ES2842245T3 - Punta de pipeta y sus usos y métodos - Google Patents

Abstract

Punta de pipeta (11) que comprende un constituyente (A) y un constituyente (B) de manera espacialmente separada, en la que los constituyentes (A) y (B) están adaptados para formar una composición de diagnóstico tras la combinación, comprendiendo la composición de diagnóstico al menos los siguientes componentes (i) e (ii): i) un activador de coagulación; y ii) una sal de calcio. caracterizada por que 1) el constituyente (A) comprende el componente (i) pero no el componente (ii) y el constituyente (B) comprende el componente (ii) pero no el componente (i); o 2) el constituyente (A) comprende el componente (ii) pero no el componente (i) y el constituyente (B) comprende el componente (i) pero no el componente (ii).

Description

DESCRIPCIÓN

Punta de pipeta y sus usos y métodos

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico in vitro, en particular a las pruebas de diagnóstico de fluidos corporales, tales como muestras de sangre. Más en concreto, la presente invención se refiere a una punta de pipeta que puede usarse en diagnósticos in vitro, en particular en pruebas de diagnóstico de fluidos corporales, tales como pruebas de coagulación. La presente invención también se refiere a un método para realizar tales diagnósticos, por ejemplo, análisis de coagulación, y al uso de la punta de pipeta en tales pruebas de diagnóstico.

Para muchos de estos métodos de diagnóstico, el fluido corporal tiene que mezclarse con otros reactivos para permitir, o al menos mejorar, la detección de diagnóstico de algunos parámetros que se han de medir. Por ejemplo, en las pruebas de coagulación, la muestra de sangre del paciente debe combinarse con reactivos “activadores” especiales para simular los procesos de coagulación. En las pruebas de coagulación hemorreológicas (también denominadas “análisis viscoelásticos”), la muestra de sangre se mezcla adicionalmente con otros modificadores de la coagulación, tales como inhibidores de plaquetas, inhibidores de heparina y/o inhibidores de lisis.

La coagulación de la sangre es un proceso muy complejo, que comienza con sangre líquida y termina con la formación de un coágulo sólido. Es una parte importante de la hemostasis, es decir, el cese de la pérdida de sangre de un vaso dañado, en la que una pared del vaso sanguíneo dañado se cubre con un coágulo de sangre para detener la hemorragia y ayudar a reparar el vaso dañado. Los trastornos en el equilibrio de la coagulación pueden provocar un aumento de la hemorragia y/o trombosis y embolia.

En un individuo normal, la coagulación se inicia aproximadamente 20 segundos después de que se produce una lesión en el vaso sanguíneo que daña las células endoteliales. Las plaquetas forman inmediatamente un tapón hemostático en el sitio de la lesión. Este proceso se denomina hemostasis primaria. La hemostasis secundaria sigue si los componentes del plasma denominados factores de coagulación responden en una cascada compleja para finalmente formar hebras de fibrina para fortalecer el tapón plaquetario.

La cascada de coagulación de la hemostasis secundaria tiene dos vías, la vía de activación por contacto (antes conocida como vía intrínseca) y la vía del factor tisular (antes conocida como vía extrínseca) que conducen a la formación de fibrina. Anteriormente se pensaba que la cascada de coagulación consistía en dos vías de igual importancia unidas a una vía común. Ahora se sabe que la vía principal para el inicio de la coagulación sanguínea es la vía del factor tisular. Las vías son una serie de reacciones en las que un zimógeno de una serina proteasa y su cofactor glicoproteico se activan para convertirse en componentes activos, que luego pueden catalizar la siguiente reacción en la cascada. Los factores de coagulación generalmente se indican con números romanos del I al XIII, con una 'a' minúscula adjunta para indicar la forma activada. De ese modo, se forma un coágulo de fibrina que fortalece el tapón plaquetario.

Sin embargo, para evitar trombosis y embolia, se controla estrictamente la formación de coágulos de fibrina. El coágulo de fibrina, es decir, el producto de coagulación se descompone en un proceso denominado fibrinólisis. En consecuencia, la fibrinólisis evita que los coágulos de sangre crezcan y lleguen a ser problemáticos. En la fibrinólisis, la enzima plasmina desempeña un papel importante, ya que la plasmina corta la malla de fibrina por varios sitios, lo que lleva a la producción de fragmentos circulantes que son eliminados por otras proteasas y/o por el riñón y/o el hígado. El plasminógeno se convierte en plasmina activa mediante el activador de plasminógeno tisular (tPA) y la uroquinasa, lo que permite que se produzca fibrinólisis.

La detección de una funcionalidad normal o disminuida de estos componentes de coagulación y/o fibrinólisis es importante para evaluar trastornos de hemostasis en pacientes. Si se identifica un trastorno de hemostasis, se puede aplicar una terapia seleccionada, por ejemplo, para detener una hemorragia.

Se conocen varios métodos para medir las características de coagulación de la sangre. Algunos de estos dispositivos intentan simular el flujo natural de la sangre en las venas y arterias de un sujeto vivo, mientras que otras técnicas de medición se realizan en volúmenes de sangre estáticos.

Una medición precisa de la capacidad de coagulación de la sangre de un paciente que sea oportuna y eficaz es crucial para algunos procedimientos quirúrgicos y médicos. La detección rápida y precisa de coagulaciones anormales también es de particular importancia con respecto al tratamiento adecuado que se debe administrar a pacientes que padecen trastornos de coagulación. A menudo, el estado de tales pacientes hace que sea necesario administrar componentes sanguíneos, anticoagulantes, algunos agentes fibrinolíticos, agentes antiplaquetarios o compuestos que inducen los efectos adversos de dichos agentes. En estos casos, la dosis de tratamiento puede adaptarse a la magnitud de un trastorno de coagulación previamente determinado.

El documento US 2002/0081747 A1 da a conocer una punta de pipeta y un método, en el que se pueden mezclar dos líquidos dentro de la punta de pipeta. Los dos líquidos pueden separarse inicialmente mediante una burbuja de aire y pueden mezclarse en la punta de pipeta tras la aspiración de los dos líquidos. Tal punta de pipeta y un método respectivo pueden utilizarse para la tipificación sanguínea y otras reacciones de aglutinación de la sangre

Las mediciones de la coagulación sanguínea se proporcionan mediante el uso de varios dispositivos, por ejemplo, como se describe en los documentos US 5.777.215 A y US 6.537.819 B2. Estos dispositivos miden las propiedades mecánicas del coágulo a lo largo de su desarrollo estructural. Estos sistemas se resumen bajo el término “métodos viscoelásticos”, ya que detectan continuamente propiedades viscoelásticas del coágulo sanguíneo durante su formación y lisis. Las mediciones viscoelásticas de la coagulación sanguínea se denominan normalmente mediciones de tromboelastografía (TEG).

Varias referencias describen instrumentos para medir características de la coagulación sanguínea basándose en movimientos mecánicos. Estos instrumentos controlan las propiedades elásticas de la sangre a medida que es inducida para coagularse en un entorno de bajo cizallamiento, es decir, en volúmenes de sangre estáticos. Los patrones de cambio en la elasticidad al cizallamiento permiten determinar la cinética de formación de coágulos, así como la resistencia y estabilidad del coágulo formado. La resistencia y estabilidad del coágulo proporcionan información sobre la capacidad del coágulo para realizar el “trabajo de hemostasis” (es decir, detener o prevenir una hemorragia anómala) y sobre la idoneidad de la interacción de las plaquetas y la fibrina en sangre. La cinética de formación de coágulos proporciona principalmente información sobre la funcionalidad de los factores de coagulación. El análisis de toda esta información proporciona resultados que son útiles para predecir la hemorragia, para controlar y manejar la trombosis o para controlar la fibrinólisis.

Además, como el proceso de coagulación consta de varios componentes interconectados, se pueden aplicar activadores e inhibidores específicos del proceso de coagulación para detectar más específicamente trastornos de hemostasis. Tales reactivos útiles en análisis viscoelásticos pueden comprender un activador inicial (por ejemplo, un activador de la vía intrínseca o extrínseca), uno o más inhibidores (por ejemplo, inhibidores de fibrinólisis, inhibidores de heparina, inhibidores de plaquetas), uno o más factores específicos adicionales de la cascada de coagulación, calcio (CaCh), fosfolípidos y/o estabilizadores.

En la literatura, se describen diferentes conceptos de reactivos para mediciones viscoelásticas modificadas, incluidos (i) TEG modificado con ReoPro, como se describe en Wenker et al.: Thromboelastography, The Internet Journal of Anesthesiology, 2000, volumen 1 número 3, http://www.ispub.com/ostia/index.php?xjlFilePath=journals/ija/vol1n3/teg.xml y Ruttmann et al.: Hemodilution Enhanced Coagulation Is Not Due to Platelet Clumping, Anesthesiology 2004; 101: A150; (ii) TEG modificado con Recombiplastina y ReoPro, como se describe en http://www.transfusionguidelines.org.uk/docs/pdfs/bbt_app-use_tegsop-example.pdf; y (iii) TEG modificado con TF y Trasylol, como se describe en Tanaka et al.: Evaluation of a novel kallikrein inhibitor on hemostatic activation in vitro, Thrombosis Research, volumen 113, número 5, 2004, Páginas 333­ 339, donde TEG modificado con TF y Trasylol se basa en la combinación de reactivos activadores disponibles comercialmente destinados a otras pruebas, tal como el activador de tiempo de protrombina Innovin o Recombiplastin®, combinado con solución de CaCh fabricada por el cliente y fármacos, tales como ReoPro® (abciximab) y Trasylol® (aprotinina).

Sin embargo, en los conceptos descritos, la normalización es baja y se incluyen muchas etapas de pipeteo complicadas, lo que deriva en muchas fuentes de error de usuario.

Hay otros sistemas de reactivos en el mercado, que se basan en una serie de reactivos. Por ejemplo, el análisis ROTEM® (fabricante: Tern Innovations GmbH, Munich, Alemania) proporciona un sistema de reactivos para mediciones viscoelásticas, que se basa en reactivos normalizados, la mayoría de los cuales se proporcionan al cliente en forma líquida, que son pipeteados por el usuario en la copa de pruebas utilizando procedimientos operativos normalizados. Esto normaliza la aplicación, sin embargo, todavía requiere varias etapas de pipeteo para el análisis. Por ejemplo, para realizar una prueba de inhibición plaquetaria junto con una prueba activada extrínsecamente, el pipeteo de solución sanguínea CaCh, activador extrínseco y un inhibidor de plaquetas puede dar como resultado la realización de un total de ocho etapas de pipeteo (incluido el cambio de la punta tres veces durante un procedimiento de prueba) y la necesidad de tres reactivos diferentes que deben ser manipulados por el usuario. Esto requiere formación, requiere tiempo y es una fuente potencial de error.

Algunos de los otros sistemas de reactivos del mercado son líquidos y deben pipetearse en una copa (p. ej., solución de CaCh), algunos se proporcionan en forma seca en la copa de medición (tal como la heparinasa) y algunos se proporcionan en viales pequeños, en una cantidad destinada a una prueba. Una característica de estos reactivos es que todavía cada reactivo se proporciona normalmente en forma individual y, por tanto, se requieren varias etapas al menos para pruebas que requieran más de un reactivo activo.

Para proporcionar un sistema de reactivos más simple para mediciones viscoelásticas de sangre o componentes sanguíneos, se investigó la provisión de combinaciones líquidas estables de los reactivos en la concentración de trabajo. Sin embargo, no se pudo lograr tal combinación líquida estable debido a las interacciones mutuas de las diferentes sustancias mientras se mezclaban durante un período más largo. Algunos componentes afectan negativamente a la estabilidad de los demás cuando se mantienen mezclados en la fase líquida en concentraciones más altas; por ejemplo, CaCh altera la estabilidad del reactivo de factor tisular en fase líquida con el tiempo. Además, si estos reactivos combinados se proporcionan en una cantidad suficiente para exactamente una prueba, surge otro problema: la porción muy pequeña de un reactivo líquido podría adherirse a partes del recipiente de reactivo o a la tapa y, por tanto, podría no mezclarse suficientemente con la muestra, es decir, el líquido de prueba, cuando se realice el análisis.

Para evitar estos problemas, Kolde et al. en el documento US 2004/0071604 A1 dan a conocer un sistema que proporciona reactivos liofilizados por separado en sus concentraciones de trabajo para una prueba en una copa de medición (que recibe el volumen de la muestra durante la medición). En particular, Kolde et al. dan a conocer un sistema de copa para análisis viscoelástico, en el que el extremo inferior de la copa se divide en varias secciones o “cámaras de reactivo”. Esto permite colocar los reactivos de forma independiente en las diferentes cámaras, sin mezclarlos y luego liofilizar los reactivos.

Sin embargo, las desventajas de esta solución incluyen la necesidad de un proceso de pipeteo muy preciso, ya que las cámaras de reactivo separadas son muy pequeñas (<5 mm de diámetro). Otro problema es que las gotas de reactivo pueden “saltar” fuera de su sección inducidas por vibraciones en la línea de llenado de reactivo y mezclarse entre sí. Otro problema es el posible secado al aire de las pequeñas gotas de reactivo durante el procesamiento en condiciones ambientales antes de que comience el proceso de liofilización.

Calatzis et al., en el documento US 2010/190193 A1, dan a conocer otra opción al proporcionar reactivos liofilizados todos mezclados juntos en sus concentraciones de trabajo para una prueba en una copa de medición o en un recipiente de reactivo convencional. Por lo tanto, se sugiere que todos los reactivos se coliofilicen en un recipiente de reactivo o directamente en la copa de medición.

