ES2328453T3

ES2328453T3 - Ensayo funcional de la proteina s.

Info

Publication number: ES2328453T3
Application number: ES01994446T
Authority: ES
Inventors: Yong Dai; Ye Biqing; Kui Chen; Pau Bruguera; Shamay Tang; Daniel E. Lawson
Original assignee: Instrumentation Laboratory Co
Current assignee: Instrumentation Laboratory Co
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-19
Publication date: 2009-11-13
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: EP1344066A2; WO2002052276A3; WO2002052276A9; JP2004528534A; DE60139572D1; ATE439601T1; CA2432118C; CA2432118A1; AU2002246838B2; WO2002052276A2; EP1344066B1

Abstract

Un procedimiento para medir la actividad de la proteína S en una muestra de plasma, que comprende los pasos de: (a) mezclar una muestra de plasma de ensayo con plasma deficiente en proteína S, factor tisular recombinante, fosfolípido sintético, calcio y o bien: i) proteína C activada, o ii) un activador de la proteína C; midiendo el tiempo de coagulación de la muestra; y (b) comparar la medición de (a) con una curva estándar derivada del tiempo de coagulación de muestras de plasma que tienen un intervalo de actividades de la proteína S conocidas.

Description

Ensayo funcional de la proteína S.

Campo de la invención

La presente invención proporciona un ensayo funcional de la proteína S y procedimientos basados en la capacidad de la proteína S para prolongar el tiempo de coagulación del plasma en presencia de Factor Tisular Recombinante exógeno, de fosfolípidos sintéticos, calcio y o bien proteína C activada o un activador de proteína C.

Antecedentes de la invención

La proteína S es una proteína anticoagulante dependiente de la vitamina K que circula en el plasma a una concentración de aproximadamente 25 \mug/ml, con una vida media de aproximadamente 2 días. En el plasma normal, el 60% de la proteína S se enlaza con la proteína de enlace C4b (C4b-BP) no covalentemente en una proporción 1:1 con afinidad elevada. La proteína S que se enlaza con C4b-BP está inactiva. El 40% restante de la proteína S existe como proteína libre en el plasma y se cree que es la forma anticoagulante fisiológicamente activa que actúa en la superficie de la membrana celular como cofactor de la proteína C activada (PCA). La PCA degrada las formas activas de los factores procoagulantes V (FVa) y VIII (FVIIIa) mediante escisión proteolítica específica, reduciéndose con ella la generación de trombina y prolongando el tiempo de coagulación. La proteína S se enlaza con la PCA y actúa como cofactor e incrementa la velocidad de escisión de los factores Va y VIIIa. La proteína S también ejerce un efecto inhibidor directo en el complejo protrombinasa al enlazarse con el factor Xa y con el factor Va, y afectando negativamente de esa manera la activación de la protrombina.

La deficiencia en la proteína S puede ser hereditaria o adquirida. La deficiencia adquirida puede ser observada durante el embarazo, en la terapia anticoagulante oral, en el uso de anticonceptivos orales, en las enfermedades hepáticas, en recién nacidos, al igual que en otras afecciones clínicas. Dado que la proteína S es una proteína que depende de la vitamina K, su concentración disminuye durante el tratamiento con anticoagulantes orales. Con una vida media de dos días, la tasa de disminución de los niveles de proteína S es mucho menor que para la proteína C y el factor VII, que tienen vidas medias de varias horas. Un intervalo normal representativo para la proteína S total es del 70-140%. Considerando 25 \mug/ml como la concentración media, esto corresponde a un intervalo de 15-35 \mug/ml. Los niveles de proteína S pueden verse influidos por las hormonas sexuales, como los estrógenos. Las mujeres premenopáusicas tienen valores menores que los hombres y que las mujeres posmenopáusicas. Se encuentran valores medios de proteína S total y libre significativamente menores en las mujeres embarazadas (de 25 \mug/ml a 15 \mug/ml) y en mujeres que usan anticonceptivos orales (de 25 \mug/ml a 18 \mug/ml). La deficiencia adquirida y congénita de proteína C está asociada con un riesgo aumentado de trombosis (por ejemplo, trombosis en venas profundas), debido a una disminución del potencial anticoagulante de la sangre. Las deficiencias hereditarias de la proteína C incluyen la trombofilia
familiar.

La subclasificación actual de la deficiencia de la proteína S en tres tipos fue recomendada por la Comisión de Estandarización Científica de la Sociedad Internacional para la Trombosis y la Hemostasis (ISTH) en 1992. El tipo I se caracteriza por niveles bajos de proteína S total y libre con una disminución en la actividad de la proteína S funcional. El tipo II se caracteriza por niveles normales de proteína S total y libre con una disminución en la actividad de la proteína S funcional. El tipo III se caracteriza por niveles normales de proteína S total y un bajo nivel de proteína S libre, con una disminución en la actividad de la proteína S funcional.

Los ensayos antigénicos (inmunológicos) miden las concentraciones ya sea de proteína S total o de la libre, dependiendo del anticuerpo y/o del procedimiento usados. Los ensayos funcionales de la proteína S miden la actividad biológica de la proteína S. Dado que la proteína S enlazada con C4BP no tiene actividad anticoagulante, es importante conocer la concentración de la proteína S libre que está disponible para actuar como cofactor de la PCA. La proteína S libre puede ser determinada cuantitativamente de varias formas, por ejemplo puede precipitarse el complejo C4BP-proteína S con glicol de polietileno, y puede determinarse la concentración de la proteína S en el sobrenadante. Alternativamente, la proteína S libre puede ser medida directamente capturando proteína S libre con C4BP inmovilizada (por ejemplo, C4BP circunscrita a pocitos de un microplaca) y cuantificar con anticuerpo (Ensayo Coaliza® de proteína S libre, Chromogenix-Instrumentation Laboratory Company SpA, Milán, Italia).

