ES2586208T3

ES2586208T3 - Composición para la determinación de las características de coagulación de un líquido de ensayo

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Publication number: ES2586208T3
Application number: ES10711886.1T
Authority: ES
Inventors: Axel Schubert
Original assignee: CA Casyso AG
Current assignee: CA Casyso AG
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2016-10-13
Anticipated expiration: 2030-03-30
Also published as: CN102834722A; KR20130010483A; RU2012140236A; AU2010350041B2; EP2553470B1; WO2011120556A1; DK2553470T3; US20130102015A1; JP2013524176A; RU2016140878A; CA2792126C; EP2553470A1; AU2010350041A1; US20160244806A1; ES2797739T3; CA2792126A1; PT2553470T; CN102834722B; EP3002591A1; BR112012024841A2

Abstract

Un procedimiento in vitro para realizar un análisis viscoelástico en una muestra de sangre, que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de sangre; b) proporcionar un recipiente (1) que contiene una composición de diagnóstico que comprende al menos un activador de la coagulación; una sal de calcio, preferentemente CaCl2, en una cantidad suficiente para asegurar la recalcificación de la muestra de sangre; y un inhibidor de la heparina; en el que los componentes están presentes en una forma esencialmente seca y en una cantidad suficiente para realizar un único análisis viscoelástico de una muestra de sangre especificada, y en el que los componentes no están presentes en una mezcla de sustancias, sino que cada uno se incorpora en gránulos separados espacialmente; c) añadir la muestra de sangre a dicho recipiente (1), disolviendo de ese modo la composición de diagnóstico que contiene; d) poner el recipiente (1) en un aparato (4) adecuado para realizar un análisis viscoelástico; y e) realizar el análisis viscoelástico de dicha mezcla.

Description

DESCRIPCION

Composicion para la determinacion de las caracterlsticas de coagulacion de un llquido de ensayo 5 Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a composiciones de diagnostico para su uso en el analisis viscoelastico de un llquido de ensayo, y a un recipiente que comprende el mismo. La presente invencion ademas se refiere a un procedimiento de realization de un analisis viscoelastico en una muestra de sangre, y al uso de la

10 composicion de diagnostico en dicho procedimiento.

Antecedentes

[0002] La coagulacion de la sangre es un proceso complejo en el que la sangre forma coagulos solidos. Es 15 una parte importante de la hemostasia (la interruption de la perdida de sangre de un vaso danado) por el que una

pared del vaso sangulneo danado se cubre con un coagulo de sangre para detener la hemorragia y ayudar a la reparation del vaso danado. Trastornos de la coagulacion pueden producir un aumento de la hemorragia y/o trombosis y embolia.

20 [0003] En un individuo normal, la coagulacion se inicia en menos de 20 segundos despues de que se

produzca una lesion en el vaso sangulneo danando las celulas endoteliales. Las plaquetas inmediatamente forman un tapon hemostatico en el sitio de la lesion. Este proceso se denomina hemostasia primaria. La hemostasia secundaria sigue a continuation si los componentes del plasma denominados factores de coagulacion responden en una cascada compleja para formar filamentos de fibrina que fortalecen el tapon plaquetario.

25

[0004] La cascada de la coagulacion de la hemostasia secundaria tiene dos vlas, la via de activation por

contacto (anteriormente conocida como via intrlnseca) y la via del factor tisular (anteriormente conocida como via extrlnseca) que dan lugar a la formation de fibrina. Antes se pensaba que la cascada de la coagulacion consistla en dos vlas de igual importancia reunidas en una via comun. Ahora se sabe que la via primaria para la initiation de la 30 coagulacion de la sangre es la via del factor tisular. Las vlas son una serie de reacciones, en las que un zimogeno de una proteasa de serina y su co-factor glicoprotelna se activan para convertirse en componentes activos que entonces catalizan la siguiente reaction en la cascada. Los factores de coagulacion generalmente se indican por numeros romanos del I-XIII, con una minuscula "a" anexa para indicar la forma activada.

35 [0005] La fibrinolisis es el proceso en el que se descompone el coagulo de fibrina. El activador del

plasminogeno tisular (tPA) y la uroquinasa son los agentes que convierten el plasminogeno en plasmina activa, lo que permite que se produzca la fibrinolisis.

[0006] La detection del funcionamiento normal o disminuido de estos componentes de la coagulacion es 40 importante a fin de evaluar los trastornos de la hemostasia de los pacientes.

[0007] Se conocen varios procedimientos de medicion de las caracterlsticas de la coagulacion de la sangre. Algunos de dichos dispositivos intentan simular el flujo natural de la sangre en las venas y arterias de un sujeto vivo, mientras que otras tecnicas de medicion se realizan en volumenes de sangre estatica.

45

[0008] Una medicion precisa de la capacidad de la sangre de un paciente para coagular de manera oportuna y eficaz es crucial para ciertos procedimientos medicos y quirurgicos. La deteccion rapida y precisa de coagulaciones anomalas tambien es de particular importancia con respecto al tratamiento adecuado a administrar a pacientes que padecen trastornos de la coagulacion. A menudo, la dolencia de estos pacientes hace que sea

50 necesario administrar componentes de la sangre, anti-coagulantes, ciertos agentes fibrinollticos, agentes anti- plaquetarios, o compuestos que inducen los efectos inversos de dichos agentes. En estos casos, la dosis de tratamiento se puede adaptar al grado de un trastorno de la coagulacion determinado previamente.