Este planteamiento, sin embargo, puede inducir inestabilidades y variaciones en el proceso de producción debido a la mezcla de todos los reactivos y a la interacción mutua resultante durante el proceso de congelación. También se pueden inducir inestabilidades durante el proceso de congelación debido a los correspondientes cambios bien conocidos en las condiciones del pH de la mezcla de reactivos. Por consiguiente, Calatzis et al. sugirieron estabilizar el proceso de producción diluyendo la mezcla de reactivos muy por debajo de la concentración que se requería en las pruebas viscoelásticas y compensar el contenido más bajo de reactivo aumentando proporcionalmente el volumen liofilizado. Pero dado que el costoso proceso de liofilización se prolonga desproporcionadamente por tales aumentos de volumen, este planteamiento reduce considerablemente la eficiencia de producción. Además, las formulaciones coliofilizadas pueden ser sustancialmente menos estables que los componentes separados dependiendo de la humedad residual en el compuesto reactivo liofilizado, que requiere un tiempo de procesamiento incluso más largo durante la producción.

Un inconveniente adicional de los sistemas descritos en los documentos US 2004/0071604 A1 y US 2010/190193 A1 es que se requieren estabilizadores de proteínas que pueden interferir posteriormente en la fuerza de adhesión del coágulo de sangre en la superficie de la copa durante la medición viscoelástica.

Para superar los problemas mencionados anteriormente, Schubert et al. describen una opción adicional en el documento US 2013/102015 A1, donde cada reactivo se diluye por separado en una solución de excipiente y se liofiliza en forma de pequeños gránulos hechos de la estructura de excipiente. Este planteamiento mantiene los reactivos separados durante todo el proceso de producción, así como durante el almacenamiento y minimiza de esta manera todas las interacciones mutuas. Por otro lado, se debe agregar un componente adicional, el excipiente, y debe verificarse ampliamente para detectar una posible interferencia con las características de coagulación. Además de esto, el proceso de producción de gránulos se vuelve considerablemente más costoso que la dispensación de líquidos. Requiere equipos altamente individualizados tanto para la producción de gránulos como para la posterior distribución de gránulos en recipientes de reactivos o copas de medición.

En vista de lo anterior, es el objeto de la presente invención superar los inconvenientes de los sistemas de reactivos actuales para análisis viscoelásticos descritos anteriormente y proporcionar una punta de pipeta que se pueda utilizar para pruebas de diagnóstico tales como análisis viscoelásticos, así como métodos correspondientes que simplifiquen métodos de diagnóstico tales como análisis viscoelásticos, por ejemplo, minimizando el número de etapas de pipeteo. Además, también es un objeto de la presente invención proporcionar una punta de pipeta que se pueda usar en análisis viscoelásticos, en los que la composición de reactivos requerida tenga una estabilidad mejorada a largo plazo, pero que no requiera equipos de fabricación costosos o materiales (excipientes) adicionales en la composición de reactivos. También es un objeto de la presente invención proporcionar una punta de pipeta para análisis viscoelásticos, y métodos y usos de esta que permitan un procedimiento seguro, reproducible y fácil de usar para diferentes pruebas. También es un objeto de la presente invención proporcionar una punta de pipeta, que se pueda utilizar en análisis viscoelásticos, y métodos relacionados que requieran solo procedimientos convencionales de llenado y secado durante la producción sin equipos de automatización costosos y especializados individualmente, permitiendo ahorrar en costes de producción. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico que proporcione resultados fiables y reproducibles, que sea fácil de manejar y que proporcione un sistema normalizado para la determinación de las características de coagulación de una muestra de sangre.

Los objetos anteriores se consiguen mediante la materia objeto que se expone a continuación y en las reivindicaciones adjuntas.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que el término “comprende” y variaciones tales como “que comprende”, incluyen un componente, un número entero o una etapa indicada, aunque no la exclusión de cualquier otro componente, número entero o etapa no indicada. El término “consta de” es una realización particular del término “comprende”, en el que se excluye cualquier otro componente, número entero o etapa no indicada. En el contexto de la presente invención, el término “comprende” abarca el término “consta de”. Por tanto, el término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consta de”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

Los términos “un” y “uno, una” y “el, la” y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse de manera que incluyan tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o lo desmienta claramente el contexto. La relación de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor individual que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de ningún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa x ±10 %.

Punta de pipeta

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una punta de pipeta que comprende un constituyente (A) y un constituyente (B) de una manera espacialmente separada, en la que los constituyentes (A) y (B) están adaptados para formar una composición de diagnóstico tras la combinación, comprendiendo la composición de diagnóstico al menos los siguientes componentes (i) e (ii):

i) un activador de coagulación; y

ii) una sal de calcio;

en la que

1) el constituyente (A) comprende el componente (i) pero no el componente (ii) y el constituyente (B) comprende el componente (ii) pero no componente (i); o

2) el constituyente (A) comprende el componente (ii) pero no el componente (i) y el constituyente (B) comprende el componente (i) pero no componente (ii).

Es decir, los constituyentes (A) y (B) están adaptados para formar una composición de diagnóstico tras la combinación de los constituyentes (A) y (B), es decir, la composición de diagnóstico corresponde en particular a una combinación de los constituyentes (A) y (B). Por tanto, los componentes que comprende la composición de diagnóstico están formados por uno o ambos de los constituyentes (A) y (B). Preferiblemente, la composición de diagnóstico comprende al menos los siguientes componentes (i) e (ii):

i) un activador de coagulación; y

ii) una sal de calcio.

Tal como se usa en este documento, una “punta de pipeta” es la punta de una pipeta. Una pipeta es una herramienta de laboratorio que se usa normalmente para transportar un volumen medido de líquido. Las pipetas vienen en varios diseños para diferentes propósitos con diferentes niveles de exactitud y precisión, desde pipetas de vidrio en una sola pieza hasta pipetas electrónicas o ajustables más complejas. Muchos tipos de pipetas funcionan creando un vacío parcial en la cámara de retención de líquido y liberando selectivamente este vacío para extraer y dispensar líquido. La precisión de la medición varía mucho dependiendo del estilo.

Preferiblemente, la pipeta es una micropipeta de desplazamiento de aire, que es un tipo de micropipeta ajustable que mide volúmenes de entre aproximadamente 0,1 pl-1000 pl (1 ml). Estas pipetas requieren puntas desechables que entren en contacto con el fluido. Los cuatro tamaños convencionales de micropipetas corresponden a cuatro colores de puntas desechables diferentes:

(1) Pipeta “P10” para pipetear un volumen de 0,5-10 pl, por lo que las puntas correspondientes suelen ser de color blanco;

(2) Pipeta “P20” para pipetear un volumen de 2-20 pl, por lo que las puntas correspondientes suelen ser de color amarillo;

(3) Pipeta “P200” para pipetear un volumen de 20-200 pl, por lo que las puntas correspondientes suelen ser de color amarillo; y

(4) Pipeta “P1000” para pipetear un volumen de 200-1000 pl, por lo que las puntas correspondientes suelen ser de color azul.

En consecuencia, la punta de pipeta de acuerdo con la presente invención es preferiblemente una punta de pipeta desechable, más preferiblemente una punta de pipeta desechable para una micropipeta de desplazamiento de aire, incluso más preferiblemente una punta de pipeta desechable para una micropipeta de desplazamiento de aire para pipetear un volumen de 5- 1000 microlitros.

También se prefiere que la punta de pipeta sea la punta de cualquier otra pipeta, por ejemplo, la punta de una pipeta de desplazamiento positivo, preferiblemente una punta desechable de una pipeta de desplazamiento positivo, que es en particular una microjeringa (plástico), compuesta por un émbolo que desplaza directamente el líquido; la punta de una pipeta volumétrica, la punta de una pipeta graduada o cualquier otro tipo de pipeta. Por tanto, se prefiere que sea una punta de pipeta desechable.

En general, la punta de pipeta según la presente invención, que contiene los constituyentes (A) y (B) de la composición de diagnóstico, comprende:

- un extremo superior abierto que se ajusta al extremo correspondiente de una pipeta; y

- un extremo inferior abierto.

La parte/extremo “superior” e “inferior” de la punta de una pipeta, tal como se usa aquí, se refiere a la orientación (ideal) de la punta de pipeta en la práctica: dado que es deseable que el líquido que se ha de pipetear esté situado solo en la parte inferior de la punta de pipeta (para evitar la contaminación de la pipeta y para evitar que las burbujas de aire perjudiquen la precisión de la medición del volumen que se ha de pipetear), una pipeta se sostiene preferiblemente perpendicular (a la superficie de la tierra). Por consiguiente, el líquido que se ha de pipetear suele entrar en la punta de pipeta por su extremo inferior abierto (durante la aspiración) y también se libera a través del extremo inferior abierto de la punta de pipeta. El extremo superior abierto, por el contrario, encaja en el extremo (inferior) correspondiente de una pipeta y se utiliza para fijar la punta de pipeta en la pipeta.

Preferiblemente, el extremo superior abierto de la punta de pipeta y el extremo inferior abierto de la punta de pipeta tienen forma circular. También se prefiere que el extremo inferior abierto de la punta de pipeta tenga un diámetro menor que el extremo superior abierto.

Preferiblemente, la punta de pipeta según la presente invención comprende, además

- al menos una región de la superficie interna de la punta de pipeta que contiene uno (único) de los constituyentes (A) y (B), en particular en donde el constituyente (A) o (B) se deposita directamente sobre dicha superficie interna de la punta de pipeta, es decir, sin más capas/sustancias entre al menos uno de los constituyentes (A) y (B) y dicha superficie interna de la punta de pipeta; y/o

- al menos un inserto que contiene uno (único) de los constituyentes (A) y (B), en donde el inserto comprende preferiblemente una estructura porosa homogénea, preferiblemente de un polímero natural o artificial.

Preferiblemente, la punta de pipeta según la presente invención comprende una región de la superficie interna de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (A) y una región de la superficie interna de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (B). Preferiblemente, la punta de pipeta según la presente invención comprende una región de la superficie interna de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (A) y un inserto, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (B). Preferiblemente, la punta de pipeta de acuerdo con la presente invención comprende un inserto, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (A) y una región de la superficie interna de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (B). Preferiblemente, la punta de pipeta según la presente invención comprende un inserto, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (A) y un inserto, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (B). Más preferiblemente, la punta de pipeta según la presente invención comprende (i) una región de la superficie interna de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (A) y un inserto, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (B) o (ii) un inserto, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (A) y una región de la superficie interna de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (B). De un modo sumamente preferible, la punta de pipeta según la presente invención comprende (i) una región de la superficie interna de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (A) y un inserto, como se describe anteriormente, que contiene el constituyente (B).

Por lo tanto, los constituyentes (A) y (B) se conservan durante el tiempo (permitido) de almacenamiento de la punta.

Las puntas de pipeteo comunes se producen generalmente mediante moldeo por inyección de polímeros transparentes tales como polietileno, polipropileno, policarbonato y muchos otros. Por consiguiente, la punta de pipeta se hace preferiblemente de plástico, tal como polietileno, polipropileno y/o policarbonato. Algunas puntas de pipeta se colorean ligeramente añadiendo un tinte a la materia prima y esta coloración se refiere a un determinado tamaño de la pipeta correspondiente (por ejemplo, azul para pipetas de 1000 j l y amarillo para pipetas de 100 jl). Si es posible, la punta de pipeta se moldea más preferiblemente con un color (transparente u opaco). Tal color se usa preferiblemente para indicar los constituyentes que forman una composición de diagnóstico tras la combinación y, por tanto, para la prueba de diagnóstico que se puede realizar usando esta punta.

En la punta de pipeta, los constituyentes (A) y (B) están presentes de manera separada espacialmente. Es decir, en la punta de pipeta, los constituyentes (A) y (B) no están en contacto entre sí. Esta separación espacial permite así que los constituyentes (A) y (B) no estén en contacto entre sí, evitando así reacciones químicas no deseadas de los constituyentes (A) y (B).

Preferiblemente, la punta de pipeta comprende

a) un compartimento (a) que contiene el constituyente (A); y/o

b) un compartimento (b) que contiene el constituyente (B).

El término “compartimento”, tal como se utiliza aquí, se refiere a una parte separada dentro de la punta de pipeta. Es decir, el constituyente (A) está contenido preferiblemente en una parte separada de la punta de pipeta y el constituyente (B) está contenido preferiblemente en otra parte separada de la punta de pipeta. Preferiblemente, un compartimento está confinado estructuralmente, por ejemplo, por su propia estructura (por ejemplo, si el compartimento es un inserto, tal como un inserto poroso), por paredes (laterales), salientes, membranas u otras estructuras de confinamiento. También se prefiere que un compartimento no esté (completamente) confinado estructuralmente, tal como distintos compartimentos en la punta de pipeta son secciones distintas de la punta de pipeta, tal como secciones horizontales (transversales) de la punta de pipeta o secciones longitudinales de la punta de pipeta sin estructuras (constructivas) para separar una sección de otra.

Preferiblemente, los compartimentos (a) y (b) están diseñados para evitar cualquier contacto entre los constituyentes (A) y (B), en particular siempre que estén en forma líquida, por ejemplo, durante y/o después del proceso de fabricación/llenado de la punta.

