CN106574922B - 用于检测纤维蛋白溶解和纤溶亢进的方法学和试剂 - Google Patents

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Abstract

在一些实施方案中，本发明提供了检测来自患者的血液样品中纤维蛋白溶解或纤溶亢进的方法。该方法包括使包含降低的血小板功能的血液样品的第一部分在不存在纤维蛋白溶解抑制剂的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第一部分的凝血特征；并且使包含降低的血小板功能的血液样品的第二部分在纤维蛋白溶解抑制剂存在的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第二部分的凝血特征；其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。在一些实施方案中，本发明还提供适用于使用粘弹性分析检测血液样品中纤溶亢进或纤维蛋白溶解的容器，包含具有涂层的内部，所述涂层包含纤维蛋白溶解抑制剂。

Description

用于检测纤维蛋白溶解和纤溶亢进的方法学和试剂
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明借助美国政府支持在美国国立卫生研究院资助号NIH- T32-GM008315下做出。美国政府在本发明中享有一定的权利。
背景技术
本发明涉及止血。
止血是引起出血停止的严密调控的过程。在身体内，循环的血液在正常条件下保持为流体，但是当血管系统完整性遭破坏时形成局部血块。创伤、感染和炎症均激活血液的凝血系统，这取决于两个独立系统的相互作用：凝血级联中的酶蛋白(例如，凝血因子诸如因子VII 或因子IX)和活化的血小板。这两个系统协调工作以堵住破损血管中的缺损。
止血期间形成的血凝块(也称作血栓)由两个部分组成—血小板塞和交联的纤维蛋白网。纤维蛋白由在凝血级联期间活化的凝血酶将纤维蛋白原切割成纤维蛋白而产生(参见图1)。血凝块需要具有足够强度以抵抗由循环的血液所致的移动或机械运动。如果特定凝血因子机能不良或不存在，如血友病中那样，形成的纤维蛋白的量不足。类似地，创伤情况下凝血因子的大量消耗减少所形成的纤维蛋白的量。因创伤、手术或化疗所致的血小板数目不足也减少血小板聚集，遗传病、尿毒症或水杨酸酯治疗同样如此。最终，减少的纤维蛋白形成或血小板聚集产生拉伸强度不足的血块。这种低可凝状态令患者易于出血。相反，内皮损伤、淤滞、癌症、遗传疾病或其他高可凝状态导致血栓(即，血凝块)形成，如深静脉血栓形成、肺栓塞和动脉闭塞诸如卒中和心肌梗死中所例示的。
纤溶酶的前体(纤溶酶原)是掺入血凝块的无活性蛋白质。组织纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶能够将纤溶酶原转化成纤溶酶，因此活化它并引起纤维蛋白溶解发生。纤维蛋白溶解(分解血凝块从而它们不引起问题的过程)是一个正常生物学过程。正常情况下，t-PA由受损的血管内皮非常缓慢地释放入血液。作为结果，在出血停止后，血块遭分解，因为血块中无活性的纤溶酶原活化已变成纤溶酶，纤溶酶发挥作用以分解将血块固定在一起的纤维蛋白网。被称作纤维蛋白降解产物(FDP)的所得片段随后由其他酶或由肾和肝清除。
在一些情况下，纤溶亢进也可能发生。这种病况(一种纤维蛋白溶解活性明显增强的凝血病(出血障碍)形式)导致增加的和有时致命的出血。
纤溶亢进可以是获得性的或可以是先天性的。纤溶亢进的先天性原因罕见并且包括α-2-抗纤溶酶(α-2-纤溶酶抑制剂)缺乏和1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)缺乏。受累个体显示血友病样出血表型。
获得性纤溶亢进可以在肝病患者、严重创伤患者、接受外科大手术的患者和患有其他病况的患者中发生。实际上，多达20％的严重损伤创伤患者受获得性纤溶亢进侵袭，其他大出血患者也是如此。
检测纤维蛋白溶解和纤溶亢进的已知方法包括检测生物标记物 (诸如D-Dimer(交联的纤维蛋白降解产物)、纤维蛋白原分解产物 (FSP)、纤溶酶和α-2-抗纤溶酶(PAP)复合物)升高的间接免疫化学方法。然而，这些方法的灵敏度和特异性有限，原因是这些生物标记物的升高也可能在其他病况下诱导出现。经典的凝血试验诸如PT(凝血酶原时间)、aPPT(活化的部分促凝血酶原激酶时间)或凝血酶时间对纤维蛋白溶解和纤溶亢进并不非常敏感，并且受许多其他变量影响。
因此，存在快速并准确诊断和/或检测纤维蛋白溶解和纤溶亢进的方法的需要。
实施方案概述
本发明提供快速并准确检测血液样品中纤维蛋白溶解和纤溶亢进的方法和试剂。
因此，在一个方面，本发明提供一种检测血液样品中纤维蛋白溶解或纤溶亢进的方法。该方法包括使包含降低的血小板功能的血液样品的第一部分在不存在纤维蛋白溶解抑制剂的第一容器中接受粘弹性分析以在时间点获得第一部分的凝血特征；并且使包含降低的血小板功能的血液样品的第二部分在包含纤维蛋白溶解抑制剂的第二容器中接受粘弹性分析以在时间点获得第二部分的凝血特征；其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。在一些实施方案中，血液样品(例如，在血液样品中血小板功能降低之前)取自来源。在一些实施方案中，来源是血液捐赠载具(例如，袋或管)。在一些实施方案中，来源是患者是人。在一些实施方案中，取得血液样品的患者对方法中所用的纤维蛋白溶解抑制剂有反应。
在一些实施方案中，凝血特征是粘弹性分析的输出幅度。在一些实施方案中，凝血特征是粘弹性分析的输出幅度的一阶导数。在一些实施方案中，时间点是在第一部分的血块最大强度的时候。在一些实施方案中，时间点是在启动粘弹性分析后约15分钟至约35分钟之间或是在启动粘弹性分析后少于20分钟。在一些实施方案中，获得的时间点是在未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中血块坚实度达到 20mm的时间。
在各种实施方案中，第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间为至少1％的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。在其他实施方案中，第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间为至少2％的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。
在一些实施方案中，包含降低的血小板功能的血液样品包含血小板功能抑制剂。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是糖蛋白 IIb/IIIa受体抑制剂，如阿昔单抗、依替巴肽或替罗非班。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂或血栓烷抑制剂。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是松胞菌素D。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是不同抑制剂的组合，例如，阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、腺苷二磷酸(ADP) 受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂、血栓烷抑制剂和/或松胞菌素D的组合。
在一些实施方案中，包含降低的血小板功能的血液样品是血小板减少的血液样品。例如，可以通过从血液样品物理移除血小板获得血小板减少的血液样品。
在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂是氨基己酸、ε-氨基己酸或抑蛋白酶多肽。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂是氨基己酸、ε-氨基己酸、氨甲环酸和/或抑蛋白酶多肽的组合。
在一些实施方案中，在谐振频率激发样品并且可以在凝血出现时借助电磁源或光源观察它的行为。在其他实施方案中，样品的特征可以使用光源在不激发样品的情况下观察变化。
在一些实施方案中，使用止血分析仪进行粘弹性分析。止血分析仪可以是TEG血栓弹力图分析仪系统或在ROTEM血栓弹力计量术分析仪系统中。
在一些实施方案中，使用第一和第二容器和第一销钉和第二销钉进行粘弹性分析，其中第一销钉相对于第一容器移动并且第二销钉相对于第二容器移动。在一些实施方案中，用第一和第二容器和第一销钉和第二销钉进行粘弹性分析，其中第一容器相对于第一销钉移动并且第二容器相对于第二销钉移动。
在一些实施方案中，在谐振频率激发样品并且可以在凝血出现时借助电磁源或光源观察它的行为。在其他实施方案中，样品的特征可以使用光源在不激发样品的情况下观察变化。
在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂包含于第二容器内部上的涂层中。在一些实施方案中，第一容器和第二容器位于单一盒上。
