KR20090034860A - 생물학적 매질에서 효소 활성을 측정하는 방법 - Google Patents

생물학적 매질에서 효소 활성을 측정하는 방법 Download PDF

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드롬비노스코프 비.브이.
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Abstract

본 발명의 안정적이고, 신속하며 편리한 방법은 기질 소모, 신호의 색 의존성 및 발색단 또는 형광단의 농도 사이에 비선형성 및 신호의 양에 대해 보정하는 신호 기질 존재하의 생물학적 매질에서 시간 경과에 따른 효소 농도 변화를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 측정된 곡선의 특징을 결정하기 위하여 완충액과 같은 적합한 매질에서 검량 곡선을 측정하는 것을 포함한다. 이들 특징은 효소 생성이 일어나는 매질의 샘플에서 단일 지점 측정을 기본으로 하여 수학적 과정을 통하여 다시 전체 곡선 또는 충분한 그의 부분을 얻도록 허용한다. 이것은 단일 지점 측정이 적절하기 때문에 각 개별 매질에서 전체 검량 곡선을 측정할 필요가 없는 큰 이점을 갖는다.
검량 곡선, 매질, 효소 생성, 기질 소모, 색 의존성, 발색단, 형광단, 효소 농도 변화

Description

생물학적 매질에서 효소 활성을 측정하는 방법{Method of determining enzymatic activity in biological media}
본 발명은 진단학 분야에서 혈액 및 기타 체액에서 트롬빈과 같은 단백질분해성 효소의 생물학적 활성 형태를 측정하는 신규한 방법, 및 이러한 방법을 실시하기 위한 시험 키트에 관한 것이다.
생화학, 화학, 의약, 진단학 등의 많은 실험실은 생물학적 매질에서 효소의 생성을 측정하는데 관심을 가지고 있다. 이를 위하여, 발색단 또는 형광단을 방출하여서 전환 후 시간에 따라 진행되어 측정되는 발색 신호 또는 형광 신호를 얻을 수 있는 신호 기질(signal substrate)이 일반적으로 사용된다.
생물학적 매질에서 시간 경과에 따른 효소 형성을 따라가는 편리한 방법은 기질을 생물학적 매질에 직접 부가하는 것, 즉 형광 기질을 트롬빈이 형성되는 응고되는 혈장에 부가하는 것이다. 이것은 효소 생성이 생리적 매질에서 측정되는 이점을 갖는다.
이 방법의 결점은, 이러한 매질 중에 존재할 수 있는 어떠한 생리적 기질에 대한 효소의 활성이 부가된 신호 기질과 경쟁하고 또 효소 생성이 완성되기 전에 상기 기질이 완전히 소비될 수 있는 것이다. 이러한 효과를 최소화 하기 위하여, 기질은 보통 효소에 너무 긴밀하게 결합되지 않고(즉, 낮은 KM 을 가짐) 또 너무 신속하게 전환되지 않는(즉, 낮은 Kcat을 가짐) 것에서 선택된다.
다른 문제는, 반응이 생기는 매질의 혼탁도 및 색에 따라서, 상기 측정된 신호가 달라지는 것이다. 상이한 공급원 또는 공여체로부터의 매질에서 동량의 효소는 상이한 양의 신호를 생성할 것이다. 발색단 또는 형광단 농도는 신호의 양에 직접적으로 비례하지 않을 수 있다. 이것은 반응이 진행하는 동안 존재하는 효소의 양을 산출하기 어렵게 만든다. 시간 경과에 따른 효소의 농도를 정확하게 정량하기 위하여, 이러한 모든 효과를 고려해야 한다.
WO 03/093831호는 트롬빈 기질을 샘플에 부가하여 존재하는 트롬빈의 양에 대하여 관련이 있는 양으로, 단위 시간당 검출가능한 신호를 생성하는 것을 포함하는, 샘플로부터 나타나서 사라짐에 따른 혈액 또는 혈장 샘플에서 단백질분해 활성, 특히 트롬빈 활성의 경과를 실시간으로 측정하는 방법을 개시한다. 유사하게, 트롬빈 생성이 유발되지 않는 동일 혈액 또는 혈장의 대조용 샘플에서, 변치않는 트롬빈 활성을 갖는 표준 제제의 활성을 측정한다. 존재하는 트롬빈의 정확한 몰량은 응고되는 혈액에서 측정된 활성을 동시 측정된 검량기로부터 얻은 검량 곡선과 비교함으로써 얻는다. 매질의 색이 신호에 영향을 주지 않는다면, 이 검량 곡선은 사용된 각 매질의 색으로 가장 잘 측정될 수 있을 것이라고 기재되어 있다.
상이한 색 또는 혼탁도의 다른 매질에서 검량된 동량의 효소를 측정하는 방법은 소위 매질 의존적 효과를 제외하고 아주 유사한 검량 곡선을 생성할 것이다.
