JP2009539359A - 生体媒質中で酵素活性を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)所定量のトロンビン活性を含有する反応混合物にシグナル基質を添加するステップであり、前記シグナル基質が、前記トロンビン活性との反応で形成された変換産物と関連する検出可能なシグナルを生じるステップと;
b)ステップa)の経時的なシグナル曲線の特徴を、前記曲線の初期傾斜が計算されその曲率が推定されるような数学的手順により決定するステップと;
c)トロンビン産生が起こる血漿にシグナル基質を添加するステップであり、前記シグナル基質が、トロンビンとの反応で形成された変換産物と関連する検出可能なシグナルを生じるステップと;
d)トロンビン産生が起こる同一の試料、又は同一の血漿の別の試料に蛍光化合物を添加し、それにより、血漿がもたらす濁度及び/又は色がシグナルに与える影響の指標として使用される検出可能なシグナルが得られるステップと;
e)ステップd)での測定をステップa)での測定と比較して、トロンビン産生が起こる血漿の濁度及び色について補正するための関連性を確立するステップと;
f)ステップb)で決定された1)の測定の曲率を使用して、シグナルが測定される系の非線形性について補正し、ステップb)から導き出された初期傾斜を使用して、ステップc)で測定されたシグナルから経時的なトロンビン濃度を算出するステップとを含む方法が提供される。
−測定される既知濃度の酵素、又は測定される酵素と類似したシグナル基質に対する酵素活性を有する既知濃度の化合物;
−酵素産生を開始するための誘発用試薬;
−検査の診断価値を促進する添加物;
−標準化及び/又は対照に使用できる血漿;
−シグナル基質又はシグナルを発生する脱離基が付加されたシグナル基質を含有する試薬;
−プログラムがコンピュータ上で作動すると、本明細書中で開示された方法により決定される酵素活性を算出するための、コンピュータのメモリに直接ロード可能なソフトウェアプログラム;
−使用説明書;
−酵素産生が起こる媒質の内部又は外部で使用する較正された量のフルオロフォア;
−酵素産生が起こる媒質の内部又は外部で使用できる蛍光発生源
を含むキットを提供する。
定義血液又は血漿試料中に生じるタンパク質分解酵素と関連して本明細書中で使用される「一時的活性」という用語は、いったん生理学的な過程が当技術分野で公知の手段で開始されると、酵素活性がまず上昇し、その後最終的には(近似的に)無活性にまで再び低下する事実を指す。
初期傾斜は、特に、反応が追跡される媒質の色、基質濃度及びトロンビン濃度に依存する。時点ゼロでは基質が消費されずフルオロフォアが形成されていないため、定義により、初期傾斜は、基質消費の効果及び内部フィルター効果を被らない。したがって、初期傾斜は、1分当たりの蛍光単位(FU)と酵素濃度との間の変換:FU/分×C=[トロンビン]をもたらす。このCは、反応の全期間中でCが固定値に留まるようにシグナルが補正された時、トロンビン産生が起こる試料中の経時的なトロンビンを算出するためにのみ使用される。
プラトーに達すると、基質は完全に消費され且つ/又は系が蛍光の限界に達し、すなわちより多くのフルオロフォアがより多くのシグナルをもたらさない。
曲率は、基質消費にだけでなく、フルオロフォア量と蛍光シグナル量との間の非線形性にも依存する。フルオロフォア濃度と測定された蛍光量との間の関連性は非線形であることが多く、それはフルオロフォア濃度の増加が比較的少ない蛍光をもたらすことが原因である(内部フィルター効果)。第2の効果は、基質濃度の低下に繋がる基質変換である(図2及び図3を参照)。これらの基質濃度が基質のKmより下又は付近になると、トロンビンが基質を変換する速度が基質の低下と共に減速しよう。基質、測定される酵素及び測定系の選択によっては、曲率が強いこともあり又は存在しないこともある。
FU(t)=FU(0)+MAX*(1−EXP(時間*K))
により数学的にフィッティングが可能で、式中、
FU(t)は経時的な蛍光であり、
FU(0)は蛍光の初期値であり、
MAXは終レベルであり、
Kは曲率を記述する。
−測定される既知濃度の酵素、又は測定される酵素と類似したシグナル基質に対する酵素活性を有する既知濃度の化合物。
−酵素産生を開始するための誘発用試薬。特に、そのような誘発剤が、全血、又は多血小板血漿若しくは乏血小板血漿若しくは無血小板血漿中でトロンビン活性の測定に使用される場合、好適な誘発剤は、1つ又は複数の以下の化合物:精製された又は組換え型の組織因子、リン脂質小胞、微粒子、凝固因子、コラーゲン、血小板活性化因子、トロンビンを含有する試薬である。
−検査の診断価値を促進する添加物。特に、そのような添加物が、全血、又は多血小板血漿若しくは乏血小板血漿若しくは無血小板血漿中でトロンビン活性の測定に使用される場合、好適な添加物は、精製された又は合成された(組換え型の)トロンボモジュリン、活性化プロテインC、抗血栓薬、抗血小板薬、精製された又は合成された(組換え型の)凝固因子である。
−標準化及び/又は対照に使用できる血漿。
−シグナル基質又はシグナルを発生する脱離基が付加されたシグナル基質を含有する試薬。
−プログラムがコンピュータ上で作動すると、本明細書中で開示された方法により決定される酵素活性を算出するための、コンピュータのメモリに直接ロード可能なソフトウェアプログラム。