La actividad de la proteína S no siempre guarda relación con los niveles de proteína S en una muestra de plasma. Por ejemplo, una concentración de proteína S libre obtenida usando un procedimiento antigénico se correlaciona bien con la actividad funcional para pacientes con los Tipos I y III, pero no con el Tipo II de deficiencia de la proteína S por varias razones. En primer lugar, los ensayos antigénicos miden tanto la forma carboxilada (activa) como la no carboxilada (inactiva) de la proteína S libre. En segundo lugar, los ensayos de proteína S funcional se complican por la presencia en el plasma tanto de las formas libre y compleja. Por ello, los ensayos antigénicos pueden sobrevalorar el nivel de la proteína S funcional. Por ejemplo, un análisis antigénico del plasma procedente de pacientes que reciben warfarina da valores más elevados que los obtenidos usando un análisis funcional. Por lo tanto, es importante que se lleven a cabo tanto el análisis funcional como el antigénico para investigar pacientes con riesgo de padecer enfermedades trombóticas para detectar la deficiencia de la proteína S (es decir, niveles deficientes de proteína S y/o actividad deficiente de la proteína S).

En algunos ensayos de actividad de la proteína S funcional, se determina el efecto de la proteína S libre como cofactor de la PCA. Estos ensayos son predominantemente coagulométricos y miden la prolongación del tiempo de coagulación debido a la actividad de la proteína S libre como consecuencia de la degradación del FVa y del FVIIIa por parte de la PCA. Tradicionalmente, los procedimientos de cofactor de la PCA para la detección de la actividad de la proteína S han incluido el tiempo de protrombina (TP), el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y los procedimientos basados en el factor Xa, descritos más abajo. Además, la proteína S libre también ejerce una actividad anticoagulante independiente de la PCA mediante el enlace con el factor Va, el factor Xa y el factor VIII. Se ha desarrollado un ensayo de la actividad anticoagulante independiente de la PCA de la proteína S en el que el tiempo de coagulación se determina en presencia y ausencia de un anticuerpo policlonal de la proteína S.

Los ensayos funcionales de la proteína S pueden basarse en el tiempo de protrombina (TP). La actividad de cofactor de la proteína S está confinada a la degradación dependiente de la PCA de los factores Va y VIIIa. En su origen, se desarrolló un procedimiento para la caracterización de la proteína S purificada, que fue seguido más tarde por un ensayo funcional para determinar la proteína S en el plasma (Walker (1984) Sem. Thromb. Hemost. 10:131-38). La actividad de la proteína S se determina mezclando una muestra de plasma con plasma deficiente en proteína S. el efecto estimulante de la proteína S en la actividad anticoagulante de la PCA se mide observando el tiempo de coagulación que sigue a la adición de tromboplastina (factor tisular) e iones de calcio a una muestra de plasma con y sin la adición de PCA exógena o de activador de la proteína C (APC). El APC puede ser aislado a partir del veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix, que es conocido con el nombre patentado Protac® C (Pentapharm, Basilea, Suiza). Se obtiene una resolución de 40-50 segundos entre 0 y 100% de proteína S.

Alternativamente, los ensayos funcionales de la proteína S pueden basarse en la prolongación del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) debido a PCA exógena o a APC exógeno.

La reacción TTPA estándar comienza añadiendo un agente de activación superficial (por ejemplo, caolín, sílice, ácido elágico) y un preparado fosfolípido a una muestra de plasma, logrando con ello una activación máxima del factor XI. A continuación, se añade calcio para activar la cascada de coagulación y se determina el tiempo de formación de coágulos.

En los ensayos de resistencia de la PCA (por ejemplo, COATEST y COATEST F), se llevan a cabo dos reacciones TTPA, una en presencia de PCA (o APC) y la otra en ausencia de los mismos. El resultado puede ser calculado ya sea como prolongación del tiempo de coagulación o como proporción entre los tiempos de coagulación en presencia o ausencia de de PCA (o APC). La reacción TTPA sin la adición de PCA (o APC) debería estar dentro del intervalo normal de 25-40 segundos.

Sin embargo, el valor de corte de todos los ensayos conocidos hasta la fecha varía entre laboratorios, instrumentos, manejo de reactivos y otras variables preanalíticas. Por esta razón, los ensayos de TTPA y de TP requieren típicamente que se efectúe en paralelo una muestra normal de control. En tales casos, el tiempo de coagulación y/o la prolongación del tiempo de coagulación de la muestra del paciente se comparan con los de la muestra o muestras normales de control con contenido conocido de proteína S.

Otros ensayos de la proteína S incluyen los procedimientos basados en FXa, en los que la coagulación es desencadenada por el factor Xa en presencia de iones de calcio y de fosfolípidos. En su origen se usaba plasma sin diluir (Comp (1984) J. Clin. Invest. 74: 2082-2088). Esto se sustituyó más tarde por procedimientos para minimizar la interferencia por los niveles de protrombina en el plasma, permitiendo la disolución de las plasma del ensayo y proporcionando cerca de 100 segundos de resolución entre 0 y 100% de proteína S (Wiesel et al. (1990) Thromb. Res. 58:461-468). En una variante del procedimiento, la proteína S libre en el plasma del ensayo, en primer lugar, es adsorbida en un anticuerpo insolubilizado monoclonal de la proteína S (D'Angelo et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:1445-1454). También se ha usado el factor Xa como desencadenante en un sistema que utiliza componentes purificados (Dahlback (1986) J. Biol. Chem. 261:12022-12027).