본 발명은 또한 검량 곡선이 1개 매질에서 오직 1회 측정되고 또 상이한 색 또는 혼탁도의 유사한 매질에서 측정이 전체 곡선을 측정하는 것에 의해 더 이상 실시되지 않고 "단일-지점" 측정에 의해 교체되어 실시될 수 있는 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명에 따르면,
a) 소정 양의 트롬빈 활성을 함유하는 반응 혼합물에 신호 기질을 부가하는 단계, 이때 상기 신호 기질은 상기 트롬빈 활성에 의한 반응시 형성된 전환 생성물에 관련된 검출가능한 신호를 유발하며;
b) 단계 a)에서 시간에 따른 신호의 곡선 특징을, 곡선의 초기 기울기가 산출되고 또 그 곡율로부터 예상을 할 수 있게 하는 수학적 과정에 의해 측정하는 단계;
c) 트롬빈 생성이 일어나는 혈장에 신호 기질을 부가하는 단계, 이때 상기 신호 기질은 트롬빈과 반응시 형성된 전환 생성물에 관련된 검출가능한 신호를 유발하며;
d) 동일 샘플, 또는 트롬빈 생성이 일어나는 동일 혈장의 다른 샘플에 형광 화합물을 부가하여, 신호 상에서 혈장에 의한 혼탁도 및/또는 색의 영향에 대한 측도로서 사용되는 검출가능한 신호를 제공하는 단계;
e) 단계 d)에서 얻은 측정치를 단계 a)에서 얻은 측정치와 비교하여 트롬빈 생성이 일어나는 혈장의 혼탁도 및 색에 대하여 보정되는 관계를 확립하는 단계; 및
f) 신호가 측정되는 계의 비선형성을 보정하도록 단계 b)에서 측정된 바와 같은 1)의 측정의 곡선을 이용하고 또 단계 c)에서 측정된 신호로부터 시간 경과에 따른 트롬빈의 농도를 산출하기기 위해 단계 b)로부터 유도된 초기 기울기를 이용하는 단계를 포함하는,
응고되는 혈장에서 시간에 따른 트롬빈의 경과를 측정하는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 청구항 1의 방법을 실시하기 위한 키트로서,
- 측정될 공지 농도의 효소 또는 신호 기질에 대하여 측정될 효소와 유사한 효소 활성을 갖는 공지 농도의 화합물,
- 효소 생성을 개시하기 위한 유발물질 시약,
- 시험의 진단치를 용이하게 하기 위한 첨가제,
- 표준 및/또는 대조용으로 사용될 수 있는 혈장,
- 신호 기질 또는 신호 생성 이탈기가 부가된 신호 기질을 함유하는 시약,
- 본 명세서에 기재된 방법에 의해 측정되는 바와 같은 효소 활성을 산출하기 위한 컴퓨터 메모리에 직접 로딩가능한 컴퓨터에서 운용하기 위한 소프트웨어 프로그램,
- 기구 매뉴얼,
- 효소 생성이 일어나는 매질 내 또는 외부에서 사용할 검량된 양의 형광단,
- 효소 생성이 일어나는 매질 내 또는 외부에서 사용될 수 있는 형광 공급원을 포함하는 키트를 제공한다.
제1 생물학적 샘플은 보통 혈액, 혈소판이 풍부한 혈장, 혈소판이 부족한 혈장 또는 혈소판이 없는 혈장과 같은 혈장, 타액, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 정자 및 분변으로부터 선택된다.
혈액 샘플에서 본 발명의 방법을 실시할 때, 혈액은 보통 시트르산나트륨 또는 EDTA 등을 함유하는 튜브에 흔히 수집되며, 혈액 중의 유리 칼슘 이온이 결합되어 트롬빈 형성 및 응고가 방지된다. 따라서, 트롬빈 생성을 위하여, 칼슘은 측정 개시 바로 직전에 부가되어야 한다. 그러나, 혈액이 시트르산나트륨에서 수집되지 않은 경우에서는 칼슘의 부가는 필요하지 않다. 예컨대 상기 방법이 이용되면 혈액이 취한지 수분 이내에 실험을 개시할 수 있도록 한다.
측정할 단백질분해성 활성은 보통 트롬빈을 비롯한 활성화된 응고 인자 활성, 활성화된 섬유소용해인자 활성, 및 보체계 활성의 활성화된 성분으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 방법에 따라 혈액 또는 혈장의 샘플로부터 트롬빈 활성의 경과를 실시간 측정하는 것이 바람직한 구체예이다.
본 발명의 방법에 사용되는 신호 기질은 바람직하게는 형성된 단백질분해성 효소에 의한 반응시 검출가능한 전환 생성물을 내는 이탈기를 포함하는 화합물 군으로부터 선택된다. 이러한 전환 생성물은 보통 분광계, 특히 형광(바람직함), 광학 밀도 및 NMR에 의해 측정된다. 따라서, 상기 이탈기는 보통 형광기, 발색기, 수소 이온을 방출하는 기 등이다. 본 발명의 방법을 실시하기 위한 적합하고 바람직한 신호 기질은 Z-Gly-Gly-Arg-AMC 이다. 또한, 적합한 검출가능한 전환 생성물은 p-니트로아닐리드 및 7-아미노-4-메틸-쿠마린을 포함한다.
상기 정의한 바와 같이 본 발명의 방법을 실시하기 위한 공지된 안정한 단백질분해성 활성을 갖는 적합한 수단은 α2-마크로글로불린-트롬빈 착물(바람직함), 스타필로코아굴라아제-프로트롬빈 착물, 및 감마 트롬빈을 포함한다. 또한, 활성 중심이 그대로 존재하지만 반응 혼합물에서 단백질과의 상호작용 기능은 제거된 제2 인식 부위에서 변형된 단백질분해성 효소가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하기 위한 유용한 프로테아제 활성화제는 칼슘 이온, 인지질, 조직 인자, 용해성 조직 인자, 트롬보플라스틴, 카올린 및 엘라긴산을 포함한다.
본 발명의 다른 요지에 따르면, 상기 제1 생물학적 샘플은 또한 지혈성-혈전 계와 같은 연구중인 단백질분해성 계에 대한 영향에 대해 시험할 약학적 물질을 더 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 적합한 약학적 물질은 항-혈소판제와 같은 항혈전제 및 예컨대 헤파린, 데르마탄 설페이트와 같은 항응고제, 예컨대 히루딘, 아르가트로반 또는 멜라가트란과 같은 직접 트롬빈-억제제, 및 예컨대 짙은 항응고제 단백질과 같은 인자 Xa 억제제이다.
본 발명의 이들 목적 및 기타 목적은 이하에서 자세하게 설명할 것이다.
