂，将这两种试剂分开保存，在测量之前立刻混合两种试剂后制成锂试剂组合物使用。

本发明的测量方法中所使用的锂试剂组合物是将以将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的所述结构式所表示的化合物作为螯合剂，且包含与水混合而得的有机溶剂和pH调节剂在内的水溶液，通过与血清以及血浆试验样本的锂离子相接触所生成的锂错合物会显现出色调变化，一旦对其照射特定光量的光，进而，与锂离子未反应的F28四苯基卟啉会变化为鲜艳的绿色，另一方面，F28卟啉与锂离子的显色错合物保持为红色没有变化。结果是获得一种锂测量方法，其特征在于：发现锂浓度在0.0mM到4.5mM范围内会从鲜艳的绿色经由黄色再变化为红色，出于这种呈色变化的原理，通过目测来检测出或者使用比色计来简便地检测出此时的明显的色调变化，将混入有血清以及血浆试验样本的水溶液作为被检测物。

再者，不依据目测方式的锂测量方法，也可以测量锂试剂组合物所产生的锂错合物的吸光度、以及相应光谱，同样地将已知浓度的锂标准样本的浓度作为基准浓度也可以计算出未知样本的定量值，特别是对于锂错合物的显色以及相应光谱，可以将波长550nm或者从其附近波长530nm到560nm的波段作为测量波长，测量出其敏感度，或者，测量出波长570nm或者从其附近波长565nm到650nm的波段的敏感度来计算出锂浓度。

根据上述现有技术的波长的测量方法，优选如下方法：将血清以及血浆试验样本与如前所述的锂试剂组合物相接触，测量出锂错合物的显色及其吸光度、或者相应光谱，对于相应光谱，将波长550nm或者从其附近波长530nm到560nm的波段作为测量波长来测量出其敏感度，或者，测量出波长570nm或者从其附近波长565nm到650nm的波段的敏感度来计算出锂的定量值。

如上所述的波长550nm或者从其附近波长530nm到560nm的波段比起将索雷谱带(波长400nm到500nm产生极大吸收的波段)作为测光波长时，检量线的直线性更好，更便于使用简单的比色计或分光光度计进行浓度演算，色调从黄色到红色的变化明显，因此也可以目测方式来判定浓度等级。因此，虽然现有的锂浓度测量中还必需大型的专用设备，但使用便携式比色计或通用型紫外可见分光光度计就可计测出锂浓度，也可以构成为POCT(Point Of CareTesting)套组。

其次，对本发明中实际所使用的锂试剂组合物的实施例1加以说明。

[实施例1(锂试剂组合样本1)]

对于本发明所使用的锂试剂组合物，制成作为pH缓冲液的第1试剂，制成作为显色试液的第2试剂，在测量之前立刻混合两种液体后制成锂试剂组合物。最好一开始就制成这两种液体，因为长时间保存会导致试剂劣化，应加以避免。

此处，对试剂组合物的制成方法加以说明。

首先，主要制成作为pH缓冲液的第1试剂，其组合如下所示。

[实施例1(锂试剂组合样本1)]

(1)第一试剂(作为稳定剂和缓冲液)

螯合剂：无

有机溶剂：无

稳定剂(分散剂：非离子性界面活性剂)：

TritonX-100(注册商标)

(辛基苯基聚氧乙烯醚) 1.0重量％

掩盖剂：三乙醇胺 10mM

如上，添加7重量％的氯化铵后调节为pH10，加入净化水达到1L后保管在通用的保存容器中。

再者，将TritonX-100(注册商标)(辛基苯基聚氧乙烯醚)设为1.0重量％，如果过少，则测量时会产生轻微混浊，如果过多，则在反应容器内会产生泡沫，这两种原因都会有可能影响到再现性，因此处于0.1～5.0重量％范围比较好，优选1.0重量％。

而且，掩盖剂是将三乙醇胺设为10mM，如果过少，则在含有过量锂离子以外的夹杂离子的样本中，其掩盖效果会降低，如果过多，则会掩盖锂离子本身，成为产生测量误差的原因，所以处于1.0～100mM范围比较好，优选10mM。