En la patente U.S. Nº 5.726.028 se describe un procedimiento basado en el tiempo de protrombina. El ensayo usa Thromborel S®, un factor tisular/preparado fosfolípido procedente de la placenta humana y de activador de la proteína C. La proteína endógena C de la muestra es activada por el activador por el activador de la proteína C y forma con la proteína S complejos activos PCA/proteína S. La coagulación es inducida añadiendo iones de calcio, y los complejos PCA/proteína S resultantes demoran la formación de coágulos.

Sin embargo, este ensayo y otro (véase también EP-A-0 406 971) generalmente disponible usan extractos crudos de factor tisular y fosfolípido. Además, la proteína C activada, que es usada también en los ensayos, es obtenida activando una muestra de plasma que contiene proteína C con una activador crudo de proteína C, como, por ejemplo, un activador de veneno de serpiente. Como consecuencia de las impurezas presentes en estos reactivos crudos, los ensayos funcionales tradicionales de la proteína S sufren de una reproducibilidad y de una sensibilidad reducidas, así como de inestabilidad.

Por lo tanto, existente la necesidad de un ensayo reproducible, sensible, estable y funcional de la proteína S que, opcionalmente, no requiera comparación de los resultados del paciente con los resultados de uno normal.

Breve descripción de los dibujos

Los que anteceden y otros objetos, características y ventajas de la presente invención, al igual que la propia invención, se entenderán más plenamente con la siguiente descripción de las realizaciones preferidas cuando se lea conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra una curva ejemplar de calibración.

La Figura 2 muestra una comparación entre las mediciones de TP obtenidas usando el ensayo funcional y el ensayo antigénico.

Resumen de la invención

La invención versa en general acerca de un nuevo ensayo funcional de la proteína S y acerca de un kit que está basado en la capacidad de la proteína S exógena para prolongar el tiempo de coagulación en respuesta a APC o PCA exógenos. En el procedimiento del ensayo, se diluye una muestra de plasma de ensayo con plasma normal deficiente en proteína S, seguido por la adición de factor tisular recombinante (FTr), fosfolípido sintético (FLs) y activado con o sin proteína C purificada o recombinante (PCAp o PCAr) y sales apropiadas. A continuación, se determina la prolongación del tiempo de coagulación debido al APC o a la CPA exógenos, y es indicativa de la actividad de la proteína S en la muestra del ensayo. La prolongación del tiempo de coagulación obtenido para la muestra del paciente puede ser comparada con una curva estándar de la coagulación del plasma normal. Una prolongación insuficiente del tiempo de coagulación es indicativa de deficiencia en proteína S.

El FT es recombinante (por ejemplo, de conejo o humano). Preferentemente, el FT es relipidado con FL antes de añadirlo al reactivo del ensayo de la proteína S.

El FL es un FLs. En una realización preferida, el FL comprende 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (FC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (FS) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (FE). Preferentemente, la razón FC:FS:FE está en una proporción molar de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 a aproximadamente 5.

La PCA es preferentemente PCAr. Si se usa PCA exógena, es preferible que derive por activación de proteína C exógena mediante proteolisis con una enzima adecuada. Las enzimas preferidas son las que no activan ni influyen de otra manera en ningún otro factor del sistema de coagulación aparte de la proteína C. La trombina es particularmente preferida. También preferidos son los activadores de la proteína C procedentes del veneno de serpientes, como, por ejemplo, Agkistrodon contortrix contortrix, Agkistrodon bilineatus o Agkistrodon halys halys.

En realizaciones en las que el tiempo de coagulación se observa cromogénicamente, por ejemplo, puede añadirse un sustrato cromogénico para un componente de la cascada de coagulación influido por la actividad del cofactor PS para que la trombina facilite la determinación cromogénica.

Preferentemente, el plasma deficiente en PS, el FT y la PCA derivan de un origen mamífero, como, por ejemplo, una vaca, un cerdo, un conejo o un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para medir la actividad funcional de la PS dotado de un recipiente que contiene plasma deficiente en PS y uno o más recipientes que comprenden FTr, FLs, calcio, PCA o APC. El kit puede comprender también plasma de calibración para preparar una curva estándar o una muestra de plasma de control con una actividad conocida de la proteína S.

Descripción de las realizaciones preferidas

La invención proporciona un ensayo sensible de la proteína S (PS) funcional basado en la capacidad de la proteína S endógena para prolongar el tiempo de coagulación en respuesta a la PCA o al APC en un ensayo basado en el TP. Así, se añaden FT, FL, calcio y APC o PCA a una alícuota de una muestra del paciente, y se observan los tiempos de coagulación. El tiempo de coagulación se compara con una curva estándar de tiempos de coagulación de muestras de plasma que tienen actividades conocidas de la proteína S. El uso de FL sintético, de FT recombinante y de PCA activada purificada permite la optimización de la sensibilidad, de la reproducibilidad y de la especificidad del reactivo.

Los ensayos tradicionales de la proteína S funcional conllevan normalmente el uso de FT derivado de extracto pulverizado de cerebro y de FL crudo de origen vegetal y animal (patente U.S. Nº 5.726.028). Sin embargo, la proteína S endógena no puede prolongar significativamente el tiempo de coagulación cuando se usan estos reactivos, que son a menudo insensibles a los niveles de la proteína S. En la presente invención, los reactivos del ensayo son sensibles específicamente para la medición de la actividad de la proteína S y, por lo tanto, en lo sucesivo de alude a ellos de forma colectiva como reactivo de proteína S (PS).