정의
혈액 또는 혈장에서 생기는 단백질분해성 효소와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "일시적으로 활성"은 효소 활성이 당업자에게 공지된 수단에 의해 생리학적 과정이 개시되면 먼저 생긴 다음 결국에는 (거의) 0 활성에 가깝게 가라앉는 사실을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "매질"로도 나타내는 용어 "생물학적 매질"은 효소 활성화 및 불활성화가 생기는 생물학적 과정에서 혈장, 혈액 세포 또는 전혈을 갖는 혈장 또는 생체 기원의 기타 체액 등을 지칭한다.
용어 "단일 지점 측정"(single point measurement: SPM)은 시간경과에 따른 신호의 변화가 이어지는 일련의 측정과 반대되는 단시간의 기간 동안 신호를 측정하는 수법을 지칭한다. SPM은 반복적으로 측정될 수 있고 이어 평균내거나, 또는 오직 1회 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "신호 기질"은 광학, NMR 또는 기타 방법에 의해 검출될 수 있는 이탈기가 제거되는 매질에서 존재하는 단백질분해성 효소에 의해 분해되는 기질을 의미한다. 광학 검출될 수 있는 이탈기는 예컨대 p-니트로알닐리드 및 7-아미도-4-메틸-쿠마린이다. p-니트로아닐리드는 450 nm에서 흡수하고 또 7-아미도-4-메틸-쿠마린은 형광성이다(350 nm에서 여기되고 또 460 nm에서 방출한다). NMR-활성 이탈기의 예는 NMR 또는 유사한 수법으로 검출될 수 있는 31P, 13C, 또는 기타 원자를 함유하는 것이다. H+ 이온도 이탈기로 사용될 수 있으며, 이는 pH에서 변화를 측정함으로써 검출될 수 있다. 농도가 시간에 따라 이어지는 효소가 전기적 도전성을 측정함으로써 이어질 수 있는 반응 혼합물에 기질에 대하여 부가된 기질의 변화에 관여하는 암페어측정 기질이 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
앞에서 언급한 바와 같이, 생물학적 매질의 샘플에서 효소 형성을 측정하기 위한 확립된 방법은 그 효소에 대해 특이적인 신호 기질을 매질에 부가한 다음 시간 경과에 따른 신호를 추적하는 것이다. 이 신호는 효소의 농도 변화에 의해 달라질 수 있을 뿐만 아니라 다양한 매질 의존적 및 매질 독립적 변수에 의해서도 달라질 수 있다. 매질 의존적 변수는 상기 매질의 혼탁도 및 흡수 스펙트럼(예컨대 색)이다. 매질 독립적 변수는 효소의 농도, 기질의 농도, 효소에 대한 신호 기질의 효소 역학적 변수 (Km 및 Kcat 와 같은), 측정 수법, 측정하는 동안 매질이 가라앉는 물질을 포함한다.
WO 03/093831호는 이들 효과를 보정하기 위하여, 검량된 양의 효소를 매질에 부가하였다. 신호 기질의 부가는 매질 의존적 뿐만 아니라 매질 독립적 영향이 나타나는 신호를 초래할 것이다. 이러한 측정은 생물학적 매질에서 (다른 샘플) 형성된 미지량의 효소를 산출하기 위해 사용된다. 즉, 이 곡선은 상기 신호를 동일 매질의 다른 샘플에서 생물학적 반응 동안 형성되는 효소 농도로 시간 경과에 따라 전환하는데 필요한 모든 정보를 함유하는 "검량 곡선"으로 사용된다. 이러한 셋업에서, 검량 곡선은 효소 형성이 생기는 바와 같이 동일 색과 혼탁도를 갖는 매질에서 측정되는 것이 필요하다. 이것은 신호에 대한 매질 의존적 영향을 보정하는 가장 최적 방법이다.
본 발명은 신호 기질의 존재하의 생물학적 매질에서 시간 경과에 따라서 효소의 농도 변화를 측정하기 위한 안정적이고, 신속하며 편리한 방법을 제공하며, 상기 적절한 보정은 기질 소모, 신호의 색 의존성 및 발색단 또는 형광단의 농도 사이에 비선형성 및 신호의 양에 대해 실시된다. 측정된 신호는 각 샘플(샘플 의존적 변이성)에 대해 상이한 효과 및 유사한 조건하에서 측정된 모든 샘플에 대해 동일한 효과에 대해 보정될 것이다. 이러한 변이성은 기질 소모 효과, 내부 필터 효과, 기구 특이적 효과, 실험 셋업 의존적 효과 등을 포함한다. 본 발명의 주안점은 샘플 의존적 변이성으로부터 샘플 독립적 변이성을 개별적으로 측정하는 것이다. 샘플 의존적 변이성은 더욱 편리하고 더욱 용이한 방식으로 측정될 수 있다.
단일 지점 측정은 신호가 매질을 통하여 이동하여 신호의 양이 매질의 색 및/또는 혼탁도에 대한 측도가 되게 하는 일부 신호 생성 공급원의 측정으로 구성된다. 이 방법은 측정된 곡선의 특징을 결정하기 위한 완충액과 같은 적합한 매질에서 검량 곡선의 측정을 필수적으로 포함한다. 이들 특징은 샘플 독립적 변이성을 기재하며 또 효소 생성이 일어나는 매질의 샘플에서 샘플 의존적 변이성의 단일 지점 측정을 기초로 하여 수학적 과정을 통하여 충분한 곡선 부분 또는 전체 곡선을 얻는다. 이것은 매질의 각 독립적 샘플에서 전체 검량 곡선을 측정할 필요가 없고 단일 지점 측정이 적합한 이점이 있다. 이 단일 지점 측정은 매질 자체에 의해 유발된 신호의 변이성에 대한 측도이어야 한다. 이것은 생물학적 매질에서 형광단의 고정 농도의 측정을 포함할 수 있으며, 그 결과는 혈장의 색에서 공여체 대 공여체 차이에 대한 측도이다.