[0009] Las mediciones de la coagulacion de la sangre son suministradas por varios dispositivos, por ejemplo 55 como se describe en los documentos (Estados Unidos 5.777.215), (Estados Unidos 6.537.819), o (Estados Unidos

5.777.215). Estos dispositivos miden las propiedades mecanicas del coagulo durante todo su desarrollo estructural. Estos sistemas se resumen bajo el termino "procedimientos viscoelasticos", ya que detectan continuamente propiedades viscoelasticas del coagulo de sangre durante su formacion y lisis.

[0010] Una medicion viscoelastica proporciona informacion acerca de varios parametros diferentes, por ejemplo, el tiempo entre la activacion de la coagulacion y la iniciacion del coagulo (tiempo de coagulacion, CT), la dinamica de la formation de coagulos (tiempo de formation del coagulo, CFT), la firmeza del coagulo (amplitudes A5-A30 y maxima firmeza del coagulo, MCF), o el grado de fibrinolisis (lisis maxima, ML).

5

[0011] Una serie de referencias describen instrumentos para medir las caracterlsticas de coagulacion de la sangre en base a movimientos mecanicos. Estos instrumentos controlan las propiedades elasticas de la sangre a medida que se induce su coagulacion en un entorno de baja cizalladura, es decir, en volumenes de sangre estatica. Los patrones de cambio en la elasticidad de cizallamiento permiten la determination de la cinetica de formacion del

10 coagulo, as! como la fuerza y la estabilidad del coagulo formado. La resistencia y la estabilidad del coagulo proporcionan informacion sobre la capacidad del coagulo para llevar a cabo el "trabajo de la hemostasia" (es decir, detener o prevenir la hemorragia anomala) y sobre la suficiencia de la interaction de las plaquetas y la fibrina en sangre. La cinetica de formacion de coagulos principalmente proporciona informacion acerca de la funcionalidad de los factores de coagulacion. El analisis de toda esta informacion proporciona resultados que son utiles para predecir 15 la hemorragia, para supervisar y gestionar la trombosis, o para controlar la fibrinolisis.

[0012] Sin embargo, puesto que el proceso de coagulacion consta de varios componentes interrelacionados, posteriormente se aplica el uso de activadores e inhibidores especlficos a fin de detectar mas especlficamente alteraciones de la hemostasia.

20

[0013] En consecuencia, los reactivos utilizados en el analisis viscoelastico constan de un activador inicial (por ejemplo, un activador de la via intrlnseca o de la via extrlnseca) y, opcionalmente, uno o mas inhibidores (por ejemplo, inhibidores de la fibrinolisis, inhibidores de la heparina, inhibidores de plaquetas) y/o uno o mas factores especlficos adicionales de la cascada de la coagulacion.

25

[0014] Opcionalmente se pueden anadir componentes adicionales:

- Calcio (CaCl2): El calcio se anade para la recalcificacion de la muestra. Se puede evitar que las muestras de sangre coagulen con varias sustancias anticoagulantes diferentes, como la heparina, el EDTA, y el citrato. Por lo general los

30 ensayos funcionales se realizan con sangre anticoagulada con citrato. El citrato compleja el calcio de la muestra de sangre de forma moderada. El calcio es necesario para el proceso de coagulacion, que esta implicado en la formacion del complejo y es un co-factor para la mayorla de los factores de coagulacion (por ejemplo, FI, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII, TF). Por lo tanto, la recalcificacion de la muestra es necesaria para asegurar la correcta coagulacion en la muestra, si la muestra se somete a citracion durante la extraction de sangre (mediante el 35 uso de un tubo de sangre que contiene citrato).

- Fosfollpidos: Varios complejos en la cascada de coagulacion son dependientes de fosfollpidos y, por lo tanto, se podrlan anadir fosfollpidos adicionales.

40 - Estabilizadores: Para la estabilizacion de los reactivos entre el momento de la production y el analisis (por ejemplo, albumina, gelatina)

[0015] Dependiendo de la finalidad del diagnostico, estos reactivos se pueden utilizar solos o en combination: por ejemplo, una medicion unicamente con activador intrlnseco en la muestra se puede combinar con

45 una medicion con activador intrlnseco y una cantidad suficiente de inhibidor de la heparina (por ejemplo, heparinasa) en la muestra para detectar la presencia de heparina en el llquido de ensayo; se aplica una combinacion de activador extrlnseco e inhibidor de plaquetas (por ejemplo, citocalasina D) en la muestra para determinar la actividad de fibrinogeno sin la contribution de las plaquetas en el llquido de ensayo.

50 [0016] En la literatura existe un concepto de reactivo para mediciones viscoelasticas (TEG modificado con

ReoPro: Wenker et al.: Thrombelastography, The Internet Journal of Anesthesiology, 2000, Volumen 1, Numero 3; (
http://www.ispub.com/ostialindex.php?xmlFilePath=journals/ija/volln3/teg.xml); Ruttmann et al.: Hemodilution Enhanced Coagulation Is Not Due to Platelet Clumping, Anesthesiology 2004; 101: A150; Recombiplastin- and ReoPro-modified TEG:
http://www.transfusionguidelines.org.uk/docs/pdfs/bbt_app-use_teg-sop-example.pdf; TF- and 55 Trasylol-modified TEG: Tanaka et al.: Evaluation of a novel kallikrein inhibitor on hemostatic activation in vitro, Thrombosis Research, Volumen 113, N.° 5, 2004, paginas 333-339) que se basa en la combinacion de reactivos activadores disponibles en el mercado destinados a otros ensayos, tales como el activador del tiempo de protrombina Innovin o Recombiplastin®, combinados con una solution de CaCl2 y farmacos a medida, tales como ReoPro® (abciximab) y Trasylol (aprotinina). Esto conduce a una baja normalization, muchas etapas de pipeteado y

muchas fuentes de error.