在一些实施方案中，血小板功能抑制剂包含于第一容器内部和第二容器内部上的涂层中。在一些实施方案中，将血小板功能抑制剂添加至样品。
在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定纤维蛋白溶解抑制剂的方法，所述纤维蛋白溶解抑制剂将在出现或可能出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进的患者中实现有益反应，所述方法包括：使包含降低的血小板功能的血液样品的第一部分在不存在纤维蛋白溶解抑制剂的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第一部分的凝血特征；使包含降低的血小板功能的血液样品的第二部分在存在第一纤维蛋白溶解抑制剂的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第二部分的凝血特征；使包含降低的血小板功能的血液样品的第三部分在第一纤维蛋白溶解抑制剂存在的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第三部分的凝血特征；并且比较在第一抑制剂存在的情况下第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的第一差异，和在第二抑制剂存在的情况下第一部分的凝血特征和第三部分的凝血特征之间的第二差异，其中如果第一差异大于第二差异，患者将从第一抑制剂治疗获得有益结果，而如果第二差异是大于第一差异，患者将从第二抑制剂治疗获得有益结果。
在一些实施方案中，患者是人。
在一些实施方案中，第一纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解的第一抑制剂和第二抑制剂中的每一个选自ε-氨基己酸、氨甲环酸、氨基己酸和抑蛋白酶多肽，其中第一抑制剂和第二抑制剂不是相同的。
在又一个方面，本发明提供一种容器，其适用于使用粘弹性分析检测血液样品中纤溶亢进或纤维蛋白溶解，所述容器包含具有涂层的内部，所述涂层包含纤维蛋白溶解抑制剂。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂是氨基己酸、ε-氨基己酸或抑蛋白酶多肽。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂是氨基己酸、ε-氨基己酸、氨甲环酸和/或抑蛋白酶多肽的组合。
在一些实施方案中，使用TEG血栓弹力图分析仪系统或在 ROTEM血栓弹力计量术分析仪系统中进行粘弹性分析。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂与糖一起配制于涂层中。在一些实施方案中，抑制剂与叠氮钠一起配制于涂层中。
在一些实施方案中，涂层还包含血小板功能抑制剂。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，诸如阿昔单抗、依替巴肽或替罗非班。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂或血栓烷抑制剂。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是松胞菌素D。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是不同抑制剂的组合，例如，阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂、血栓烷抑制剂和/或松胞菌素D的组合。
在一些实施方案中，容器位于盒或板上，其中盒或板还包括第二容器。
附图简述
将通过参考以下发明详述，参考附图更容易地理解前述实施方案的特征，其中：
图1是显示凝血级联的示意图，所示凝血级联最终导致由交联的纤维蛋白构成的纤维蛋白血块的形成。t-PA激活纤溶酶原产生纤溶酶，所述纤溶酶将纤维蛋白降解成纤维蛋白降解产物。
图2是显示来自止血过程正常(即，纤维蛋白溶解的量正常并且无纤溶亢进)的样品的TEG描迹的示意图。R(反应时间)是形成纤维蛋白链聚合物的时间，K(血块动力学，以分钟计量)是血块形成的速度，α是从R至K引出的斜率，并且MA(最大幅度，以mm计量)是血块的强度。LY30是在MA后30分钟存在的溶解百分数。
图3A是显示TEMogram描迹的示意图。CT表示凝固时间，CFT 表示血块形成时间，α是α角，λ角是溶解速率，MCF是血块最大坚实度，LI130是CT后30分钟的溶解指数，并且ML是最大溶解。
图3B是显示另一个TEMogram描迹的示意图。
图4是显示显示LY30量值的计算的TEG描迹示意图。
图5是显示经氨甲环酸(一种非限制性纤维蛋白溶解抑制剂)处理的血液样品(顶部线，蓝色)和未经氨甲环酸处理的血液样品(底部线，红色)的TEG描迹的差异的示意图。在本图显示其结果的实验中，两种血液样品将用非限制的血小板功能抑制剂处理。
图6是显示经氨甲环酸处理(一种非限制性纤维蛋白溶解抑制剂) 的血液样品(顶部线，绿色)和未经氨甲环酸处理的血液样品(底部线，蓝色)的TEG描迹的差异的示意图。在本图显示其结果的实验中，两种血液样品将用非限制的血小板功能抑制剂处理。将LY30值叠加在未经氨甲环酸处理的血液样品的TEG描迹上。
图7是ΔV@MA对渐增加浓度的t-PA作图的直线图。
图8是ΔV@MA对ΔLY30作图的直线图。
图9是使用柠檬酸盐化高岭土TEG测定法时来自15位健康供体的血液样品的LY30对渐增加浓度的t-PA作图的直线图。
图10是使用本文所述的非限制性方法之一时来自15位健康供体的血液样品的ΔLY30对渐增加浓度的t-PA作图的直线图，其中ΔLY30 是在功能性纤维蛋白原测定法的LY30和功能性纤维蛋白原测定法在纤维蛋白溶解抑制剂氨甲环酸存在下的LY30之间的差异。
具体实施方案详述
在一些实施方案中，本发明提供了用于检测纤维蛋白溶解和纤溶亢进的方法和试剂(例如，杯)。本发明部分地源自意料之外的发现：参与血块的血小板可以部分地掩蔽纤维蛋白溶解的启动和扩展程度。因此，降低就其止血状态受检的血液样品中的血小板功能可以加快血液样品(和取得血液样品的患者中)中纤维蛋白溶解和纤溶亢进的检测。
本文中提及的出版物(包括专利出版物)、网站、公司名称和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识并且是因而通过引用的方式完整并入至相同的程度，如同专门且逐一指明通过引用的方式并入前述每一者。在本文中援引的任何参考文献和本说明书的具体教授内容之间的任何冲突应当在支持后者的情况下解决。
如本文所用，术语‘止血”(或“止血”)意指通过血液凝固引起出血停止的过程，并且还意指凝固的血液(或血凝块)借以溶解的过程。本术语包括通过形成含纤维蛋白的血凝块而凝血和通过激活纤溶酶分解这种血凝块以溶解将血块固定在一起的纤维蛋白网。
止血是动态、极其复杂的过程，其涉及许多相互作用的因子，所述因子包括凝血蛋白和纤维蛋白溶解蛋白、激活物、抑制物和细胞成分诸如血小板细胞骨架、血小板胞质颗粒物和血小板细胞表面。作为结果，在激活期间，没有因子保持静态或孤立发挥作用。因此，为了完整，需要将患者止血过程的全部阶段作为全血组分的净产物按照非孤立或非静态方式连续测量。为了给出测量止血过程孤立部分的结果的例子，假定患者出现由纤溶酶原活化成为纤溶酶(分解血块的酶)引起的纤维蛋白溶解。在这种情况下，这个过程的副产物是如同抗凝血药那样起作用的纤维蛋白原降解产物(FDP)。如果患者仅接受抗凝检验并且因此受到治疗，则这位患者可能面临风险，原因在于未用抗纤维蛋白溶解剂治疗(例如，用氨甲环酸治疗)。
检测纤维蛋白溶解或纤溶亢进是困难的。另外，为了有益于可能需要用抗纤维蛋白溶解剂治疗(例如，在手术或创伤期间)的患者，纤维蛋白溶解或纤溶亢进的检测优选地非常迅速的检测。在一些实施方案中，本发明提供了用于快速检测血液样品中纤维蛋白溶解或纤溶亢进的方法和试剂。
因此，在第一方面，本发明提供用于检测血液样品中纤维蛋白溶解或纤溶亢进的方法，所述方法包括获得血液样品，其中血液样品具有降低的血小板功能；使血液样品的第一部分在纤维蛋白溶解抑制剂存在的情况下接受粘弹性分析以在某个时间点获得第一部分的凝血特征；并且使血液样品的第二部分在纤维蛋白溶解抑制剂不存在的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得的第二部分的凝血特征；其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。
在一些实施方案中，血液样品(例如，在血液样品中血小板功能降低之前)取自来源。来源可以是任何来源，包括捐赠袋或直接来自患者。在一些实施方案中，取得血液样品的患者对方法中所用的纤维蛋白溶解抑制剂有反应。
如本文所用，术语“纤维蛋白溶解”意指因血块中无活性纤溶酶原转变成活性纤溶酶而分解血凝块。在纤维蛋白溶解期间，活性纤溶酶分解将血块固定在一起的纤维蛋白网(参见图1)。