En la Tabla 1 se muestran el contenido de un reactivo preferido de PS y los intervalos de concentración de los reactivos. El reactivo de PS contiene Proteína C Activada purificada o recombinante (PCAp o PCAr), FL sintético (FLs) y FT recombinante (FTr) para evitar variación de lote a lote en la actividad y en la sensibilidad. El ensayo contiene PCA purificada, TFr y FLs. El uso de FLs y de FT recombinante evita la contaminación procedente del origen (por ejemplo, polvo del cerebro), y proporciona y procedimiento de fabricación mucho más sencillo y más controlable. Las cantidades de FT y de FL en el reactivo de PS requeridas por los ensayos desvelados son menores que las requeridas para los ensayos tradicionales de TP.

La PCA puede ser genera activando la proteína C de plasma exógeno o endógeno con activador de veneno de serpiente (por ejemplo, Protac®), lo que lleva mucho tiempo y puede también resultar en una activación insuficiente o variable de la PCA (por ejemplo, de lote a lote). Alternativamente, la proteína C exógena puede ser activada usando trombina, tal como se describe en el Ejemplo 4.

El reactivo de PS de la invención contiene preferentemente PCA purificada para eliminar el paso de activación externa y para simplificar el ensayo. El uso de PCA purificada (PCAp) garantiza que los niveles de PCA sean constantes de ensayo a ensayo. La PCAp adecuada puede ser purificada a partir de un origen mamífero, como, por ejemplo, un ser humano, un bóvido, un suido, un équido y un conejo.

Alternativamente, el activador de la proteína C (APC) es usado en el ensayo para activar la proteína C endógena. La concentración del APC se escoge para que sea generada una prolongación adecuada del tiempo de coagulación en el plasma por el APC exógeno. Una prolongación adecuada del tiempo de coagulación (en comparación con el tiempo de coagulación en ausencia de APC) es aquella en la que, sobre la base del tipo de aparato usado, permite que se detecten diferencias significativas con respecto a plasmas normales. El tiempo de prolongación es preferentemente de al menos aproximadamente un 25%, 50% o 75%, en particular preferentemente de al menos aproximadamente un 100%, o aproximadamente un 200%.

El Factor Tisular (FT, también denominado tromboplastina) es la proteína responsable de desencadenar la coagulación de la sangre en los ensayos pasados en el TP. Es una proteína integral de membrana que, para alcanzar una actividad óptima, debe ser incorporada en las vesículas fosfolipídicas. El FT recombinante (FTr) puede ser obtenido de un origen mamífero, como, por ejemplo, un ser humano, un bóvido, un suido o un équido. El FT preferido es el FT recombinante de conejo, como el descrito en la Patente U.S. Número 5.858.724 o 6.100.072. El FT recombinante puede ser obtenido, por ejemplo, por transcripción y traslación in vitro. Alternativamente, podría usarse FT purificado natural. El FT puede ser purificado conforme al procedimiento proporcionado en el Ejemplo 2. En una realización preferida, el reactivo de PS se prepara con FTr que ha sido relipidado con FLs.

El fosfolípido sintético (FLs) puede prepararse, por ejemplo, usando procedimientos estándar de síntesis orgánica. El FLs de la invención es preferentemente una mezcla de tres lípidos: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (FC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (FS) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (FE). En una realización preferida, la proporción molar FC:FS:FE es de aproximadamente 3: aproximadamente 4: aproximadamente 5.

El FLs usando para la relipidación de FT antes del ensayo de la proteína S se preparó mediante un procedimiento de extrusión. En este procedimiento, el FLs es obligado a pasar o es extrudido a través de dos membranas diferentes (tamaños de poro de 0,45 \mum y de 0,1 \mum) secuencialmente y es hecho pasar reiteradamente a través de una membrana de 0,1 \mum para formar vesículas o micelas lipídicas. Alternativamente, el FL puede ser tratado mediante un procedimiento de solubilización con detergente, en el que los FL son disueltos en detergente para formar vesículas o micelas lipídicas sueltas. A continuación se añade FT recombinante, y este se incorpora a las vesículas. Luego se elimina el detergente, lo que hace que la vesícula se contraiga o encoja, haciendo que el FT se intercale entre moléculas de FL. Con ello, el FT queda expuesto al exterior de la vesícula.

El ensayo de la proteína S de la invención conlleva mezclar entre sí el plasma del ensayo, plasma deficiente en PS, diluyente de factores y un reactivo de ensayo de PS que comprende FT, FL y PCA o APC (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5). Las interferencias analíticas potenciales son minimizadas diluyendo la muestra del ensayo aproximadamente veinte veces con plasma deficiente en PS y diluyente de factores, para que el ensayo sea específico para la proteína S. Los resultados del ensayo son lineales en todo el intervalo del 5%-150% de la actividad de la proteína S. La variación de las curvas de calibración es pequeña, con un coeficiente de variación (CV) < 3% a lo largo de un periodo de 2 semanas. El ensayo es reproducible, con un CV < 3% dentro de la tanda y un CV < 5% entre tandas para las muestras normales, y CV < 5% dentro de la tanda y un CV < 8% entre tandas para muestras anormales (PS < 30%) (Figura 1).

La especificidad del ensayo fue demostrada mediante una buena correlación entre la PS funcional y la PS antigénica en muestras normales y de pacientes (pendiente = 0,971, intercepción = -0,107 y r = 0,932) (Figura 2). Se llevó a cabo un ensayo antigénico para determinar la concentración de la PS libre conforme a los procedimientos estándar (por ejemplo, Coaliza). Los ensayos funcional y antigénico de la proteína S dieron una recuperación de la proteína S comparable en las muestras de resistencia de la PCA, lo que indica que la resistencia de la CPA no interfiere en el ensayo funcional.