其次，主要制成作为显色试液的第2试剂，其组合如下所示。

(2)第二试剂(作为显色试液)

螯合剂：F28四苯基卟啉 0.5g/L

有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO) 20重量％

稳定剂(分散剂：非离子性界面活性剂)：TritonX-100(注册商标)

(辛基苯基聚氧乙烯醚) 1.0重量％

掩盖剂：三乙醇胺 10mM

在其中添加MOPS(Good缓冲剂)达到0.05M(mol/L)后调节为pH7.0，加入净化水达到1L后保管在通用的保存容器中。

然而，对于临床检查时的血清中的锂定量，其浓度范围较广，可以求得在0.6mM～3mM范围内的正确度。根据本发明的实施例1，对于上述锂浓度范围，还发现F28四苯基卟啉的化合物的浓度可以设为0.1～1.0g/L，优选设为0.5g/L，就可以正确地进行测量。

锂浓度处于0.6mM～3mM范围内时，将F28四苯基卟啉在成品试剂组合物中的浓度设为每1L在0.1～1.0g/L范围内可以进行测量，优选0.5g/L。如果过少，则F28四苯基卟啉与锂离子的反应无法充分进行，如果过多，则会导致F28四苯基卟啉源性空白的吸光度增加这样的不合格问题，所以优选0.5g/L。

更详细地说明这点，就是F28四苯基卟啉与锂离子形成莫耳比为1:1的螯合错合物的反应。此处，在使用有本试剂组合物的实施例1的条件下，使检测物中的锂浓度含有3mM的检测物产生反应时，其反应系中的锂浓度设为约0.02mM。因此，以1:1进行反应的F28四苯基卟啉浓度在反应系内也不会存在大于等于0.02mM，所以无法使检测物中的锂不多不少地进行反应。

通常，螯合剂和金属离子的错合物形成反应(显色反应)需要相对于被反应物质(锂)为等倍～10倍的莫耳浓度的螯合剂(F28四苯基卟啉)，如图1的F28四苯基卟啉的适量浓度的参考计算图表所示，以将反应时的F28四苯基卟啉的浓度设为等倍到10倍的方式来构成试剂组合物，但现实中试剂组合物的添加量、检测物量的所谓测量反应时的用量所涉及的参数，会由于其测光机种或目标临界值不同而存在若干差值，因此该试剂组合物中的螯合剂浓度与等倍的0.1g/L相比，5倍量的0.5g/L可以耐受更大范围的测量条件。例如，使用检测物量的微量化技术较低的机种进行测量时，假设将检测物量相对于实施例1的相关数据增量2倍～5倍左右，因此预先将作为5倍量的试剂组合物设为0.5g/L就不会不够。另一方面，即使根据莫耳比添加螯合剂大于等于10倍，也没有给显色反应带来动态促进性，只会担心试剂空白值增大，这样做没有好处。

如上所述，只要满足螯合剂与锂的反应莫耳比的条件就行了，因此，例如将第二试剂的螯合剂(F28四苯基卟啉)浓度设为1.0g/L时，就可以将反应时的第二试剂添加量减半。或者，该检测物量减半时，也可以同样地将螯合剂浓度设为半分量。

如此一来，本实施例1中将F28四苯基卟啉设为0.5g/L，考虑到满足反应莫耳量，且将试剂空白值设为最小限，结果发现0.1～1.0g/L范围最合适。

而且，将二甲基亚砜(DMSO)设为5～30重量％，如果过少，则F28四苯基卟啉在溶液中的分散性会降低，如果过多，则试剂组合物中有机溶媒的比例会增加，因此优选20重量％。但是，想要降低作为溶剂的DMSO浓度时，设为小于等于10重量％也完全没有妨碍。

此处，本实施例1中的F28四苯基卟啉是将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的如下所示的结构式。

【化1】

(3)对制作检量线加以说明，该检量线使用有如上所述的混合有第一试剂和第二试剂的锂试剂中的锂浓度已知样本。

根据实施例1，于6μL样本中加入720μL第一试剂(缓冲液)、240μL第二试剂(显色试液)。此时第一试剂具有pH10的缓冲功能，试验时混合有第一试剂、第二试剂、样本时的试验液的pH值几乎成为pH＝10。