−使用説明書。
−酵素産生が起こる媒質の内部又は外部で使用する較正された量のフルオロフォア。
−酵素産生が起こる媒質の内部又は外部で使用できる蛍光発生源。これは、液体、ゲル、吸収性物質、メイズ、又は蛍光性の若しくは蛍光性に作られた任意の形態の物質であり得る。
−上記で言及した化合物又は添加物の任意の組合せを含有する試薬。
−キュベット、マイクロタイタープレート又は測定を都合よく遂行するために必要な他の器具などの使い捨て品。
−ソフトウェアがその存在なしで作動しないようにソフトウェアプログラムにより検出されるドングル。ソフトウェアが作動しているコンピュータのUSBポートに挿入できるそのようなドングルは、コピー防止の役割を果たす。
FU_補正済=−SPM*LN[FU(0)+SPM−FU]+SPM*LN(SPM)+FU(0)
(式中、
SPMは蛍光の一点測定であり、
FU(0)は反応の時点ゼロにおける蛍光であり、
FUは未補正の蛍光値である)
を用い、図8Aの蛍光シグナルを補正する。
Claims (4)
- 凝固血漿中でトロンビンの経時的な経過を決定するための方法であって、
a)所定量のトロンビン活性を含有する反応混合物にシグナル基質を添加するステップであり、前記シグナル基質が、前記トロンビン活性との反応で形成された変換産物と関連する検出可能なシグナルを生じるステップと;
b)ステップa)の経時的なシグナル曲線の特徴を、前記曲線の初期傾斜が計算されその曲率が推定されるような数学的手順により決定するステップと;
c)トロンビン産生が起こる血漿にシグナル基質を添加するステップであり、前記シグナル基質が、トロンビンとの反応で形成された変換産物と関連する検出可能なシグナルを生じるステップと;
d)トロンビン産生が起こる同一の試料、又は同一の血漿の別の試料に蛍光化合物を添加し、それにより、血漿がもたらす濁度及び/又は色がシグナルに与える影響の指標として使用される検出可能なシグナルが得られるステップと;
e)ステップd)での測定をステップa)での測定と比較して、トロンビン産生が起こる血漿の濁度及び色について補正するための関連性を確立するステップと;
f)ステップb)で決定された1)の測定の曲率を使用して、シグナルが測定される系の非線形性について補正し、ステップb)から導き出された初期傾斜を使用して、ステップc)で測定されたシグナルから経時的なトロンビン濃度を算出するステップとを含む上記方法。 - 第1の生体試料中で実質的なトロンビン活性であるタンパク質分解活性の経過をリアルタイムで、その活性の試料中での出現及び試料からの消失に従って決定する方法であって、
a)前記第1の試料にタンパク質分解酵素活性化物質を添加してタンパク質分解活性を生じさせるステップと;
b)シグナル基質をステップa)に添加するステップであり、前記シグナル基質が、前記発生したタンパク質分解活性による反応で形成された変換産物の量と関連する検出可能なシグナルを生じるステップと;
c)ステップb)に記載のシグナル基質に対して既知の安定したタンパク質分解活性を有する手段を、緩衝液など好適な媒質に添加するステップであり、定常的で既知の安定したタンパク質分解活性を有する前記手段が、アルファ2マクログロブリン−トロンビン複合体、スタフィロコアグラーゼ−プロトロンビン複合体、ガンマトロンビン、及びトロンビンからなる群から選択されるステップと;
d)ステップb)に記載のものと同一のシグナル基質をステップc)に添加するステップであり、前記シグナル基質が、既知の安定したタンパク質分解活性を有する前記手段による反応の際に検出可能なシグナルを生じるステップと;
e)b)で測定されたシグナルの発生源を使用するステップであり、このシグナルが前記第1の試料を介して伝わり、シグナル量が第1の試料の色及び濁度により影響を受けるステップと;
f)c)で測定されたシグナル量とe)で測定されたシグナル量との間の関連性を確立するステップと;
g)f)の前記関連性を使用して、c)でのシグナルの経時的な発生を算出し、シグナルが第1の試料中で測定された場合にどのくらいであるかを予測するステップと;
h)g)での予測曲線をb)での測定曲線と比較して、第1の試料中のタンパク質分解活性の経時的な経過を導き出すステップとを含む上記方法。 - 請求項1又は請求項2に記載の方法を実行するためのキットであって、以下の構成要素:
−測定される既知濃度の酵素、又は測定される酵素と類似したシグナル基質に対する酵素活性を有する既知濃度の化合物;
−酵素産生を開始するための誘発用試薬;
−検査の診断価値を促進する添加物;
−標準化及び/又は対照に使用できる血漿;
−シグナル基質又はシグナルを発生する脱離基が付加されたシグナル基質を含有する試薬;
−プログラムがコンピュータ上で作動すると、本明細書中で開示された方法により決定される酵素活性を算出するための、コンピュータのメモリに直接ロード可能なソフトウェアプログラム;
−使用説明書;
−酵素産生が起こる媒質の内部又は外部で使用する較正された量のフルオロフォア;
−酵素産生が起こる媒質の内部又は外部で使用できる蛍光発生源
を含む上記キット。 - 凍結乾燥した試薬を含む、請求項3に記載のキット。
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