트롬빈은 혈액 응고하는 동안 혈장에서 나타나다가 사라진다. 적합한 형광성 기질을 상기 반응에 부가하면, 형광은 시간 경과에 따라 추적되며 이 형광으로부터 트롬빈의 농도가 산출될 수 있다. 그러나, 측정된 신호는 기질 소모 및 생성된 형광단의 양과 형광의 양 사이의 비선형 관계에 기인한 계의 비선형성을 갖게 된다. 이것은 도 1에 도시되어 있으며, 여기서 완충액에서 트롬빈의 고정 양은 형광 기질 Z-Gly-Gly-Arg-AMC의 존재하에서 형광계로 측정되며, 이것은 분명히 꺾어지는 곡선을 나타낸다. 전형적으로 이러한 곡선은 3개의 특징을 갖는다: 그의 초기 기울기(1), 그의 말기 수준(2) 및 그의 곡율(3).
초기 기울기(1)
초기 기울기는 반응이 계속되는 매질의 색, 기질 농도 및 트롬빈 농도에 따라 달라진다. 정의에 의해, 초기 기울기는 0 시간에서 기질이 소모되지 않고 형광단도 형성되지 않기 때문에, 기질 소모의 효과 및 내부 필터 효과에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 초기 기울기는 형광 단위(FU)/분 및 효소의 농도 사이의 전달을 나타낸다: FU/분 x C = [트롬빈]. 상기 C는, 전체 반응 동안 C가 고정값으로 유지되도록 보정될 때, 트롬빈 생성이 일어나는 샘플에서 시간 경과에 따른 트롬빈을 산출하기 위해 사용될 수 있다.
말기 수준(End-level)(2)
최고점(plateau)에 도달하면, 기질은 완전히 소모되고 및/또는 계는 그의 형광 한도에 도달한다, 즉 더 이상의 형광단은 더 이상의 신호를 초래하지 않는다.
말기 수준에서 측정된 형광 양은 형광단 농도 및 계의 한도에 따라 달라진다. 또한 이러한 말기 수준은 형광이 측정된 매질의 색에 따라 달라진다.
곡율(Curvature)(3)
곡율은 형광단의 양과 형광 신호의 양 뿐만 아니라 기질 소모 사이의 비선형성에 따라 달라진다. 형광단의 농도 및 측정된 형광 양 사이의 관계는 흔히 비선형이며, 이것은 증가하는 형광 농도가 비교적 형광을 덜 생성한다(내부 필터 효과)는 사실에 의해 기인한 것이다. 두번째 효과는 기질 농도의 저하를 초래하는 기질의 전환이다(도 2 및 도 3 참조). 이들 기질 농도가 기질의 Km 미만 또는 근처이면, 트롬빈이 기질을 전환하는 속도는 기질의 저하에 따라 저하될 것이다. 기질의 선택에 따라서, 측정된 효소 및 곡율 측정 계는 강하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.
도 4는 동일 농도의 트롬빈 활성(상이한 공여체로부터 얻은 혈장에서 측정된 알파2-마크로글로불린-트롬빈 착물(α2M-IIa)로부터 유도됨)의 측정 예를 도시한다. 상기 도면으로부터 1) 이들 상이한 혈장에서 동일 효소 활성은 큰 변화를 나타내고 또 2) 모든 곡선은 최고점을 향하여 꺾어진다는 것이 분명하다. 이들 곡선은 혈장의 색에서 공여체 대 공여체 차이 뿐만 아니라 계의 비선형성을 보정하는데 필요한 모든 정보를 함유한다. 도 4의 곡선은 하기 식에 따라서 수학적으로 맞출 수 있다:
FU(t) = FU(O) + MAX*(1 - EXP(시간*K))
식 중에서,
FU(t)는 시간에 따른 형광을 나타내고,
FU(O)는 초기 형광 값을 나타내며,
MAX는 말기 수준이고, 또
K는 곡율을 나타낸다.
상기 대수 식은 보통 양호한 근사치를 나타내지만, 다항 함수, 쌍곡선 또는 이들의 조합, 또는 다른 대체물과 같은 다른 수학적 식도 사용될 수 있다. 사용된 식은 중요한 것은 아니고, 사용된 매질의 곡율과 색 차이에 대해 보정이 실시되도록 곡선을 기재할 수 있는 것이 필요하다.
도 5는 놀랍게도 각 곡선의 초기 기울기와 그의 말기 수준 사이의 탁월한 관계를 도시한다. 이 관계가 확립되면, 초기 기울기는 말기 수준값으로부터만 산출될 수 있다. 변수 K로 기재한 곡율은 모든 곡선에 대해 동일하며 매질의 색에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 기질 농도 및 내부 필터 효과와 같은 계의 인위 인자에 의해 영향을 받는 K는 1회만 측정되는 것이 필요하다. 그 후, 곡선은 말기 수준만을 측정하여 생성할 수 있다. 말기 수준은 모든 기질이 형광단으로 전환되는 상황에서 측정한다. 형광성 기질과 효소의 조합의 부가 대신 이러한 형광단을 각 개별 혈장에 부가하는 것은 동일 양의 신호를 초래할 것이다. 이것은 K가 알려지고 또 말기 수준이 형광단 부가만의 단일지점 측정으로부터 알려지면, 전체 곡선은 모든 이들 곡선이 이들 모든 개별 혈장에서 측정되는 바와 같이 각 개별 혈장에 대해 생성될 수 있음을 의미한다.