[0017] Hay un sistema de reactivos para mediciones viscoelasticas comercializado por Pentapharm, que se basa en reactivos normalizados, la mayorla de los cuales se ofrecen a los clientes en forma llquida, que el usuario

5 pipetea en la copa de ensayo utilizando procedimientos operativos normalizados. Esto normaliza su aplicacion; sin embargo, todavla requiere varias etapas de pipeteado para su analisis. Por ejemplo, para realizar un ensayo de FIBTEM junto con un ensayo de control Extem, el pipeteado de la sangre, la solucion de CaCl2, el activador extrlnseco y un inhibidor de plaquetas pueden dar lugar a la realizacion de un total de 8 etapas de pipeteado (incluyendo tres cambios de la punta durante un procedimiento de ensayo) y la necesidad de 3 reactivos diferentes 10 que deben ser manipulados por el usuario. Esto exige formacion que consume tiempo y es una posible fuente de errores. Hay otros sistemas de reactivos en el mercado, que se basan en una variedad de reactivos. Algunos de ellos son llquidos y se deben pipetear en la copa (por ejemplo, solucion de CaCh), algunos se secan en la copa de ensayo (tal como la heparinasa) y algunos se encuentran dentro de viales pequenos, en una cantidad destinada a un ensayo. Una caracterlstica de estos reactivos es que normalmente cada reactivo aun se proporciona solo, y por lo 15 tanto se requieren varias etapas al menos para ensayos que requieran mas de un reactivo activo.

[0018] En consecuencia, en el pasado se han realizado algunos esfuerzos para proporcionar un sistema reactivo simple para mediciones viscoelasticas de la sangre o de sus componentes:

20 - su secado directamente en la copa que toma el volumen de la muestra durante la medicion

- combinaciones llquidas estables de compuestos de los reactivos a la concentracion de trabajo

[0019] Uno de los defectos de la estrategia de secado de reactivos activos directamente en la copa de 25 ensayo es que estas copas normalmente estan fabricadas de plastico y son ligeras, lo que hace mas diflcil el llenado

de estas copas en llneas automatizadas de dispensacion de reactivos. Esto hace necesario etapas de llenado manuales o el desarrollo de equipos especializados, los cuales son caros. Otro inconveniente de esta estrategia es que los componentes activos o estabilizadores pueden interferir con la fuerza de adhesion del coagulo de sangre en las superficies de la copa, que es necesaria para llevar a cabo mediciones correctas. Por ejemplo, se ha demostrado 30 una menor adhesion del coagulo despues de la incubacion de una solucion de albumina en la copa (la albumina es un estabilizador tlpico utilizado para estabilizar todo tipo de protelnas en reactivos):

: Control Albumina al 1 %

: CT MCF ML CT MCF ML

Muestra 1: 139 62 0 136 41 66

Muestra 2: 123 64 2 119 47 85

Muestra 3: 121 65 0 130 42 79

Muestra 4: 133 63 0 135 34 79

Media: 129 63,5 0,5 130 41 77,25

SD: 8,5 1,3 1,0 7,8 5,4 8,0

Tabla 1: Resultados de las mediciones de INTEM con y sin incubacion previa con solucion de albumina.

35

[0020] Otra posible estrategia para simplificar la manipulacion de los reactivos es combinar los diferentes reactivos necesarios para un ensayo en fase llquida a su concentracion de trabajo. El principal problema en este caso es la interaccion de las diferentes sustancias que permanecen juntas durante un perlodo mas prolongado. Algunos componentes afectan negativamente a la estabilidad de los otros cuando permanecen juntos en fase llquida

40 a concentraciones mas altas; por ejemplo, el CaCl2 altera la estabilidad del reactivo del factor tisular en fase llquida con el tiempo.

[0021] Por otra parte, si estos reactivos combinados se deben proporcionar en una cantidad suficiente exacta para un ensayo, surgirla otro problema: En este caso, la porcion muy pequena de reactivo llquido puede adherirse a

45 partes del recipiente del reactivo o a la tapa y por tanto no se mezclarla suficientemente con el llquido de ensayo cuando se realice el analisis.

[0022] Una estrategia propuesta para resolver los aspectos mencionados fue desvelada por Kolde et al., en la solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0071604. En esta solicitud, se presenta un sistema de copa para

50 analisis viscoelasticos, en el que el extremo inferior de la copa esta dividido en varias camaras de reactivos. Esto permite colocar los reactivos de forma independiente en las diferentes camaras, sin mezclarlos y posteriormente

liofilizar los reactivos.

[0023] Sin embargo, las desventajas de esta solucion incluyen la necesidad de un proceso de pipeteado muy preciso, ya que las camaras de reactivos independientes son muy pequenas y ademas el problema de que las gotas

5 de reactivos aun se pueden mezclar antes de la liofilizacion por las vibraciones presentes en la llnea de llenado de reactivo. Otro problema es el posible secado al aire de las pequenas gotas de reactivo durante el tratamiento en condiciones ambientales antes de que comience el proceso de liofilizacion. Una vez mas, esta presente el problema de manipular de forma automatica el pequeno recipiente de plastico, y por tanto muy ligero, con llneas de llenado de reactivo convencionales.