如此一来，通过使用F28四苯基卟啉作为螯合剂，可以在pH5～10范围内实现显色反应，构成具有小于等于pH12的强pH缓冲作用的锂测量试剂，因而可减少由于吸收空气中的CO₂所导致的pH变动，最终可避免对测量值造成不好影响。而且，由此能够保存在通用的容器中。

再者，第一试剂和第二试剂在使用之前以相同比例立刻加以混合，可将混合液以相同容量添加到样本中，此时，在6μL样本中添加940μL混合液后也可以制成测量对象的试验液。

在常温下使该混合试剂中添加有样本的pH10试验液反应10分钟后，使用紫外-可见分光光度计(日立U-3900型)，对照试剂空白来测量出550nm的吸光度。相应结果就是图2的锂浓度mg/dL和吸光度的曲线图，以及，图4的F28四苯基卟啉-锂错合物生成时的可见部分的光谱变化曲线图。

不是将四苯基卟啉金属错合物中可获得被称为典型性索雷谱带(380nm到460nm附近)的最大敏感度的波长，而是将相对于血清检测物中锂浓度范围可获得最佳敏感度的波长550nm或者从其附近波长530nm到560nm的波段设为测光波长，由此就不需要稀释操作或者稀释装置等的复杂操作、以及操作所需的附带装置。

再者，如图3的锂浓度mg/dL和吸光度的曲线图(光波长*405nm、×415nm、●550nm)所示，如上所述的波长550nm或者从其附近波长530nm到560nm的波段与将索雷谱带作为测光波长时相比，检量线的直线性更好，因此更便于使用简单的比色计或分光光度计来进行浓度演算，色调明显地从黄色变化为红色，因此也可以目测方式来判定浓度等级。因此，虽然现有的锂浓度测量中还必需大型的专用设备，但根据本发明，使用便携式比色计或通用型紫外可见分光光度计就可计测出锂浓度，也可以构成POCT套组。

但是，根据图3的曲线图，波长●550nm是实施例1本身，作为索雷谱带的测光波长的*405nm、×415nm和实施例1一样添加有第1试剂、第2试剂，因为敏感度过高，所以将样本稀释5倍后进行测量反应，使用了405nm和415nm波长。根据图3的曲线图，判断如下：405nm和415nm波长的检量线不成直线，但将本实施例的550nm设为测光波长时，可获得直线性良好的检量线。

而且，如图4的F28四苯基卟啉-锂错合物生成的光谱变化的曲线图所示，锂浓度0.6mg/dL、1.2mg/dL、1.8mg/dL、2.4mg/dL、3.0mg/dL和吸光度呈直线增加是非常确定的。与锂浓度成正比，卟啉-金属错合物中典型的415nm(索雷谱带)的峰值和图中所示的550nm的吸收峰值会增大，570nm的吸收峰值会减少，因此作为测光波长都可以求得吸光度差，但如上所述，由于可获得直线性良好的检量线，还是优选550nm作为测光波长。

当然，本实施例1中设为550nm的吸光度，但波长540nm到560nm的波段也可以设为测光范围。由于测量设备不同，有时没有550nm的测光滤波器，也可以将此时在其附近产生敏感度的540nm或560nm设定为测光波长。根据图4的实施例1中的锂浓度所得的吸光度的曲线图所示，570nm的敏感度的减少相对于锂浓度也是定量的，因此可以将试剂空白作为对照求得吸光度差(ΔAbs)，可用作为测光波长。

进而，有很少的患者检测物的样本，会产生干扰波长550nm的夹杂物质，在550nm波长时数据会产生误差，为了避免这种情况，也可以从波长570nm或者从其附近的565nm到650nm范围内选择测光波长，将敏感度的减少用作吸光度差来计算出锂浓度。

而且，对根据上述锂浓度测量方法进行误差校正以及修改方法之一加以说明。

对于正在溶血的血清等检测物，众所周知会产生血红蛋白源性540nm附近、560nm到650nm附近的两个吸收峰值(分别为β谱带、α谱带)成为妨碍因子，但高浓度含有这种血红蛋白的检测物与本发明的试剂组合物相接触时，作为本发明的测光波长的550nm和血红蛋白的β、α谱带源性540nm的吸收会重复，因此相对于实际的测量值，可判断出产生了正误差。