Preferiblemente, los compartimentos están diseñados para permitir el llenado con diferentes volúmenes. Es decir, los volúmenes de los compartimentos (a) y (b) son preferiblemente diferentes entre sí, es decir, el volumen del compartimento (a) es preferiblemente mayor o menor que el volumen del compartimento (b). Por ejemplo, el compartimento (a) puede llenarse con menos de 5 j l de constituyente líquido (A) y el compartimento (b) puede llenarse con más de 5 j l de constituyente líquido (B), lo que implica que el compartimento (a) tiene un volumen de menos de 5 j l y el compartimento (b) tiene un volumen de más de 5 jl. Por ejemplo, el compartimento (a) puede llenarse con menos de 2 j l de constituyente líquido (A) y el compartimento (b) puede llenarse con más de 2 j l de constituyente líquido (B), lo que implica que el compartimento (a) tiene un volumen de menos de 2 j l y el compartimento (b) tiene un volumen de más de 2 jl. Por ejemplo, el compartimento (a) puede llenarse con menos de 10 j l de constituyente líquido (A) y el compartimento (b) puede llenarse con más de 10 j l de constituyente líquido (B), lo que implica que el compartimento (a) tiene un volumen de menos de 10 j l y el compartimento (b) tiene un volumen de más de 10 jl. Tales volúmenes permiten la preparación de los componentes líquidos A y B en su respectiva concentración óptima, en particular para el volumen de muestra (sangre) previsto. Por consiguiente, los diferentes volúmenes de llenado de reactivo pueden depender del volumen total de la punta de pipeteo. Por ejemplo, una punta de pipeta con un volumen de muestra (de sangre) de aproximadamente 300 j l podría tener un compartimento adecuado para volúmenes de más de 5 j l de reactivo y un compartimento adecuado para menos de 5 j l de reactivo. Por ejemplo, una punta de pipeta con un volumen de muestra (de sangre) de aproximadamente 100 j l podría tener un compartimento adecuado para volúmenes superiores a 2 j l de reactivo y un compartimento adecuado para volúmenes inferiores a 2 j l de reactivo. Por ejemplo, una punta de pipeta para un volumen de muestra (de sangre) de aproximadamente 600 j l podría tener un compartimento adecuado para volúmenes superiores a 10 j l de reactivo y un compartimento adecuado para volúmenes inferiores a 10 j l de reactivo.

Preferiblemente, al menos uno de los compartimentos (a) y (b) está formado por un inserto (poroso). Por consiguiente, la punta de pipeta comprende preferiblemente al menos un inserto (poroso). Preferiblemente, el constituyente (A) está contenido (exactamente) en un inserto (poroso) y/o el constituyente (B) está contenido (exactamente) en un inserto (poroso). Si ambos, los constituyentes (A) y (B) están contenidos en insertos (porosos), el inserto (poroso) que comprende el constituyente (A) es preferiblemente diferente del inserto (poroso) que comprende el constituyente (B) para asegurar la separación espacial de constituyentes (A) y (B). Más preferiblemente, el compartimento (b) que contiene el constituyente (B) está formado por un inserto (poroso). El término “inserto”, tal como se usa en este documento, se refiere a un elemento que no está contenido en puntas de pipeta desechables convencionales (no precargadas/no modificadas). Típicamente, un “inserto” está hecho de un material diferente del material de la punta de pipeta. Sin embargo, el inserto también puede estar hecho del mismo material que la punta de pipeta. El término “poroso” se refiere a un inserto que tiene poros, como se describe a continuación. Preferiblemente, los poros del inserto poroso tienen un diámetro de poro mínimo de 2 |jm y un diámetro de poro máximo de 2,0 mm dependiendo del diámetro interno de la punta de pipeta en la región en la que se coloca el inserto poroso, como se describe a continuación.

Preferiblemente, la forma de la punta de pipeta está adaptada para recibir un inserto, en particular un inserto poroso (en este documento también denominado “tapón”), preferiblemente en la parte inferior de la punta de pipeta. El inserto (poroso) tiene preferiblemente una forma cilíndrica o esférica. Para recibir un inserto (poroso), la punta de pipeta puede tener una forma convencional (simplemente cónica) o se puede modificar la forma de la punta. Preferiblemente, la forma de la punta puede modificarse en comparación con la forma de una punta de pipeta cónica regular de manera que el inserto pueda tener una forma cilíndrica. En particular, se prefiere que tal punta de pipeta modificada preferida tenga una forma apenas cónica, pero casi cilíndrica, más preferiblemente una forma cilíndrica, en al menos 2 mm de su longitud total. Una punta de pipeta modificada de este tipo puede recibir un tapón cilíndrico y se puede evitar una forma cónica del inserto. Los tapones cilíndricos son más fáciles y económicos de producir que los insertos cónicos porque pueden moldearse directamente del material laminado. También se prefiere que la punta de pipeta no sea modificada y tenga, por tanto, una forma convencional (simplemente cónica).

Preferiblemente, el inserto poroso se hace de un material de soporte. Un “material de soporte” permite preferiblemente la absorción del constituyente (inicialmente) líquido (A) y/o (B), por ejemplo, durante el proceso de fabricación/llenado de la punta de pipeta. El término “material de soporte” tal como se usa en este documento, se refiere a un material “que soporta” un constituyente contenido en la punta de pipeta, en particular un material “que soporta” el constituyente (A) o el constituyente (B) contenido en la punta de pipeta, como se describe aquí. Es decir, un constituyente, en particular el constituyente (A) o el constituyente (B), contenido en la punta de pipeta como se describe en el presente documento, puede depositarse sobre un material de soporte. Por consiguiente, un material de soporte proporciona preferiblemente una estructura de soporte para un constituyente, en particular el constituyente (A) o el constituyente (B) , contenido en la pipeta, como se describe en este documento. Preferiblemente, el material de soporte es una espuma, tal como una espuma polimérica, por ejemplo, una espuma natural o artificial, tal como por ejemplo una espuma de poliéter, una espuma de poliéster, una espuma de poliestireno o una espuma de poliuretano. Más preferiblemente, el material de soporte es una estructura de espuma de celda abierta (o esponja) e, incluso más preferiblemente, la estructura de espuma tiene poca variación en los tamaños de poro porque los tamaños de poro similares y la alta homogeneidad del material permiten una distribución uniforme del reactivo líquido en el tapón de espuma durante el proceso de llenado. Preferiblemente, el tamaño de poro, en particular el diámetro mínimo de los poros, del material de soporte es de al menos 2 jm , por lo que (i) permite que todos los componentes posiblemente aparentes de un líquido de muestra humano (tales como trombocitos sanguíneos o glóbulos rojos; bacterias en urea, etc.) pasen a través del inserto poroso (hecho del material de soporte) durante la aspiración de la muestra, (ii) permite que la muestra se dispense sin crear cierres en el material de soporte y/o (iii) permite que la muestra se dispense sin reducir excesivamente su velocidad de aspiración/dispensación (por ejemplo, a más de 15 segundos por volumen total de la punta). El diámetro máximo de los poros preferiblemente no sobrepasa valores de un tercio del diámetro interno de la punta de pipeta en la región en la que se coloca el inserto poroso, para permitir un ajuste adecuado y una mejora suficiente del área de superficie (por ejemplo, diámetro máximo de poro de 0,3 mm para una punta que tenga un diámetro interno de 0,9 mm en la región en la que se coloca el inserto poroso, o un tamaño máximo de poro de 2,0 mm para una punta que tenga un diámetro interno de 6,0 mm en la región en la que se coloca el material de soporte).

El diámetro de poro (p. ej., un diámetro de poro máximo o mínimo), tal como se utiliza a lo largo de la presente descripción, puede medirse utilizando métodos bien conocidos por los expertos, en particular mediante la formación de imágenes microscópicas. Por tanto, la microscopía se realiza preferiblemente en condiciones normales (temperatura: 22 °C y presión absoluta: 101,325 kPa), reflejando en particular el diámetro de poro cuando se usa la punta de pipeta. El programa informático convencional para la formación de imágenes microscópicas generalmente proporciona herramientas para medición que tienen en cuenta la resolución. Otra opción para determinar el diámetro de poro, que es, sin embargo, menos preferida que la formación de imágenes microscópicas, es la medición del caudal y la determinación del diámetro de poro utilizando, por ejemplo, la ley de Darcy.

También se prefiere que el material de tipo espuma tenga un módulo de elasticidad mínimo de >0,3 N/m2 para permitir la fijación simple de un inserto poroso predominantemente simétrico axialmente (por ejemplo, cilíndrico o esférico), tal como un “tapón de espuma”, (material de soporte) dentro de la punta presionándolo activamente en una región en la que el diámetro interno de la punta es menor que el diámetro externo del tapón y la fuerza de descompresión resultante mantiene el tapón en su sitio. Además, dicha elasticidad mínima facilitaría la manipulación del tapón de espuma durante la fabricación en comparación con materiales que reaccionan con deformaciones más inelásticas a fuerzas de retención, fuerzas de aceleración y otras fuerzas que son típicas de la manipulación de artículos en la fabricación automatizada.

El módulo de elasticidad (por ejemplo, un módulo de elasticidad máximo o mínimo), tal como se utiliza a lo largo de la presente descripción, puede medirse usando métodos bien conocidos por los expertos, en particular mediante elongación simple de material bajo esfuerzo de tracción perpendicular a una sección transversal definida.

Se prefiere además que al menos uno de los compartimentos (a) y (b) de la punta de pipeta esté formado por un inserto poroso hecho de material de soporte, tal como un tapón de espuma, que tenga un módulo de elasticidad máximo de <300 N/m2, que permitiría el llenado de reactivo utilizando las fuerzas de succión resultantes de la compresión y posterior descompresión de la espuma (principio de esponja). Las fuerzas de compresión podrían aplicarse directamente usando los medios de llenado empleados, por ejemplo, una aguja dispensadora, o usando medios adicionales.

Cabe destacar que los valores de módulo de elasticidad descritos anteriormente deben medirse para una parte macroscópica del material de espuma, en particular como promedio de varias paredes de polímero y esferas vacías encerradas (los poros), mientras que el polímero en sí podría tener un módulo de elasticidad considerablemente mayor cuando se procese de manera diferente que con la extrusión de espuma.

Más en general, el inserto (poroso) se hace preferiblemente de un material plástico que pueda moldearse por inyección, sinterizarse, extruirse o espumarse con la formación de una porosidad bastante homogénea con tamaños de poro de 2-500 pm (diámetro mínimo de poro: 2 pm y diámetro máximo de poro: 500 pm). Ejemplos de tal material plástico, que es el material preferido del inserto (poroso), incluyen polietileno, polipropileno, policarbonato, poliéter y poliéster. También se prefiere que el inserto no se haga de un material que contenga vidrio o metal, p. ej., chapa y/o lámina de aluminio, más preferiblemente el inserto no contiene vidrio o metal, por ejemplo, chapa y/o lámina de aluminio. También se prefiere que la punta de pipeta no se haga de un material que contenga vidrio o metal, p. ej., chapa y/o lámina de aluminio, más preferiblemente, la punta de pipeta no contiene vidrio o metal, p. ej., chapa y/o lámina de aluminio.

Preferiblemente, al menos uno de los compartimentos (a) y (b) está formado por una sección (longitudinal o transversal) de la punta de pipeta que comprende una capa de reactivo. Por consiguiente, la punta de pipeta comprende preferiblemente al menos una capa de reactivo. Preferiblemente, el constituyente (A) está formado (exactamente) por una capa de reactivo y/o el constituyente (B) está formado (exactamente) por una capa de reactivo. Si ambos, los constituyentes (A) y (B) están formados por capas de reactivo, la capa de reactivo que comprende el constituyente (A) es preferiblemente diferente de la capa de reactivo que comprende el constituyente (B) para asegurar la separación espacial de los constituyentes (A) y (B) (en otras palabras, la capa de reactivo que comprende el constituyente (A) preferiblemente no tiene contacto con la capa de reactivo que comprende el constituyente (B) en la punta de pipeta). Más preferiblemente, el compartimento (a) que contiene el constituyente (A) está formado por una sección (longitudinal o transversal) de la punta de pipeta que comprende una capa de reactivo. Para obtener una capa de reactivo, el constituyente respectivo (A) o (B) (o sus componentes) se deposita preferiblemente sobre la superficie interna de la punta de pipeta. Por ejemplo, el constituyente respectivo (A) o (B) (o sus componentes) puede depositarse sobre la superficie interna de la punta de pipeta en su forma líquida y luego el constituyente respectivo (A) o (B) (o sus componentes) se seca, p. ej., mediante liofilización, secado con calor. Por ejemplo, el constituyente respectivo (A) o (B) (o sus componentes) se puede pulverizar en microgotas (preferiblemente gotas que tengan un diámetro de no más de 100 pm cuando se pulveriza sobre la superficie interna de la punta). De ese modo, se evita la acumulación de reactivo a lo largo del extremo inferior abierto de la punta (y la obstrucción de ese extremo). Esto además permite la humectación de las paredes laterales y aumenta la superficie cubierta, dando como resultado un menor espesor de la capa de reactivo y una disolución correspondiente más rápida después de la adición de la muestra.

De preferencia, la punta de pipeta comprende una capa de reactivo que tiene un espesor uniforme. Preferiblemente, la capa de reactivo se encuentra en la parte más baja de la punta de pipeta, por ejemplo, dentro del tercio inferior de la punta de pipeta (con referencia al volumen de la punta de pipeta), preferiblemente dentro del cuarto inferior de la punta de pipeta (con referencia al volumen de la punta de pipeta), más preferiblemente dentro del quinto inferior de la punta de pipeta (con referencia al volumen de la punta de pipeta) y de un modo sumamente preferible dentro del sexto inferior de la punta de pipeta (con referencia al volumen de la punta de pipeta).

En general, las posiciones de los al menos dos compartimentos (a) y (b) en la punta de pipeta pueden variar, aunque preferiblemente están en el intervalo en el que el líquido de muestra (en la cantidad requerida para realizar la prueba de diagnóstico) puede humedecer completamente la región correspondiente. De ese modo, la posición de los compartimentos (a) y (b) dentro de la punta está preferiblemente dentro de la mitad inferior de la punta de pipeta, más preferiblemente dentro del tercio inferior de la punta de pipeta, incluso más preferiblemente dentro del cuarto inferior de la punta de pipeta, por lo que los términos “mitad”, “tercio” y “cuarto” se refieren al volumen correspondiente en relación con el volumen total de la punta de pipeta, es decir, A del volumen total, 'A del volumen total o % del volumen total.