10

[0024] Las mayorla de los procedimientos de ensayo de coagulacion de uso rutinario en laboratorio solo miden el tiempo desde la adicion de un activador a la muestra hasta que se puede detectar la primera formation inicial de un coagulo de fibrina (= tiempo de coagulacion). Se detienen en este punto y no se realiza ninguna medicion mas alla. Esto tiene las consecuencias de que en estos procedimientos no es necesaria una adhesion

15 firme de la sangre a las superficies de la celda de medicion. Por consiguiente, la variedad de analizadores y reactivos disponibles para la evaluacion de los tiempos de coagulacion con dichos procedimientos no tiene que gestionar los problemas especlficos relacionados con las mediciones viscoelasticas.

[0025] El documento EP 0 972 203 describe un reactivo para la determination de la aPTT, que comprende al 20 menos una protelna de la coagulacion, fosfollpidos y un activador de la coagulacion intrlnseca en forma de co-

liofilizado. Sin embargo, en este caso surge el problema de que todos los componentes necesarios para realizar el analisis estan en contacto inmediato entre si. Por lo tanto, se pueden producir problemas de estabilidad o incompatibilidades a largo plazo al usar sustancias de esta forma.

25 [0026] El documento WO 2008/093216 describe una composition de diagnostico para su uso en el analisis

viscoelastico de un llquido de ensayo y un recipiente que comprende el mismo. La composicion comprende al menos un activador de la coagulacion, y, opcionalmente, CaCl2 y uno o mas inhibidores y/o componentes de la coagulacion. La composicion esta presente como mezcla esencialmente seca de todos los componentes y en una cantidad suficiente para realizar un unico analisis viscoelastico de una muestra de sangre o plasma especificado. Sin 30 embargo, no se desvela que los constituyentes se incorporen cada uno en granulos separados espacialmente.

Resumen de la invention

[0027] Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion de diagnostico que 35 permita un procedimiento seguro, reproducible y facil de usar para diferentes ensayos en sistemas viscoelasticos. Un

objeto adicional de la presente invencion es proporcionar una composicion de diagnostico que este adaptada especlficamente para un unico analisis de una muestra de sangre y que tenga una estabilidad de reactivos superior, con respecto a composiciones de la tecnica anterior. Aun un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un procedimiento de diagnostico que proporcione resultados fiables y reproducibles, sea facil de 40 manipular y proporcione un sistema normalizado para la determinacion de las caracterlsticas de coagulacion de una muestra de sangre. Un objeto adicional de la invencion es proporcionar una composicion de diagnostico del tipo anterior, que tenga una estabilidad mejorada a largo plazo.

[0028] Estos objetos se consiguen por el procedimiento de la reivindicacion 1, la composicion de la 45 reivindicacion 6, y el recipiente de la reivindicacion 13.

[0029] Las realizaciones preferidas se exponen en las reivindicaciones dependientes.

[0030] Al usar la composicion de diagnostico de la invencion, se pueden realizar los ensayos como sigue: Se 50 anade un volumen definido de una muestra (por ejemplo, sangre entera, plasma sangulneo etc.) directamente en un

recipiente 1 que contiene la composicion de diagnostico. Despues de disolver la composicion en la muestra de sangre, la mezcla resultante se pipetea del recipiente 1 en la copa de medicion 2 de un aparato de medicion 4. A continuation, la copa 2 se pone en una position tal que el alfiler 3 se sumerge en el llquido en la copa de ensayo (cp. Fig. 2).

55

[0031] Por lo tanto, el usuario solo necesita 4 etapas de pipeteado para llevar a cabo cada ensayo (en el sistema llquido de la tecnica anterior hay hasta 8 etapas, vease mas arriba) y no es necesario un cambio de la punta de la pipeta.

[0032] Por lo tanto, es evidente que el presente sistema para la determinacion de las caracterlsticas de coagulacion de una muestra de sangre se puede manipular mas facilmente, con lo que la probabilidad de errores es mas pequena, que pueden ser debidos a una llnea de accion imprecisa por un operario (potencialmente menos experimentado).

5

[0033] Segun la invencion, los componentes no estan presentes en una mezcla de sustancias, sino que cada uno se incorpora en granulos separados espacialmente. Esto permite una mejora de la estabilidad de la composicion a largo plazo sin deterioro de sus otras caracterlsticas.

10 [0034] De ello pueden derivarse otras ventajas como, por ejemplo, una mayor reproducibilidad de los

resultados a alcanzar y, por lo tanto, un mayor grado de normalizacion.

Breve descripcion de los dibujos

15 [0035] Otras caracterlsticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes a partir de una descripcion

de las formas de realization con referencia a las figuras.

[0036] En las figuras:

20 La Figura 1 es un diagrama ejemplar que muestra una medicion trombo-elastometrica tlpica;

La Figura 2 muestra un aparato de medicion 4 para el analisis tromboelastometrico;

La Figura 3 es una ilustracion de una copa de medicion 2 de un aparato de medicion 4 de la tecnica anterior;

25

Las Figuras 4A, B, C son vistas esquematicas en section transversal de tres formas de realizacion preferidas de un recipiente 1 de la presente invencion.

Descripcion detallada de la invencion 30

[0037] En un aspecto, la presente invencion proporciona una composicion de diagnostico para su uso en el analisis viscoelastico de un llquido de ensayo, que comprende:

a) al menos un activador de la coagulacion; y

35 b) una sal de calcio, preferentemente CaCl2, en una cantidad suficiente para asegurar la recalcificacion del llquido de ensayo; y,

c) un inhibidor de la heparina;

caracterizada porque 40

los componentes estan presentes en una forma esencialmente seca y en una cantidad suficiente para llevar a cabo un unico analisis viscoelastico de un llquido de ensayo especificado,

y en el que los componentes no estan presentes en una mezcla de sustancias, sino que cada uno se incorpora en 45 granulos separados espacialmente.

