CN102834722A - 用于测定测试液体的凝固特性的组合物 - Google Patents

用于测定测试液体的凝固特性的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于测试液体的粘弹性分析的诊断组合物，以及涉及包含该组合物的容器（1）。该组合物包含至少一种凝固的活化剂，以及至少一种选自CaCl2和选自一种或多种抑制剂和/或凝固成分的另外的成分，其中组合物具有所有成分的基本上干形式并且用量足以进行指定血液或血浆样品的单一粘弹性分析，以及其中成分并不以物质混合物而是以空间上分离的形式来提供。本发明进一步涉及用于对测试液体进行粘弹性分析的方法，以及涉及该诊断组合物在这样的方法中的应用。

Description

用于测定测试液体的凝固特性的组合物
技术领域
本发明涉及用于测试液体的粘弹性分析的诊断组合物，并涉及包含诊断组合物的容器。本发明进一步涉及用于对测试液体进行粘弹性分析的方法，以及涉及诊断组合物在这样的方法中的应用。
背景技术
血液的凝固是一种复杂过程，其间血液形成固体凝块。它是止血（停止自受损血管的失血）的重要部分，借此通过凝块来保护受损的血管壁以阻止出血和帮助受损血管的修复。在凝固方面的障碍可以导致增加的出血和/或血栓形成和栓塞。
在正常个体中，在对损害内皮细胞的血管发生损伤以后的20秒内开始凝固。血小板立即在损伤部位形成止血塞。此过程称作初级止血。如果称作凝固因子的血浆成分以复杂级联方式响应以形成血纤蛋白链（其会增强血小板塞），则接着是辅助止血。
辅助止血的凝固级联（coagulation cascade）具有两种途径，接触活化途径（以前称为内源性途径）和组织因子途径（以前称为外源性途径），其导致血纤蛋白形成。以前认为，凝固级联包括加入常见途径的同样重要的两种途径。现在已经知道，用于引发血液凝固的主要途径是组织因子途径。上述途径是一系列反应，其中丝氨酸蛋白酶的酶原和它的糖蛋白辅因子被活化以变成活性成分，其然后催化在级联中的下一反应。通常用罗马数字（I-XIII）来表示凝固因子，其中附加的小写'a'用来表示活化形式。
纤维蛋白溶解是这样的过程，其中纤维蛋白凝块被打破。组织纤溶酶原激活物（tPA）和尿激酶是介质，其将血纤蛋白溶酶原转化成活性纤维蛋白溶酶，从而便于发生纤维蛋白溶解。
这些凝固成分的正常或降低功能的检测是重要的，以评估患者的止血障碍。
测量血液的凝固特性的若干方法是已知的。一些这样的装置尝试模拟血液在活主体的静脉和动脉中的自然流动，而其它测量技术则用于静态血量。
患者血液以及时和有效方式凝固的能力的精确测量对于某些手术和医疗程序是关键的。就将适当治疗给予患有凝固障碍的患者而言，异常凝固的快速和精确检测也是特别重要的。经常地上述患者的病症使得必须给予血液成分、抗凝血剂、某些血纤维蛋白溶解剂、抗血小板剂、或诱导上述制剂的逆效果的化合物。在这些情况下，治疗可以适合于先前测定的凝固障碍的程度。
各种装置可以提供血凝固的测量，例如如在（US 5,777,215）、（US6,537,819）、或（US 5,777,215）中所披露的。这些装置测量凝块在其结构发展中的机械性能。以术语“粘弹性方法”来总结这些系统，因为它们连续检测凝块在形成和溶解时的粘弹特性。
粘弹性测量可以提供关于若干不同参数的信息，例如在凝固活化和凝块引发之间的时间（凝固时间CT）、凝块形成的动力学（凝块形成时间CFT）、凝块的坚固性（幅度A5-A30和最大凝块坚固性MCF）、或纤维蛋白溶解的程度（最大溶解ML）。
若干参考文献描述了基于机械运动来测量血凝固特征的仪器。这些仪器监测血液的弹性性能，因为它在低剪切环境下，即在静态血量中，它被诱导凝固。剪切弹性的变化模式使得能够测定凝块形成的动力学、以及所形成凝块的强度和稳定性。凝块的强度和稳定性提供关于凝块进行"止血工作"（即，阻止或防止异常出血）的能力并关于血小板-血纤蛋白相互作用的适合性的信息。凝块形成的动力学主要提供关于凝固因子的功能的信息。所有这种信息的分析可以提供结果，其可用来预测出血，监测和管理血栓形成，或监测纤维蛋白溶解。