“纤溶亢进”意指一种纤维蛋白溶解活性明显增强的凝血病(出血障碍)形式，其导致增加的和有时致命的出血。纤溶亢进可以是获得性的或可以是先天性的。先天性纤溶亢进可能归因于α-2-抗纤溶酶(α-2- 纤溶酶抑制剂)缺乏和1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)缺乏。获得性纤溶亢进可以在肝病患者、严重创伤患者、接受外科大手术的患者和患有其他病况的患者中发生。实际上，多达20％的严重损伤创伤患者受获得性纤溶亢进侵袭，其他大出血患者也是如此。
如本文所用，“血液样品”意指例如从患者取得的血液的样品。该患者可以是人，但也可以是任何其他动物(例如，兽医动物或外来动物)。血液是生物中携带氧和营养物质至组织并带走二氧化碳和各种代谢产物供排泄的循环组织。血液由红细胞、白细胞和血小板悬浮于其中的浅黄色或灰黄色流体(血浆)组成。
在一些实施方案中，血液样品是全血。血液可以是未处理的，或可以是柠檬酸盐化的血液(例如，收集到3.5mL含有3.2％柠檬酸盐的容器中的全血)。
“粘弹性分析”意指测量弹性固体(例如，纤维蛋白固体)和流体的特征的任何分析方法。换言之，粘弹性分析允许研究粘稠流体(如血液或血液样品)的特性。在一些实施方案中，粘弹性分析在这样的条件下进行，所述条件模拟导致止血的体内条件。例如，条件可以包括模拟体温(例如，37℃的温度)的温度。条件还可以包括以模拟在血管中存在的那些流速的流速下血块形成和溶解。
在一些实施方案中，血液样品的粘弹性分析可以包括在止血分析仪仪器上使血液样品接受分析。一个非限制性粘弹性分析方法是血栓弹力图(“TEG”)测定法。因此在一些实施方案中，粘弹性分析包括使血液样品接受用血栓弹力图(TEG)分析，这首先由HelmutHartert在德国于二十世纪四十年代描述。
执行血栓弹力图法的各种装置和及其使用方法在中描述美国专利公开号5,223,227；6,225,126；6,537,819；7,182,913；6,613,573； 6,787,363；7,179,652；7,732,213,8,008,086；7,754,489；7,939,329； 8,076,144；6,797,419；6,890,299；7,524,670；7,811,792；20070092405； 20070059840；8,421,458；US 20120301967；和7,261,861，所述每篇文献的完整公开内容因而通过引用的方式明确并入本文。
血栓弹力图(TE)在类似于静脉血迟缓流动的低剪切环境下诱导形成血块时监测血液的弹性特性。正在形成的血块的剪切弹性的变化样式使得能够实现测定血块形成的动力学以及所形成血块的强度和稳定性；简而言之，正在形成的血块的力学性能。如上文所述，血块的动力学、强度和稳定性提供关于血块执行“机械功”(即，抵抗循环血液的变形剪应力)的能力的信息。实质上，血块是止血的基本手段。测量止血过程的止血仪器能够测量血块在其结构性形成期间自始至终执行机械功的能力。通过血凝速率强化和最终通过历经血块溶解的血块强度，从检验起始时间直至初始纤维蛋白形成，这些止血分析仪将患者止血过程的全部阶段作为全血组分的净产物按照非孤立或非静态方式连续测量。
在一些实施方案中，粘弹性分析和/或止血分析仪包含与血液接触的容器。
如本文所用，“容器”意指刚性表面(例如，固体表面)，所述刚性表面的一部分在粘弹性分析期间的任何时点接触置入容器的血液样品的一部分。接触血液样品的部分的容器部分也可以称作容器的“内部”。注意，短语“进入容器”不意指容器具有与血液样品的部分接触的底面。相反，容器可以是环形结构，其中环的内部是容器的内部，意指环的内是环形容器中与血液样品的部分接触的部分。血液样品可以例如借助真空压力或表面张力流动进入容器并装在其中。
另外，纳入这个定义的额外类型的容器是在板和盒(例如，微流体盒)上存在的那些容器，其中板或盒在板或盒中具有多个通道、储器、隧道和环。如该术语本文所用那样，每个连续通道(例如包括，通道、储器和环)均是容器。因此，在一个盒上可以存在多个容器。美国专利号7,261,861(其通过引用方式并入本文)描述了具有多个通道或容器的这样的盒。如果盒的任何通道或隧道中的任何表面在粘弹性分析期间的任何时间与血液样品的任何部分接触，则该表面可以是容器的内部。
美国专利号7,261,861；美国专利公开号US20070092405；和美国专利公开号US20070059840中描述了一个非限制性止血分析仪装置。
用血栓弹力图法执行粘弹性分析的另一个非限制性止血分析仪仪器是由Haemonetics,Corp.(Braintree,MA)商业出售的TEG血栓弹力图止血分析仪系统。
因此，可以使用TEG血栓弹力图止血分析仪系统进行TEG测定法，所述系统测量正在演进的血凝块的机械强度。为了运行该测定法，将血液样品置于容器(例如，杯或小池)中，并且金属销钉进入容器的中心。与容器内壁接触(或向容器添加凝血激活物)启动血块形成。TEG 血栓弹力图止血分析仪随后以摆动的方式转动容器，每10秒转动大约 4.45度至4.75度、以模仿缓慢的静脉流动并激活凝血。随着纤维蛋白和血小板聚集物形成，它们将容器的内部与金属销钉连接，转移用于移动容器的销钉中的能量。与销钉连接的扭丝测量随时间推移的血块强度，其中输出的量级与血块的强度直接成比例。当血块的强度随时间推移而增加时，经典TEG描迹曲线形成(参见图2)。
销钉的回转运动由换能器转换成电信号，所述电信号可以由包括处理器和控制程序的计算机监测。计算机可依赖电信号操作以产生与测量的凝血过程相对应的止血谱图。另外，计算机可以包括视觉显示器或连接至打印机以提供止血谱图的视觉展示。计算机的此类配置完全处于本领域普通技术人员的技能范围内。如图2中所示，所产生的止血谱图(即，TEG描迹曲线)是形成首条纤维蛋白链耗费的时间、血块形成动力学、血块强度(以毫米(mm)计量并换算成剪切弹性单位达因/cm2)和血块溶解的度量。还参见通过引用方式并入本文的Donahue 等人,J.Veterinary Emergency and Critical Care:15(1):9-16.(2005年 3月)。
对测量的这些参数中几种参数的说明如下：
R是从血液置于TEG 5000分析仪内的时间直至初始纤维蛋白形成的潜伏时间段。这一般耗费约30秒至约10分钟。对于处于低可凝状态(即，血液凝固性降低的状态)的患者，R数值较长，而在高可凝状态(即，血液凝固性增加的状态)下，R数值较短。
K值(以分钟计量)是从R结束直至血块达到20mm的时间并且这代表血块形成的速度。这种K值是约0至约4分钟(即，在R结束后)。在低可凝状态下，K数值较长，而在高可凝状态下，K数值较短。
α测量纤维蛋白积累和交联(血块强化)的快速程度。它是从相切于曲线的分割点形成的直线和水平轴之间的角度。这个角度一般是约47°至74°。在低可凝状态，α度较低，而在高可凝状态，α度较高。
以mm计的MA或最大幅度是随纤维蛋白和血小板结合作用的最大动态性能直接变化并且代表纤维蛋白血块的最终强度。这个数值一般是从约54mm至约72mm，并且MA一般在开始粘弹性测定法后约15至约35分钟之间出现。注意如果受检的血液样品具有降低的血小板功能，这个MA代表仅基于纤维蛋白的血块的强度。MA的下降可反映低可凝状态(例如，存在血小板功能障碍或血小板减少症)，而增加的MA(例如，伴有R减少)可能提示高可凝状态。
LY30测量MA后30分钟的幅度降低的速率并且代表血块缩回或溶解。因此LY30是MA后30分钟的幅度下降百分数。这个数值一般是0％至约8％。在一些实施方案中，如果LY30大于7.5％，则低可凝状态存在。然而，近来的研究结果已经显示，这个百分数可能太高，以至于不能鉴定患者中的低可凝状态。因此，在一些实施方案中，大于6％、或大于约5％、或大于约4％、或大于约3.5％、或大于约3％的LY30鉴定具有低可凝状态的患者。
如果出现纤维蛋白溶解，纤维蛋白溶解或血块溶解降低血块的强度，从而造成TEG描迹的最大幅度(MA)下降，引起LY30百分数升高(参见图2)。
可以使用的另一种粘弹性止血测定法是血栓弹力计量术(“TEM”) 测定法。这种TEM测定法可以使用其用途是熟知的ROTEM血栓弹力计量术凝血分析仪(TEMInternational GmbH，慕尼黑，德国)进行 (参见，例如，Sorensen,B.等人, J.Thromb.Haemost.,2003.1(3):第 551-8页；Ingerslev,J.等人,Haemophilia,2003.9(4):第348-52页； Fenger-Eriksen,C.等人Br J Anaesth,2005.94(3):第324-9页)。在ROTEM分析仪中，血液样品置于容器(也称作小池或杯)中并且将圆柱状销钉浸没。在销钉和容器内壁之间存在容器存在由血液衔接的1 mm间隙。销钉由弹簧转动至右边和左边。只要血液为液态(即，未凝固)，移动就不受限制。然而，当血液开始凝固时，随着渐增的血块坚实度，血块日益地限制销钉的转动。销钉与光学检测器连接。这种动力学以机械方式检出并由一体化计算机计算成常见描迹曲线 (TEMogram)和数值参数(参见图3A和图3B)。
在ROTEM血栓弹力计量术测量凝血分析仪中，销钉的移动可以由包括处理器和控制程序的计算机监测。计算机可依赖电信号操作以产生与测量的凝血过程相对应的止血谱图。另外，计算机可以包括视觉显示器或连接至打印机以提供止血谱图的视觉展示(称作TEMogram)。计算机的此类配置完全处于本领域普通技术人员的技能范围内。如图3A和图3B中所示，所产生的止血谱图(即，TEM描迹曲线)是形成首条纤维蛋白链耗费的时间、血块形成动力学、血块强度 (以毫米(mm)计量并换算成剪切弹性单位dyn/cm2)和血块溶解的度量。对测量的这些参数中几种参数的说明如下：