Preferiblemente, la punta de pipeta comprende al menos un inserto (poroso), como se describe en este documento, y al menos una capa de reactivo, como se describe en este documento. Por lo tanto, se prefiere que el inserto poroso comprenda el constituyente (A) y la capa de reactivo comprenda el constituyente (B) o el inserto poroso comprenda el constituyente (B) y la capa de reactivo comprenda el constituyente (A). Si la punta de pipeta comprende al menos un inserto (poroso), como se describe en este documento, y al menos una capa de reactivo, como se describe en este documento, (i) el al menos un inserto (poroso), como se describe en este documento, puede situarse por encima de la menos una capa de reactivo, como se describe en este documento (con referencia a una orientación de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, en el contexto de la “parte/extremo superior e inferior” de la punta de pipeta),o (ii) el al menos un inserto (poroso), como se describe en este documento, puede situarse por debajo de la al menos una capa de reactivo, como se describe en este documento (con referencia a una orientación de la punta de pipeta, como se describe anteriormente en el contexto de la “parte/extremo superior e inferior” de la punta de pipeta).

Preferiblemente, el al menos un inserto (poroso), como se describe en este documento, puede situarse por encima de al menos una capa de reactivo, como se describe en este documento (con referencia a una orientación de la punta de pipeta, como se describe anteriormente, en el contexto de la “parte/extremo superior e inferior” de la punta de pipeta).

Preferiblemente, al menos el compartimento que tiene el volumen mayor, como se describe anteriormente, está formado por un inserto (poroso), p. ej., hecho de un material de soporte. Por ejemplo, el compartimento (b) que contiene el constituyente (B) está formado por un inserto (poroso), p. ej., hecho de un material de soporte, o el compartimento (a) que contiene el constituyente (A) está formado por un inserto (poroso), p. ej., hecho de un material de soporte.

Preferiblemente, la punta de pipeta según la presente invención comprende:

a) un compartimento (a) que contiene el constituyente (A) y no contiene el constituyente (B); y

b) un compartimento (b) que contiene el constituyente (B) y no contiene el constituyente (A).

Tal como se describe anteriormente, los constituyentes (A) y (B) están adaptados para formar una composición de diagnóstico tras la combinación, en donde la composición de diagnóstico (es decir, los constituyentes (A) y/o (B)) comprende los siguientes componentes (i) e (ii):

i) un activador de coagulación; y

ii) una sal de calcio.

En la punta de pipeta según la presente invención, como se describe anteriormente, el constituyente (A) es diferente del constituyente (B). Es decir, los constituyentes (A) y (B) preferiblemente no son iguales.

Dado que los constituyentes (A) y (B) están adaptados para formar una composición de diagnóstico tras la combinación, en donde la composición de diagnóstico comprende los componentes (i) e (ii), como se describe anteriormente, cada uno de los constituyentes (A) y (B) es en particular una composición de componentes (o reactivos) por sí misma. El constituyente (A) es una composición que comprende el componente (i) o el componente (ii) y, opcionalmente, otros componentes. Por consiguiente, el constituyente (B) es una composición que comprende el componente (i) o el componente (ii) y, opcionalmente, otros componentes. Sin embargo, el constituyente (A) es diferente del constituyente (B) y, por tanto:

1) el componente (i) está contenido en el constituyente (A) y el componente (ii) está contenido en el constituyente (B); o

2) el componente (ii) está contenido en el constituyente (A) y el componente (i) está contenido en el constituyente (B).

En la figura 1 se muestra un diagrama ejemplar que muestra una prueba de coagulación típica, a saber, un análisis viscoelástico (también denominado medición viscoelástica). La curva del diagrama representa el aumento de firmeza del coágulo en la copa de medición después de un tiempo de demora inicial (tiempo de coagulación). La curva se desarrolla hasta que se alcanza un máximo que representa la máxima firmeza del coágulo de la muestra.

Mediante el uso de la punta de pipeta según la presente invención, se puede realizar un análisis viscoelástico, por ejemplo, de la siguiente manera:

1) se aspira un volumen definido de una muestra (p. ej., sangre completa, plasma sanguíneo, etc.) hacia una punta de pipeta que contiene un constituyente (A) de la composición de diagnóstico en formulación seca, húmeda u otra, y un constituyente (B) de la composición de diagnóstico en formulación seca, húmeda u otra, obteniéndose así una mezcla de constituyente (A), constituyente (B) y la muestra;

2) opcionalmente, una breve demora de tiempo (por ejemplo, 0-30 s) que permite la disolución completa de los constituyentes (A) y (B) de la composición de diagnóstico dentro del líquido de muestra;

3) la mezcla (o solución) del constituyente (A), el constituyente (B) y la muestra se añaden directamente a una copa de medición adecuada para medición viscoelástica;

4) opcionalmente, para mejorar la mezcla de todos los componentes, la mezcla resultante se aspira nuevamente al menos parcialmente hacia la punta de pipeta y posteriormente se libera nuevamente en la copa de medición (esta etapa puede repetirse una o más veces); y

5) se inicia la medición viscoelástica (después de colocar la copa en la posición de medición correcta si esto no se ha hecho antes).

Opcionalmente, la muestra puede añadirse a un recipiente que contenga otro constituyente de la composición de diagnóstico después de la etapa 2) y aspirarse de nuevo después de un breve tiempo de disolución (0-30 s) y antes de la etapa 3).

Por consiguiente, el usuario solo necesita un mínimo de dos etapas de pipeteo para realizar cada prueba, mientras que en el sistema de reactivo líquido según la técnica anterior se requieren hasta ocho etapas. Además, no es necesario cambiar la punta de pipeta. Por lo tanto, la punta de pipeta actual, por ejemplo, para determinar características de coagulación de una muestra de sangre, se puede manipular más fácilmente, disminuyendo así la probabilidad de errores que pueden deberse a una línea de acción imprecisa de un operario (potencialmente menos experimentado). De ahí pueden surgir otras ventajas tales como, por ejemplo, una mayor reproducibilidad de los resultados que se han de conseguir y, por tanto, un mayor grado de normalización.

La muestra que se va a analizar mediante el uso de la punta de pipeta según la presente invención es preferiblemente líquida. Por consiguiente, en el presente documento también se hace referencia a una muestra de líquido como líquido de muestra o líquido de prueba. Más preferiblemente, la muestra de líquido es un biofluido (también denominado fluido corporal), es decir, un fluido procedente de un organismo, en particular un fluido procedente de un ser humano o un animal. Incluso más preferiblemente, el líquido de muestra es sangre, preferiblemente sangre completa, o uno o más de sus elementos, p. ej., plasma y/o células. De manera particularmente preferible, la muestra es una muestra de sangre humana y comprende sangre (completa) y/o plasma sanguíneo.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico y a una punta de pipeta, que se pueden utilizar en diagnósticos in vitro de una muestra, tales como pruebas de coagulación, en particular en el análisis viscoelástico de una muestra. La composición de diagnóstico contiene preferiblemente al menos un activador de coagulación y una sal de calcio, es decir, componentes (i) e (ii). Opcionalmente, la composición de diagnóstico puede contener componentes adicionales, tal como se describe a continuación, p. ej., uno o más inhibidores y/o componentes de coagulación. Según la presente invención, los componentes de la composición de diagnóstico están separados dentro de la punta de pipeta, en particular los componentes de la composición de diagnóstico están contenidos en al menos dos compartimentos distintos de la punta de pipeta. Ya que en cualquier caso se requiere una punta de pipeta y, opcionalmente, una copa de medición en diagnósticos in vitro de una muestra, tal como pruebas de coagulación, en particular en el análisis viscoelástico de una muestra, no se necesitan recipientes de reactivo adicionales y se puede evitar la pérdida de la composición de diagnóstico o de uno o más componentes de esta, debido al pipeteo desde un recipiente de reactivo adicional a otro recipiente de reactivo. Además, la presente invención permite proporcionar la composición de diagnóstico requerida con una estabilidad mejorada a largo plazo y un mayor tiempo de reconstitución para las biomoléculas contenidas, aunque sin la necesidad de utilizar equipos de fabricación costosos o materiales (excipientes) adicionales en la composición de reactivos. En la aplicación clínica de la punta de pipeta descrita, se minimiza el número de etapas de pipeteo. En particular, la punta de pipeta según la presente invención está adaptada para un único análisis de una muestra de sangre y tiene una estabilidad de reactivo superior con respecto a varias composiciones de la técnica anterior. El concepto inventivo se basa en la separación de las sustancias necesarias, p. ej., en dos compartimentos diferentes.

Opcionalmente, la punta de pipeta según la presente invención puede contener preferiblemente uno o más compartimentos adicionales, p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5 compartimentos adicionales, además del compartimento (A) que contiene un constituyente (A) y un compartimento (b) que contiene un constituyente (B). Tales compartimentos adicionales contienen preferiblemente constituyentes distintos de los constituyentes (A) y (B), que también ayudan en la composición de diagnóstico formada tras la combinación de los constituyentes (A) y (B).

Opcionalmente, otro recipiente (reactivo), tal como un vial de reactivo normal o una copa de medición, además de la punta de pipeta, puede proporcionar uno o más componentes (reactivos) adicionales, proporcionando así un kit de diagnóstico.

Sin embargo, también se prefiere que la punta de pipeteo según la presente invención comprenda exactamente dos constituyentes (A) y (B), es decir, no más constituyentes que los constituyentes (A) y (B).

Preferiblemente, la punta de pipeta, que contiene los constituyentes (A) y (B) (y cualquier recipiente de reactivo adicional opcional) contiene en particular un constituyente de la composición de diagnóstico en cantidad suficiente para realizar un único análisis viscoelástico de una muestra, en particular líquido de prueba. En particular, la punta de pipeta, que contiene los constituyentes (A) y (B) (y cualquier recipiente de reactivo adicional opcional) se puede llenar con reactivos en una formulación líquida, seca, sustancialmente seca o cualquier otra formulación.

La cantidad suficiente para realizar un solo análisis viscoelástico de una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre es la cantidad requerida para cada uno de los constituyentes cuando todos los constituyentes están mezclados (es decir, en la “composición de diagnóstico”), lo que proporciona la concentración requerida de los reactivos en el análisis de diagnóstico final, p. ej., análisis viscoelástico, de la muestra, p. ej., de una muestra de sangre. Por lo tanto, no es necesario dividir además la composición de diagnóstico antes o después de mezclarla, disolviéndola preferiblemente en un líquido.

Preferiblemente, la concentración de trabajo final de reactivos se logra mezclando los constituyentes con la muestra directamente en la punta de pipeta, pero no mezclando los constituyentes en una cantidad de diluyente líquido en la punta de pipeta y juntando después esta solución con la muestra deseada.

Además, se prefiere que la mezcla se logre mediante la disolución de los constituyentes dentro de la muestra.

En consecuencia, la presente invención (1) permite la separación de algunos ingredientes reactivos que se influyen entre sí, lo que aumenta la estabilidad del reactivo; (2) permite la formulación de ingredientes ya sea en forma líquida, seca, sustancialmente seca o cualquier otra, dependiendo de su estabilidad y/o necesidades de estabilidad (en particular, algunos de los ingredientes se suelen usar en exceso para que la degradación parcial no falsifique los resultados de las pruebas, algunos ingredientes suelen ser increíblemente estables incluso en forma líquida, y solo algunos ingredientes suelen ser menos estables en forma líquida y no se usan en exceso y, por tanto, deben tratarse con más cuidado); y (3) ahorra costes adicionales y desperdicio de material (es decir, viales de reactivo) al emplear recipientes que se utilizan de todos modos para realizar pruebas de diagnóstico, tales como pruebas viscoelásticas.

En consecuencia, la presente invención proporciona una combinación única de dos constituyentes (A) y (B) dispuestos en una sola punta de pipeta de manera espacialmente separada, por lo que la punta de pipeta se usa de todos modos para realizar una medición viscoelástica u otra medición de diagnóstico. El grado de libertad resultante para formular las al menos dos partes separadas (es decir, los al menos dos constituyentes separados) de la composición de diagnóstico en formulación seca, sustancialmente seca, líquida u otra formulación comprende un planteamiento nuevo y altamente rentable. Sorprendentemente, los presentes inventores llegaron a la presente invención basándose en la realización de una combinación de análisis de interacciones mutuas de ingredientes, realizando estudios de estabilidad en función de la formulación como seca, sustancialmente seca o líquida, investigando estudios de estabilidad y resultados de pruebas para evaluar el posible impacto negativo de los recipientes empleados en el resultado de las pruebas en mediciones viscoelásticas con líquidos corporales tales como sangre o plasma sanguíneo (cf. ejemplos) y, por último, pero no menos importante, entendiendo el impacto comercial al proporcionarse un reactivo ya sea en cantidades excesivas o no.

Preferiblemente, cada uno de los constituyentes (A) y (B) es independientemente de otro una formulación líquida, una formulación sustancialmente seca o una formulación seca.

“Sustancialmente seca”, tal como se usa en este documento, se refiere a un estado, en el que la mezcla está sustancialmente libre de cualquier líquido o humedad, en particular sin agua. Sin embargo, puede haber agua o cualquier otro líquido como residuo en la mezcla, pero solo hasta cierto punto, lo cual no influye negativamente en la estabilidad de toda la composición. En particular, debe excluirse que se produzca una interacción entre los diferentes constituyentes que afecte negativamente a la estabilidad. Una cantidad restante de líquido, preferiblemente agua, en la composición de hasta el 10 % en peso puede ser aceptable en una formulación sustancialmente seca.

Más preferiblemente, los constituyentes (A) y (B) son formulaciones sustancialmente secas o formulaciones secas, e incluso más preferiblemente los constituyentes (A) y (B) son formulaciones secas. Por ejemplo, se prefiere que (1) el constituyente (A) sea una formulación seca y el constituyente (B) sea una formulación sustancialmente seca; o (2) el constituyente (A) sea una formulación sustancialmente seca y el constituyente (B) sea una formulación seca. De un modo sumamente preferido, sin embargo, ambos constituyentes (A) y (B) son formulaciones secas.