然而，因为凝固过程包括各种相互关联成分，所以进一步使用特定活化剂和抑制剂，以更具体地检测止血障碍。
因此，在粘弹性分析中使用的试剂包括初始活化剂（例如，内源性或外源性途径的活化剂）以及可选地一种或多种抑制剂（例如，纤维蛋白溶解抑制剂、肝素抑制剂、血小板抑制剂）和/或凝固级联的一种或多种另外的特定因子。
可选地，可以添加另外的成分：
-钙（CaCl2）：添加钙，用于样品的再钙化。可以通过若干不同的抗凝物质如肝素、EDTA、柠檬酸盐，来防止血液样品凝固。通常，用借助于柠檬酸盐加以抗凝的血液进行功能测试。柠檬酸盐中等复合血液样品的钙。钙是凝固过程所必要的，它涉及复合物形成并且是大多数凝固因子（例如，FI、FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXIII、TF）的辅因子。因此，如果在抽血期间柠檬酸化样品（通过使用包含柠檬酸盐的血液管），则样品的再钙化是必需的，以确保要样品中的正确凝固。
-磷脂：在凝固级联中的若干复合物是磷脂依赖的，因而，可以添加另外的磷脂。
-稳定剂：用于在产生和分析的时间之间稳定试剂（例如，白蛋白、明胶）。
取决于诊断目的，可以单独或联合使用这些试剂。例如，借助于样品中的仅内源性活化剂进行的测量可以结合于借助于样品中的内源性活化剂和足量的肝素抑制剂（例如，肝素酶）进行的测量，以在测试液体中检测肝素的存在；在样品中外源性活化剂和血小板抑制剂（例如，细胞松弛素D）的组合适用于测定在测试液体中在没有血小板贡献的情况下血纤蛋白原的活性。
在文献中有用于粘弹性测量的试剂选择（构想）（ReoPro-修饰TEG:Wenker et al.:Thrombelastography,The Internet Journal of Anesthesiology,2000,Volume 1 Number 3;（http://www.ispub.com/ostia/index.php?xmlFilePath＝journals/ija/vol1n3/teg.xml）；Ruttmann et al.:Hemodilution Enhanced Coagulation Is NotDue to Platelet Clumping,Anesthesiology 2004;101:A150；重组肌动蛋白-和ReoPro-修饰TEG:http://www.transfusionguidelines.org.uk/ docs/pdfs/bbt_app-use_teg-sop-example.pdf；TF-和Trasylol-修饰TEG:Tanaka et al.:Evaluation of a novel kallikrein inhibitor on hemostaticactivation in vitro,Thrombosis Research,Volume 113,Issue 5,2004,Pages333-339），其基于用于其它测试的市售活化试剂的组合，如凝血酶原时间活化剂Innovin或
Figure BDA00002208043500041
结合于客户定制的CaCl2溶液和药物，如
Figure BDA00002208043500042
（阿昔单抗）和
Figure BDA00002208043500043
（抑肽酶）。这导致低标准化、许多吸移步骤和许多误差来源。
存在由Pentapharm销售的用于粘弹性测量的试剂系统，其是基于标准化试剂，它们的大多数以液体形式提供给用户，其是由使用者利用标准化操作程序吸移到测试杯。这可以标准化应用；然而，它仍然需要若干吸移步骤以用于分析。例如，为了连同EXTEM对照测试一起进行FIBTEM测试，血液、CaCl2溶液、外源性活化剂和血小板抑制剂的吸移可以导致进行总共8个吸移步骤（包括在一个测试程序期间三次改变管尖）和需要必须由使用者处理的3种不同试剂。这需要耗费时间的训练并且是潜在的误差源。