[0038] La sal de calcio preferentemente es CaCl2.

[0039] La composicion de diagnostico o mezcla de reaction de la presente invencion comprende 50 componentes que son conocidos de por si en la tecnica. Sin embargo, una diferencia de las estrategias de la tecnica

anterior es que la mezcla de estos constituyentes se proporciona en una forma esencialmente seca.

[0040] "Esencialmente" seca en el contexto de la invencion significa un estado en el que la mezcla esta esencialmente libre de cualquier llquido o humedad, en particular, que esta empobrecida de agua. Sin embargo,

55 puede haber presente agua o cualquier otro llquido, como residuo en la mezcla, pero solo hasta cierto punto, que no influya negativamente en la estabilidad de la composicion global. En particular, se debe descartar que se produzca una interaction entre los diferentes constituyentes, lo que afecta negativamente a la estabilidad. Deberla ser aceptable una cantidad restante de llquido, preferentemente agua, en la composicion de hasta el 10 % en peso.

[0041] La cantidad suficiente para llevar a cabo un unico analisis viscoelastico de un llquido de ensayo especificado, por ejemplo, una muestra de sangre, es la cantidad de todos los componentes en la mezcla que proporciona la concentracion requerida de los reactivos en el analisis final de las caracterlsticas de coagulacion de la muestra de sangre, es decir, en la copa 2 de un aparato de medicion 4. Por tanto, no es necesario repartir

5 adicionalmente la composicion de diagnostico antes o despues de su disolucion en un llquido.

[0042] Ademas, esto se consigue disolviendo las sustancias en el propio llquido de ensayo (muestra de sangre, etc.), no disolviendo los constituyentes en una cantidad de diluyente llquido que da lugar a la concentracion de trabajo final.

10

[0043] Un elemento importante de la presente invencion es que los componentes no estan presentes en una mezcla de sustancias, sino en una forma separada espacialmente. Esto evita problemas relacionados con la estabilidad.

15 [0044] La separacion espacial de los componentes se realiza incorporando cada componente en un material

de soporte independiente. Este termino significa que cada uno de los constituyentes se incorpora en entidades separadas en el espacio, tales como granulos, mini-pastillas, etc. El termino "material de soporte independiente" no significa necesariamente que los materiales utilizados sean qulmicamente diferentes. Solo se quiere decir que estan separados espacialmente unos de otros.

20

[0045] El soporte tiene forma de granulos. Estos granulos se pueden producir por procedimientos que son conocidos de por si en la tecnica anterior. Sin embargo, se prefiere usar uno de los dos procedimientos de produccion de granulos, que se describen brevemente a continuacion:

25 a) El constituyente respectivo en solucion se mezcla con un material de soporte adecuado, mezcla que se convierte entonces en forma de aerosol. Este aerosol, que contiene pequenas gotas de la mezcla, se congela de golpe en nitrogeno llquido, a continuacion se calienta en una atmosfera protectora y se almacena en un recipiente hermetico (tal como un vial).

b) Los granulos se producen como en a), sin embargo, la mezcla de partida no contiene ningun constituyente. El 30 constituyente se proporciona como una solucion y se deja caer sobre los granulos en una atmosfera protectora. Despues de secar sobre los granulos, los granulos se envasan en un recipiente hermetico.

[0046] En una realizacion preferida, el material de soporte comprende al menos un hidrato de carbono, por ejemplo sacarosa, lactosa o celulosa. El material de soporte preferentemente no muestra una influencia significativa

35 sobre el comportamiento de coagulacion, el comportamiento de formacion de coagulos, o el comportamiento de lisis de los coagulos.

[0047] El activador de la coagulacion como se ha mencionado anteriormente preferentemente es un activador intrlnseco y/o extrlnseco.

40

[0048] El activador extrlnseco de la coagulacion a su vez preferentemente es el factor tisular (TF) y se selecciona mas preferentemente entre TF lipidado o rTF.

[0049] El activador intrlnseco de la coagulacion se selecciona preferentemente entre celita, acido elagico, 45 sulfatit, caolln, sllice, ARN, o sus mezclas.

[0050] Como segunda caracterlstica, la composicion de diagnostico de la presente invencion comprende una sal de calcio, tal como CaCl2, en el que el CaCl2 esta presente preferentemente en una cantidad de aproximadamente 1-100 pmol/ml de llquido de ensayo. Como se ha mencionado anteriormente, la cantidad de CaCl2

50 debe ser suficiente para asegurar la recalcificacion del llquido de ensayo, en particular, de la muestra de sangre, si la muestra se descalcifica antes. Resulto que la cantidad de 3-30 pmol/ml es optima para conseguir este requisito. Con el fin de determinar aun con mas precision la cantidad necesaria de CaCl2 que debe estar contenida en la composicion de diagnostico, el volumen exacto de llquido de ensayo que se recoge del paciente debe ser conocido, as! como la cantidad de reactivo de descalcificacion empleado.

55

[0051] La composicion de diagnostico de la presente invencion contiene un inhibidor de heparina.

[0052] Los inhibidores se pueden usar y combinar dependiendo de las demandas de diagnostico precisas, por ejemplo, el inhibidor de plaquetas puede ser un inhibidor del citoesqueleto o un antagonista de GPIIb/IIIa.