De ese modo, se mejora la estabilidad de los constituyentes (A) y (B) en condiciones de temperatura ambiente. No obstante, los constituyentes (A) y (B) pueden introducirse en la punta de pipeta, p. ej., durante el proceso de fabricación de la punta de pipeta, en una formulación seca, sustancialmente seca o líquida, por ejemplo, usando posteriormente secado al vacío, secado con calor, liofilización o cualquier otro proceso adecuado para secar los constituyentes (A) y (B).

En la punta de pipeta según la presente invención:

1) el constituyente (A) comprende el componente (i) pero no el componente (ii) y el constituyente (B) comprende el componente (ii) pero no el componente (i); o

2) el constituyente (A) comprende el componente (ii) pero no el componente (i) y el constituyente (B) comprende el componente (i) pero no el componente (ii).

Por lo tanto, se entiende que en la situación 1), es decir, si el componente (i) está contenido en el constituyente (A) y el componente (ii) está contenido en el constituyente (B), el constituyente (A) no comprende el componente (ii) y el constituyente (B) no comprende el componente (i). En consecuencia, en la situación 2), es decir, si el componente (ii) está contenido en el constituyente (A) y el componente (i) está contenido en el constituyente (B), el constituyente (A) no comprende el componente (i) y el constituyente (B) no comprende el componente (ii). Por tanto, cada uno de los constituyentes (A) y (B) comprende el componente (i) o el componente (ii).

De acuerdo con la presente invención, el componente (i) de la composición de diagnóstico, es decir el activador de coagulación, está preferiblemente separado espacialmente del componente (ii) de la composición de diagnóstico, es decir, la sal de calcio. Si estos componentes permanecen separados espacialmente hasta poco antes de que comience el análisis viscoelástico, se puede lograr una mejor estabilidad de la composición de diagnóstico (o de los componentes respectivos) y se pueden evitar problemas relacionados con la estabilidad. Por tanto, el constituyente (A) de la composición de diagnóstico comprende el componente (i) o el componente (ii), pero no ambos, los componentes (i) e (ii). Por consiguiente, el constituyente (B) de la composición de diagnóstico comprende el componente seleccionado de entre el componente (i) y el componente (ii), que no está contenido en el constituyente (A), y tampoco ambos, los componentes (i) e (ii).

Aunque se pueden preferir algunas realizaciones, como se describe a continuación, en general, el activador de coagulación (el componente (i)) puede estar contenido en el constituyente (A) y la sal de calcio (el componente (ii)) puede estar contenido en el constituyente (B) o viceversa.

Composición de diagnóstico y sus constituyentes y componentes

En el contexto de la presente invención, el término “composición de diagnóstico” se refiere a una composición de reactivos (mezcla de reactivos) para análisis de diagnóstico in vitro, tal como pruebas de coagulación, en particular análisis viscoelástico, lista para usar. Es decir, además de la composición de diagnóstico y la muestra, no se requieren más reactivos para realizar el análisis de diagnóstico. Además, no es necesaria la dilución de la composición de diagnóstico.

En la presente invención, los constituyentes de la composición de diagnóstico, en particular el constituyente (A) y el constituyente (B), están separados espacialmente. Siempre que los constituyentes, en particular el constituyente (A) y el constituyente (B), estén separados espacialmente, todavía no forman una composición de diagnóstico, sin embargo, pueden llegar a formar una composición de diagnóstico. La composición de diagnóstico se forma poniendo los constituyentes, por ejemplo, el constituyente (A) y el constituyente (B), en contacto entre sí, preferiblemente mezclándolos.

La muestra puede ponerse en contacto (i) con la composición de diagnóstico, es decir, después de poner en contacto los constituyentes de la composición de diagnóstico entre sí, o (ii) con un constituyente, p. ej., con el constituyente (A) o el constituyente (B). En el caso (ii) la composición de diagnóstico se forma después de poner en contacto la muestra con uno de los constituyentes, es decir, la muestra se pone en contacto con uno de los constituyentes, p. ej., con el constituyente (A), y el otro constituyente, p. ej., el constituyente (B), se pone en contacto posteriormente con una mezcla del constituyente (A) y la muestra, formando así una mezcla de la composición de diagnóstico y la muestra.

Según la presente invención, la punta de pipeta contiene los constituyentes (A) y (B). Cuando la muestra se aspira con la punta de pipeta, la muestra entra en contacto con el primer constituyente (A) o el constituyente (B), o con ambos constituyentes aproximadamente al mismo tiempo. Incluso aunque haya diferencias de tiempo entre estos dos contactos, estas diferencias temporales son bastante insignificantes (normalmente de menos de 1 segundo) y se forma una mezcla de la composición de diagnóstico y la muestra de forma bastante instantánea.

Como se describe anteriormente, una composición de diagnóstico comprende componentes que se describen con más detalle a continuación. Dado que los constituyentes de la composición de diagnóstico deben formar la composición de diagnóstico, los constituyentes, en particular el constituyente (A) y el constituyente (B), comprenden los componentes de la composición de diagnóstico. Por ello, uno o más componentes de la composición de diagnóstico pueden estar contenidos en el constituyente (A), uno o más componentes de la composición de diagnóstico pueden estar contenidos en el constituyente (B), y uno o más componentes de la composición de diagnóstico pueden estar contenidos en ambos, constituyentes (A) y (B).

Así, se entiende que un componente “contenido en la composición de diagnóstico” es un componente que está contenido en uno o ambos constituyentes, es decir, en los constituyentes (A) y/o (B). Es decir, si la composición de diagnóstico comprende un determinado componente, este componente suele estar contenido en el constituyente (A) (y no por el constituyente (B)) o por el constituyente (B) (y no por el constituyente (A)) o por ambos, constituyentes (A) y (B).

En una realización preferida, la composición de diagnóstico puede ser para análisis viscoelástico. Por tanto, los constituyentes (A) y/o (B) comprenden (i) un activador de coagulación (p. ej., un activador de la vía intrínseca o extrínseca), (ii) una sal de calcio y (iii) opcionalmente, uno o más inhibidores adicionales, p ej., inhibidores de fibrinólisis, inhibidores de plaquetas, inhibidores de heparina y/o (iv) opcionalmente, uno o más factores o cofactores específicos adicionales de la cascada de coagulación.

En otra realización preferida, la composición de diagnóstico puede ser para diagnósticos de coagulación en sangre o plasma sanguíneo que no sean análisis viscoelásticos, tal como 'tiempo de protrombina' (PT), 'tiempo de tromboplastina parcial activada' (APTT), 'tiempo de coagulación activada' (ACT) o 'tiempo de coagulación inducida por protrombinasa' (PICT). Por tanto, los constituyentes A y B son de preferencia exactamente iguales a los descritos en este documento para análisis viscoelásticos o el activador puede ser diferente. Por tanto, los activadores de coagulación preferidos incluyen FXa y veneno de víbora de Russel: componente activador de factor V (RVV-V). Preferiblemente, el activador de coagulación es un activador extrínseco y/o un activador intrínseco, es decir, un activador de la vía extrínseca (la vía de factor tisular) o de la vía intrínseca (vía de activación por contacto).

Por lo tanto, se prefiere que:

- el componente (i) sea un activador extrínseco de coagulación y el componente (ii) sea una sal de calcio; o - el componente (i) sea un activador intrínseco de coagulación y el componente (ii) sea una sal de calcio.

El activador extrínseco de coagulación puede ser un activador de la vía de activación de protrombina extrínseca (vía extrínseca), en particular un factor tisular (TF, también denominado factor tisular plaquetario, factor III, tromboplastina o CD142). Preferiblemente, el TF se selecciona de TF lipidado o TF recombinante (rTF).

El activador intrínseco de coagulación puede ser cualquier factor de activación de la vía de activación por contacto (vía intrínseca), p. ej., celita, ácido elágico, sulfatita, caolín, sílice o ARN. Preferiblemente, el activador intrínseco de coagulación se selecciona de celita, ácido elágico, sulfatita, caolín, sílice, ARN y sus mezclas.

La punta de pipeta según la presente invención, como se describe en el presente documento, puede contener una sal de calcio como componente (ii). La sal de calcio se agrega para recalcificar la muestra. Se puede evitar que las muestras de sangre se coagulen mediante varias sustancias anticoagulantes diferentes, tales como heparina, EDTA, citrato. Normalmente, se realizan pruebas funcionales con sangre anticoagulada con citrato. El citrato compleja moderadamente el calcio de la muestra de sangre. El calcio es necesario para el proceso de coagulación que está implicado en la formación del complejo y es un cofactor para la mayoría de los factores de coagulación (p. ej., FI, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII, TF). Por lo tanto, la recalcificación de la muestra es necesaria para asegurar una coagulación correcta en la muestra, si la muestra fue citrada, por ejemplo, durante la extracción de sangre (utilizando un tubo de sangre que contenía citrato). Preferiblemente, la sal de calcio es cloruro de calcio y/o lactato de calcio y/o gluconato de calcio. Más preferiblemente, la sal de calcio es CaCh.

Preferiblemente, la sal de calcio, en particular CaCh, está presente en una cantidad de aproximadamente 1-100 pmol/ml de la muestra (líquido de prueba), más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 3-30 pmol/ml de la muestra (líquido de prueba). Como se menciona anteriormente, la cantidad de sal de calcio, en particular CaCh, debe ser suficiente para asegurar la recalcificación de la muestra, en particular de la muestra de sangre, si la muestra se descalcificó antes. Resultó que una cantidad de 3-30 pmol/ml es particularmente óptima para lograr este requisito. Para determinar la cantidad requerida de la sal de calcio, en particular CaCh, que tenía que contener la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), incluso de manera más precisa, debe conocerse el volumen exacto de la muestra que ha de ser recogida del paciente, así como la cantidad de reactivo descalcificante empleado.

La composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), puede comprender opcionalmente otros componentes. Preferiblemente, la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en: un activador adicional de coagulación (es decir, un activador de coagulación como se describe en este documento, que es diferente del activador de coagulación comprendido como componente (i), también denominado “factor activador de coagulación”; un inhibidor de coagulación (es decir, una sustancia que detiene, reduce o al menos modifica la función de algunos componentes de la cascada de coagulación y/o lisis de coágulo); y un inhibidor de componente activo (es decir, una sustancia que detiene, reduce o al menos modifica la función de un componente activo en la coagulación, por ejemplo, un inhibidor de coagulación). Preferiblemente, el factor de activación de coagulación se selecciona del grupo que consiste en FI, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII y TF. Preferiblemente, el inhibidor de coagulación se selecciona del grupo que consta de inhibidor de vía de factor tisular, antitrombina I-IV o proteína C activada.

Preferiblemente, el inhibidor de componente activo se selecciona del grupo que consta de uno o más inhibidores plaquetarios (es decir, sustancias que detienen, reducen o al menos modifican la función de los trombocitos), uno o más inhibidores de fibrinólisis (es decir, sustancias que detienen, reducen o al menos modifican la función de lisis de coágulo) y/o uno o más inhibidores de heparina. Preferiblemente, el inhibidor de plaquetas es un inhibidor de citoesqueleto, preferiblemente citocalasina D, o un antagonista de GPIIb/IIIa, preferiblemente Abciximab. Preferiblemente, el inhibidor de fibrinólisis se selecciona del grupo que consta de aprotinina, ácido tranexámico, eaca, inhibidor de fibrinólisis activado por trombina, inhibidor de activación de plasminógeno 1/2, a2-antiplasmina y a2-macroglobulina. Preferiblemente, el inhibidor de heparina se selecciona de entre heparinasa, protamina o péptidos relacionados con protamina y sus derivados, u otros polímeros catiónicos, por ejemplo, bromuro de hexadimetrina (polibreno). El inhibidor de heparina es útil en particular para detectar la presencia de heparina en la muestra y, por tanto, la cantidad de inhibidor de heparina (p. ej., heparinasa) es suficiente para detectar la presencia de heparina en la muestra.

Esos inhibidores pueden usarse y combinarse dependiendo de las demandas de diagnóstico precisas, por ejemplo, el inhibidor de plaquetas puede ser un inhibidor de citoesqueleto o un antagonista de GPIIb/IIIa. El inhibidor de fibrinólisis puede seleccionarse, por ejemplo, de entre aprotinina, ácido tranexámico o eaca; el inhibidor de heparina podría seleccionarse, por ejemplo, de entre heparinasa, protamina o péptidos relacionados con protamina; y el factor de coagulación puede seleccionarse, por ejemplo, de entre uno o más factores de coagulación o factores de coagulación activada, preferiblemente FXa o FVa o proteína C o FVIIa activada. Sin embargo, se observa que esta es solo una selección preferida y se pueden usar más inhibidores si es necesario.

Preferiblemente, la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), también pueden contener uno o más estabilizadores, en donde el estabilizador es preferiblemente albúmina o gelatina. Tales estabilizadores se utilizan típicamente para la estabilización de los reactivos entre el momento de la producción y el análisis. Preferiblemente, en la punta de pipeta según la presente invención, un estabilizador de proteínas, por ejemplo, albúmina o gelatina, está contenido en el constituyente (A) pero no está contenido en el constituyente (B); o un estabilizador de proteínas, por ejemplo, albúmina o gelatina, está contenido en el constituyente (B) pero no está contenido en el constituyente (A).

Alternativamente, también se prefiere que la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), no contenga albúmina, más preferiblemente la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), no contiene albúmina o gelatina, e incluso más preferiblemente la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), no contiene ningún estabilizador. Más preferiblemente, la punta de pipeta, y en particular los constituyentes (A) y (B), no contienen estabilizadores de proteínas como albúmina. Tales estabilizadores pueden interferir en las mediciones viscoelásticas.