市场上存在其它试剂系统，其基于各种各样的试剂。它们中的一些是液体，并且必须被吸移到杯中（例如，CaCl2溶液），一些是干燥形式，并且被放入测试杯中（如肝素酶），以及一些是以小瓶形式提供，其数量用于一次测试。这些试剂的特点在于，仍然通常单独提供各种试剂，因而至少对于需要一种以上活性试剂的测试，需要若干步骤。
因此，在过去已进行一些努力以提供用于血液或血液成分的粘弹性测量的更加简单的试剂系统：
●将它们直接干燥到杯中，上述杯具有在测量期间样品的容积
●化合物是工作浓度的试剂的稳定的液体组合
将干燥活性试剂直接放入测试杯中的策略的一个缺点在于，它们通常制备自塑料并且较轻，这使得在自动试剂分配线中这些杯的填充更加困难。这使得需要人工填充步骤或开发专门装备，两者均是昂贵的。上述策略的另一个缺点在于，活性成分或稳定剂可以干扰凝块在杯表面上的附着强度，其是进行正确测量所需要的。例如，在杯中温育白蛋白溶液（白蛋白是典型的稳定剂，其用来稳定在试剂中的所有种类的蛋白质）以后，已显示减少的凝块附着。
Figure BDA00002208043500051
表1：在先前用和没有用白蛋白溶液温育的情况下的INTEM测量结果。
简化试剂处理的另一种可能的策略是在液相中以它们的工作浓度结合为一次测试所需要的不同试剂。这里的主要问题是当停留在一起较长时间时不同物质的相互作用。当在液相中以较高浓度停留在一起时，一些成分会负面地影响彼此的稳定性；例如，在液相中，随着时间的推移，CaCl2会扰乱组织因子试剂的稳定性。
另外，如果以足以用于恰好一次测试的量来提供这些联合试剂，则产生另一个问题：在这种情况下，液体试剂的很小一部分可能粘附于部分的试剂容器或杯，因而当进行分析时不能足够混合于测试液体。
Kolde等在美国专利申请20040071604中披露了一种策略，其提议用来解决上述问题。在此申请中，提出了用于粘弹性分析的杯系统，其中杯的下端被分成若干试剂室。这便于将试剂独立地放入不同室，而没有混合它们，然后冷冻干燥试剂。
然而，这种解决方案的缺点包括需要非常精确的吸移过程，这是因为分开的试剂室非常小，以及还存在以下问题：在冷冻干燥以前，通过存在于试剂充填线上的振动，试剂滴仍然可能混合。另一个问题是，在冻干过程开始以前，在室温条件下的处理期间，小试剂滴的可能的空气干燥。再次面临利用标准试剂充填线来自动处理较小并非常轻的塑料的问题。
在只使用测量的常规实验室中，大多数凝固测试方法可以检测从将活化剂加入样品直到纤维蛋白凝块的最初形成的时间（=凝固时间）。它们在此时停止并且没有进行进一步的测量。这意味着，在这些方法中，血液与测量池表面的牢固附着不是必要的。因此，借助于上述方法，可用于评估凝固时间的各种分析仪和试剂不必处理与粘弹性测量有关的特有问题。
EP 0 972 203描述了用于测定aPTT的试剂，其包含至少一种凝血蛋白、磷脂和内源性凝固的活化剂（共冻干形式）。然而，这里产生以下问题：为进行分析所需要的所有成分彼此直接接触。因而，通过以这种形式来使用物质可以发生关于长期稳定性或不相容性的问题。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供诊断组合物，其能够在粘弹性系统中安全、可重现性和易于使用用于不同的测试的程序。本发明的另一个目的是提供诊断组合物，其特别适用于血液样品的单一分析（one singleanalysis）并且相对于现有技术的组合物具有优越的试剂稳定性。本发明的又一个目的是提供诊断方法，该方法提供可靠的和可重复的结果，易于处理，并且其为血液样品的凝固特性的测定提供标准化系统。本发明的另一个目的是提供上述类型的、具有改善的长期稳定性的诊断组合物。
通过根据权利要求1所述的诊断组合物、根据权利要求20所述的容器、权利要求24所述的诊断方法以及根据权利要求32所述的应用，来实现这些目的。
在从属权利要求中陈述了优选实施方式。
通过使用本发明的诊断组合物，可以按下述来进行测试：将限定容积的样品（例如，全血、血浆等）直接加入包含诊断组合物的容器1。在血液样品中溶解组合物以后，将获得的混合物从容器1吸移到测量装置4的量杯2。然后将量杯2放入使得针3浸入在测试杯中的液体中的位置（参见图2）。