Asimismo, el inhibidor de la fibrinolisis se puede seleccionar, por ejemplo, entre aprotinina, acido tranexamico, o EACA; el inhibidor de la heparina se puede seleccionar, por ejemplo, entre heparinasa, protamina o peptidos relacionados con la protamina; y el factor de coagulacion se puede seleccionar, por ejemplo, entre uno o mas factores de coagulacion o factores de coagulacion activados, preferentemente entre FXa o FVa o la protelna C 5 activada o FVIIa. Sin embargo, se observa que esto solo es una seleccion preferida y si es necesario se pueden utilizar mas inhibidores.

[0053] En una realizacion preferida, la composicion de diagnostico tambien puede contener uno o mas estabilizadores, en el que el estabilizador preferentemente es albumina o gelatina.

10

[0054] En una realizacion preferida, la composicion de diagnostico tambien puede contener uno o mas fosfollpidos, en el que los fosfollpidos pueden ser una composicion de diferentes fosfollpidos, como fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina y fosfatidiletanolcolina. Por ejemplo, se pueden usar mezclas de fosfollpidos extraldos de cerebro de conejo.

15

[0055] La presente composicion de diagnostico puede tener la siguiente constitucion en realizaciones preferidas:

• activacion extrlnseca insensible a la heparina: Combinacion de activador extrlnseco, inhibidor de la heparina y 20 estabilizador y CaCl2

• activacion intrlnseca insensible a la heparina: Combinacion de activador intrlnseco, inhibidor de la heparina y estabilizador y CaCl2

• activacion extrlnseca sin activacion de plaquetas, insensible a la heparina: Combinacion de activador extrlnseco, inhibidor de plaquetas, inhibidor de la heparina y estabilizador y CaCl2

25 • activacion intrlnseca sin activacion de las plaquetas, insensible a la heparina: Combinacion de activador intrlnseco, inhibidor de plaquetas, inhibidor de la heparina y estabilizador y CaCl2

• activacion extrlnseca con inhibicion de la fibrinolisis, insensible a la heparina: Combinacion de activador extrlnseco, inhibidor de la fibrinolisis, inhibidor de la heparina y estabilizador y CaCl2

• activacion intrlnseca con inhibicion de la fibrinolisis, insensible a la heparina: Combinacion de activador intrlnseco, 30 inhibidor de la fibrinolisis, inhibidor de la heparina y estabilizador y CaCl2

• activacion extrlnseca con factor de coagulacion adicional, insensible a la heparina: Combinacion de activador extrlnseco, uno de los factores de coagulacion adicional, inhibidor de la heparina y estabilizador y CaCl2

• activacion intrlnseca con factor de coagulacion adicional, insensible a la heparina: Combinacion de activador intrlnseco, uno de los factores de coagulacion adicional, inhibidor de la heparina y estabilizador y CaCl2

35

[0056] En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un recipiente 1, que comprende la composicion de diagnostico como se define anteriormente. El recipiente 1 tiene preferentemente la forma de un vial o una cubeta.

40 [0057] El recipiente 1 esta formado de un material (por ejemplo, plastico o vidrio), que no se corroe o se ve

afectado de otro modo por los reactivos con los que se ha de rellenar o por el llquido de ensayo con el que se ha de rellenar.

[0058] El recipiente 1 puede tener forma cillndrica, pero su forma no tiene que ser necesariamente cillndrica. 45 El recipiente 1 puede tener una forma que reduce su perfil lateral interior desde la apertura superior a la parte

inferior, como por ejemplo forma conica como se indica en la Fig. 4 o al menos una forma parcialmente conica. Esto proporciona un mejor manejo de las, por lo general, pequenas cantidades de mezcla de reactivo llquido. Utilizando viales de fondo plano con un diametro mas pequeno se reducirla este problema, pero entonces dichos viales podrlan tener un diametro de apertura que es demasiado estrecho para ser manipulado con el equipo de pipeteo 50 convencional utilizado junto con los dispositivos de diagnostico como, por ejemplo, el trombo-elastometro ROTEM. (En cuanto al diseno del sistema ROTEM y la forma de utilizarlo, se hace referencia a la publicacion de Estados Unidos 5.777.215).

[0059] Por otra parte, este tipo de viales pequenos podrlan llegar a ser mas diflciles de manipular para los 55 sistemas de tratamiento automatizado comunes y por lo tanto podrlan aumentar los costes de produccion.

[0060] La seccion transversal de un recipiente 1 basicamente simetrico a su eje de una realizacion preferida se muestra en la Fig. 4A. Sin embargo, hay que senalar expresamente que la presente invencion no se limita al

mismo, y tambien se pueden usar en forma de U, con forma rectangular o formas similares.

[0061] Como se ha mencionado anteriormente, el recipiente 1 se puede cerrar o sellar con una tapa 5 o similar con el fin de evitar una perdida de los reactivos, o una invasion de contaminantes, agua, etc.

5

[0062] En una realizacion adicional, el recipiente 1 esta disenado de manera que se pueda utilizar directamente como copa de medicion 2 del aparato de medicion viscoelastica 4. En otras palabras, se puede realizar un analisis viscoelastico de tal manera que se proporcione el respectivo recipiente 1, el llquido de ensayo se anade en el recipiente 1, y la medicion se lleva a cabo directamente en el recipiente 1. En este caso, solo se tiene que

10 realizar la dispensation de la sangre en el recipiente como etapa de transferencia de llquido, que se puede realizar mediante el uso de una pipeta manual, una pipeta automatica, un dispensador automatico o cualquier otro equipo de transferencia de llquido.