La prolongación del tiempo de coagulación puede ser medida de diversas maneras (por ejemplo, fotométrica o cromogénicamente). Cuando la coagulación se mide cromogénicamente, puede añadirse al ensayo un sustrato para un componente de la cascada de coagulación que se ve influido por la actividad de la proteína S. Un sustrato cromogénico ejemplar sería un sustrato para la trombina (por ejemplo, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA-2HCl; MW 625.6; S-2238, Chromogenix).

La elevada sensibilidad, la especificidad, la reproducibilidad y la sencillez hacen que este ensayo sea adecuado para la automatización en los analizadores de coagulación (por ejemplo, IL Coagulation o el Sistema ELECTRA, de Instrumentation Laboratory) conforme a los procedimientos conocidos de la técnica, por ejemplo, para el análisis de la deficiencia de la proteína S congénita o adquirida. Además, el ensayo permite el uso de curvas de calibración para determinar la actividad de la proteína S.

Ejemplificación Ejemplo 1 Preparación de fosfolípidos por extrusión

Se prepararon por extrusión micelas de FL. En este procedimiento, se suspenden en primer lugar FL en una solución tampón salina para dar vesículas grandes multilamelares. Se hace pasar a continuación a la solución de las vesículas, por ejemplo, 0,5-1,0 mls, a través de una membrana de policarbonato de 0,45 \mum y se la hace pasar de forma reiterada a través de una membrana de policarbonato de 0,1 \mum seis veces. El resultado son vesículas unilamelares de tamaño uniforme, de aproximadamente 100 nm de diámetro. El procedimiento de extrusión se lleva a cabo usando, por ejemplo, un Extrusor LiposoFast-100 (Avestin, Inc., Ottawa, Canadá). El LiposoFast-100 es un extrusor de presión mediana que usa gas comprimido (por ejemplo, nitrógeno) a hasta 4,14 MPa para presurizar el cilindro de muestras y obligar al material de partida a que atraviese la membrana. El FL extrudido en añadido entonces al FT, que se adhiere al exterior de la vesícula lipídica.

La extrusión puede llevarse a cabo conforme a los procedimientos estándar o conforme a las recomendaciones del fabricante, por ejemplo el procedimiento de http://tf7.org/methods.html - James H. Morrissey, Departamento de Bioquímica, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801, EE. UU.- como sigue:

1.: Dispensar un total de 2,6 \muM de fosfolípidos (FL) en un tubo de ensayo de vidrio.

2.: Usando una campana de ventilación, secar la mezcla de FL bajo una suave corriente de nitrógeno o de argón. Cuando esté seca, centrifugar en Speed-Vac durante 60 minutos adicionales a un vacío elevado para eliminar todo cloroformo residual.

3.: A los FL secos, añadir 2,6 ml de una solución de HBS a temperatura ambiente y cubrir el extremo del tubo con "parafilm". Dejar reposar 1 hora a temperatura ambiente.

4.: Centrifugar el tubo vigorosamente para resuspender completamente los FL. El resultado debería ser una suspensión lechosa y uniforme. Se puede contribuir al proceso de resuspensión congelando y descongelando la suspensión múltiples veces (hasta diez veces).

5.: Cargar 0,5 ml de la suspensión de lípidos en una de dos jeringas de vidrio (que contiene un filtro de 0,45 \mum) de la máquina LiposoFast y fijarla al conector Luer a un lado del dispositivo. Cerrar la otra jeringa (vacía) y fijarla al conocer Luer al lado opuesto del dispositivo.

7.: Presionar la jeringa cargada para que todo su contenido pase a través del filtro y se introduzca en la jeringa opuesta. Cambiar los 45 \mum a 0,1 \mum. Repetir este proceso alternativamente con las dos jeringas un total de 7 pases. Es esencial que se emplee siempre un número impar de pases, para que el producto final acabe en lo que era en su origen la jeringa vacía. Esto garantizará que ninguna de las vesículas multilamelares iniciales contamine el producto final.

8.: Retirar el producto final y repetir los pasos 6 y 7 para el resto de la suspensión fosfolípida sin procesar, hasta que toda la suspensión haya sido procesada.

9.: Almacenar el producto final a 4ºC. El resultado es una suspensión uniforme de vesículas unilamelares (de aproximadamente 100 nm de diámetro) que contiene un total de 1 mM de fosfolípidos en HBS.

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Ejemplo 2 Purificación del FT de los lisatos celulares

El factor tisular (FT) es purificado de los lisatos celulares usando el siguiente procedimiento. Las células que producen FT son lavadas con TBS y resuspendidas a 2 \times 10^{7}/ml en TBS con un contenido de Triton-X 100 al 0,25%, 10 \mug/ml de inhibidor de la tripsina derivado de la soja, y 1 mM de EDTA. Tras la incubación durante 30 min a 4ºC, se eliminan los detritos celulares centrifugando durante 20 min a aproximadamente 5000\times g a 4ºC. El lisato clarificado es diluido 2,5 veces con TBS para reducir la concentración de Triton a 0,1% y es pasado por una resina de inmunoafinidad que contiene un anticuerpo monoclonal covalentemente ligado dirigido contra el FT. El lecho de resina se lava con de 2 a 3 veces el volumen del lecho de TBS + 0,1% de Triton-X 100, de 2 a 3 volúmenes de Tris 20 mM, pH 7,5, 0,5 M de NaCl, 0,1% de Triton-X 100 y, finalmente, de 2 a 3 veces el volumen del lecho de NaCl 0,5 M, 0,1% Triton-X 100. Las fracciones recogidas después de que el tampón se cambió a glicina son neutralizadas inmediatamente con un volumen apropiado de Tris 1 M, pH 8. Se encuentra FT en esas fracciones rodeando inmediatamente el punto en el que cambia el pH del efluente de columna. Las fracciones que contienen FT son juntadas y dializadas contra 20 mM de Tris, pH 8, 0,1% de Triton-X 100, y concentradas enlazando el FT con una columna de DEAE Trisacryl de volumen de lecho pequeño (IBF Biotechniques, Columbia, Maryland). El Triton X-100 es sustituido con CHAPS (Calbiochem) lavando el lecho de resina con al menos 10 volúmenes del lecho de 20 mM Tris, pH 8 que contiene 10 mM de CHAPS. El FT es eluido con un único paso de 0,5 M de NaCl en 20 mM de Tris, pH 8, 10 mM de CHAPS.