因而，为了进行每个测试，使用者仅需要4个吸移步骤（在现有技术液体系统中则多达8个步骤，参见上文）并且不需要改变吸移管尖。
因此，很显然，可以更容易地处理用于测定血液样品的凝固特性的本系统，从而使得误差的可能性更小，其中上述误差的可能性可以起因于（潜在地经验不足的）操作者的不精确的动作方式（line of action）。
根据本发明，成分并不以物质混合物存在，而是以空间上分离形式存在。这便于组合物的改善的长期稳定性而没有恶化它的其它特性。
由此，可以产生进一步的优点，例如，可以实现结果的较高的重复性，因而，较高程度的标准化。
附图说明
根据实施方式的描述并参照附图，本发明的另外的特点和优点将是显而易见的。
在附图中：
图1是例示图，其示出典型的血栓弹性测量；
图2示出用于血栓弹性分析的测量装置4；
图3是现有技术的测量装置4的量杯2的示意图；
图4A、4B、4C是本发明的容器1的三种优选实施方式的示意性剖视图。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了用于测试液体的粘弹性分析的诊断组合物，该组合物包含至少两种以下成分：
a）凝固的至少一种活化剂；以及至少一种成分，其选自
b）钙盐，优选CaCl2，其用量足以确保测试液体的再钙化（recalcification）；和/或
c）一种或多种抑制剂和/或其它凝固成分或因子；
特征在于
成分是以基本上干形式存在，并且存在量足以进行指定测试液体的单个粘弹性分析，
以及其中成分并不以物质混合物（substance mixture）存在，而是以空间上分离形式存在。
钙盐优选为CaCl2。
本发明的诊断组合物或反应混合物包含一些成分，其本身在本领域中是已知的。然而，与现有技术方式的一个差异是，以基本上干形式来提供这些成分的混合物。
在本发明的语境中，“基本上”干燥是指一种状态，其中混合物基本上没有任何液体或湿气，尤其是没有水。然而，水或任何其它液体可以存在为在混合物中的残余物，但仅到这样的程度，其并不负面影响整体组合物的稳定性。尤其是，已排除，在不同组分之间发生负面地影响稳定性的相互作用。在组合物中，按重量计至多10%剩余量的液体，优选水，应是可接受的。
足以进行指定测试液体（例如血液样品）的单个粘弹性分析的量是在混合物中所有成分的量，其在血液样品的凝固特性的最终分析中，即在测量装置4的杯2中，提供所需浓度的试剂。因而，在将它溶解在液体中以前或以后，没有必要进一步分配诊断组合物。
另外，这是通过在测试液体（血液样品等）本身中溶解物质而不是通过在一定量的液体稀释剂（导致最终工作浓度）中溶解成分，来实现。
本发明的重要因素是，成分并不以物质混合物，而是以空间上分离形式存在。这可以避免稳定性相关的问题。
在一种实施方式中，通过将每种成分加入单独的载体材料来实现成分的空间分离。此术语是指，将成分各自加入空间上分离的实体如颗粒、小片等。术语"单独的载体材料"不一定意味着所使用的材料化学上不同的。它仅指，它们是空间上彼此分离的。
优选地，载体具有颗粒的形式。可以通过在本领域中本身是已知的方法来产生那些颗粒。然而，优选使用产生颗粒的两种方法（其将在下文加以简单概述）之一：
a）在溶液中的相应的成分混合于适宜的载体材料，然后将该混合物转化成喷雾形式。将这种喷雾形式（包括混合物的雾滴）冷冻存储在液氮中，然后在保护气氛下加热并存储在气密性容器（如小瓶）中。
b）如在a）中产生的颗粒，然而，起始混合物并不包含任何成分。成分提供为溶液并允许在保护气氛下滴到颗粒上。在被干燥到颗粒上以后，将颗粒包装在气密性容器中。
在一种优选实施方式中，载体材料包含至少碳水化合物，例如，蔗糖、乳糖或纤维素。载体材料优选对凝结行为、凝块形成行为、或凝块溶解行为不显示显著影响。
如上所述的凝固的活化剂优选为内源性活化剂（intrinsic activator）和/或外源性活化剂（extrinsic activator）。
凝固的外源性活化剂又优选为组织因子（TF）并且更优先选自脂质化TF或rTF。