[0063] En esta realizacion, el recipiente 1 puede estar disenado por combination de dos materiales, por 15 ejemplo, vidrio y plastico o vidrio y un revestimiento superficial. En este contexto, la parte del recipiente fabricada de

vidrio no tiene que cubrir necesariamente toda parte inferior de la zona de plastico, sino que podrla estar construida de acuerdo con la Figura 4C.

[0064] En las Figuras 4B y C, se puede ver una realizacion adicional de la invention. El recipiente 1 (por 20 ejemplo, una cubeta) se puede incorporar a una estructura mas grande, por ejemplo un artlculo de vidrio, que

proporciona algunas ventajas tecnicas: esta configuration puede proporcionar una sujecion para el contenedor.

[0065] En estas realizaciones se descarta la posible activation de la coagulation en el llquido de ensayo por la superficie de vidrio, mientras que se siguen utilizando las propiedades superiores de sellado del material de vidrio

25 cuando se compara con material plastico. Se puede conseguir el efecto similar de suprimir la posible activacion de la coagulacion en el llquido de ensayo por la superficie del vidrio, cubriendo la superficie de vidrio (o al menos la parte interior de la superficie de vidrio) con una capa de una o mas sustancias que no son capaces de activar la coagulacion si estan en contacto con la sangre o con los componentes sangulneos.

30 [0066] Para su comparacion, en la Fig. 3 se ilustra una copa de medicion 2 de la tecnica anterior de acuerdo

con el documento de Estados Unidos 2004/0071604:

[0067] Se proporciona un recipiente 1, que sirve como soporte del reactivo y recipiente de medicion (es decir, se puede considerar como una copa de medicion 2) para el analisis utilizando diversos procesos de analisis, y tiene

35 una region que se divide en al menos dos camaras (6a, 6b, 6c) con una o mas barras que se extienden desde la pared del recipiente o la base del recipiente, en el que las camaras estan dispuestas de manera que los reactivos llquidos o solidos se puedan introducir en la misma sin que se puedan mezclar por difusion o toparse entre si. El recipiente 1 se utiliza para el secado o la liofilizacion con camaras completa o parcialmente llenas y al mismo tiempo sirve como recipiente de medicion despues de volver a disolver el material seco mediante la adicion de agua, la 40 solution de reactivo, o la muestra presente en la fase acuosa.

[0068] En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un procedimiento in vitro de realizacion de un analisis viscoelastico en una muestra de sangre que comprende las etapas de:

45 a) proporcionar una muestra de sangre;

b) proporcionar un recipiente 1 tal como se define anteriormente;

c) anadir la muestra de sangre a dicho recipiente 1, disolviendo de ese modo la composition de diagnostico que contiene;

d) poner el recipiente 1 en un aparato 4 adecuado para realizar un analisis viscoelastico; y 50 e) realizar el analisis viscoelastico de dicha mezcla.

[0069] Como ya se ha mencionado anteriormente, el llquido de ensayo es una muestra de sangre, preferentemente es una muestra de sangre de mamlfero, mas preferentemente una muestra de sangre o de componentes sangulneos humanos (por ejemplo, sangre entera o plasma sangulneo).

55

[0070] La etapa c) del procedimiento de la presente invencion preferentemente requiere aproximadamente 160 s, mas preferentemente 2-10 segundos y lo mas preferentemente requiere aproximadamente 5 segundos. Despues de ese tiempo, la mezcla de la composicion de diagnostico y la muestra de sangre se deben transferir rapidamente a la copa de medicion 2 del aparato de medicion 4. Esto se hace en la etapa d) mediante pipeteo

manual o automatico de la mezcla desde el recipiente 1 y mediante su transferencia de este modo al aparato 4, es decir, a la copa de medicion 2 del aparato 4.

[0071] El aparato 4 preferentemente es un dispositivo adecuado para las mediciones viscoelasticas, por 5 ejemplo, dispositivos desvelados en los documentos (Estados Unidos 5.777.215), (Estados Unidos 6.537.819), o

(Estados Unidos 5.777.215).

[0072] Un ejemplo de dicho aparato 4 se muestra en la Fig. 2:

10 [0073] Despues de la formacion del coagulo entre la copa 2 (cubeta) y el alfiler 3, el propio coagulo se estira

por el movimiento del alfiler 3 con respecto a la copa 2. La deteccion de los parametros caracterlsticos del coagulo se basa en el acoplamiento mecanico de copa 2 y el alfiler 3 por el coagulo. Esto solo es posible si el coagulo se adhiere a las superficies tanto de la copa 2 como del alfiler 3. Por lo tanto, para el analisis viscoelastico esencialmente se requiere una adhesion firme sobre las superficies tanto de la copa 2 como del alfiler 3.

15

[0074] El procedimiento de la presente invencion comprende un analisis viscoelastico de este tipo de una muestra de sangre con el fin de determinar sus caracterlsticas de coagulacion, en el que un analisis viscoelastico de este tipo en el sentido mas amplio es la medicion de un movimiento relativo de una cubeta que contiene una muestra de sangre en relacion con un punzon. El analisis preferentemente comprende la determinacion del tiempo de

20 coagulacion, el tiempo de formacion del coagulo, y la firmeza del coagulo con el tiempo que incluye efectos fibrinollticos.