Preferiblemente, la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), también puede contener uno o más fosfolípidos. Pueden añadirse fosfolípidos ya que varios complejos en la cascada de coagulación son dependientes de fosfolípidos. Preferiblemente, los fosfolípidos pueden ser una composición de diferentes fosfolípidos tales como, por ejemplo, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina y fosfatidiletanolcolina. Preferiblemente, pueden usarse mezclas de diferentes fosfolípidos extraídos de muestras biológicas (por ejemplo, cerebro de conejo).

Preferiblemente, el fosfolípido y/o el inhibidor de heparina, preferiblemente heparinasa y/o bromuro de hexadimetrina (polibreno), más preferiblemente bromuro de hexadimetrina (polibreno), están contenidos en el constituyente (A) y dispuestos en el compartimento (a).

Dependiendo del objetivo del diagnóstico, los componentes descritos anteriormente pueden usarse solos o en combinación: por ejemplo, una medición con un solo activador intrínseco en la muestra se puede combinar con una medición con un activador intrínseco y una cantidad suficiente de inhibidor de heparina (p. ej., heparinasa) en la muestra para detectar la presencia de heparina en el líquido de prueba; se puede aplicar una combinación de activador extrínseco e inhibidor de plaquetas (por ejemplo, citocalasina D) en la muestra para determinar la actividad del fibrinógeno sin contribución de plaquetas en la muestra.

Preferiblemente, la composición de diagnóstico, es decir, los constituyentes (A) y/o (B), comprende o consiste en combinaciones de componentes seleccionados de las siguientes combinaciones de componentes:

- activación extrínseca: combinación de activador extrínseco y CaCh y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca: combinación de activador intrínseco y CaCh y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca insensible a la heparina: combinación de activador extrínseco, inhibidor de heparina, CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca insensible a la heparina: combinación de activador intrínseco, inhibidor de heparina, CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca sin activación plaquetaria: combinación de activador extrínseco, inhibidor plaquetario y CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca sin activación plaquetaria, insensible a la heparina: combinación de activador extrínseco, inhibidor plaquetario, inhibidor de heparina, CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca sin activación plaquetaria, insensible a la heparina: combinación de activador extrínseco, inhibidor plaquetario, inhibidor de heparina, CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca sin activación plaquetaria: combinación de activador intrínseco, inhibidor plaquetario, CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca sin activación plaquetaria, insensible a la heparina: combinación de activador intrínseco, inhibidor plaquetario, inhibidor de heparina, CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca con inhibición de fibrinólisis: combinación de activador extrínseco, inhibidor de fibrinólisis y CaCh y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca con inhibición de fibrinólisis, insensible a la heparina: combinación de activador extrínseco, inhibidor de fibrinólisis, inhibidor de heparina, CaCh y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca con inhibición de fibrinólisis: combinación de activador intrínseco, inhibidor de fibrinólisis y CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca con inhibición de fibrinólisis, insensible a la heparina: combinación de activador intrínseco, inhibidor de fibrinólisis, inhibidor de heparina, CaCh y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca con factor de coagulación adicional: combinación de activador extrínseco, un factor de coagulación adicional y CaCl² y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación extrínseca con factor de coagulación adicional, insensible a la heparina: combinación de activador extrínseco, un factor de coagulación adicional, inhibidor de heparina, CaChy, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca con factor de coagulación adicional: combinación de activador intrínseco, un factor de coagulación adicional y CaChy, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores;

- activación intrínseca con factor de coagulación adicional, insensible a la heparina: combinación de activador intrínseco, un factor de coagulación adicional, inhibidor de heparina, CaCh y, opcionalmente, estabilizador o estabilizadores.

En una primera realización preferida, el constituyente (A) comprende al menos un activador extrínseco de coagulación, que se selecciona preferiblemente de entre factor tisular (TF), TF lipidado o TF recombinante o cualquiera de sus mezclas en formulación seca, sustancialmente seca o líquida o en cualquier otra formulación que permita la disolución del TF dentro de los 30 s posteriores a la aspiración del líquido de muestra. En la misma realización preferida, el constituyente (B) comprende una sal de calcio. Preferiblemente, los constituyentes (A) y (B) no comprenden un inhibidor de plaquetas y/o un inhibidor de fibrinólisis. Esta realización a continuación se denomina “punta EX” y podría usarse para realizar una medición viscoelástica de la vía de coagulación activada extrínsecamente.

En una segunda realización preferida, el constituyente (A) y el constituyente (B) comprenden los componentes descritos para la primera realización preferida. Además, el constituyente (A) o el constituyente (B), tal como se describe para la primera realización preferida, contiene además uno o más inhibidores de plaquetas, preferiblemente seleccionados de antagonistas de GPIIb/IIIa, preferiblemente Abciximab, y/o inhibidores de citoesqueleto, preferiblemente citocalasina D, en formulación seca, sustancialmente seca o líquida, o en cualquier otra formulación que permita la disolución de la composición de reactivos dentro de los 30 s posteriores a la aspiración del líquido de muestra. Esta realización se denomina “punta FIB” a continuación.

En una tercera realización preferida, el constituyente (A) y el constituyente (B) comprenden los componentes descritos para la primera realización preferida. Además, el constituyente (A) o el constituyente (B) de la primera realización preferida contiene adicionalmente uno o más inhibidores de fibrinólisis, preferiblemente aprotinina, ácido tranexámico o eaca, en formulación seca, sustancialmente seca o líquida, o en cualquier otra formulación que permita la disolución de la composición de reactivos dentro de los 30 s posteriores a la aspiración del líquido de muestra. Esta realización se denomina “punta AP” a continuación.

También se prefiere que el constituyente (A) o (B) de acuerdo con las tres realizaciones preferidas descritas anteriormente 'punta EX, 'punta FIB y 'punta AP' contenga además uno o más inhibidores de heparina, preferiblemente protamina o derivados de protamina, por lo que los derivados de protamina preferidos incluyen sulfato de protamina e hidrocloruro de protamina u otros péptidos similares a protamina y sus derivados, u otros polímeros catiónicos, preferiblemente bromuro de hexadimetrina (polibreno), que tengan la posibilidad de neutralizar el efecto o efectos anticoagulantes de heparina o sustancias similares a la heparina en una muestra de sangre por interacción de carga. La composición de reactivos resultante es preferiblemente una formulación seca, sustancialmente seca o líquida, o cualquier otra formulación que permita la disolución de la composición de reactivos dentro de los 30 s posteriores a la aspiración de la muestra líquida. Las puntas correspondientes se denominan 'punta EX HI', 'punta FIB HI' y 'punta AP HI' a continuación.

En una cuarta realización preferida, el constituyente (B) comprende al menos un activador intrínseco de coagulación, que se selecciona preferiblemente de celita, ácido elágico, sulfatita, caolín, sílice, ARN o cualquiera de sus mezclas en formulación seca, sustancialmente seca o líquida, o en cualquier otra formulación que permita la disolución del activador dentro de los 30 s posteriores a la aspiración del líquido de muestra. En esta realización, el constituyente (A) comprende una sal de calcio y la realización se denomina “punta IN” a partir de ahora.

En una quinta realización preferida, el constituyente (A) y el constituyente (B) comprenden los componentes descritos para la cuarta realización preferida. Además, el constituyente (A) o (B) de la realización 'punta IN' comprende además uno o más inhibidores de heparina, preferiblemente heparinasa, protamina o péptidos relacionados con protamina, en formulación seca, sustancialmente seca o líquida, o en cualquier otra formulación que permita la disolución del activador dentro de los 30 s posteriores a la aspiración del líquido de muestra. Esta realización se denomina “punta HEP” a continuación.

También se prefiere que la sal de calcio se seleccione en todas las realizaciones mencionadas anteriormente de CaCh, lactato de calcio, gluconato de calcio o cualquiera de sus mezclas en una formulación seca, sustancialmente seca o líquida, o en cualquier otra formulación que permita la disolución del activador dentro de los 30 s posteriores a la aspiración del líquido de muestra.

Si la composición de diagnóstico comprende más de dos componentes para separarlos en los compartimentos (a) y (b), los componentes adicionales también pueden colocarse en compartimentos adicionales (c), (d) dentro de la punta. De ese modo, la punta de pipeta puede contener uno o más compartimentos, por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5 compartimentos. Preferiblemente, los más de dos componentes se combinan, p. ej. mezclados con los constituyentes (A) y/o (B) y, por tanto, los compartimentos (a) y (b) son suficientes. Sin embargo, también se prefiere que los componentes adicionales, que no estén contenidos en los constituyentes (A) y/o (B), se puedan colocar en compartimentos adicionales distintos de los compartimentos (a) y (b).

Si se mezclan componentes adicionales de la composición de diagnóstico con el constituyente (A) o (B), deben estar en la misma condición física (es decir, líquidos, secos, sustancialmente secos). Si se colocan en un compartimento adicional, pueden tener otra condición física. Por ejemplo, un componente de un primer compartimento es una formulación seca, mientras que otro componente de un segundo compartimento es una formulación líquida y un tercer componente es una formulación sustancialmente seca. En otro ejemplo, dos componentes se mezclan como líquidos y un componente se puede secar en un compartimento separado o, en otro ejemplo, dos componentes son una mezcla seca y un componente puede ser un líquido desecado en un compartimento separado.

En las figuras 3a-3g, se muestran realizaciones preferidas de una punta de pipeta que contiene los constituyentes (A) y (B) en los compartimentos (a) y (b), respectivamente. Una primera realización preferida, mostrada en la figura 3a), es una punta de pipeta (11a) que tiene forma de punta convencional (simplemente cónica) con un extremo inferior abierto (12a) y un extremo superior abierto (13a), que se adaptan a las dimensiones de la pipeta. El compartimento (b) que contiene el constituyente (B) está representado por un inserto poroso (14a). El compartimento (a) que contiene el constituyente (A) está representado por la sección transversal inferior de la punta (por debajo del inserto poroso (14a) que tiene un área de superficie interna de punta de 1-1000 mm2, sobre la que se deposita una capa circunferencial de reactivo (15a) de constituyente (A).

Otra realización preferida, mostrada en la figura 3b), es una punta de pipeta (11b) que tiene forma de punta modificada con un extremo inferior abierto (12b) y un extremo superior abierto (13b) que se adaptan a las dimensiones de la pipeta. El compartimento (b) que contiene el constituyente (B) está representado por un inserto poroso (14b), en el que el inserto poroso (14b) tiene forma cilíndrica. El compartimento (a) que contiene el constituyente (A) está representado por la sección transversal inferior de la punta (por debajo del inserto poroso (14a) que tiene un área de superficie interna de punta de 1-1000 mm2, sobre la que se deposita una capa de reactivo en forma de puntos (no circunferencial) (15a) de constituyente (A).

Otra realización preferida, mostrada en la figura 3c), es una punta de pipeta (11c) que tiene forma de punta modificada con un extremo inferior abierto (12c) y un extremo superior abierto (13c) que se adaptan a las dimensiones de la pipeta. La punta de pipeta (11c) tiene dos insertos porosos (14c y 14c') que forman el compartimento (a) que comprende el constituyente (A) (14c) y el compartimento (b) que comprende el constituyente (B) (14c'), estando los dos insertos porosos colocados adyacentes entre sí, en donde cada uno de los insertos porosos (14c, 14c') tiene forma cilíndrica, preferiblemente con el mismo diámetro.

Otra realización preferida, mostrada en la figura 3d), es una punta de pipeta (11d), que tiene forma de punta convencional (simplemente cónica) con el extremo inferior abierto (12d) y el extremo superior abierto (13d) que se adaptan a las dimensiones de la pipeta. El compartimento (b) que contiene el constituyente (B) está representado por un inserto poroso (14d). El compartimento (a) que contiene el constituyente (A) está representado por la sección transversal de la punta justo por encima del inserto poroso (14d) que tiene un área de superficie interna de punta de 1-1000 mm2, sobre la que se deposita una capa de reactivo circunferencial (15d) de constituyente (A).

Otra realización preferida, mostrada en la figura 3e), es una punta de pipeta (11e), que tiene forma de punta convencional (simplemente cónica) con el extremo inferior abierto (12e) y el extremo superior abierto (13e) adaptados a las dimensiones de la pipeta. El compartimento (a) que contiene el constituyente (A) está representado por la sección transversal inferior de la punta que tiene un área de superficie interna de punta de 1 a 1000 mm2, sobre la que se deposita una capa de reactivo circunferencial (15e) de constituyente (A). El compartimento (b) que contiene el constituyente (B) está representado por la sección transversal de la punta justo por encima del compartimento (a) que tiene un área de superficie interna de punta de 1-1000 mm2, sobre la que se deposita una capa de reactivo circunferencial (15e') de constituyente (B).

Otra realización preferida, mostrada en la figura 3f), es una punta de pipeta (11f), que tiene forma de punta convencional (simplemente cónica) con el extremo inferior abierto (12f) y el extremo superior abierto (13f) adaptados a las dimensiones de la pipeta. El compartimiento (a) que contiene el constituyente (A) está representado por la sección longitudinal derecha de la punta, sobre la que se deposita una capa de reactivo en forma de puntos (no circunferencial) (15f) de constituyente (A). El compartimento (b) que contiene el constituyente (B) está representado por la sección longitudinal izquierda de la punta, sobre la que se deposita una capa de reactivo en forma de puntos (no circunferencial) (15f) de constituyente (B).

En otras realizaciones preferidas, puede haber presente un compartimento adicional (c), que puede estar representado por un inserto poroso adicional o por una sección de punta adicional que contiene una capa de reactivo. Tal compartimento (c) puede estar situado en la punta de pipeta (i) por encima de ambos compartimentos (a) y (b); (ii) por debajo de ambos compartimentos (a) y (b); o (iii) entre el compartimento (a) y el compartimento (b).