K가 알려지고 또 말기 수준이 측정되면, 효소 생성 곡선으로부터 유도된 신호 기질의 전환값은 보정될 수 있다. 본 발명은 각 개별 혈장에서 측정된 단일 지점 측정만을 이용하여 매질의 색의 영향에 대해 보정하는데 이용하는 것을 제안한다. 이러한 단일 지점 측정은 비선형에 대한 곡선을 보정하기 위해 사용될 수 있다. 말기 수준 측정은 계의 비선형을 보정하기 위한 가장 정확한 변수일 수 있지만, 곡선 내의 어떤 값은 전체 곡선을 기재하는데 사용될 수 있다. 예컨대 곡선의 신호값이 말기 수준의 50%를 내는 것으로 공지되면, 적절한 수학식은 잔류하는 곡선을 외삽(extrapolate) 및 내삽(interpolate)할 수 있을 것이다. 값이 말기 수준에 가까울수록 더 정확한 적합도로 될 것이다. 최고점을 향하여 꺾어지지 않는 검량 곡선의 경우 또는 계의 비선형이 그리 중요한 것으로 간주되지 않는 경우에서 단일 지점 측정은 색 만의 보정을 위해 여전히 사용될 수 있다. 후자의 경우에서 변수 K의 값은 사용되지 않는다.
혈장에서 트롬빈 생성의 측정은 혈전-지혈 계의 기능을 평가하기 위한 탁월한 도구이다. 상술한 바와 같이, WO 03/093831호는 응집되는 혈장에서 트롬빈 생성을 측정하는 방법을 개시한다. 이 방법은 널리 이용되고 있고 또 현재 기술에서 형광 검출을 포함한다. 혈장은 2개 샘플로 나뉘며, 1개 샘플에서 트롬빈 생성은 유발되고(TG-샘플) 또 다른 샘플에는 검량된 양의 α2M-IIa 활성을 부가하였다. 양쪽 샘플은 동량의 형광기질을 받으며 형광은 형광계로 측정된다. 검량곡선(도 1과 유사)은 내부 필터 효과 및 기질 소모로 인하여 꺾어진다. 이 검량 곡선으로부터, TG 샘플에서 형성된 시간 경과에 따른 트롬빈의 양이 산출될 수 있다:
a) 검량 곡선을 위로 똑바르게 하는데 필요한 변수는 TG 샘플로부터 유도된 형광 신호에 대해 보정을 실시하도록 이용될 수 있다. 도 8a 참조. 이 보정의 정확성은 검량 곡선의 더 오래 측정함에 따라 증가하며, 즉 측정이 곡선의 말기 수준을 향하여 더 가까이 갈수록 보정에 필요한 수학적 변수의 산출이 더 정확하게 된다. 이것은 실제로 곡선을 측정하는데 필요한 최소 시간이 적어도 20분임을 의미한다. Thrombinoscope BV (The Netherlands)(www.thrombinoscope.com)으로부터 입수할 수 있는 소프트웨어는 TG 곡선에서 각 형광의 양에 대해, 보정된 형광값을 산출한다. TG 샘플에서 형광의 측정값은 보정된 값으로 교체된다.
b) 검량 곡선으로부터 전환 곡선은 TG 샘플의 시간 경과에 따른 형과의 제1 유도에 의해 유도될 수 있고, FU/분(형광 단위/분)은 검량 곡선이 공지된 양의 트롬빈 활성을 이용하여 측정되었기 때문에 트롬빈의 농도에 도달하도록 곱해질 수 있다.
a)하에서 변수는 매질의 색 또는 혼탁도에 의존하지 않음을 알아야 한다. 매질의 색에 따른 신호 변화로 인하여, WO 03/093831호는 기재된 방법에서 검량 곡선은 트롬빈 생성이 일어나는 동일 혈장(TG 샘플)에서 (다른 샘플) 측정되어야 한다고 가르친다. 상기 신호는 혈장-색의 변화에 기인한 공여체 사이에 현저히 다르기 때문에, 검량 곡선은 각 개별 혈장에서 측정될 필요가 있다. b)하에서 언급한 전환 인자는 형광이 측정되는 혈장의 색에 따라 달라진다.
본 발명은 혈장 색 및 혼탁도에 대한 보정을 허용함으로써 WO 03/09831호에 개시된 트롬빈 생성 시험에 대한 개선을 제공한다.
본 발명에 따르면, 샘플에서 색 변이 및/또는 내부 필터 효과 및 기질 소모를 보정하기 위해 혈장 샘플에서 오직 1번의 측정이 필요하다. 이용된 형광계에서, 적합한 매질 중에서 1회의 측정은 검량 곡선의 특징을 확립하는데 필요하다. 일단 이들이 공지되면, 매질의 각 색에 대하여 오직 단일 지점 측정만을 실시할 필요가 있을 것이다. 단일 지점 측정은 예컨대 다양한 방식으로 실시할 수 있다:
2. 매질의 광학 밀도의 측정. 적절한 파장에서 측정된 광학 밀도에서의 변이 사이, 상이한 혈장과 검량곡선의 상이한 말기 수준 또는 상이한 말기 수준 또는 초기 기울기(도 6) 사이에는 양호한 관계가 존재한다. OD 측정은 수초 이하로 걸리며 일단 상기 관계가 확립되면 보정이 행해질 수 있다.