[0075] En la practica, se pueden realizar las etapas siguientes:

25 1. Se anade un volumen definido de una muestra (por ejemplo, sangre entera, plasma) directamente en un vial que contiene la composicion de reactivo; la medicion debe comenzar en un momento cercano al momento de la adicion de la muestra

2. Despues de disolver la mezcla de reactivo en la muestra (5 segundos) la mezcla de reactivo-muestra se pipetea del vial de reactivo a la copa de medicion 2 (no es necesario si el propio vial actua como copa de medicion 2)

30 3. La copa 2 se pone entonces en una posicion tal que el alfiler 3 se sumerja en el llquido contenido en la copa de ensayo, la medicion continua hasta que se detiene por el usuario

[0076] Por lo tanto, el usuario no necesita realizar mas de 4 etapas de pipeteado en total para cada ensayo (en comparacion con las hasta 8 etapas necesarias para un sistema de reactivo llquido) y no es necesario ningun

35 cambio de la punta de la pipeta en la preparacion de un ensayo. Esto indica claramente el beneficio directo de la presente invencion para la persona que vaya a realizar este tipo de ensayos.

[0077] En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere al uso de una composicion de diagnostico o de un recipiente 1 como se define anteriormente en un procedimiento para analizar el comportamiento viscoelastico

40 de una muestra de sangre.

[0078] Aunque la presente invencion ha sido descrita de acuerdo con realizaciones preferidas, es evidente para un experto en la materia que son posibles modificaciones en todas las realizaciones.

45 Slmbolos de referencia

[0079]

1: recipiente

2: copa de medicion

3: alfiler

4: aparato de medicion

5: tapa

6 a, b, c: camaras de reactivos

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para realizar un analisis viscoelastico en una muestra de sangre, que comprende las etapas de:

5

a) proporcionar una muestra de sangre;

b) proporcionar un recipiente (1) que contiene una composicion de diagnostico que comprende al menos un activador de la coagulacion; una sal de calcio, preferentemente CaCl2, en una cantidad suficiente para asegurar la recalcificacion de la muestra de sangre; y un inhibidor de la heparina; en el que los componentes estan presentes en

10 una forma esencialmente seca y en una cantidad suficiente para realizar un unico analisis viscoelastico de una muestra de sangre especificada, y en el que los componentes no estan presentes en una mezcla de sustancias, sino que cada uno se incorpora en granulos separados espacialmente;

c) anadir la muestra de sangre a dicho recipiente (1), disolviendo de ese modo la composicion de diagnostico que contiene;

15 d) poner el recipiente (1) en un aparato (4) adecuado para realizar un analisis viscoelastico; y e) realizar el analisis viscoelastico de dicha mezcla.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la muestra de sangre es una muestra de sangre de un mamlfero, mas preferentemente una muestra de sangre humana.

20
3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la etapa c) requiere aproximadamente 1-60 segundos, preferentemente unos 2-10 segundos, mas preferentemente unos 5 segundos.
4. El procedimiento de una o mas de las reivindicaciones anteriores, en el que el aparato (4) es un 25 tromboelastometro o una tromboelastografo.
5. El procedimiento de una o mas de las reivindicaciones anteriores, en el que el analisis comprende la determinacion del tiempo de coagulacion, el tiempo de formacion del coagulo, la firmeza del coagulo con el tiempo y/o la fibrinolisis.

30
6. Una composicion de diagnostico para su uso en el procedimiento de una o mas de las reivindicaciones 1-5 para el analisis viscoelastico de una muestra de sangre, que comprende:

a) al menos un activador de la coagulacion;

35 b) una sal de calcio, preferentemente CaCl2, en una cantidad suficiente para asegurar la recalcificacion de la muestra de sangre; y c) un inhibidor de la heparina;

caracterizada porque

40

los componentes estan presentes en una forma esencialmente seca y en una cantidad suficiente para realizar un unico analisis viscoelastico de una muestra de sangre especificada, y en el que los componentes no estan presentes en una mezcla de sustancias, sino que cada uno se incorpora en granulos separados espacialmente.

45 7. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que la separacion espacial de los

componentes se realiza mediante la incorporacion de cada componente a un material de soporte independiente, en el que el material de soporte comprende preferentemente al menos un hidrato de carbono, mas preferentemente sacarosa, lactosa o celulosa.

50 8. La composicion de diagnostico de la reivindicacion 6, en la que el activador de la coagulacion es un

activador intrlnseco y/o extrlnseco.
9. La composicion de diagnostico de la reivindicacion 8, en la que el activador extrlnseco de la coagulacion es el factor tisular (TF), preferentemente TF lipidado o TF recombinante (rTF), o

55 en la que el activador intrlnseco de la coagulacion se selecciona del grupo que consiste en celita, acido elagico, sulfatit, caolln, sllice, ARN, o sus mezclas.
10. La composicion de diagnostico de la reivindicacion 6, en la que el inhibidor de la heparina se selecciona entre heparinasa, protamina o peptidos relacionados con la protamina.
11. La composicion de diagnostico de una o mas de las reivindicaciones 6-10, en la que el factor de coagulacion se selecciona entre uno o mas factores de coagulacion o factores de coagulacion activados, preferentemente FXa o FVa o protelna C activada o FVIIa, y/o

5 en la que el CaCl2 esta presente en una cantidad de aproximadamente 1-100 pmol/ml de la muestra de sangre.
12. La composicion de diagnostico de una o mas de las reivindicaciones 7-12, en la que la forma seca es una forma liofilizada, y/o que comprende ademas un estabilizador, preferentemente albumina o gelatina.

10 13. Un recipiente, que comprende la composicion de diagnostico de una o mas de las reivindicaciones 6

12,

en el que el recipiente (1) preferentemente adopta la forma de un vial o una cubeta, mas preferentemente se conforma de manera que el perfil lateral interior se reduce desde la apertura hacia la parte inferior.

15 14. El recipiente de la reivindicacion 13 con su parte interna conformada de manera que se puede

conectar a un dispositivo para realizar mediciones viscoelasticas