即，(锂和F28四苯基卟啉错合物源性550nm的敏感度)+(血红蛋白源性550nm的敏感度)＝550nm的测量敏感度(∴产生血红蛋白源性的正误差。)

此处，根据本发明，应注意到血红蛋白的550nm和600nm的两个敏感度比几乎相同。即，应注意到血红蛋白的550nm的敏感度＝血红蛋白的600nm的敏感度，可以想到将血红蛋白的550nm的敏感度使用600nm的敏感度相抵消。

因此，如果设为550nm的敏感度＝锂和F28四苯基卟啉错合物的550nm敏感度+血红蛋白的550nm敏感度-血红蛋白的600nm敏感度，则会抵消掉血红蛋白源性550nm的敏感度，可获得更正确的550nm的敏感度。

根据如下实验结果，使用本发明的实施例1的锂试剂，可大致正确地测量出锂浓度，就此加以说明。

[使用紫外-可见分光光度计(日立U-3900型)的实验结果]

图2的曲线图是使用紫外-可见分光光度计(日立U-3900型)得出的测量试验结果。横轴X表示预先调配好的已知的锂浓度(锂浓度mg/dL)，纵轴Y表示使用紫外可见分光光度计得出的550nm的吸光度差，是直线回归型的结果。

根据该图2的曲线图来判断，所得的吸光度与锂浓度成正比，可绘制出直线性良好的检量线。

[将血清作为样本时的原子吸光法(现有法)和本发明方法的关联试验结果]

图5的曲线图是根据图2中所说明的实施例1进行的测量法，和根据将相同血清作为样本的现有的原子吸光法(现有法)得出的锂浓度测量值的关联试验结果。纵轴Y表示根据本发明得出的锂浓度测量值，横轴X表示根据原子吸光法(现有法)得出的锂浓度测量值，根据图2所示的回归线表示出两测量值具有大于等于95％的良好关联。因此，对于相同的血清样本，使用本发明的试剂组合物，根据紫外-可见吸光光度定量法，可正确定量出血清样本中的锂。

[根据将管理血清作为样本的自动分析所得出的测量值的比较]

作为带有锂浓度数值的管理血清，将PrecinormU(PrecinormU)(Roche制)、PrecipathU(PrecipathU)(Roche制)、PathonormH(PathonormH)(SEROAS制)、Autonorm(Autonorm)(SERO AS制)作为样本，使用生化学自动分析装置(日立H-7700型)将546nm(接近550nm的波长且本机上所安装的波长)作为测光波长，根据1PointEnd法加以测量。

(装置参数)

试剂：0.24mL

样本：0.005mL

测光波长(主/副)：546nm/700nm

测光时间：10分钟

温度：37℃

1PointEnd和增加法

将上述设定条件下的实验结果示出在图6的[表1]中，可判定本发明的实施例中的测量值相对于保证值具有良好的一致性，即便使用临床检查用自动分析装置也足以测量出血清中的锂。

如上根据混合有第一试剂和第二试剂的二液型锂试剂的实施例加以说明，对于使用如后所述的微盘分析仪进行的锂测量方法，和以目测方式进行的锂检测法，两者都使用96孔培养盘作为样本容器，因而作为以实施例1为基础的组合的一液型样本，调制出实施例2(锂试剂组合样本2)进行了实验。

再者，为了以防万一，对于实施例1的锂试剂组合样本1，调制出被检测物的分量，以与如后所述的实施例2相同的目测方式，对锂检测方法进行了实验，一旦照射白色光，对于被检测物中的锂浓度，小于等于0.5mEq/L(＝mol/L)时呈绿色，0.5mEq/L到1.5mEq/L时呈黄色，大于等于1.5mEq/L时呈红色。该呈色变化与管理区域、中毒区域的临界值等级非常一致，通过目测或者比色计就可明确检测出来，可获得几乎相同的结果。详细内容和实施例2相同，故省略说明。