CT(凝固时间)是从血液置于ROME分析仪的时间直至血块开始形成的潜伏时间段。
CFT(血块形成时间)：从CT直至已经达到20mm的血块坚实度点的时间。
α角：α角是在2和曲线之间的正切角度。
以mm计的MA或最大幅度随纤维蛋白和血小板结合作用的最大动态性能直接变化并且代表纤维蛋白凝块的最终强度。如果受检的血液样品具有降低的血小板功能，这个MA仅是纤维蛋白键合作用的直接函数。
MCF(血块最大坚实度)：MCF是迹线的最大垂直幅度。MCF反映纤维蛋白和血小板血块的绝对强度。
A10(或A5、A15或A20值)。这个值描述在10(或5或15或20) 分钟后获得的血块坚实度(或幅度)并且在早期提供期望的MCF值的预测。
LI30(30分钟后的溶解指数)。LI30值是在CT后30分钟处相对于MCF值的剩余血块稳定性的百分数。
ML(最大溶解)。ML参数描述了在任何选定时间点观察的或已经停止试验时的已损失血块稳定性(相对于MCF，以％计)的百分数。
低LI30值或高ML值表示纤溶亢进。尽管正常血液中纤维蛋白溶解活性十分低，在临床样品中，血块稳定性因纤溶亢进而更快损失可能导致可以通过施用抗纤维蛋白溶解药物治疗的出血并发症。
因此，在TEG或TEM测定法中的目的参数包括反映血块强度的血块最大强度。这是TEG测定法中的MA值和TEM测定法中的MCF 值。TEG中的反应时间(R)(以秒计量)和TEG中的凝固时间(CT)是直至存在血块的首个证据的时间；血块动力学(K，以分钟计量)是TEG 试验中表示血块坚实度的实现的参数；并且TEG中的α或TEM中的α角是来自切线的角度量度，所述切线画到TEG描迹曲线或TEM描迹的曲线，所述曲线始于反映血块形成动力学的血块反应时间点。(参见Trapani,L.M.Thromboelastography:Current Applications, FutureDirections”,Open Journal of Anesthesiology 3(1):Article ID: 27628,5页(2013)；和Kroll,M..H.,“Thromboelastography:Theory and Practice in MeasuringHemostasis,”Clinical Laboratory News:Thromboelastography 36(12),2010年12月；TEG仪使用手册(可从 Haemonetics,Corp.获得)和ROTEM仪器使用手册(可从TEMInternational GmbH获得)，全部文件均通过引用方式完整地并入本文。
在一些实施方案中，通过观察凝血发生时样品的不同激发水平，记录参数(并因此记录凝血特征)。例如，在容器是微流体盒或盒中特定通道的情况下，可以在谐振频率激发样品并且可以在凝血出现时借助电磁源或光源观察它的行为。在其他实施方案中，样品的凝血特征可以用光源在不激发样品的情况下观察变化。
因为单个盒可以具有多个容器(例如，盒中的不同通道)，所以接触纤维蛋白溶解抑制剂的容器中的样品容易地与不接触纤维蛋白溶解抑制剂的容器(例如，相同微流体盒中的毗邻通道内)中的样品直接可比。
当无纤维蛋白溶解出现时，TEG描迹上MA处的幅度值和TEM 描迹上MCF处的幅度值保持恒定或可能因血块回缩而略微降低。然而，随着纤维蛋白溶解发生(例如，处于低可凝状态)，TEG描迹和TEM 描迹的曲线开始衰减。TEG测定法中最大幅度后30分钟内所致的潜在曲线下面积损失称作LY30(参见图4)。LY30(最大幅度点后30分钟的溶解百分数(表述为溶解的血块的百分数))和血块坚实度(G，以达因 /cm2计量)表示血块溶解速率。TEM测定法中的相应值是LI30值(参见图3A)。
这个LY30是纤维蛋白溶解的常见度量。然而，这个参数具有一些局限，包括缺少灵敏度和特异性。最重要地，LY30参数耗时至少 30分钟获得。在正常患者中，至少30分钟内获得LY30(因为无论血块首先耗费多少时间形成，都必须增加30分钟)是适当的。但是，在一些情况下(例如，在发生创伤、出血或在手术期间的患者中)，等待至少30分钟以确定患者的血液是否正在凝固通常可能有损于患者的健康。对于LY30高的处于低可凝状态的这些患者，可以更快地用纤维蛋白溶解抑制剂(例如，氨甲环酸或抑蛋白酶多肽)治疗患者。
如本文所用，“凝血特征”意指指示受检的血液样品的止血状态的参数。例如，凝血特征可以是粘弹性分析的输出就某个时间点而言的幅度。注意，获得凝血特征的时间不需要是未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的样品的MA。该时间点可以是任何时间点，只要时间点是相同的。例如，时间点可以在开始粘弹性分析测定法后约15分钟至约35 分钟之间。该时间点也可以是当纤维蛋白溶解抑制剂处理的样品的 TEG描迹开始与未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的样品的TEG描迹趋异时的时刻。因此，时间点可以是在开始粘弹性分析后早至约2分钟或约5分钟。
使用粘弹性分析测定法测量的其他凝血特征可以按照相似的方式使用以确定患者是否出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进。例如，在TEG 测定法中，可以比较R(反应时间)、K(实现血块坚实度的时间)、α(血块形成动力学)、MA(最大幅度)和LY30的任一者(参见图2和图4)。对于TEM测定法，可以比较CT(凝固时间)、CFT(血块形成时间)、α角、MCF(血块最大坚实度)、A10(CT后10分钟的幅度)、LI30(CT后 30分钟的溶解指数)和ML(最大溶解)的任一者(参见图3A-3B)，以及任何和全部这些参数的导数也可以用作凝血特征。
在一些实施方案中，来自未经抗纤维蛋白溶解剂处理的血液样品 (例如，血小板功能降低的样品)的粘弹性读数的导数与来自经抗纤维蛋白溶解剂处理的血液样品的粘弹性读数的导数比较。出于历史原因， TEG描迹或TEM描迹的参数在y轴上显示幅度(以mm计)并且在x 轴上显示时间。因此，TEG描迹或TEM描迹的一阶导数是速率(即，描迹线的斜率)。因此，来自未经抗纤维蛋白溶解剂处理的血液样品的描迹的速率可与来自经抗纤维蛋白溶解剂处理的血液样品的粘弹性读数的速率比较。这个值称作ΔVA。当ΔVA中存在差异时，该差异鉴定了样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。
在一些实施方案中，ΔVA在未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的样品的MA处获得。为方便起见，这个凝血特征称作ΔVA@MA。在图6 中，将ΔVA@MA作为两个描迹之间在24分钟的双向箭头描述。
注意，用作凝血特征的任何参数(例如，ΔVA、ΔLY30)可以通过标准方法获得。另外，可以使用计算机、计算器或计算机程序或软件获得参数。
当然，也可以获得速率的二阶导数并且可在未经抗纤维蛋白溶解剂处理的样品和经纤维蛋白溶解剂处理的样品之间进行比较。实际上，用作凝血特征的参数将影响方法的灵敏度；然而，方法不应当限于任一个作为凝血特征的具体参数。实际上，在创伤情况下，一般熟练的医师可以对来自患者血液样品(例如，缺少血小板的血液样品)简单地实时(不含抗纤维蛋白溶解剂的一份样品和含抗纤维蛋白溶解剂的一份样品)进行粘弹性测定法(例如，TEG测定法)，并且一旦两个描迹开始趋异(例如，早至开始测定法后两个分钟)，医师可以在那一时刻选择用抗纤维蛋白溶解剂治疗该患者。因此，患者中检测纤维蛋白溶解或纤溶亢进的速度有临床意义，特别在其中生存和死亡结局可能在数分钟内决定的创伤患者的情况下。
本文所述的方法因此比较了经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中的凝血特征和未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中的相同凝血特征。在具有正常血液的患者中，在经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中和未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中的选定凝血特征将相同或将非常明显地相似。但是，在出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进的患者中，在经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中和未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中的选定凝血特征将不同。在一些实施方案中，在出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进的患者中，经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品的凝血特征和未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品之间的差异将是至少1％差异、或至少1.5％差异、或至少2％差异、或至少2.5％差异、或至少3％差异、或至少3.5％差异、或至少4％差异、或至少4.5％差异、或至少5％差异、或至少10％差异。如本领域技术人员将理解的是，不同的量将当然取决于用作凝血特征的参数。