凝固的内源性活化剂优选选自赛力特硅藻土（c盐，celite）、鞣花酸、sulfatit、高岭土、二氧化硅、RNA、或它们的混合物。
作为第二特征，本发明的诊断组合物可以可选地包含钙盐如CaCl2，其中CaCl2的存在量优选为约1-100μmol/ml测试液体。如上所述，CaCl2的量必须足以确保测试液体，尤其是血液样品，的再钙化（如果样品以前被脱钙）。结果是，为了实现此目标要求，3-30μmol/ml的量是最佳的。为了甚至更精确地确定待包含在诊断组合物中的CaCl2的所需量，必须知道待收集自患者的测试液体的确切量以及所采用的脱钙试剂的量。
本发明的诊断组合物可选地包含一种或多种抑制剂，其例如选自以下一种或多种：血小板抑制剂、纤维蛋白溶解抑制剂、或肝素抑制剂。
可以使用和结合的那些抑制剂取决于精确的诊断需求，例如，血小板抑制剂可以是细胞骨架抑制剂或GPIIb/IIIa拮抗剂。同样，纤维蛋白溶解抑制剂可以例如选自抑肽酶、氨甲环酸（tranexamic acid）、或6-氨基己酸（eaca）；肝素抑制剂可以例如选自肝素酶、鱼精蛋白或鱼精蛋白相关肽；以及凝固因子可以例如选自一种或多种凝固因子或活化凝固因子，优选FXa或FVa或活化蛋白C或FVIIa。然而，应当指出，这仅是优选的选择，并且如果需要的话可以使用另外的抑制剂。
在一种优选实施方式中，诊断组合物还可以包含一种或多种稳定剂，其中稳定剂优选为白蛋白或明胶。
在一种优选实施方式中，诊断组合物还可以包含一种或多种磷脂，其中磷脂可以是不同磷脂如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰乙醇胆碱（phosphatidylethanolcholine）的混合物。例如，可以使用提取自兔脑的磷脂的混合物。
在优选实施方式中，本发明的诊断组合物可以具有以下成分：
●外源性激活：外源性活化剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●内源性激活：内源性活化剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●对肝素不敏感的外源性激活：外源性活化剂、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●对肝素不敏感的内源性激活：内源性活化剂、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●没有血小板活化的外源性激活：外源性活化剂、血小板抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●没有血小板活化、对肝素不敏感的外源性激活：外源性活化剂、血小板抑制剂、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●没有血小板活化的内源性激活：内源性活化剂、血小板抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●没有血小板活化的、对肝素不敏感的内源性激活：内源性活化剂、血小板抑制剂、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●抑制纤维蛋白溶解的外源性激活：外源性活化剂、纤维蛋白溶解抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●抑制纤维蛋白溶解、对肝素不敏感的外源性激活：外源性活化剂、纤维蛋白溶解抑制剂、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●抑制纤维蛋白溶解的内源性激活：内源性活化剂、纤维蛋白溶解抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●抑制纤维蛋白溶解、对肝素不敏感的内源性激活：内源性活化剂、纤维蛋白溶解抑制剂、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●具有另外的凝固因子的外源性激活：外源性活化剂、一种另外的凝固因子和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●具有另外的凝固因子、对肝素不敏感的外源性激活：外源性活化剂、一种另外的凝固因子、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
