JP4928119B2 - 内因性トロンビン活性を自動的に測定するための方法 - Google Patents
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Description
∂ は、偏導関数、
α2MT(t)は、時間tにおけるα2−マクログロブリン/トロンビン複合体の濃度、
T(t)は、時間tにおけるトロンビンの濃度、および
Cは、トロンビンのα2Mに対する結合定数。]
1.当業者に周知の、時間の関数としてのトロンビン基質のターンオーバー速度の測定、および
2.本発明による、定量されるべき検体の内因性トロンビン活性の定量を可能にする、生のETP値の測定。
a)誘導相(lag phase)と名づけられた、第一相は、トロンビン生成活性化物質の添加をした時点t0に始まり、遅い反応速度を示すゆるやかな曲線で特徴付けられる。ここは、トロンビン生成が進行状態にある反応部分である。試験設計の如何によって、この誘導相は0〜30分間続く可能性がある。
b)指数相(exponential phase)と名づけられた、第二相は、誘導相の後に続き、速い反応速度を示す急勾配の上昇曲線で特徴付けられる。この相は、トロンビン生成速度が最大に達した反応部分を含み、そして、結局のところ、トロンビンの阻害速度もまた最大である。この相では、トロンビン基質は、遊離トロンビン、および、α2−マクログロブリン/トロンビン複合体(α2MT)の活性の両方により変換される。この相は遊離トロンビンがもはや存在しなくなる時まで継続する。
c)飽和相(saturation phase)と名づけられた、第三相は、継続して上昇するが指数相に比べればよりゆるやかな曲線で特徴付けられる。この相は、トロンビン基質の変換がもっぱらα2−マクログロブリン/トロンビン複合体(α2MT)の活性に起因している反応部分を含んでいる。この相は、総反応速度が継続的に直線的に上昇していく経過が予想されるように、反応速度または単位時間当たり遊離される指示物質の量が一定のままである、という事実により確認できる。
nは、時間枠の中の測定点の数、
iは、数値カウンター変数(numeric counter variable)
tiは、測定する反応速度の時間値を含む級数、および
Kiは、測定する反応速度の測定値を含む級数)
が、その終結点がtendに対応し、および、その開始点がtmin、または、所定の時間枠tmin〜tendの範囲内の任意の測定点に対応している、それぞれの可能な時間枠について作成される。
nは、飽和相の直線領域における測定点の数、
iは、数値カウンター変数
tiは、飽和相の直線領域における時間値を含む級数、および
Kiは、飽和相の直線領域における測定された総反応速度の測定値を含む級数)。
ti=T(ti)は、時間tiでのトロンビン反応速度値、
istartは、直線領域の開始の指標、
iendは、直線領域の終結の指標である)。
C0=0、および
iは、トロンビン反応速度値T(ti)に関する数値指標、
jは、反復に関する数値指標である)。
血漿検体の生ETP値の自動測定
EP0420332−B1に記載されたような、発色試験法をヒト血漿検体の生ETP値を測定するために用いた。
図1:本発明の方法を用いて測定された、正常血漿検体の、総反応速度(A)、ならびに、α2MTおよびトロンビンの反応速度のグラフによる表示。説明のために、総反応曲線(A)の3つの反応相のおおよその経過時間を書き込んだ(Iは誘導相、IIは指数相およびIIIは飽和相を意味している)。さらに、本願で用いた、tmin=650秒からtend=1078秒で、最良の直線性を有する総反応速度K(t)の領域が求められた、試験特有の時間枠を書き入れた(点線)。総反応速度の直線領域(破線)は、点istart=672秒およびiend=tend=1078秒の間として決められた。この直線領域の範囲内で、測定されたトロンビン反応速度に関する曲線Bは、X軸に対してほぼ平行に伸びている。生のETP値の378mUは、生の値の測定に関して2.9%の変動係数を有し、この直線領域の時間枠内で測定されたトロンビン値を平均化することにより測定された。
図2:本発明の方法を用いて測定された、経口抗凝固剤を投与されている患者の血漿検体の、総反応速度(A)、ならびに、α2MTおよびトロンビンの反応速度のグラフによる表示。生のETP値の136mUは、正常血漿検体の生のETP値と比較して著しく減少しており、これは患者が出血性凝固状態を有していることを示しており、総反応速度の直線領域で測定された、遊離トロンビンの反応速度の値を平均化することにより測定された。生の値の測定に関する変動係数は2.3%である。
図3:本発明の方法を用いて測定された、病理的な血漿検体の、総反応速度(A)、ならびに、α2MTおよびトロンビンの反応速度のグラフによる表示。生のETP値の1034mUは、正常血漿検体の生のETP値と比較して著しく上昇しており、これは患者が血栓性凝固状態を有していることを示しており、総反応速度の直線領域で測定された、遊離トロンビンの反応速度の値を平均化することにより測定された。生の値の測定に関する変動係数は0.7%である。
Claims (9)
- 時間の関数として、測定すべきトロンビン基質の代謝速度を用いる、凝固する血液または血漿の検体の内因性トロンビン活性(ETP)の測定方法であって、
a)トロンビン基質のターンオーバーの総反応速度の飽和相の直線領域を、所定の時間枠の範囲内で測定し、そして、次に、
b)トロンビンのα2−マクログロブリンに対する結合定数Cを、飽和相の直線領域における総反応速度の勾配Aを用いて反復測定し、ここで該勾配はα2MTの反応速度の勾配に対応しており、そして、次に、
c)α2MTの反応速度の値を測定して、総反応速度の対応する値から差引き、そして、次に、
d)飽和相の総反応速度の直線領域について測定した、遊離トロンビンの反応速度の値を平均化することによって、生のETP値を算出する、
上記の測定方法。 - 時間枠が、飽和相の範囲内で少なくとも3個の測定点を含む、請求項1に記載の方法。
- 測定した総反応速度の飽和相の直線領域を、回帰法を用いて測定する、請求項1または2に記載の方法。
- 終結点が所定の時間枠の終結点に対応し、および、開始点が所定の時間枠の開始点か、または、所定の時間枠の範囲内での測定点に対応している、それぞれの可能な時間枠について、ピアソン相関係数rの二乗値を作成する、請求項3に記載の方法。
- 相関係数riの二乗値の最大値を測定し、次いで、該最大値を有する時間枠を総反応速度の直線領域として選択する、請求項4に記載の方法。
- 測定された直線領域が定義された最小幅より小さい場合、予め定義された最小幅の枠を直線領域として選択する、請求項5に記載の方法。
- 飽和相の直線領域中での総反応速度の勾配Aを、直線回帰を用いて計算する、請求項1に記載の方法。
- トロンビンのα2Mに対する結合定数Cの変動による、総反応速度の勾配Aからのα2MTの計算された勾配の変動を最小にするために、適合計算の方法を用いる、請求項7に記載の方法。
- 最小二乗法を、適合計算の方法として用いる、請求項8に記載の方法。
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