本发明部分地源自如下尝试：通过添加抗纤维蛋白溶解剂(即，纤维蛋白溶解抑制剂)至受检的血液样品而减少检测纤维蛋白溶解和纤溶亢进所需的时间量。在本公开中描述的发现之前，一旦LY30百分数可获得，则患者可以使用TEG装置(例如，可从Haemonetics,Corp., Braintree,MA,美国商业获得)被最早鉴定为出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进。甚至在最快速的环境下，假定反应时间为4分钟，K时间为 0分钟、在9分钟实现MA并且LY30分析为30分钟，LY30百分数可从开始粘弹性测定法起不早于43分钟获得。通常，LY30百分数直到开始粘弹性测定法后至少50分钟才可获得。通过跳过LY30时间局限，在一些实施方案中，本文所述的方法可以提供比可以获得相同患者的LY30百分数早至少30分钟、并且在一些实施方案中甚至更快提供比可以获得LY30百分数早30分钟的关于患者止血状态的结果。
应当指出，当提到“相同患者”时，这意指在相同时间的相同患者。因此，作为完全健康个体的患者不是与刚遭受严重损伤的相同健康个体相同的患者(出于本定义的目的)。显然，完全健康个体的未受损个体可能根本没有LY30百分数。
在一些实施方案中，获得凝血特征的时间点是在开始粘弹性测定法后少于30分钟。在一些实施方案中，获得凝血特征的时间点是在开始粘弹性测定法后少于20分钟、或是在开始粘弹性测定法后少于15 分钟、或是在开始粘弹性测定法后少于10分钟、或在开始粘弹性测定法后少于5分钟。在一些实施方案中，获得凝血特征的时间点是未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品的最大幅度的时间。在一些实施方案中，获得凝血特征的时间点是未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品的血块最大坚实度的时间。在一些实施方案中，获得凝血特征的时间点是在未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中血块坚实度达到20mm的时间。
在一些实施方案中，抗纤维蛋白溶解剂是纤溶酶原抑制剂。在一些实施方案中，纤溶酶原抑制剂是氨甲环酸(TXA)。
在一些实施方案中，抗纤维蛋白溶解剂是氨基己酸(也称作 Amicar、ε-氨基己酸或6-氨基己酸)。在一些实施方案中，抗纤维蛋白溶解剂是抑蛋白酶多肽。
纤维蛋白溶解抑制剂(包括上文所列的那些)是熟知的并且可以以已知浓度使用。在各种实施方案中，将抗纤维蛋白溶解剂以约2.5 ug/ml至约250ug/ml之间的浓度施用至血液样品(例如，血小板功能下降的血液样品)。对于人类患者中治疗性使用的那些纤维蛋白溶解抑制剂，剂量是熟知的并且可以基于患者的个体特征(例如，总体健康状态、体重和年龄)。
在一些实施方案中，将血液样品(例如，具有降低的血小板功能) 添加至容器后，向容器添加纤维蛋白溶解抑制剂。
在一些实施方案中，当受验的血液置于容器(例如，杯或小池)中时，抗纤维蛋白溶解剂在添加血液样品之前处于容器中。
在一些实施方案中，抗纤维蛋白溶解剂包被容器的内部，以使得一旦血液样品置于容器中则所述抗纤维蛋白溶解剂与血液样品接触。
在止血期间，还涉及血小板。由骨髓中的巨核细胞产生、直径约 1um的这些小胞质囊泡是具有完全活性的生物因子。正如需要激活凝血级联的酶以形成纤维蛋白血块那样，四种药物—腺苷二磷酸(ADP)、肾上腺素、凝血酶和胶原蛋白—激活血小板。称作糖蛋白IIb-IIIa(Gp IIb-IIIa)的黏性蛋白介导血小板聚集。促凝血因子(纤维蛋白原)附着至这种受体，令血小板彼此连接。由纤维蛋白原连接的衔接作用代表主要的聚集源。手术或创伤使促凝血因子暴露于组织因子，触发凝血级联。除了将纤维蛋白原转化成纤维蛋白(增强血块的聚合物)外，凝血级联产生大量的凝血酶(血小板的主要激活物)。
在一些实施方案中，可以移除或减少血小板对患者的血块形成和强度的贡献，因而允许仅基于血块的纤维蛋白含量和纤维蛋白原的贡献确定纤溶亢进或纤维蛋白溶解。
因此，在一些实施方案中，血液样品是具有降低的血小板功能的血液样品。例如，血液样品可以与血小板功能抑制剂接触以减少血液样品中血小板的功能。也可以物理操作血液样品(例如，经历离心)以通过从血液样品物理移除血小板，减少血液样品中血小板的数目。
如上文提到，纤维蛋白原和血小板二者均有助于血块完整性。在本文所述的一些方法中，可以在血小板功能已经降低(例如通过用血小板抑制剂诸如松胞菌素D处理样品)的血液样品中检测纤维蛋白溶解。如果在血小板功能降低的样品中用添加抗纤维蛋白溶解剂(例如，氨甲环酸)防止纤维蛋白溶解，则纤维蛋白溶解有可能不归因于血小板功能，而归因于纤维蛋白和凝血级联中的其他因子。因此，从中获得样品(并且倾向于形成或目前正在经历纤维蛋白溶解或纤溶亢进)的患者将有可能对抗纤维蛋白溶解剂治疗有反应。因此，在一些实施方案中，如与正常全血相比，受验的血液样品具有降低的血小板功能。
注意，“降低的血小板功能”不意指血液样品已经根本没有任何血小板功能。相反，血小板功能下降的血液样品仅仅与正常全血相比具有降低的血小板功能。例如，血小板功能下降的血液样品包括与全血相比具有低至少25％、或低至少50％、或低至少75％、或低至少90％的血小板功能的血液样品。血小板功能包括而不限于有助于止血。降低的血小板功能因此可以由凝血期间(例如，在高岭土和钙存在下)血小板彼此聚集的减少来进行评定。
在一些实施方案中，物理操作血液样品以减少血液样品中血小板的数目。例如，可以将全血离心以移除一些或大部分血小板。在一个非常简单的操作程序中，可以将1.5ul血液在2.0ml微量离心管中以 1000转/分钟离心10分钟。富含血小板的血浆将浮在上清液中血液的顶上。可以取出这种上清液(例如，通过抽吸)，在管底留下血小板减少的全血。由于需要小于500ul血液进行下文描述的粘弹性分析，这是一个快速减少血液中血小板数目的极迅速方法。
在另一种方法中，可以通过使全血与附着至固态表面的血小板特异性抗体接触获得血小板减少的全血。血小板将选择性地与固态表面结合，并且可以获得血小板减少的全血。例如，与(在血小板上表达但是在红细胞上不表达的)糖蛋白IIb/IIIa受体特异性结合的抗体可以偶联于磁珠(例如，可从Life Technologies,Carlsbad,CA,美国商业获得的Dynabeads)。全血可以与抗体包被的磁珠接触，而后允许血小板被抗体结合后，应用磁体。磁体将吸引磁珠(和因而将吸引血小板)，并且具有降低的血小板含量(并且因此具有降低的血小板功能)的剩余血液将不与磁性体结合并且可以因此得到收集。
在一些实施方案中，通过使血液样品与血小板功能抑制剂接触而降低血小板功能。一种非限制性血小板功能抑制剂是阿昔单抗(也称作 c7E3Fab)。阿昔单抗是糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂并且抑制血小板聚集。另外的非限制性血小板功能抑制剂包括腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂(例如，氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、噻氯匹定)、磷酸二酯酶抑制剂(例如，西洛他唑)、糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂(例如，阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班)、腺苷再吸收抑制剂(例如，双嘧达莫)和血栓烷抑制剂，包括血栓烷合酶抑制剂和血栓烷受体拮抗剂(例如， tertroban)。这些血小板功能抑制剂(或其组合)的任一者可以用于本文所述的方法中。
血小板功能抑制剂(包括上文所列的那些及其组合)是熟知的并且可以以减少全血中血小板功能的已知浓度使用。在多种实施方案中，将血小板功能抑制剂以约2.5ug/ml至约250ug/ml之间的浓度施用至血液样品(例如，全血样品)。
在本文所述的方法的一些实施方案中，一旦全血样品从患者采集，血液可以按这样的方式处理以降低样品中的血小板功能(例如，通过物理操作或通过接触于血小板功能抑制剂)。例如，全血可以置于已经含有血小板功能抑制剂的单个容器中。或者，血小板功能抑制剂可以添加至含有全血的容器。或者，全血可以耗尽血小板(例如，通过从血液物理移除血小板)。在血小板功能降低后，血液样品随后可以分配至两个粘弹性测定法试验组，其中第一检验在纤维蛋白溶解剂不存在的情况下进行并且第二检验在抗纤维蛋白溶解剂存在的情况下进行。