3. 형광단을 혈장에 부가할 수 있고, 측정된 형광의 양은 혈장의 색에 따라 다를 것이다. 형광의 양은 검량 곡선의 말기 수준 또는 초기 기울기에 대해 탁월한 측도를 제공한다. 형광단의 농도가 기질의 양과 동일하면, 측정된 값은 말기 수준과 동일할 것이다. 저농도의 형광단은 단일 지점 측정과 상이한 매질의 색에 기인한 형광단의 변이성 사이의 관계가 확립되는 한 적절할 수 있다. 형광단의 0 농도에서도, 즉 형광이 혈장의 측도이라도 측정된 값은 혈장의 색에 따라 다를 것이다. 그러나, 형광단의 부가는 보정의 정확도에 크게 영향을 준다. 형광단을 각 혈장에 부가하는 편리한 방법은 형광단을 형광성 기질 자체에 부가하는 것이다. 예컨대 형광단의 농도가 초기 기질 농도의 5%에 동일하도록 부가하면, 상기 측정은 0 시간에서 형광의 특정 옵셋(offset)을 나타낼 것이다. 이 옵셋은 신호가 어떻게 샘플의 색 및 혼탁도에 의해 영향을 받는지의 탁월한 측도일 것이며 또 이들 효과에 대해 보정하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 트롬빈 생성이 일어나는 아주 동일한 혈장 샘플이 검량에 대해 사용될 수 있는 큰 이점을 가질 것이다. 이것은 시험을 실시하는데 필요한 샘플의 최소양을 감소시킬 것이며 또 측정 처리양을 증가시킬 것이다.
4. 형광 공급원은 여기 광이 샘플을 통과하여 광원에 도달해야 하고 및/또는 방출광이 샘플을 통과하여 검출기에 도달해야 하도록 위치할 수 있다. 예컨대, 혈장으로 채워진 투명 큐벳은 형광단이 채워진 큐벳 옆에 위치할 수 있다. 방출광이 먼저 샘플을 통과한 다음 형광단 용액을 치면 측정은 샘플 색의 변이에 비례할 것이다. 형광단 용액 대신, 적합한 물질 또는 메시 또는 젤 또는 메이즈에 결합된 건조 형광 형광단과 같은 다른 형광 공급원 또는 혈장, 혈소판이 풍부한 혈장 또는 전혈이 부가되어 형광으로 제조된 흡수 물질이 사용될 수 있다. 마이크로티터 플레이트를 사용한 가능한 셋업은 도 7에 도시되어 있다. 이 실시예에서, 형광 공급원은 마이크로티터 웰 외부 및 하부에 위치할 수 있다.
본 발명은 앞서 기재한 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 유리하게는 적합한 용기 또는 기타 통상적인 포장 수단내에 하기 성분 중의 1 이상을 포함한다:
- 측정된 공지 농도의 효소 또는 신호 기질에 대하여 측정될 효소와 유사한 효소 활성을 갖는 공지 농도의 화합물.
- 효소 생성을 개시하기 위한 유발물질 시약. 특히, 이러한 유발물질은 전체혈액, 또는 혈소판이 풍부한 혈장 또는 혈소판이 부족한 혈장 또는 혈소판이 없는 혈장에서 트롬빈 활성을 측정하기 위해 사용되며, 적합한 유발물질은 정제된 또는 재조합 조직 인자, 인지질 소포, 미립자, 응집 인자, 콜라겐, 혈소판 활성화제, 트롬빈의 1 이상의 화합물을 함유하는 시약이다.
- 시험의 진단 값을 실시하기 위한 첨가제. 특히, 전체혈액, 또는 혈소판이 풍부한 혈장 또는 혈소판이 부족한 혈장 또는 혈소판이 없는 혈장에서 트롬빈 활성을 측정하기 위해 이러한 첨가제를 사용하며, 적합한 첨가제는 정제되거나 합성된 (재조합) 트롬보모듈린, 활성화된 단백질 C, 항혈전 약물, 항혈소판 약물, 정제되거나 합성된 (재조합) 응집 인자이다.
- 표준 및/또는 대조용으로 사용하기 위한 혈장.
- 신호 기질 또는 신호 생성 이탈기가 부가된 신호 기질을 함유하는 시약.
- 본 명세서에 기재된 방법에 의해 측정되는 바와 같은 효소 활성을 산출하기 위한 컴퓨터 메모리에 직접 로딩가능한 컴퓨터에서 운용하기 위한 소프트웨어 프로그램.
- 기구 매뉴얼.
- 효소 생성이 일어나는 매질 내 또는 외부에서 사용할 검량된 양의 형광단. 이것은 액체, 젤, 흡수성 물질, 옥수수 또는 형광이거나 또는 형광으로 제조된 물질의 형태일 수 있다.
- 상술한 화합물 또는 첨가제의 조합물을 함유하는 시약.
- 큐벳, 마이크로티터 플레이트 또는 측정을 편리하게 실시하는데 필요한 기타 물질과 같은 일회용 기구.
- 그의 존재없이는 실시되지 않게 하는 소프트웨어 프로그램에 의해 검출되는 동글(dongle). 소프트웨어가 실시되는 컴퓨터의 USB 포트에 삽입될 수 있는 이러한 동글은 복제 보호를 위해 작용할 수 있다.
상기 키트는 동결 건조된 시약을 적합하게 포함한다.
본 발명은 또한 이하의 실시예에 의해 더욱 자세하게 설명하지만, 어떠한 의미로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
도 1은 트롬빈 및 신호 기질을 함유하는 반응 혼합물로부터 시간 경과에 따른 신호를 도시한다.
도 2는 완충액 및 혈장에서 형광단(아미노 메틸 쿠마린, AMC) 농도 범위를 도시한다. 내부 필터 효과(IEF)로 인하여, 곡선은 꺾인다. 동일 형광단 농도에서 신호의 양은 실질적으로 2개의 상이한 매질에 대해 상이함도 알 수 있다.
도 3은 a) 검량선 곡선(구부려진 선, 흑색), b) IFE에 대해 보정된 동일 곡선(점선) 및 c) IFE에 대해 보정된 다음 기질 소비에 대해 보정된 동일 곡선(직선)을 도시한다. 원래의 곡선은 왼손 축의 값에 따라 플럿팅된다(형광 단위, FU). 점선 곡선은 형광과 도 2에 도시된 AMC 농도 사이의 관계로부터 산출된다.