[实施例2(锂试剂组合样本2)]

此处，对实施例2加以说明，本实施例2的组合与实施例1本质相同，但实施例2不是实施例1的二液型，而是使用显色液构成为一液型，这样的做法依据下述理由。

分注到微盘分析仪用的96孔培养盘中时，在使用一液型试剂的情况下，仅操作样本和显色液就大功告成了，在使用二液型试剂的情况下，需要将样本、第1试剂、第2试剂这三样在小容量的培养盘上进行混合操作。使用如实施例1的大容量1mL大小的分光光度计用的比色管容器时，该操作简便，但使用96孔培养盘时，该操作就变得繁杂，因此在本实施例2中采用了操作更简便的一液型试剂。而且，为了避免此时的试剂组合对作为培养盘材质的聚苯乙烯树脂带来不好影响，应如前所述来选择界面活性剂、pH缓冲剂。

在图7的[表2]中，如前所述，采用根据锂浓度测量方法进行的误差校正以及修改方法，实际上使用微盘分析仪(CORONA SH1200型)，表示出溶血时干扰试验的结果。所使用的试剂组合物、试验方法如下所示。

[实施例2(锂试剂组合样本2)]

(1)显色试剂(锂试剂组合物2)

螯合剂：F28四苯基卟啉0.17g/L

有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO) 5重量％

稳定剂(分散剂)：十二烷基硫酸钠 1重量％

Triton X-100 1重量％

掩盖剂：三乙醇胺 10g/L

乙二胺四醋酸二钾 0.5g/L

在其中添加pH缓冲剂以及pH调节剂用以达到特定pH10，加入净化水达到1L后保管在通用的保存容器中。

(2)样本

在含有1.5mM锂的基础血清中添加干扰Check A+(注册商标、Sysmex制)作为特定浓度的溶血血红蛋白，调制出溶血样本。

在上述4μL样本中加入240μL显色试剂，反应5分钟，设为主波长550nm、副波长600nm，使用微盘分析仪(CORONA SH-1200型)来观测其吸光度，以标准物质的吸光度为基准来计算出锂浓度。

如上所述，仅在550nm测量测光波长时，溶血检测物中血红蛋白的550nm会对测量值带来正妨碍，因此作为校正方法，就是测量550nm和600nm两个波长，演算为550nm-600nm，就可以相互抵消，不受到溶血影响。采用自动分析法时，输入主波长550nm、副波长600nm和参数即可。

根据该图7的[表2]来判断：血红蛋白为1000mg/dL时，和经过校正的102％仅有2％的误差，却和没有经过校正的125％产生25％的误差，因此本发明所公示之锂浓度测量方法的校正方式是极其有效的校正方法。

[以目测方式进行的锂检测方法」

此处，就以本发明的目测方式进行的锂浓度的测量方法以及检查方法加以说明。

首先，本发明者们以目测方式来观察前述专利文献3中所公示的现有技术的试验液，将相应结果示出在图8的[表3]中。

将所述锂试剂组合样本2作为显色试剂，在4μL样本中添加240μL显色试剂，反应5分钟，在常温下反应5分钟后，以目测方式来观测其呈色。使用特定浓度的锂标准液、不同浓度等级的管理血清作为色调参照物对样本进行比较。

可以确认在各浓度区域中出现从黄色到红色的呈色变化，管理血清的呈色与色调参照物较为一致。可以判断无需使用特殊装置就可迅速且简便地判定出血清中的锂浓度。

但是，参照从黄色到红色的呈色变化，根据作为管理区域的1mM Autonorm的黄色、以及作为危险区域的3.5mM模拟血清的红色，对25位判定者的判断正解率达到100％，但对于准中毒区域的1.6mM PathonormH、以及中毒区域的2.5mM PrecinormU，正解率下降到52％。