当然在一些实施方案中，在添加抗纤维蛋白溶解剂至第二试验组的相同时间降低样品的血小板功能。因此，在一些实施方案中，当受检的血液样品置于容器(例如，杯或小池)中时，血小板功能抑制剂在添加血液样品之前处于容器中。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂包被容器的内部，以使得一旦血液样品置于容器中则所述血小板功能抑制剂与血液样品接触。
使用血栓弹力图(TEG)方法学的功能性纤维蛋白原测定法可从 Haemonetics,Corp.(Braintree,MA,USA)商业获得。这种测定法包含血小板抑制剂并且因此从纤维蛋白溶解测量移除血小板的贡献。已经描述这种功能性纤维蛋白原测定法的用途(参见Harr等人,Shock 39(1):45-49,2013)。
如下文描述，为了在极早期检测纤维蛋白溶解或纤溶亢进，通过在抗纤维蛋白溶解剂存在或不存下进行功能性纤维蛋白原(FF)测定法，修改FF测定法(即，消除血小板对止血过程的贡献的TEG测定法)。虽然在抗纤维蛋白溶解剂存在和不存在的情况下，正常血液将显示相同的TEG描迹和TEM描迹，但是来自出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进的患者中的血液将显示如与抗纤维蛋白溶解剂不存在下的描迹相比，在抗纤维蛋白溶解剂存在下的描迹之间的差异。
在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定纤维蛋白溶解抑制剂的方法，其中患者将会对所述纤维蛋白溶解抑制剂有反应。该方法包括：使包含降低的血小板功能的血液样品的第一部分在不存在纤维蛋白溶解抑制剂的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第一部分的凝血特征；使包含降低的血小板功能的血液样品的第二部分在存在第一纤维蛋白溶解抑制剂的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第二部分的凝血特征；使包含降低的血小板功能的血液样品的第三部分在第一纤维蛋白溶解抑制剂存在的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第三部分的凝血特征；和比较在第一抑制剂存在的情况下第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的第一差异，和在第二抑制剂存在的情况下第一部分的凝血特征和第三部分的凝血特征之间的第二差异，其中如果第一差异大于第二差异，患者将从第一抑制剂治疗获得有益结果，并且如果第二差异是大于第一差异，患者将从第二抑制剂治疗获得有益结果。
当然，该方法可以包含第三纤维蛋白溶解抑制剂等。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解的第一抑制剂和第二抑制剂中的每一个选自(ε- 氨基己酸)、氨甲环酸和抑蛋白酶多肽，其中第一抑制剂和第二抑制剂不是相同的。纤维蛋白溶解抑制剂可以例如在约2.5ug/ml至约250 ug/ml之间的范围内使用。
在另一个方面，本发明提供一种容器，其适用于使用粘弹性分析检测血液样品中的止血状态，所述容器包含具有涂层的内部，所述涂层包含血小板功能抑制剂。血小板功能抑制剂可以是糖蛋白IIb/IIIa 受体抑制剂(例如，阿昔单抗、依替巴肽或替罗非班)，或可以是腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂或血栓烷抑制剂，或可以是松胞菌素D。在一些实施方案中，血小板功能抑制剂是不同抑制剂的组合，例如，阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、腺苷二磷酸(ADP) 受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂、血栓烷抑制剂和/或松胞菌素D的组合。
在另一个方面，本发明提供一种容器，其适用于使用粘弹性分析检测血液样品中纤溶亢进或纤维蛋白溶解，所述容器包含具有涂层的内部，所述涂层包含纤维蛋白溶解抑制剂。在一些实施方案中，该容器的内部上的涂层还包含血小板功能抑制剂。
在一些实施方案中，该容器的涂层中的纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂是氨基己酸(ε-氨基己酸)、氨甲环酸或抑蛋白酶多肽。在一些实施方案中，纤维蛋白溶解抑制剂与糖和/或叠氮钠一起配制于涂层中。
在一些实施方案中，在使用TEG血栓弹力图分析仪系统或在 ROTEM血栓弹力计量术分析仪系统中进行的粘弹性分析中使用该容器。
在一些实施方案中，该容器的涂层还包含血小板功能抑制剂。血小板功能抑制剂可以是糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂(例如，阿昔单抗、依替巴肽或替罗非班)，或可以是腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂或血栓烷抑制剂，或可以是松胞菌素D。
提供意在说明但不限制本文所述的发明的以下实施例。
实施例1：采用氨甲环酸(TXA)的功能性纤维蛋白原TEG测定法
总体上遵循上文Harr等人的方法。
简而言之，从创伤患者获得柠檬酸盐化的全血样品。℃用21号针在肘前静脉中进行静脉穿刺，并将血液收集入含有3.2％柠檬酸盐的抽真空型容器(例如，3.5mL含有3.2％柠檬酸盐的塑料
Figure BDA0001171553820000241
)。
功能性纤维蛋白原测定法购自Haemonetics Corp.(Niles,IL, USA andBraintree,MA,美国)，并且根据制造商的说明在
Figure BDA0001171553820000242
5000 装置上执行。
为了执行功能性纤维蛋白原(FF)测定法，将0.5mL柠檬酸盐化的血液添加至含有组织因子(凝血激活物)和阿昔单抗(单克隆GPIIb/IIIa 受体拮抗剂；有时称作FF试剂)的混合物的名称为FF小瓶，并温和混合血液样品。将340uL等分试样从FF小瓶转移至预装有20μL 0.2 摩尔/升CaCl2的37℃的TEG杯。FF-测定法测量无血小板的血块的凝血参数。将第二个340uL等分试样从FF小瓶转移至预装有20μL 0.2摩尔/升CaCl2的37℃的TEG杯，其中根据实施例2中描述的方法用TXA包被第二个TEG杯。
在TEG 5000装置上同时分析血液样品的两个部分(即，无TXA 的FF和FF加TXA)。如果血液样品正常，则两个描迹将几乎相同并且在彼此重叠时将形成一条线(或两条非常靠近的线)。
然而，如果血液样品取自出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进的患者，则TXA处理的血液样品部分将提供是与未经TXA处理的相同血液部分的TEG描迹明显不同的TEG描迹。图5和图6显示来自这些研究的代表性结果。如显示，TXA处理的血液样品部分将具有幅度更高、增长更快的TEG描迹。这些TEG描迹的趋异几乎立即出现(例如，在测定法开始后2分钟)并且在测定法开始后约15至约35分钟(例如，在销钉插入杯后约15至约35分钟)之间显然不同。差异在单独的 FF(即，无TXA的FF)处理的血液样品的TEG描迹的MA时明显清晰。
从图5和图6中获得的数据(或相似结果)已经形成一个新参数，即ΔV@MA。ΔV@MA是在未经TXA处理的血液样品的MA时间处 (即，在TXA不存在下的血液和在TXA存在下的血液)两个通道的速度的差分。因此，可以通过从TXA处理的样品的TEG速度(图6和图 7中的顶部线)简单减去未经TXA处理的样品的TEG速度(图6和图7 中的底部线)来计算ΔV@MA。
为了确定这个新参数即ΔV@MA是否指示纤维蛋白溶解，首先生成标准滴定曲线。如上文讨论，t-PA(组织纤溶酶原激活物)可以将无活性的纤溶酶原转化成活性的纤溶酶，后者随后可以分解纤维蛋白并且因此引起纤维蛋白溶解。从健康人采集全血，用渐增量的t-PA内标，并且将血液样品等分，将TXA添加至一个部分，但是不添加至另一部分。使这两个部分(即，两份样品)在TEG 5000装置上接受分析，并且得到ΔV@MA(在未经TXA处理的样品的MA时从TXA处理的样品减去未经TXA处理的样品的TEG速度)。图7是显示对tPA的浓度(以ng/ml计)作图的ΔV@MA的直线图，所述直线图揭示标准滴定曲线。
下一个问题是这个新参数(ΔV@MA)是否与如上文讨论LY30相关，LY30是用于检测纤维蛋白溶解的现有技术已知方法。为此，进行ΔLY30的计算，再次计算TXA处理的样品的LY30数值和未经TXA 处理的样品的LY30数值之间的差异。未经TXA处理的样品的LY30 是直观的(straight forward)。例如，参考图6，未经TXA处理的样品的LY30是大约50％(而MA是进入测定法大约24分钟，并且30 分钟后计算LY30)。对于TXA处理的样品，LY30非常小，是大约 0.1％(基于74分钟时TXA处理的样品的幅度计算LY30)。如上文讨论，低至3％的LY30可能是临床相关的。因此，低至3％的ΔLY30 也可能是临床相关的。在这个例子中，未处理的样品中大致50％的 LY30代表了非常严重的纤溶亢进。