도 4는 상이한 혈장에서 동일 농도의 트롬빈 활성을 측정한 것으로부터 얻은 곡선이다.
도 5는 곡선의 초기 기울과 이들의 최종 수준 사이의 관계를 도시한다.
도 6은 상이한 공여체의 혈장의 광학 밀도와 동일 혈장에서 측정된 검량 고선의 수준 사이의 관계를 도시한다.
도 7은 단일 지점 측정이 마이크로티터 웰 아래에 위치한 형광 광원으로부터 측정되는 셋업을 도시한다.
도 8a는 혈장에서 트롬빈 생성의 측정의 보정되지 않은 형광 값과 보정된 형광 값을 도시한다.
도 8b는 완충액에서 트롬빈의 측정, 점선은 IFE 및 기질 소비에 대한 신호 보정치를 도시한다.
도 9는 a2M-IIa의 아미드 분해성 활성에 대한 보정 전(얇은 선) 및 후(두꺼운 선)에서 본 발명에 따라 산출한 트롬빈의 값을 도시한다.
실시예
도 8a는 2/3rd 혈소판이 부족한 혈장, 416 μM의 형광성 트롬빈 기질 Z-G-G-R-AMC, 4μM의 프로코아굴란트 인지질 소포 및 5 pM 재조합 조직 인자를 함유하는 반응 혼합물로부터 측정된 보정되지 않은 형광 신호를 도시한다. 0 시간에서 반응은 형광 기질 및 칼슘을 시트레이트화된 혈장에 부가함으로써 개시된다. 점선은 내부 필터 효과 및 기질 소모에 대해 보정이 실시된 상기 반응에 대한 보정된 신호를 도시한다.
도 8b는 헤페스 완충된 염수 pH 7.35에서 100 나노몰의 트롬빈의 측정을 도시한다. 이 검량 곡선은 식 FU(t) = FU(0) + MAX*(1-exp(K*t))에 따라 수학적으로 적응된다. 트롬빈 생성이 일어나는 동일 혈장의 다른 샘플에서 기질 농도와 동일한 형광단의 농도의 단일 지점 측정은 하기 식을 이용하여 도 8a에서 형광 신호를 보정하기 위해 사용하였다:
FU_보정됨 = -SPM*LN[FU(O) + SPM - FU] + SPM*LN(SPM) + FU(O)
식 중에서,
SPM은 형광의 단일 지점 측정이고,
FU(O)는 반응의 0 시간에서 형광이며, 또
FU는 형광의 보정되지 않은 값이다.
상기 식을 이용하여 검량 곡선은 직선(8b, 점선)으로 변경될 것이다. 이 직선은 곡선의 초기 기울기와 거의 근사하다. 도 8a에서 보정된 곡선의 제1 도함수(도 9)는 FU/분으로부터 시간에 따라 나노몰 트롬빈으로 전달될 필요가 있다. 이를 위하여, 초기 기울기는 다음 식을 이용하여 단일 지점 측정 SPM으로부터 산출된다: 초기 기울기 = -SPM*K, 이때 K는 도 8b에서 측정으로부터 산출됨. 각 매질에서 오직 단일 지점 측정은 형광 신호의 비선형 거동에 대해서 뿐만 아니라 형광에서 속도 증가(FU/분) 및 트롬빈 농도 사이의 전달에 대해 보정될 필요가 있다. 마지막으로 트롬빈 생성 곡선은 트롬빈에 의해 유발되는 것이 아니라 α2M-IIa 착물의 아미드분해 활성에 의해 유발된 기질 전환 비율에 대해 보정될 필요가 있다.
이 실시예에서, 검량 곡선은 말기 수준에 도달할 때 까지 완전히 측정되었고, 이는 식 중의 SPM 값이 말기 수준과 동일함을 의미한다. 그러나, 측정을 완료할 필요는 없으며, 수학적 적응은 외삽에 의해 말기 수준의 합리적인 근사치를 만들 수 있다. 다르게는, 보정을 실시하기에 필요한 모든 정보는 완료하는데 오직 수 분이 걸리는 검량곡선의 초기 기울기 V(O)만을 측정함으로써 모아질 수 있으며, 또 한 검량 곡선이 측정된 동일 완충액을 함유하는 반응 혼합물에서 기질 농도와 동일한 형광단의 양의 측정을 실시한다. 이 측정은 거량 곡선의 말기 수준에서 형광의 양을 즉시 내는 FU-max 값을 얻을 것이다. 상기 기재된 변수 K는 -V(O)/FU-max와 동일하다. 이런 방식으로 K는 수분 내에 측정된다. 기질 농도와 정확하게 일치하는 형광단의 농도를 측정할 필요는 없으므로, 농도가 기질 농도에 더 가까울수록 전체 곡선이 만들 수 있는 설명이 더 정확하게 된다.
본 발명은 매질의 혼탁도 및 색과 같은 매질 독립적 변수 뿐만 아니라 매질 의존적 변수에 대해 보정되는 생물학적 매질의 샘플에서 단백질 분해 활성, 특히 혈액 또는 혈장 또는 혈소판이 풍부한 혈장에서 트롬빈 활성을 실시간 측정하는 편리한 시험 방법을 제공함으로써, 각 샘플에서 단일 지점 측정 및 완충액과 같은 적합한 매질에서 오직 1회 측정된 검량 곡선에 의해 샘플에서 단백질분해 활성을 안전하고, 우아하고 간단한 방식으로 측정하는 방법을 제공한다.
상기 시험 방법은 시험관내에서 트롬빈 활성의 시간 경과를 측정하는데 유용하며, 즉 그의 생성에 이어 샘플에서 활성 트롬빈을 측정하는데 유용하며, 이는 이러한 것이 혈소판을 함유하는 전체 혈액 또는 혈장 또는 혈소판을 갖지 않는 혈장의 응고 샘플에서 생기기 때문이다.