因此，本发明者们重新加以改良，本发明研发而成。

该发明的实施例通过对根据所述现有技术所得的被检测物(：混合有试剂组合物和样本的测量检测物)照射特定亮度的白色光，或者暴露在光中，仅使与锂离子未反应的F28四苯基卟啉变化为结构异性体而成为光化学互变异性体，结果是，被检测物中的锂浓度小于等于0.5mEq/L(＝mol/L)时呈绿色，0.5mEq/L到1.5mEq/L时呈黄色，大于等于1.5mEq/L时呈红色。该呈色变化与管理区域、中毒区域的临界值等级非常一致，通过目测或者比色计就可明确地检测出来。

通过本发明的目测检测来判定试验液中的锂浓度等级，相应结果示出在图9的[表4]中。该试验结果根据作为管理区域的1mM Autonorm的绿色、以及作为危险区域的3.5mM模拟血清的红色，对25位判定者的判断正确率达到100％，而且对于准中毒区域的1.6mM PathonormH、以及中毒区域的2.5mM PrecinormU，正确率高达96％。

即，仅对与锂未反应的F28四苯基卟啉照射白色光，生成光化学互变异体且变色为绿色，但锂浓度为4.3mM时，F28四苯基卟啉几乎都与锂离子产生了反应，未反应化学种(所生成的光化学互变异体)非常有限，保持为红色。对于其中间的锂浓度，出于同样原理，呈现出黄色作为绿色和红色的中间色。

如此一来，通过目测或比色计，通常是根据呈色浓淡来进行浓淡检测，但色调本身从绿色变化为黄色、橙色、红色，该色调可以明显检测出来就是极其罕有的高性能。

从调制样本开始，详细地说明该方法，对放入透明容器的被检测物照射特定亮度的白色光，或者暴露在光中，仅使与锂离子未反应的F28四苯基卟啉变化为结构异性体而成为光化学互变异性体，图10就是用于这种变化的装置的概略图。

对于图10的被检测液的照射装置，实施例2的锂试剂组合样本2调制成与所述实施例1几乎相同的试剂组合物，将其1mL添加到分光用比色管的透明容器的反应部1中，使用LED光源2照射白色光，如图11所示，测量出到光异性化反应结束为止所需的时间(：反应结束时间)。

使用设置在分光比色管近处的照度计来测量LED光源强度，对于光异性化反应的终点(：反应结束时间)，测量电子吸收光谱时的400nm到600nm(：反应前的光谱)通过观测600nm到800nm(：光异性化后的光谱)的波段的光谱位移来决定。

相应结果示出在图10中，在420勒克斯的照度下，反应需要3分钟左右，在大于等于1430勒克斯的照度下，40秒钟以内就可完成光异性化。普通办公室、医院诊室、检查室的照度为300勒克斯到750勒克斯，所以无需特殊光源，在普通设施的日常室内照明下就可以迅速地适用本发明的测量方法。

进而，要求更快速地完成反应时，为获得大于等于1430勒克斯的照度，只要将被检测液拉近和LED光源的距离就可以充分实现。

如此一来，对于光异性化反应所需时间，即色相变化(光异性化)所需时间，讨论作为光源的定量性指标即照度(Lux)所带来的影响，讨论结果就是图11的曲线图。

再者，图10中对于光源部2的反应部2(透明容器)的照射角度θ可设为任意角度，这是因为其具有如下特征：如果容器是透明的，则光会透过容器本身，该透过光可直达被检测物，因此照射角度θ自身完全不会受到影响，而且，反应结束时间如下图11所示，例如500勒克斯下需要150sec较短时间，可快速变换为结构异性体而成为光化学互变异性体。而且，如果将该光化学互变异性体放置在暗室中，经过漫长的时间会恢复到原先状态。

对于图10的被检测液的照射装置，仅使与锂离子未反应的F28四苯基卟啉变化为结构异性体而成为光化学互变异性体，相应结果如图12所示，对于被检测物中的锂浓度，小于等于0.5mEq/L(＝mol/L)时变化为绿色。将这个示出在图10的曲线图中加以说明，相对于照射前的波长的400nm到800nm的可见光线范围内的吸收光谱是实线，但照射上述白色光3分钟左右后，变化为虚线的吸收光谱。以目测方式来观测该变化，则分别从黄橙色变化为绿色。