En conjunto, una de las diferentes ventajas de la punta de pipeta según la presente invención es que el constituyente (A) contenido en el compartimento (a) y el constituyente (B) contenido en el compartimento (b) se pueden optimizar con respecto a la estabilidad a largo plazo de la composición de diagnóstico. Por ejemplo, si el TF tiene menos estabilidad cuando se mezcla con bromuro de hexadimetrina (polibreno), el TF puede colocarse en un compartimento y el bromuro de hexadimetrina (polibreno) puede colocarse en cambio (opcionalmente junto con la sal de calcio) en un compartimento separado. Por ejemplo, si el TF también tiene menos estabilidad cuando se mezcla con citocalasina D, la citocalasina D también se puede colocar en el compartimento en el que se coloca el polibreno. Pero, por ejemplo, si la citocalasina D tiene menos estabilidad cuando se mezcla con bromuro de hexadimetrina (polibreno) en fase líquida, se puede colocar finalmente junto con el TF en un compartimento.

Por tanto, la punta de pipeta según la presente invención proporciona una variedad considerable de opciones para aumentar la estabilidad del reactivo al nivel requerido. Esto se logra sin la necesidad de una nueva tecnología de automatización para el llenado o manipulación de reactivos y sin agregar nuevas sustancias a la composición de reactivos.

Además, es preferible que el constituyente (A) y/o el constituyente (B) descritos en este documento comprendan además un factor de coagulación, seleccionado preferiblemente de F¡, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI y fX|II o un inhibidor de coagulación, preferiblemente seleccionado de entre TFPI, ATIII y APC.

Método y uso

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para realizar una prueba de diagnóstico en una muestra, preferiblemente un fluido corporal o una muestra de sangre, que comprende las siguientes etapas:

(1) proporcionar una punta de pipeta según la presente invención, como se describe anteriormente;

(2) aspirar la muestra en la punta de pipeta, mezclando así, preferiblemente disolviendo, el constituyente (A), p. ej., contenido en el compartimento (a), y el constituyente (B), p. ej., contenido en el compartimento (b), de dicha punta de pipeta en la muestra y obtener una mezcla, preferiblemente una solución, de muestra y constituyentes (A) y (B), en donde dicha mezcla de constituyentes (A) y (B) forma una composición de diagnóstico que se requiere para realizar una prueba de diagnóstico;

(3) opcionalmente, transferir la mezcla de dichas muestra y composición de diagnóstico a un recipiente de medición, tal como una cubeta, adecuado para realizar dicha prueba de diagnóstico;

(4) opcionalmente, colocar el recipiente de medición, tal como la cubeta, en un aparato adecuado para realizar dicha prueba de diagnóstico; y

(5) realizar la prueba de diagnóstico de dicha mezcla, opcionalmente en el recipiente de medición, tal como una cubeta.

La muestra es preferiblemente una muestra de sangre o una muestra que comprende una fracción de sangre (p. ej., plasma aislado o plaquetas), más preferiblemente de mamífero, en particular sangre o componentes sanguíneos o una fracción de sangre humana. Por ejemplo, la muestra es sangre completa o plasma sanguíneo, en particular sangre humana completa o plasma sanguíneo humano. La muestra puede contener componentes adicionales añadidos ex vivo a la muestra, por ejemplo ácidos, bases o tampones para la modificación, corrección o estabilización de los niveles de pH; y/o sales para modificar, corregir o estabilizar los niveles de iones; y/o diluyentes para ajustar la concentración de los componentes de la muestra a un nivel requerido tales como agua, soluciones de proteínas, soluciones coloidales y/o modificadores de las propiedades físicas de la muestra (p. ej., aceites o disolventes orgánicos para aumentar o disminuir la viscosidad de la muestra; o tensioactivos para aumentar/disminuir la formación de espuma).

La prueba de diagnóstico realizada en el método de acuerdo con la presente invención preferiblemente evalúa el estado de coagulación de la muestra y es, por tanto, una “prueba de coagulación”. Las pruebas de coagulación (también denominadas “pruebas de coagulación de la sangre”) son las pruebas que se utilizan para el diagnóstico del sistema de hemostasis. Preferiblemente, la prueba de coagulación es una prueba de coagulación global o una prueba de coagulación localizada. Las pruebas globales clasifican los resultados del trabajo de toda la cascada de coagulación. Sirven para diagnosticar el estado general del sistema de coagulación sanguínea y la intensidad de las patologías, y para registrar simultáneamente todas las influencias asociadas. Los métodos globales desempeñan un papel clave en la primera etapa del diagnóstico: brindan una imagen integral de las alteraciones dentro del sistema de coagulación y en general permiten predecir una tendencia a la hiper o hipocoagulación. Las pruebas localizadas clasifican los resultados del trabajo de los componentes separados de la cascada del sistema de coagulación sanguínea, así como de los factores de coagulación separados. Son esenciales para poder especificar la localización de la patología a la hora de precisar el factor de coagulación. Ejemplos preferidos de pruebas de coagulación globales incluyen tromboelastografía, prueba de generación de trombina (potencial de trombina, potencial de trombina endógena) y prueba de trombodinámica. Ejemplos preferidos de pruebas de coagulación localizadas incluyen tiempo de tromboplastina parcial (PTT o APTT: tiempo de tromboplastina parcial activada), prueba de tiempo de protrombina (o prueba de protrombina, INR, PT) y otros métodos altamente especializados para revelar la alteración en la concentración de factores separados.

Preferiblemente, la prueba de coagulación mide:

(i) el tiempo de demora entre la activación de la coagulación y la coagulación inicial (por ejemplo, tiempo de protrombina (PT), índice normalizado internacional (INR), tiempo de tromboplastina parcial (pTt ), tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT)); y/o

(ii) la actividad de agregación plaquetaria (p. ej., por agregometría óptica o agregometría de impedancia); y/o (iii) la fuerza del coágulo (p. ej., mediante métodos viscoelásticos tales como tromboelastografía o tromboelastometría); y/o

(iv) la actividad de lisis de coágulo (p. ej., mediante detección del nivel de dímero D o disminución de la fuerza del coágulo en métodos viscoelásticos).

En una prueba de coagulación, la muestra es preferiblemente una muestra de sangre o una fracción de una muestra de sangre como se describe anteriormente.

De un modo sumamente preferible, la prueba de diagnóstico es un análisis viscoelástico.

En consecuencia, se prefiere que la prueba de diagnóstico en la etapa (5) comprenda determinar el tiempo de coagulación, el tiempo de formación de coágulos, la firmeza del coágulo con el paso del tiempo, la actividad de fibrinólisis (obtenida como porcentaje de la reducción de firmeza en relación con la firmeza máxima de coágulo), y/o cualquiera de sus combinaciones.

El aparato adecuado para realizar una prueba de diagnóstico, tal como un análisis viscoelástico, es preferiblemente un dispositivo como se describe en el documento US 5.777.215 A o en el documento US 6.537.819 B2. Otro ejemplo preferido de un aparato adecuado para realizar un análisis viscoelástico se muestra esquemáticamente en la figura 2. De forma más general, se prefiere que el aparato adecuado para realizar una prueba de diagnóstico sea un coagulómetro. Un coagulómetro es un analizador médico de laboratorio que se utiliza para probar el sistema de hemostasis, en particular en las pruebas de coagulación. Los coagulómetros modernos realizan diferentes métodos de activación y observación del desarrollo de coágulos de sangre en la sangre o en el plasma sanguíneo.

En términos más generales, tal como se usa en este documento, un análisis viscoelástico (también denominado medición viscoelástica) se refiere a un análisis (viscoelástico) de una muestra, en particular una muestra de sangre o una muestra de elementos sanguíneos, p. ej., plasma o células, con el fin de determinar sus características de coagulación, en donde tal análisis viscoelástico en el sentido más amplio es la medición de un movimiento relativo de un recipiente de medición, tal como una cubeta, que contiene una muestra de sangre en relación con un alfiler. En particular, en un análisis viscoelástico típico se forma un coágulo entre el recipiente de medición y el alfiler y, a continuación, el mismo coágulo se estira por el movimiento del alfiler con respecto al recipiente. La detección de los parámetros característicos del coágulo se basa en el acoplamiento mecánico del recipiente y el alfiler mediante el coágulo. En particular, una medición viscoelástica proporciona información sobre varios parámetros diferentes, por ejemplo, el tiempo entre la activación de la coagulación y el inicio del coágulo (tiempo de coagulación CT), la dinámica de la formación de coágulos (tiempo de formación de coágulos CFT), la firmeza del coágulo (amplitudes A5-A30 y máxima firmeza del coágulo MCF) y/o el grado de fibrinólisis (lisis máxima ML). Por tanto, el análisis viscoelástico comprende preferiblemente la determinación del tiempo de coagulación, el tiempo de formación de coágulos y/o la firmeza del coágulo a lo largo del tiempo, incluidos los efectos fibrinolíticos. En la figura 1 se muestra un diagrama ejemplar que muestra un análisis viscoelástico típico (también denominado medición viscoelástica) y el significado de los parámetros mencionados anteriormente. El tiempo de coagulación CT es el tiempo de demora inicial hasta que comienza a incrementarse la firmeza. Los valores de amplitud A5-A30 son los valores de firmeza 5-30 minutos después de CT. La lisis máxima es el porcentaje de disminución de la firmeza después de que se alcanza el valor máximo (MCF).

La colocación del recipiente de medición en un aparato adecuado para realizar la prueba de diagnóstico (etapa (4)) es opcional, ya que también puede ocurrir en cualquier momento anterior. Por ejemplo, todo el pipeteo también se puede realizar mientras el recipiente de medición está en el aparato, si el aparato proporciona suficiente acceso al extremo superior abierto del recipiente de medición mientras está en la posición de medición.

Preferiblemente, el método para realizar una prueba de diagnóstico, tal como un análisis viscoelástico, en una muestra según la presente invención comprende además una etapa (2-a) que sigue a la etapa (2) y precede a la etapa (3), en la que la punta se mantiene en la pipeta durante 1-30 s, preferiblemente de 1-5 s. Por lo tanto, se permite una mejor o incluso completa disolución del reactivo. Por consiguiente, en la etapa (2-a) una breve demora de tiempo de, por ejemplo, 1-30 s permite la disolución completa de los constituyentes (A) y (B) de la composición de diagnóstico dentro de la muestra. Además, la muestra dentro de la punta podría moverse suavemente hacia arriba y hacia abajo dentro de la punta de pipeta durante la etapa (2-a) usando la función de aspiración/dispensación de la pipeta, que se realiza preferiblemente en una secuencia automatizada que no requiere que actúe ningún usuario.

Preferiblemente, cada una de las etapas (2) y (3) del método de la presente invención dura menos de 30 segundos, más preferiblemente cada una de las etapas (2) y (3) dura de 2 a 10 s. Posteriormente, la mezcla de la muestra y la composición de diagnóstico (opcionalmente en el recipiente de medición) se transfiere de preferencia rápidamente al aparato de medición, más preferiblemente en menos de 30 s.

En el método de acuerdo con la presente invención, también se prefiere que el método comprenda además una etapa (3-a) después de la etapa (3) y antes de la etapa (4), en donde en la etapa (3-a) la mezcla es al menos parcialmente reaspirada en la punta de pipeta y posteriormente liberada de nuevo en el recipiente de medición. Esta etapa puede repetirse una o más veces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces. De ese modo se consigue una mejor mezcla de la muestra y se permite una mejor disolución de los constituyentes (A) y (B).

No es necesario cambiar la punta de pipeta al preparar una prueba. Esto muestra el beneficio directo de la presente invención con respecto a la facilidad de uso para la persona que realiza tales pruebas.

En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona el uso de una punta de pipeta, como se describe anteriormente, en una prueba de coagulación, como se describe anteriormente. Preferiblemente, la punta de pipeta descrita anteriormente se usa en análisis viscoelásticos, como se describe anteriormente.

Breve descripción de las figuras

A continuación, se describen brevemente las figuras adjuntas. Las figuras están destinadas a ilustrar la presente invención con más detalle.

La figura 1 es un diagrama ejemplar que muestra una medición viscoelástica típica y parámetros de curva correspondientes: el tiempo de coagulación CT es el tiempo de demora entre la activación de la muestra y el tiempo en el que se alcanza un valor de firmeza de 2 mm; el tiempo de formación de coágulos CFT es el tiempo que pasa entre los valores de firmeza de 2 mm y 20 mm; alfa es el ángulo que se forma entre la tangencial de la curva de firmeza y el eje x; máxima firmeza de coágulo MCF es el valor máximo de firmeza de la curva; lisis máxima es el porcentaje de disminución de la firmeza después de que se ha alcanzado la MCF.

La figura 2 muestra una ilustración de un aparato para pruebas viscoelásticas: después de la formación del coágulo entre la copa 1 (cubeta) y el alfiler 2, el mismo coágulo se estira por el movimiento del alfiler 2 con respecto a la copa 1. La detección de los parámetros característicos del coágulo se basa en el acoplamiento mecánico de la copa 1 y el alfiler 2 mediante el coágulo. Esto solo es posible si el coágulo se adhiere a las superficies de la copa 1 y el alfiler 2. Por lo tanto, normalmente se requiere una adhesión firme a las superficies tanto de la copa 1 como del alfiler 2 para el análisis viscoelástico. Durante una medición viscoelástica, el alfiler se fija al eje 4 y se gira suave y lentamente en la copa a través del resorte 7. El propio eje 4 se fija a la placa de base 5 con el rodamiento de bolas 6. El movimiento del alfiler se mide ópticamente iluminando el espejo 9 (fijado al eje 4) con la fuente de luz 8 y detectando la señal reflejada en el fotodetector de resolución espacial 10.