혈액 응고 결핍과 관련된 병리학적 조건을 검출 또는 모니터링하는 것을 포함하는 환자의 상태를 모니터링하는데 유용하다. 응고 과정과 상호작용할 수 있는, 특히 트롬빈 활성과 상호작용할 수 있는 약물을 스크리닝하는 것을 포함하는 기질의 스크리닝에 유용하다.
본 발명에 개시된 것은 모든 면에서 설명으로 예시된 것이며 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 나타내며, 동일한 의미 및 등가 범위 내의 모든 변화는 본 발명에 포함된다.

Claims (4)

  1. a) 소정 양의 트롬빈 활성을 함유하는 반응 혼합물에 신호 기질을 부가하는 단계, 이때 상기 신호 기질은 상기 트롬빈 활성에 의한 반응시 형성된 전환 생성물에 관련된 검출가능한 신호를 유발하며;
    b) 단계 a)에서 시간에 따른 신호의 곡선 특징을, 곡선의 초기 기울기가 산출되고 또 그 곡율로부터 예상을 할 수 있게 하는 수학적 과정에 의해 측정하는 단계;
    c) 트롬빈 생성이 일어나는 혈장에 신호 기질을 부가하는 단계, 이때 상기 신호 기질은 트롬빈과 반응시 형성된 전환 생성물에 관련된 검출가능한 신호를 유발하며;
    d) 동일 샘플, 또는 트롬빈 생성이 일어나는 동일 혈장의 다른 샘플에 형광 화합물을 부가하여, 신호 상에서 혈장에 의한 혼탁도 및/또는 색의 영향에 대한 측도로서 사용되는 검출가능한 신호를 제공하는 단계;
    e) 단계 d)에서 얻은 측정치를 단계 a)에서 얻은 측정치와 비교하여 트롬빈 생성이 일어나는 혈장의 혼탁도 및 색에 대하여 보정되는 관계를 확립하는 단계; 및
    f) 신호가 측정되는 계의 비선형성을 보정하도록 단계 b)에서 측정된 바와 같은 1)의 측정의 곡선을 이용하고 또 단계 c)에서 측정된 신호로부터 시간 경과에 따른 트롬빈의 농도를 산출하기기 위해 단계 b)로부터 유도된 초기 기울기를 이용 하는 단계를 포함하는,
    응고되는 혈장에서 시간에 따른 트롬빈의 경과를 측정하는 방법.
  2. 단백질분해 활성의 경과를 실시간 측정하는 방법으로서,
    상기 단백질분해 활성은 샘플에서 생겼다 사라지는 제1 생물학적 샘플에서 실제로 트롬빈 활성이며 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 제1 샘플에 프로테아제 활성화제를 부가하여 단백질분해성 활성을 생성하는 단계;
    b) 단계 a)에 신호 기질을 부가하여 상기 신호 기질이 생성된 단백질분해성 활성에 의한 반응시 형성된 전환 생성물의 양에 관련된 검출가능한 신호를 유발하는 단계;
    c) 단계 b)에 정의된 바와 같은 신호 기질 상에서 공지된 안정한 단백질분해성 활성을 갖는 수단을 완충액과 같은 적합한 매질에 부가하는 단계, 이때 일정한 공지된 안정한 단백질분해 활성을 갖는 수단은 알파2-마크로글로불린-트롬빈 착물, 스타필로코아굴라아제-프로트롬빈 착물, 감마 트롬빈 및 트롬빈으로 구성된 군으로부터 선택되며;
    d) 단계 b)에 정의된 바와 같은 동일 신호 기질을 단계 c)에 부가하는 단계, 이때 상기 신호 기질은 공지된 안정한 단백질분해 활성을 갖는 수단에 의해 반응시 검출가능한 신호를 유발하며;
    e) b)에서 측정된 신호 공급원을, 신호가 제1 샘플을 통하여 이동하여 신호 의 양이 상기 제1 샘플의 색 또는 혼탁도에 의해 영향을 받도록 적용하는 단계;
    f) c)에서 측정된 신호 양과 e)에서 측정된 신호 양 사이의 관계를 확립하는 단계;
    g) f)에서 얻은 상기 관계를 이용하여 c)에서의 시간 동안 신호 발생을 산출하여 제1 샘플에서 측정된다면 신호가 어떻게 되는지 예측하는 단계;
    h) g)에서 예상된 곡선을 b)에서 측정된 곡선과 비교하여 제1 샘플에서 시간 내에 단백질분해 활성의 경과를 유도하는 단계.
  3. - 측정된 공지 농도의 효소 또는 효소가 측정됨에 따라 신호 기질에 대하여 유사한 효소 활성을 갖는 공지 농도의 화합물,
    - 효소 생성을 개시하기 위한 유발 시약,
    - 시험의 진단 값을 실시하기 위한 첨가제,
    - 표준 및/또는 대조용으로 사용하기 위한 혈장,
    - 신호 기질 또는 신호 생성 이탈기가 부가된 신호 기질을 함유하는 시약,
    - 본 명세서에 기재된 방법에 의해 측정되는 바와 같은 효소 활성을 산출하기 위한 컴퓨터 메모리에 직접 로딩가능한 컴퓨터에서 운용하기 위한 소프트웨어 프로그램,
    - 기구 매뉴얼,
    - 효소 생성이 일어나는 매질 내 또는 외부에서 사용할 검량된 양의 형광단,
    - 효소 생성이 일어나는 매질 내 또는 외부에서 사용될 수 있는 형광 공급원 을 포함하는, 제1항 또는 제2항의 방법을 실시하기 위한 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 동결 건조된 시약을 포함하는 키트.
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