而且，如图13的放大图所示，对于锂离子浓度，小于等于0.5mEq/L(＝mol/L)的从500nm到600nm的可见光线范围内的吸收光谱变成为粗虚线，大于等于1.5mEq/L的吸收光谱以细点线来表示，以目测方式来观测时呈红色。

出于该原理，对管理血清中的锂浓度进行目测判定的结果是图8的[表3]，通过简便且迅速的目测检测，可明确地判定出被检测物中的锂浓度。

此处，作为本发明所使用的锂试剂组合物，对实施例1以及实施例2已经加以说明了，这是专利文献3中所公示的组合物，如下所述的实施例3中可获得与如前所述的实施例1或实施例2相同的结果，通过对被检测物的颜色浓淡或色调进行目测，可测量出被检测物中的锂浓度，对此经过追加试验后得以确认。

[实施例3(锂试剂组合样本3)]

(1)第一试剂(作为稳定剂和缓冲液)

螯合剂：无

有机溶剂：无

稳定剂(分散剂：非离子性界面活性剂)：TritonX-100(商标注册)

(辛基苯基聚氧乙烯醚) 1.0重量％

掩盖剂：三乙醇胺 10mM

如上，添加MOPS达到0.1M后调节为pH8，加入净化水达到1L后保管在通用的保存容器中。

(2)第二试剂(作为显色试液)

螯合剂：F28四苯基卟啉 0.5g/L

有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO) 20重量％

稳定剂(分散剂：非离子性界面活性剂)：TritonX-100

(注册商标)(辛基苯基聚氧乙烯醚) 1.0重量％

掩盖剂：三乙醇胺 10mM

在其中添加MOPS(缓冲剂)达到0.05M，调节为pH7.0，加入净化水达到1L后保管在通用的保存容器中。

测量锂浓度时，和实施例1一样，6μL样本中添加720μL第一试剂(缓冲液)、240μL第二试剂(显色试液)，在特定时间内进行显色反应。

此处和实施例1或实施例2一样，于所述锂试剂组合物中混合被检测物，以特定亮度的白色光进行照射，或者暴露在光中，仅使与锂未反应的F28四苯基卟啉变化为结构异性体而成为光化学互变异性体，结果是，对于被检测物中的锂浓度，小于等于0.5mEq/L(＝mol/L)时呈绿色，0.5mEq/L到1.5mEq/L时呈黄色，大于等于1.5mEq/L时呈红色。该呈色变化与管理区域、中毒区域的临界值等级相一致，通过目测或者比色计可明确地检测出来。当然，与实施例1和实施例2的关系一样，也可以使用一液型。

以上，本发明的各实施例中，使用血清试验样本对被检测物进行了说明，作为除此以外的被检测物，可以使用含有尿、血液、血浆试验样本在内的活体样本，当然，也可以是工业用水、饮用水、环境样本等，使用简便的比色计就可立刻测量出水溶液中的锂浓度，而且，还可以目测方式进行判定。

而且，根据本发明的特征，例如，与锂离子进行反应且在吡咯环的β位上键合有8个溴(Br)原子的卟啉，对于含有该卟啉的分析试剂还尚不明了，但由于光感度会对电子吸收光谱造成影响，暗示也可适用于和本发明相同的锂检测系。

Claims

1.一种锂测量方法，其特征在于：将被检测物和锂试剂组合物相接触，该锂试剂组合物的特点在于它就是包含以将与四苯基卟啉的碳所键合的氢全部取代为氟的结构式

【化1】

所表示的化合物、pH调节剂以及pH缓冲剂在内的水溶液；对该反应液照射白色光，或者暴露在光中，通过目测方式来检测出应时而生的色调变化，或者使用比色计来检测出其敏感度。

2.根据权利要求1所述的锂测量方法，其特征在于：所述显色的色调在不存在锂呈色错合物时呈现绿色，随着锂呈色错合物数量增加，则从黄色经由橙色再变化为红色。

3.根据权利要求2所述的锂测量方法，其特征在于：所述色调的变化会发生在锂浓度为0.0mM到4.5mM的范围内。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的锂测量方法，其特征在于：所述被检测物是包含血清以及血浆试验样本在内的活体样本。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的锂测量方法，其特征在于：所述被检测物是环境样本。