●具有另外的凝固因子的内源性激活：内源性活化剂、一种另外的凝固因子和稳定剂以用可选的CaCl2的组合
●具有另外的凝固因子、对肝素不敏感的内源性激活：内源性活化剂、一种另外的凝固因子、肝素抑制剂和稳定剂以及可选的CaCl2的组合
在第二方面，本发明提供了容器1，其包含如上文所定义的诊断组合物。容器1优选具有瓶或槽的形式。
容器1形成自一种材料（例如，塑料或玻璃），其并不受到待填入的试剂或待填入的测试液体的腐蚀或其它方式的影响。
容器1可以具有圆筒形，但它的形状不一定必须是圆筒形。容器1可以具有从上部开口到底部其内横向剖面减小的形式，例如如图4所示的锥形或至少部分的锥形。这可以提供通常少量液体试剂混合物的更好处理。使用具有较小直径的平底瓶将减小此问题，但这样的瓶可以具有太窄的开口直径以致不能用连同诊断装置（例如，ROTEM血栓弹性仪（thromboelastometer））一起使用的标准吸移装置加以处理。（关于ROTEM系统的设计和如何使用它，参见US 5,777,215的出版物，其以引用方式结合于本文。）
另外，对于常见自动化处理系统，这样的小瓶可以变得难以管理，并因而增加生产成本。
图4A示出优选实施方式的基本上轴对称容器1的横截面。然而，应当清楚地注意到，本发明并不限于此，并且还可以使用U形、长方形或类似形式。
如上所述，可以通过盖5等来闭合或密封容器1，以避免试剂的损失、或污染物、水等的侵入。
在另一实施方式中，以这样的方式设计容器1：使得它可能直接用作粘弹性测量装置4的量杯2。换言之，可以进行粘弹性分析，以致提供相应的容器1，将测试液体加入容器1，并在容器1中直接进行测量。在这种情况下，仅必须进行血液分配到容器作为液体转移步骤，其可以通过利用人工吸移管、自动吸移管、自动分配器或任何其它液体转移装置来实现。
在此实施方式中，可以通过结合两种材料，例如，玻璃和塑料或玻璃和表面盖来设计容器1。在本文中，由玻璃制备的部分容器并不一定必须扣紧塑料部分的整个下侧，而是可以按照图4C加以构造。
在图4B和C中，可以看到本发明的另一实施方式。可以将容器1（例如槽）加入较大结构，例如玻璃制品，其提供一些技术优点：这种装置可以为容器提供支撑。
在这些实施方式中，通过玻璃表面可以排除在测试液体中的可能的凝固活化，同时当和塑料比较时仍然使用玻璃材料的优越的密封性能。可以通过用一层当它们接触血液或血液成分时不能活化凝固的一种或多种物质覆盖玻璃表面（或至少玻璃表面的内部）来实现在测试液体中通过玻璃表面来抑制可能的凝固活化的类似效应。
为了便于比较，图3示出按照US 2004/0071604的现有技术的量杯2。
提供了容器1，其用作试剂支撑和测量容器（即可以被视为量杯2），用于利用各种分析过程的分析，并具有一区域，通过延伸自容器壁或容器底面的一个或多个杆，其被分成至少两个室（6a、6b、6c），其中室被设置成使得可以将液体或固体试剂引入其中而没有使它们能够通过扩散而混合或进入彼此之中。容器1用于干燥或冷冻干燥（通过完全或部分填充的室），并在通过添加水、试剂溶液、或存在于水相中的样品再溶解干燥材料以后同时用作测量容器。
在第三方面，本发明涉及对测试液体，优选血液样品，进行粘弹性分析的方法，该方法包括以下步骤：
a）获得测试液体；
b）提供如上文所定义的容器1；
c）将测试液体加入所述容器1，从而溶解包含在其中的诊断组合物；
d）将所述测试液体和所述诊断组合物的混合物转移到杯2并将它放入适合于进行粘弹性分析的装置4，
或者
将容器1放入适合于进行粘弹性分析的装置4；以及