Ejemplo 3 Relipidación del factor tisular

Un procedimiento preferido de relipidación es como sigue: Se reconstituyen 66 g de FLs con 44,4 ml de CHAPS de 100 mM en tampón. Los FLs se mezclaron a 30-37ºC hasta que se disolvieron por completo. Los FL se transfirieron a un recipiente con cámara exterior y revestimiento de PVFD y se aclaró el recipiente con un tampón de 2\times su volumen (400 ml). Se añadieron 100 ml de CHAPS/BGG de 20 mM al recipiente con revestimiento de PVFD y se mezclaron a 200-400 RPM durante 5-10 min, evitando un exceso de espuma. Se descongeló rápidamente FT recombinante y se añadió a los FL. El tampón restante fue añadido a la mezcla de FT/FL. La mezcla de FT/FL fue incubada durante 55-65 min a 27-33ºC con un agitador de varilla a 200-400 RPM. Se lavó resina XAD-6 con tampón y repartida en 6 alícuotas. Una alícuota de la resina fue filtrada al vacío y añadida a la mezcla de FT/FL. La mezcla de FT/FL fue incubada con mezcla usando un agitador de varilla a 200-400 RPM durante 2 horas +/- 15 min a 27-33ºC. Se añadieron alícuotas adicionales de resina a la mezcla de FT/FL. Tras la adición de la 4ª alícuota, la mezcla de FT/FL se quedó mezclándose durante la noche a 27-33ºC. En el día 3, se añadieron las alícuotas restantes de resina y la mezcla de FT/FL se filtró por una serie de Malla de NYTEX de 250 de 250 \muM, 2-10 y filtros de 0,22 \muM, y se mezclaron durante 15 min.

Ejemplo 3 Relipidación del factor tisular usando detergente

Esta técnica para incorporar FT en vesículas de FL usa el detergente dializable aniónico n-octil-beta-D-glucopiranósido (octilglucósido) (Calbiochem Corp., La Jolla, California) (http://tf7.org/methods.html; Neuenschwander et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:21489-21492) (véase también la Patente U.S. Nº 6.203,816, el contenido de la cual se incorpora en el presente documento por referencia).

En este procedimiento, se disuelven tanto los FL como el FT en octilglucósido formando micelas mixtas. Dado que el octilglucósido tiene una elevada concentración crítica de micelas (CCM = 20 a 25 mM), puede eliminarse con facilidad de las soluciones mediante diálisis. Según se extrae el octilglucósido mediante diálisis, los fosfolípidos se organizan en vesículas unilamelares. El FT se incrusta en estas vesículas gracias a su dominio periférico de membrana única, ubicado cerca del término C de la proteína. Típicamente, aproximadamente del 50 al 80% de las moléculas de FT miran hacia fuera en estas vesículas. El resto de las moléculas de FT miran hacia dentro y, por lo tanto, son incapaces de interactuar con el factor VII/VIIa (Neuenschwander et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:21489-21492). Para obtener FT relipidado que no esté contaminado con detergente, es preferible usar soluciones madre que contienen un detergente dializable como CHAPS u octilglucósido, en vez de Triton. Los FL es solución acuosa están sujetos a la oxidación. Por esta razón, una vez que el FT ha sido relipidado, típicamente debería ser usado dentro de un lapso de aproximadamente 2 o 3 semanas. (Para algunas aplicaciones, pueden usarse aún preparados de FT más viejos con buenos resultados. Téngase presente, no obstante, que tales preparados pueden contener fosfolípidos oxidados.)

Para la mayoría de las aplicaciones, la actividad del FT es máxima cuando las vesículas contienen 20% mol de fosfatidilserina o menos, de modo que, normalmente, no hay razón alguna para superar este nivel. Nótese que el factor tisular soluble (FTs) no puede incorporarse en los fosfolípidos; debería usarse en aquellos en los que el dominio periférico de membrana esté intacto. Pueden hacerse vesículas vacías sencillamente omitiendo el FT en el protocolo.

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Preparación de la solución de fosfolípidos en octilglucósido

1.: Para cada muestra, dispensar un total de 2,6 \muM de FL en un tubo de ensayo de vidrio, usando la proporción polar de FL (por ejemplo, 30% de FC, 40% de FS, 50% de FE) (Avanti Polar Lipid, Alabaster, Alabama).

2.: Secar la mezcla de FL bajo una suave corriente de argón o de nitrógeno. Si es posible, colocar el tubo con un ángulo, para que los FL formen una película delgada en el lado del tubo.

3.: Cuando el tubo parezca seco, centrifugar en Speed-Vac durante 60 minutos adicionales a un vacío elevado para eliminar todo cloroformo residual.

4.: Al tubo con los FL secos, añadir 400 \mul de una solución de OG/BHS recién preparada (100 mM de n-octil-beta-D-glucopiranósido en HBS (100 mM de NaCl, 20 mM de tampón Hepes/NaOH, pH 7,5, 0,02% (p/v) de azida de sodio (TA))). Centrifugar vigorosamente para disolver completamente los FL secos.