如图8中所示，在LY30的临床相关范围内，ΔV@MA相对于ΔLY30的曲线是线性的。因此，在未经TXA处理的样品的MA时计算并且依照定义比ΔLY30参数快30分钟获得的新ΔV@MA参数是纤维蛋白溶解的有效度量，但是比LY30快得多地为临床医生所用。检测纤维蛋白溶解和纤溶亢进所需要时间的此类减少对创伤患者的结局至关重要。
注意，如上文讨论，ΔV不需要在未经TXA处理的样品的MA时获得。相反，ΔV可以在纤维蛋白溶解抑制剂处理样品和未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的样品开始显示趋异TEG描迹的任何时间获得。
实施例2：产生TXA(氨甲环酸)包被的容器
制备包被了TXA的TEG杯。
使用1.282mL 11.7％海藻糖；0.03mL 10％NaN3；0.9mL Cyklokapron(氨甲环酸的市售制剂，H2O中100mg/mL TXA)；和 12.788mL去离子化的H2O，制备15mL母液。
将30uL这种溶液分配入TEG杯，TXA的终浓度为180ug/杯。将杯空气干燥过夜并且每个盒包装20个杯(和销钉)，附带干燥剂包。每盒包装在密封的Ziploc袋内。
药物溶液的最终基质(在干燥前)是1％海藻糖和0.02％NaN3。注意，干燥过程可以在冻干仪进行，在这种情况下干燥过程可以称作冻干。
使用实施例2中描述的这种方法，每个杯中TXA的量可以标准化、并且包被了TXA的杯可以容易地储存以供稍后使用。
实施例3：产生用抗纤维蛋白溶解剂和血小板功能抑制剂包被或仅血小板功能抑 制剂包被的容器
对于同时具有TXA和血小板抑制剂的杯，制备含有叠氮钠、海藻糖、氨甲环酸(TXA)和松胞菌素D的溶液并用来包被TEG杯的内部。如实施例2中所述，施加溶液，并且随后允许杯干燥。每个杯中TXA 的终浓度是180ug/杯。每个杯中松胞菌素D的终浓度在约2.5ug/ml至约250ug/ml之间的范围内。
对于仅具有血小板抑制剂的杯，制备含有叠氮钠、海藻糖和松胞菌素D的溶液并用来包被TEG杯的内部。将溶液施加至杯中，并且随后允许杯干燥。每个杯中松胞菌素D的终浓度在约2.5ug/ml至约 250ug/ml之间的范围内。
实施例4：采用氨甲环酸(TXA)的TEG测定法
对于这些研究，遵循实施例1中的操作方案，但是血液不进行柠檬酸盐化并且不添加激活物至血液。
简而言之，从接受手术的患者收集全血。取得的血液样品立即分成两个部分各自360uL并且每个部分置入TEG杯。将第一部分添加至包被涂层的TEG杯，所述涂层包含FF试剂(单克隆GPIIb/IIIa受体拮抗剂)和200ug氨甲环酸(TXA)。将第二部分添加至包被包含200ug TXA才涂层的TEG杯。
在TEG 5000装置上同时分析血液样品的两个部分(即，无FF的 TXA和附加TXA的FF)。如果血液样品正常，则两个描迹将相同并且在彼此重叠时将形成一条线。
然而，在两个描迹开始趋异(例如，早至开始分析后两分钟)的时刻，制备TEG测定法中所用的小剂量抗纤维蛋白溶解剂(在这种情况下，氨甲环酸)以施用于患者。剂量可以增加或不增加，取决于两个描迹多大程度趋异。例如，如果两个描迹在例如开始分析后20分钟极端趋异，患者有可能出现纤溶亢进。在此刻，可以增加抗纤维蛋白溶解剂(例如，氨甲环酸或抑蛋白酶多肽)的剂量以改善在外科手术期间和之后患者有利结果的机会。
实施例5：柠檬酸盐化高岭土(CK)TEG与本文所述方法的比较
本文所述的方法是一个优异和柠檬酸盐化高岭土试验比更灵敏的试验、所述方法比较未经抗纤维蛋白溶解剂处理的患者血液样品的凝血特征与抗纤维蛋白溶解剂处理的患者血液样品的凝血特征。
为了证明这个构思，血液取自15位供体并且分成两个组—柠檬酸盐化高岭土组和FF(功能性纤维蛋白原)组。
对于柠檬酸盐化高岭土组，从每位供体收集柠檬酸盐化血液(例如，收集到含有柠檬酸钠的管中的全血(因而产生大约9:1的血液对柠檬酸盐比))。对于8个不同tPA浓度，将0.5ml血液与高岭土(凝血激活物)和渐增浓度的t-PA温和混合以诱导纤维蛋白溶解。等分试样转移至37℃的TEG杯，并且使用TEG 5000装置分析样品、并且计算在每种tPA浓度时15位供体各自的LY30。图9中显示了LY30对t-PA 浓度作图的结果。如图9中垂线所示，只有t-PA浓度达到约75ng/ml 和100ng/ml之间时溶解信号才从基线噪声升出来。
对于功能性纤维蛋白原(FF)组，从每位供体收集柠檬酸盐化血液。对于8个不同t-PA浓度，将0.5ml血液温和地与渐增浓度的t-PA和 FF试剂(GPIIb/IIIa受体拮抗剂)混合，并且温和地混合血液样品。将一个等分试样转移至预装有CaCl2的37℃的TEG杯。将第二个等分试样转移至预装有CaCl2的37℃的TEG杯，其中第二TEG杯用TXA 包被。
在TEG 5000装置上分析8个不同t-PA浓度时15位供体各自的两个TEG杯。从这些描迹中，计算每位供体的ΔLY30。如上文所述，ΔLY30简单地是在未经TXA处理的样品的LY30(使用未处理样品的 MA时间点的幅度和距MA时间点30分钟的幅度计算)和TXA处理的样品的LY30(使用TXA处理的样品的MA时间点的幅度和距MA时间点30分钟的幅度计算)之间的差异。
图10中显示了ΔLY30对t-PA浓度作图的结果。如图10中垂线所示，溶解信号在约25ng/ml和50ng/ml t-PA之间出现。因此，本文所述方法的检测阈值高于柠檬酸盐化高岭土试验超过2倍(比较图 10与图9)。
基于这些研究，实现以下灵敏度参数和特异性参数：
灵敏度参数：
–检测阈值[tPA]：对于ΔLY30为25-50ng/mL；对于CK-LY30 为75-100ng/mL
–分析灵敏度(斜率从75-100ng/mL)：对于ΔLY30为19.67；对于CK-LY30为8.01
–斜率的RSD(n＝15)：对于ΔLY30为0.57；对于CK-LY30 为0.77
–线性相关(R2从0-200ng/ml)：对于ΔLY30为0.87；对于 CK-LY30为0.72
特异性参数：
–基线信号(低于检测阈值的平均水平)：对于ΔLY30为-0.12；对于CK-LY30为7.38
–基线噪声(基线信号中的SD)：对于ΔLY30为0.95；对于 CK-LY30为4.18
上文描述的本发明的实施方案仅意在是示例性的；多种变体和修改将是本领域技术人员显而易见的。全部这类变体和修改均意图在任意所附权利要求中限定的本发明的范围之内。

Claims (70)

1.一种用于检测血液样品中纤维蛋白溶解的方法，包括：
a)使包含降低的血小板功能的血液样品的第一部分在不存在纤维蛋白溶解抑制剂的第一容器中接受粘弹性分析以在时间点获得第一部分的凝血特征；并且
b)使包含降低的血小板功能的血液样品的第二部分在包含纤维蛋白溶解抑制剂的第二容器中接受粘弹性分析以在时间点获得第二部分的凝血特征；
其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解。
2.根据权利要求1所述的方法，其中凝血特征是粘弹性分析的输出幅度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中凝血特征是粘弹性分析的输出幅度的一阶导数。
4.根据权利要求1所述的方法，其中时间点是在第一部分的最大血液凝块强度的时候。
5.根据权利要求1所述的方法，其中时间点是在启动粘弹性分析后15分钟至35分钟之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其中时间点是在启动粘弹性分析后少于20分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其中获得的时间点是在未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中血块坚实度达到20mm的时间。
8.根据权利要求1所述的方法，其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间为至少1％的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解。
9.根据权利要求1所述的方法，其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间为至少2％的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解。
10.根据权利要求1所述的方法，其中包含降低的血小板功能的血液样品包含血小板功能抑制剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中血小板功能抑制剂是糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂选自阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班。
13.根据权利要求10所述的方法，其中血小板功能抑制剂是腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂或血栓烷抑制剂。
14.根据权利要求10所述的方法，其中血小板功能抑制剂是松胞菌素D。