e）进行所述混合物的粘弹性分析。
如上文已提及的，测试液体优选为血液样品，优选为哺乳动物，更优选人血液或血液成分的样品（例如，全血或血浆）。
本发明的方法的步骤c）优选耗费约1-60，更优选2-10秒以及最优选约5秒。此时以后，应将诊断组合物和血液样品的混合物快速转移到测量装置4的量杯2。这是在步骤d）中通过手动或自动吸移来自容器1的混合物和通过将它转移到装置4，即到装置4的量杯2，来完成。
作为一种替代方法，如果本发明的容器1是量杯2，则直接在容器1中进行测量。在这种情况下，可以省略步骤d）。
装置4优选为适用于粘弹性测量的装置，例如在（US 5,777,215）、（US6,537,819）、或（US 5,777,215）中披露的装置。
图2示出装置4的一个实例。
在杯2（比色杯）和针3之间形成凝块以后，通过针3相对于杯2的移动来伸展凝块本身。凝块的特征参数的检测是基于杯2和针3的机械耦合，其中借助于凝块。仅当凝块附着于杯2和针3的表面时，这才是可能的。所以，对杯2和针3两者表面的牢固附着是粘弹性分析的基本要求。
本发明的方法包括血液样品的这样的粘弹性分析以测定它的凝固特性，其中这样的粘弹性分析在最广泛的意义上是测量包含血液样品的槽相对于针的相对移动。上述分析优选包括测定凝结时间、凝块形成时间、和随着时间的推移凝块的牢固度（包括纤维蛋白溶解效果）。
在实践中，可以进行以下步骤：
1．将限定容积的样品（例如，全血、血浆）直接加入包含试剂组合物的小瓶，应在接近添加样品的时刻开始测量
2．在样品中溶解试剂混合物（5秒）以后，将试剂-样品混合物从试剂瓶吸移到量杯2（如果瓶本身作为量杯2，则没有必要）
3．然后将杯2放入一定位置，使得针3浸入包含在测试杯中的液体中，继续测量直到用使用者停止。
因而，为了进行每个测试，使用者需要总共不超过4个吸移步骤（相比于液体试剂系统所需要的多达8个步骤）并且当准备一个测试时不需要改变吸移管尖。这清楚地表明，进行上述测试的人直接受益于本发明。
在另一方面，本发明涉及如上文所定义的诊断组合物或容器1在分析测试液体，优选血液样品，的粘弹行为的方法中的应用。
虽然已按照优选实施方式来描述了本发明，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对所述实施方式进行改进。
附图标记
1            容器
2            量杯
3            针
4            测量装置
5            盖
6a,b,c       试剂室。

Claims (32)

1.一种用于测试液体的粘弹性分析的诊断组合物，所述组合物包括至少两种以下成分：
a）至少一种凝固的活化剂；和选自以下的至少一种成分
b）钙盐，优选CaCl2，用量足以确保所述测试液体的再钙化；和/或
c）一种或多种抑制剂和/或其它凝固成分或因子；
特征在于
所述成分以基本上干形式存在并且用量足以进行指定测试液体的单一粘弹性分析，
以及其中所述成分并不以物质混合物而是以空间上分离的形式存在。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述成分的空间分离是通过将每种成分加入单独的载体材料内来实现的。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述载体材料包含至少碳水化合物，例如蔗糖或纤维素。
4.根据权利要求2-4所述的组合物，其中，所述载体材料对凝结行为、凝块形成行为、或凝块溶解行为没有显著影响。
5.根据权利要求1所述的诊断组合物，其中，所述凝固的活化剂是内源性活化剂和/或外源性活化剂。
6.根据权利要求5所述的诊断组合物，其中，凝固的所述外源性活化剂是组织因子（TF）。
7.根据权利要求6所述的诊断组合物，其中，所述组织因子选自脂质化TF或rTF。
8.根据前述权利要求的一项或多项所述的诊断组合物，其中，凝固的所述内源性活化剂选自由赛力特硅藻土、鞣花酸、sulfatit、高岭土、二氧化硅、RNA、或它们的混合物组成的组。