Procedimiento de relipidación

5.: Al tubo que contiene 400 \mul de solución de FL/octilglucósido, añadir la cantidad deseada de FT de membrana (preferentemente, disuelto en CHAPS u octilglucósido) y suficiente HBSA (HBS con 0,1% (p/v) de albúmina de suero bovino) para hacer que el volumen final sea 1 ml. Una proporción molar típica de FL a FT es de 8700:1; pueden usarse proporciones de hasta 50.000:1 por su extremo superior y de hasta 3.000:1 por su extremo inferior. El volumen final será de 1 ml.

6.: Mezclar bien e incubar la muestra durante 30 min a temperatura ambiente (TA).

7.: Dializar la muestra a TA contra tres cambios de HBS (24 horas cada uno, durante un total de 72 horas). Almacenar el producto final a 4ºC.

El producto final es aproximadamente 1 ml de FT relipidado que contiene aproximadamente 2,6 de fosfolípidos. Dado que la recuperación de la diálisis puede no ser del 100%, estas cantidades son solo aproximadas. Las concentraciones precisas del FT disponible y de los FL totales pueden determinarse llevando a cabo un análisis del FT expuesto (titrar con factor VIIa midiendo el aumento inducido por el FT en la actividad amidolítica VIIa) y un análisis del contenido de FL (Neuenschwander et al.).

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Ejemplo 4 Preparación de proteína C activada

En una realización preferida, la PCA se deriva por activación de la proteína C con trombina conforme a los procedimientos estándar. Por ejemplo, una fracción congelada de proteína C procedente de placenta humana (Pharmacia UpJohn) se filtra y se purifica por afinidad usando una columna Affigel a la que está ligado el anticuerpo monoclonal HPC-4 (específico para la proteína C humana) (Instrumentation Laboratory Company). La PC purificada por afinidad es eluida de la columna Affigel HPC-4 y vuelve a ultrafiltrarse. Se añade trombina purificada SP Sephadex C-50 a la PC purificada para activar la PC (PCA). Se hace pasar la PCA por una SP-Sephadex C-50 para eliminar la trombina. Se añaden CaCl_{2} y SAB al eluido que contiene la PCA purificada.

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Ejemplo 5 El ensayo de la proteína S

Se efectuó un ensayo de muestras de plasma humano para detectar la actividad de la proteína S en comparación con una curva estándar. En ensayo se llevó a cabo como sigue: Se recogieron nueve partes de sangre venosa recién extraída en una parte de trisodio citrato, y se eliminaron los glóbulos rojos mediante procedimientos estándar. Se mezclan 4 \mul de la muestra de plasma sanguíneo con 25 \mul de plasma deficiente en PS (1,0 ml de plasma humano del que se ha eliminado la proteína S), liofilizados y resuspendidos en 1,0 ml de H_{2}O), 51 \mul de diluyente de factores (0,85% de cloruro sódico, 0,1% de azida de sodio y 80 \mul de reactivo del ensayo de PS (15 mM de ácido libre HEPES, 18 mM de sodio HEPES, 5 g/l de albúmina de suero bovino, 140 mM de cloruro sódico, 10 mM de cloruro cálcico, 0,0067% de omadina sódica, 50 \muM de ciprofloxacina, 0,0667% de polibreno, 300 ng/l de factor tisular recombinante de conejo, 12,5 \muM de fosfolípido sintético (FC/FS/FE 3:4:5, por ejemplo, 9,66 \muM de FC, 12,9 \muM de FS, 16,1 \muM de FE), 4 mg/l de proteína C humana activada; pH 7,5) y se midió el tiempo de coagulación usando un instrumento de coagulación o un espectrofotómetro.

Para efectuar el ensayo y medir el tiempo de coagulación pueden usarse cualesquiera de entre varios instrumentos de coagulación (por ejemplo, el ACL, el ACL Futura o el ELECTRA; Instrumentation Laboratory Company, Lexington, Massachusetts). Dependiendo del tipo de máquina usada, puede generarse una curva de calibración y usarse para medir un número de muestras antes de que se deba generar otra curva de calibración. El instrumento está programado para que haga una curva de calibración a partir de mezclas diversas de plasma de calibración (plasma en el que los niveles del factor de coagulación son conocidos y que contiene aproximadamente un 100% de proteína S) y de plasma deficiente en proteína S (que contiene aproximadamente un 0% de proteína S). Las dos soluciones actúan como los dos puntos finales de la curva, y los puntos intermedios de la curva son generados mezclando diferentes cantidades relativas de los dos plasmas y midiendo su tiempo de coagulación. Por ejemplo, las disoluciones en serie de plasma de calibración con plasma deficiente en proteína S pueden generar muestras de plasma con aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80% o aproximadamente un 90% de actividad de la proteína S. Una vez que se han medido las muestras de la curva de calibración, se trazan gráficamente los tiempos de coagulación en función de la concentración de la proteína S. a continuación, los tiempos de coagulación de las muestras del ensayo son medidos y comparados con la curva para obtener la actividad de la proteína S. Como medida de control de calidad, el plasma de control de la proteína S, con una actividad predeterminada de la proteína S, es analizado junto con las muestras para garantizar que el ensayo se comporta de forma
precisa.

El análisis de los datos se lleva a cabo conforme a las especificaciones de la instrumentación. Por ejemplo, usando un instrumento ACL, ACL Futura o ELECTRA, los resultados son presentados automáticamente por el instrumento como % de actividad. Cada laboratorio debe establecer su propio intervalo normal. Para un instrumento ACL Futura o ELECTRA, una vez que se completa una tanda de calibración y se genera una curva estándar, el instrumento almacena la calibración para futuras tandas de pacientes.