15.根据权利要求1所述的方法，其中包含降低的血小板功能的血液样品是血小板减少的血液样品。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过从血液样品物理移除血小板获得血小板减少的血液样品。
17.根据权利要求1所述的方法，其中纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。
18.根据权利要求1所述的方法，其中纤维蛋白溶解抑制剂选自氨基己酸(ε-氨基己酸)和抑蛋白酶多肽。
19.根据权利要求1所述的方法，其中使用止血分析仪进行粘弹性分析。
20.根据权利要求1所述的方法，其中使用第一和第二容器和第一销钉和第二销钉进行粘弹性分析，其中第一销钉相对于第一容器移动并且第二销钉相对于第二容器移动。
21.根据权利要求1所述的方法，其中使用第一和第二容器和第一销钉和第二销钉进行粘弹性分析，其中第一容器相对于第一销钉移动并且第二容器相对于第二销钉移动。
22.根据权利要求1所述的方法，其中纤维蛋白溶解抑制剂包含于第二容器内部上的涂层中。
23.根据权利要求1所述的方法，其中第一容器和第二容器位于单一盒上。
24.根据权利要求10所述的方法，其中血小板功能抑制剂包含于第一容器和第二容器的内部上的涂层中。
25.根据权利要求10所述的方法，其中将血小板功能抑制剂添加至样品。
26.根据权利要求1所述的方法，其中血液样品从患者获得。
27.根据权利要求26所述的方法，其中如果检出纤维蛋白溶解，患者对纤维蛋白溶解抑制剂有反应。
28.一种容器，其适用于使用粘弹性分析检测血液样品中纤溶亢进或纤维蛋白溶解，所述容器包含具有涂层的内部，所述涂层包含纤维蛋白溶解抑制剂。
29.根据权利要求28所述的容器，其中纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。
30.根据权利要求28所述的容器，其中纤维蛋白溶解抑制剂选自氨基己酸(ε-氨基己酸)和抑蛋白酶多肽。
31.根据权利要求28所述的容器，其中使用TEG血栓弹力图分析仪系统或在ROTEM血栓弹力计量术分析仪系统中进行粘弹性分析。
32.根据权利要求28所述的容器，其中纤维蛋白溶解抑制剂与糖一起配制于涂层中。
33.根据权利要求28所述的容器，其中抑制剂与叠氮钠一起配制于涂层中。
34.根据权利要求28所述的容器，其中涂层还包含血小板功能抑制剂。
35.根据权利要求34所述的容器，其中血小板功能抑制剂是糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂。
36.根据权利要求35所述的容器，其中糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂选自阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班。
37.根据权利要求34所述的容器，其中血小板功能抑制剂是腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂或血栓烷抑制剂。
38.根据权利要求34所述的容器，其中血小板功能抑制剂是松胞菌素D。
39.根据权利要求34所述的容器，其中容器位于盒上，其中盒还包括第二容器。
40.纤维蛋白溶解抑制剂在制备容器中的用途，所述容器用于检测血液样品中纤维蛋白溶解或纤溶亢进，所述检测包括：
a)使包含降低的血小板功能的血液样品的第一部分在不存在纤维蛋白溶解抑制剂的第一容器中接受粘弹性分析以在时间点获得第一部分的凝血特征；并且
b)使包含降低的血小板功能的血液样品的第二部分在包含纤维蛋白溶解抑制剂的第二容器中接受粘弹性分析以在时间点获得第二部分的凝血特征；
其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。
41.根据权利要求40所述的用途，其中凝血特征是粘弹性分析的输出幅度。
42.根据权利要求40所述的用途，其中凝血特征是粘弹性分析的输出幅度的一阶导数。
43.根据权利要求40所述的用途，其中时间点是在第一部分的最大血液凝块强度的时候。
44.根据权利要求40所述的用途，其中时间点是在启动粘弹性分析后15分钟至35分钟之间。
45.根据权利要求40所述的用途，其中时间点是在启动粘弹性分析后少于20分钟。
46.根据权利要求40所述的用途，其中获得的时间点是在未经纤维蛋白溶解抑制剂处理的血液样品中血块坚实度达到20mm的时间。
47.根据权利要求40所述的用途，其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间为至少1％的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。
48.根据权利要求40所述的用途，其中第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间为至少2％的差异指示血液样品中的纤维蛋白溶解或纤溶亢进。
49.根据权利要求40所述的用途，其中包含降低的血小板功能的血液样品包含血小板功能抑制剂。
50.根据权利要求49所述的用途，其中血小板功能抑制剂是糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂。
51.根据权利要求50所述的用途，其中糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂选自阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班。
52.根据权利要求49所述的用途，其中血小板功能抑制剂是腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、腺苷再吸收抑制剂或血栓烷抑制剂。
53.根据权利要求49所述的用途，其中血小板功能抑制剂是松胞菌素D。
54.根据权利要求40所述的用途，其中包含降低的血小板功能的血液样品是血小板减少的血液样品。
55.根据权利要求54所述的用途，其中通过从血液样品物理移除血小板获得血小板减少的血液样品。
56.根据权利要求40所述的用途，其中纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。
57.根据权利要求40所述的用途，其中纤维蛋白溶解抑制剂选自氨基己酸(ε-氨基己酸)和抑蛋白酶多肽。
58.根据权利要求40所述的用途，其中使用止血分析仪进行粘弹性分析。
59.根据权利要求40所述的用途，其中使用第一和第二容器和第一销钉和第二销钉进行粘弹性分析，其中第一销钉相对于第一容器移动并且第二销钉相对于第二容器移动。
60.根据权利要求40所述的用途，其中使用第一和第二容器和第一销钉和第二销钉进行粘弹性分析，其中第一容器相对于第一销钉移动并且第二容器相对于第二销钉移动。
61.根据权利要求40所述的用途，其中纤维蛋白溶解抑制剂包含于第二容器内部上的涂层中。
62.根据权利要求40所述的用途，其中第一容器和第二容器位于单一盒上。
63.根据权利要求49所述的用途，其中血小板功能抑制剂包含于第一容器和第二容器的内部上的涂层中。
64.根据权利要求49所述的用途，其中将血小板功能抑制剂添加至样品。
65.根据权利要求40所述的用途，其中血液样品从患者获得。
66.根据权利要求65所述的用途，其中如果检出纤维蛋白溶解或纤溶亢进，患者对纤维蛋白溶解抑制剂有反应。
67.用于鉴定纤维蛋白溶解抑制剂的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于一种用于鉴定纤维蛋白溶解抑制剂的方法，所述纤维蛋白溶解抑制剂将在出现或可能出现纤维蛋白溶解或纤溶亢进的患者中实现有益反应，所述方法包括：
a)使包含降低的血小板功能的血液样品的第一部分在不存在纤维蛋白溶解抑制剂的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第一部分的凝血特征；
b)使包含降低的血小板功能的血液样品的第二部分在第一纤维蛋白溶解抑制剂存在的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第二部分的凝血特征；
c)使包含降低的血小板功能的血液样品的第三部分在第一纤维蛋白溶解抑制剂存在的情况下接受粘弹性分析以在时间点获得第三部分的凝血特征；并且
d)在第一抑制剂存在的情况下比较第一部分的凝血特征和第二部分的凝血特征之间的第一差异，并且在第二抑制剂存在的情况下比较第一部分的凝血特征和第三部分的凝血特征之间的第二差异，
其中如果第一差异大于第二差异，患者将从第一抑制剂治疗获得有益结果，而如果第二差异大于第一差异，患者将从第二抑制剂治疗获得有益结果。
68.根据权利要求67所述的用途，其中患者是人。
69.根据权利要求67所述的用途，其中第一纤维蛋白溶解抑制剂是氨甲环酸。
70.根据权利要求67所述的用途，其中纤维蛋白溶解的第一抑制剂和第二抑制剂中的每一个选自ε-氨基己酸、氨甲环酸和抑蛋白酶多肽，其中第一抑制剂和第二抑制剂不是相同的。
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