9.根据前述权利要求的一项或多项所述的诊断组合物，其中，所述抑制剂选自以下的一种或多种：血小板抑制剂、纤维蛋白溶解抑制剂、或肝素抑制剂。
10.根据权利要求9所述的诊断组合物，其中，血小板抑制剂是细胞骨架抑制剂或GPIIb/IIIa拮抗剂。
11.根据权利要求9所述的诊断组合物，其中，所述纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶、氨甲环酸、或6-氨基己酸。
12.根据权利要求9所述的诊断组合物，其中，所述肝素抑制剂选自肝素酶、鱼精蛋白或鱼精蛋白相关肽。
13.根据前述权利要求的一项或多项所述的诊断组合物，其中，所述凝固因子选自一种或多种凝固因子或活化凝固因子，优选FXa或FVa或活化蛋白C或FVIIa。
14.根据前述权利要求的一项或多项所述的诊断组合物，其中，CaCl2的存在量为约1-100μmol/ml所述测试液体，优选血液样品。
15.根据前述权利要求的一项或多项所述的诊断组合物，其中，所述干形式是冻干形式。
16.根据前述权利要求的一项或多项所述的诊断组合物，进一步包含稳定剂。
17.根据前述权利要求的一项或多项所述的诊断组合物，其中，所述稳定剂是白蛋白或明胶。
18.一种容器，包含根据权利要求1-17的一项或多项所述的诊断组合物。
19.根据权利要求18所述的容器，其中，所述容器（1）具有瓶或槽的形式。
20.根据权利要求19所述的容器，以这样的方式形成所述容器：内横向剖面从开口到底部是减小的。
21.根据权利要求18-20所述的容器，所述容器的内部以所述容器能够连接于用于进行粘弹性测量的装置的方式成形。
22.根据权利要求21所述的容器，由至少两种不同材料构成，其中，基本上或至少部分地形成所述容器的外形的一种材料能够通过合适的盖来密封所述容器，而基本上覆盖接收所述测试液体的部分的另一种材料则能够适当附着血液或血液成分而没有激活凝固级联。
23.一种用于对测试液体进行粘弹性分析的方法，包括以下步骤：
a）获得测试液体；
b）提供根据权利要求18-22的一项所述的容器（1）；
c）将所述测试液体加入所述容器（1），从而溶解包含在其中的诊断组合物；
d）可选地将所述测试液体和所述诊断组合物的混合物转移到适于进行粘弹性分析的装置（4）内；
或者
将所述容器（1）放入适于进行粘弹性分析的装置（4）内；以及
e）进行所述混合物的粘弹性分析。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述测试液体是血液样品，优选哺乳动物血液样品，更优选人血液样品。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述血液样品是全血或血浆。
26.根据权利要求23-25的一项或多项所述的方法，其中，步骤c）进行约1-60秒，优选约2-10秒，更优选约5秒。
27.根据权利要求23-26的一项或多项所述的方法，其中，在步骤d）中，通过手动或自动吸移来自所述容器（1）的混合物并转移它，将所述混合物转移到所述装置（4）。
28.根据权利要求23-27的一项或多项所述的方法，其中，将所述混合物转移到所述装置（4）的量杯（2）。
29.根据权利要求23-28的一项或多项所述的方法，其中，所述装置（4）是血栓弹性仪或血栓弹性描记器。
30.根据权利要求23-28的一项或多项所述的方法，其中，所述分析包括测定：凝结时间、凝块形成时间、随着时间的推移凝块的牢固度、和/或纤维蛋白溶解。
31.根据权利要求1-17的一项或多项所述的诊断组合物或根据权利要求18-22的一项或多项所述的容器（1）在用于分析测试液体的粘弹行为的方法中的应用。
32.根据权利要求31所述的应用，其中，在组合方法中，至少两种根据权利要求1-17的一种或多种所述的诊断组合物或至少两个根据权利要求18-22的一种或多种所述的容器（1）用于分析相同测试液体的粘弹行为。
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