Las concentraciones optimizadas y los intervalos de concentración adecuados de los ingredientes del reactivo de la PS se muestran en la Tabla I. Para evitar la posible influencia de la mutación del factor V de Leiden (APC-R) sobre los valores reales, las muestras de los pacientes con resultados fuera del intervalo normal deberían ser diluidas manualmente a 1:2 con plasma deficiente en proteína S y vueltas a analizar. El resultado es multiplicado luego por 2.

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TABLA I Concentraciones óptimas e intervalos de concentración de los reactivos del ensayo

1

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En la Figura 1 se muestra una curva ejemplar de calibración o estándar. Se sometió a ensayo una muestra de plasma de un paciente y se leyó un nivel funcional de la proteína S en la curva de calibración comparando el tiempo de coagulación de la muestra del paciente con el valor de la curva. La prolongación del tiempo de coagulación era proporcional a la actividad de la proteína S en la muestra de prueba.

En la Tabla II se muestra una comparación del rendimiento de tres instrumentos de coagulación. En este experimento, el plasma de control normal fue analizado contra plasma de control de la proteína S, y el % de la proteína S se determinó tanto dentro de la tanda como entre tandas. La correlación entre los sistemas ACL, ACL Futura y ELECTRA mostró una pendiente de 1,01, 1,02 y 1,03, respectivamente. Las tres máquinas lograron la linealidad para la actividad de la PS entre el 10% y el 150%. Estos resultados demuestran la precisión y la reproducibilidad del
ensayo.

TABLA II

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2

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La Tabla III muestra una comparación de los procedimientos de la invención con los ensayos de inmunoglobulina para las muestras de plasma procedentes de pacientes con diversas enfermedades. La columna 2 muestra el ensayo de la proteína S de la invención realizado en un instrumento ACL3000. La columna 3 muestra el ensayo instantáneo de la proteína S de la invención realizado en un instrumento Futura. La columna 4 muestra un ensayo de proteína S (utilizando FT bovino) realizado en un instrumento ACL3000. La columna 5 muestra los resultados usando un kit IL Test^{TM} de proteína S libre (látex-inmunológico). La columna 6 muestra los resultados usando un kit de ensayo Coaliza®. La columna 7 muestra la diferencia entre los valores obtenidos en la columna 3 menos los de la columna 2. La columna 8 muestra la diferencia entre los valores obtenidos en la columna 5 menos los de la columna 2. La columna 10 muestra la diferencia entre los valores obtenidos en la columna 6 menos los de la columna 2. La columna 11 muestra la diferencia entre los valores obtenidos en la columna 6 menos los de la columna 5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

3

Equivalentes

Por lo tanto, las realizaciones precedentes deben ser consideradas en todos los aspectos ilustrativas de la invención descrita en el presente documento, más que limitantes.

Claims

1. Un procedimiento para medir la actividad de la proteína S en una muestra de plasma, que comprende los pasos de:

(a): mezclar una muestra de plasma de ensayo con plasma deficiente en proteína S, factor tisular recombinante, fosfolípido sintético, calcio y o bien:

i): proteína C activada, o

ii): un activador de la proteína C;

\quad: midiendo el tiempo de coagulación de la muestra; y

(b): comparar la medición de (a) con una curva estándar derivada del tiempo de coagulación de muestras de plasma que tienen un intervalo de actividades de la proteína S conocidas.

2. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la curva estándar se prepara mezclando muestras de plasma que tienen un intervalo de actividades de la proteína S con plasma deficiente en proteína S, factor tisular recombinante, fosfolípido sintético, calcio y o bien:

(i): una proteína C activada, o

(ii): un activador de la proteína C; y

\quad: midiendo el tiempo de coagulación y trazando un gráfico del tiempo de coagulación con respecto a la actividad de la proteína S.

3. El procedimiento reivindicado en la reivindicación 1 o 2, en el que el factor tisular recombinante es factor tisular de conejo.

4. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que el fosfolípido sintético comprende 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (FC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (FS) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (FE).

5. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que la proporción molar de FC:FS:FE es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 a aproximadamente 5.

6. El procedimiento reivindicado en la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína C activada fue activada o bien por trombina o por veneno de serpiente.

7. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína C activada está derivada de proteína C recombinante.

8. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que uno o más del plasma deficiente en proteína S, del factor tisular recombinante y de la PCA están derivados de un origen mamífero del grupo constituido por una vaca, un cerdo, un conejo y un ser humano.

9. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que la variación de las curvas de calibración tiene un coeficiente de variación (CV) < 3% a lo largo de un periodo de o bien:

i): 2 horas; u

ii): 8 horas; o

iii): 2 semanas.

10. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que el ensayo tiene un coeficiente de variación (CV) < 3% dentro del lote.

11. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en el que el paso de medición es cromogénico o espectrofotométrico.

12. El procedimiento reivindicado en cualquier reivindicación precedente que además comprende el paso de medir el tiempo de coagulación de una muestra de plasma de control normal con actividad de la proteína S conocida y de comparar ese tiempo de coagulación con el tiempo de coagulación en el paso (a) o con la curva estándar en el paso (b).

13. Un kit para medir la actividad funcional de la proteína S en una muestra de plasma, comprendiendo dicho kit uno o más recipientes que contienen plasma deficiente en proteína S, factor tisular recombinante, fosfolípido sintético, calcio y o bien:

i): proteína C activada o

ii): activador de la proteína C.

14. El kit reivindicado en la reivindicación 13 que comprende además plasma de calibración que comprende aproximadamente un 100% de proteína S para preparar una curva estándar.

15. El kit reivindicado en la reivindicación 13 o 14 que además comprende plasma de control normal entre 40-50% de proteína S.