La figura 3 muestra vistas esquemáticas en sección transversal de seis realizaciones preferidas de una punta de pipeteo (11) que contiene los constituyentes (A) y (B):

a) sección transversal longitudinal a través de una punta de pipeta convencional (11a) con extremo inferior abierto (12a), extremo superior abierto (13a) adaptados a las dimensiones de la pipeta, inserto poroso (14a) y capa de reactivo (15a) por debajo del inserto poroso (14a);

b) sección transversal longitudinal a través de una punta de pipeta modificada (11b) con extremo inferior abierto (12b), extremo superior abierto (13b) adaptados a las dimensiones de la pipeta, inserto poroso (14b) y capa de reactivo (15b) por debajo del inserto poroso (14b);

c) sección transversal longitudinal a través de una forma de punta de pipeta modificada (11c) con extremo inferior abierto (12c), extremo superior abierto (13c) adaptados a las dimensiones de la pipeta, y dos insertos porosos (14c, 14c');

d) sección transversal longitudinal a través de una punta de pipeta convencional (11d) con extremo inferior abierto (12d), extremo superior abierto (13d) adaptados a las dimensiones de la pipeta, inserto poroso (14d) y capa de reactivo (15d) por encima del inserto poroso (14d);

e) sección transversal longitudinal a través de una punta de pipeta convencional (11e) con extremo inferior abierto (12e), extremo superior abierto (13e) adaptados a las dimensiones de la pipeta, y dos capas de reactivo circunferenciales (15e, 15e') situadas una encima de otra; y

f) sección transversal longitudinal a través de una punta de pipeta convencional (11f) con extremo inferior abierto (12f), extremo superior abierto (13f) adaptados a las dimensiones de la pipeta, y dos capas de reactivo en forma de puntos (15f, 15f) situadas en yuxtaposición.

Lista de símbolos de referencia

1, 1a, 1b, 1c copa de medición

2, 2a, 2b, 2c alfiler

3 muestra

4 eje

5 placa de base

6 rodamiento de bolas

7 resorte

8 fuente de luz

9 espejo

10 detector

11, 11a, '11b, 11c, 111d, 11e, 11f punta de pipeta

12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 12f extremo inferior abierto de la punta de pipeta

13a, 13b, 13c, 13d, 13e, 13f extremo superior abierto de la punta de pipeta

14a, 14b, 14c, 14c', 14d inserto poroso

15a, 15b, 15d , 15e, 15e' , 15f, 15f' capa de reactivo

Ejemplos

A continuación, se presentan ejemplos particulares que ilustran varias realizaciones y aspectos de la invención. Las siguientes preparaciones y ejemplos se dan para permitir a los expertos en la técnica comprender con más claridad y poner en práctica la presente invención.

Ejemplo 1. Efecto de TF/fosfolípidos depositados en el compartimento (a) o en el compartimento (b) de la punta de pipeta en el tiempo de coagulación

Para investigar el efecto del activador extrínseco de coagulación en el tiempo de coagulación cuando se depositan TF y fosfolípidos en forma seca en el compartimento (a) o en el compartimento (b), se realizaron mediciones viscoelásticas de muestras de plasma humano (10 donantes mezclados) con un dispositivo ROTEG® 05 (Pentapharm GmbH, Munich, Alemania). En la punta de pipeta utilizada aquí, el compartimento (b) estaba formado por un inserto poroso cilíndrico hecho de espuma de poliéter (RG 130 gris, Hildebrandt y Richter & Co. GmbH, Alemania), el inserto poroso tenía una forma cilíndrica con 5 mm de altura y 4 mm de diámetro. El inserto poroso se colocó en la mitad inferior de la punta de pipeta. El compartimento (a) de la punta de pipeta se proporcionó mediante una sección transversal de la punta de pipeta, en donde se depositó una capa de reactivo en forma de mancha de aproximadamente 1,5 mm de diámetro (correspondiente a aproximadamente 4 pl de reactivo líquido antes del secado).

Muestras de plasma congeladas se descongelaron y calentaron a 37 °C justo antes de la medición. La fuente de TF/fosfolípidos fue Innovin® (Siemens AG, Alemania) y la fuente de CaCh fue cloruro de calcio dihidrato (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemania). El pipeteo de TF se realizó con puntas Top-Line® de 1 ml (AHN Biotechnologie GmbH, Alemania) en un pipeteador manual de 1 ml (Brand, Alemania). Se colocó CaCh líquido en la cubeta de medición justo antes de realizar el pipeteo de TF. La composición de TF contenía 15 ul de solución madre estándar Innovin® junto con 4 % de sacarosa y se secó durante 2 días en un desecador lleno con 100 g de tamiz molecular (4 Angstroem) después de colocarlo en el compartimento (a) o en el compartimento (b). Para el experimento de control, se midió la misma muestra utilizando el reactivo líquido estándar proporcionado para el sistema ROTEG 05 (TEM Innovations GmbH, Alemania).

Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1. Tiempos de coagulación (CT) obtenidos tras colocar las mismas cantidades de TF en la punta de pipeta en forma seca o húmeda, ya sea en el compartimento (a) o en compartimento (b). Cada valor se calculó como promedio de 4 mediciones con plasma humano. El almacenamiento mixto de TF y CaCh altera gravemente el tiempo de coagulación CT (corrección imposible), mientras que mezclar TF con 4 % de sacarosa puede compensar la degradación durante el almacenamiento y/o las demoras en la disolución de TF puro.

Ejemplo 2. Efecto de TF/fosfolípidos depositados en la punta de pipeta solos o en combinación con CaCh en el tiempo de coagulación

Para investigar el efecto del activador extrínseco de coagulación TF y fosfolípidos depositados en forma seca en el compartimento (a) de la punta de pipeta, ya sean solos o en combinación con CaCh en el tiempo de coagulación, se realizaron mediciones viscoelásticas de muestras de plasma humano (10 donantes mezclados) con un dispositivo ROTEG® 05 (Pentapharm GmbH, Munich, Alemania) de acuerdo con los procedimientos descritos en el ejemplo 1. El compartimento (a) de la punta de pipeta se proporcionó mediante una sección transversal en el tercio inferior de la punta de pipeta, en donde se depositó una capa de reactivo en forma de mancha de aproximadamente 2 mm de diámetro, correspondiente a aproximadamente 5 j l de reactivo líquido antes del secado.

Los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Tiempos de coagulación (CT) obtenidos después de secar las mismas cantidades de solución de TF en el compartimento (a) de la punta de pipeta y de almacenarlas durante una semana a temperatura ambiente. Para la muestra de TF puro, se agregó la misma cantidad de CaCh que en la muestra mezclada justo antes de la medición (cada valor se calculó como promedio de 4 mediciones con plasma humano). El almacenamiento mixto de TF y CaCh altera el tiempo de coagulación CT seriamente (corrección imposible), mientras aumenta la cantidad de TF en un factor de 4 y la adición del 2 % de sacarosa puede compensar la degradación de la muestra de TF puro durante el almacenamiento y/o las demora en la disolución.

En su conjunto, los resultados de este experimento muestran que TF y CaCh no deben almacenarse mezclados. Por tanto, la separación de TF y CaCh en dos compartimentos separados espacialmente (a) y (b) parece indudablemente necesaria.

Ejemplo 3. Efecto de ácido elágico/fosfolípidos depositados en la punta de pipeta en forma húmeda o seca en el tiempo de coagulación

Para investigar el efecto de un activador intrínseco de coagulación, a saber, ácido elágico y fosfolípidos, proporcionado en forma seca o húmeda en el compartimento (b) de la punta de pipeta (formada por un inserto poroso, como se describe en el ejemplo 1) en el tiempo de coagulación, se realizaron mediciones viscoelásticas utilizando el equipo y los procedimientos descritos en el ejemplo 1 anterior.

Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Tiempos de coagulación (CT) obtenidos mediante soluciones de activador idénticas sin aditivos después del almacenamiento como punta líquida o seca durante 7 días a temperatura ambiente (inserto de punta hecho de poliéter, cada valor se calculó como un promedio de 4 mediciones con plasma humano). El almacenamiento en húmedo de ácido elágico genera valores de CT comparables a los del control, pero la degradación durante el almacenamiento en seco y/o la demora en la disolución pueden compensarse con un 35 % más de contenido de activador y añadiendo 2 % de sacarosa.

Ejemplo 4. Efecto de CaCh depositado en la punta de pipeta en forma húmeda o seca en el compartimento (a) o (b) en el tiempo de coagulación.

Para investigar el efecto de CaCh depositado ya sea en seco o en forma húmeda en el compartimiento (a) o (b) de la punta de pipeta, se realizaron mediciones viscoelásticas usando los procedimientos, equipos y especificaciones de compartimento, como se describe en el ejemplo 1 anterior.

Los resultados se muestran en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4. Tiempos de coagulación (CT) obtenidos después de almacenar CaCh en la punta durante una semana a temperatura ambiente (cada valor se calculó como un promedio de 4 mediciones con plasma humano). No se observan diferencias significativas con el CT de control para los cuatro planteamientos.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Punta de pipeta (11) que comprende un constituyente (A) y un constituyente (B) de manera espacialmente separada, en la que los constituyentes (A) y (B) están adaptados para formar una composición de diagnóstico tras la combinación, comprendiendo la composición de diagnóstico al menos los siguientes componentes (i) e (ii):

i) un activador de coagulación; y

ii) una sal de calcio.

caracterizada por que

1) el constituyente (A) comprende el componente (i) pero no el componente (ii) y el constituyente (B) comprende el componente (ii) pero no el componente (i); o

2) el constituyente (A) comprende el componente (ii) pero no el componente (i) y el constituyente (B) comprende el componente (i) pero no el componente (ii).

2. Punta de pipeta (11) según la reivindicación 1, en la que la punta de pipeta (11) comprende

a) un compartimento (a) que contiene el constituyente (A); y/o

b) un compartimento (b) que contiene el constituyente (B),

en la que el compartimento (a) preferiblemente no contiene el constituyente (B); y/o el compartimento (b) preferiblemente no contiene el constituyente (A).

3. Punta de pipeta (11) según la reivindicación 1 o 2, en la que cada uno de los constituyentes (A) y (B) es, independientemente uno de otro, una formulación sustancialmente seca o una formulación seca.

4. Punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el activador de coagulación es un activador extrínseco y/o un activador intrínseco

en la que el activador extrínseco es preferiblemente un factor tisular (TF), más preferiblemente seleccionado de TF lipidado o rTF; y/o

el activador intrínseco de coagulación se selecciona preferiblemente del grupo que consta de celita, ácido elágico, sulfatit, caolín, sílice, ARN y sus mezclas.

5. Punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el componente (i) es un activador extrínseco de coagulación y el componente (ii) es una sal de calcio; o en la que el componente (i) es un activador intrínseco de coagulación y el componente (ii) es una sal de calcio.

6. Punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la sal de calcio es cloruro de calcio y/o lactato de calcio y/o gluconato de calcio.

7. Punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición de diagnóstico comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consta de un factor de activación de coagulación, un inhibidor de coagulación y un inhibidor de componente activo

en la que

1) el inhibidor de componente activo se selecciona preferiblemente de uno o más inhibidores de plaquetas, inhibidores de fibrinólisis, y/o inhibidores de heparina, en donde

- el inhibidor de plaquetas es preferiblemente un inhibidor de citoesqueleto o un antagonista de GPIIb/IIIa;

- el inhibidor de fibrinólisis se selecciona preferiblemente del grupo que consta de aprotinina, ácido tranexámico, eaca, inhibidor de fibrinólisis activado por trombina, inhibidor de activación de plasminógeno 1/2, a2-antiplasmina y a2-macroglobulina; y/o

- el inhibidor de heparina se selecciona preferiblemente de heparinasa, protamina o péptidos relacionados con protamina y sus derivados, u otros polímeros catiónicos, por ejemplo, bromuro de hexadimetrina (polibreno);

2) el factor de activación de coagulación se selecciona preferiblemente del grupo que consta de FI, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII y TF;

3) el inhibidor de coagulación se selecciona preferiblemente de un inhibidor de la vía del factor tisular, antitrombina I-IV o proteína C activada.

8. Punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que un estabilizador de proteínas, por ejemplo, albúmina o gelatina, está contenido en el constituyente (A) pero no está contenido en el constituyente (B); o en la que un estabilizador de proteínas, por ejemplo, albúmina o gelatina, está contenido en el constituyente (B) pero no está contenido en el constituyente (A).

9. Punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la punta de pipeta (11) comprende al menos un inserto poroso (14), teniendo preferiblemente el inserto poroso (14) un diámetro de poro mínimo de 2 |jm y un diámetro de poro máximo de 2,0 mm y que contiene preferiblemente el constituyente (A) o el constituyente (B).

10. Punta de pipeta (11) según la reivindicación 9, en la que la forma de la punta de pipeta (11) está adaptada para recibir un inserto poroso (14) en su parte inferior, por lo que el inserto poroso (14) tiene preferiblemente forma cilindrica.

11. Punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la punta de pipeta (11) comprende al menos una capa de reactivo (15), estando la capa de reactivo (15) preferiblemente situada en la parte más baja de la punta de pipeta (11) y teniendo un espesor uniforme, en la que la capa de reactivo (15) se forma preferiblemente mediante la pulverización de gotas en la punta de pipeta (11), por lo que cada una de las gotas pulverizadas tiene un diámetro de menos de 100 jm .

12. Punta de pipeta (11) según la reivindicación 11, en la que la punta de pipeta (11) comprende al menos un inserto poroso (14), comprendiendo el inserto poroso (14) el constituyente (A) y comprendiendo la capa de reactivo (15) el constituyente (B) o comprendiendo el inserto poroso (14) el constituyente (B) y comprendiendo la capa de reactivo (15) el constituyente (A)

en la que el inserto poroso (14) está preferiblemente situado por encima de la al menos una capa de reactivo (15) en la punta de pipeta (11).

13. Uso de la punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en una prueba de coagulación, en particular en un análisis viscoelástico de una muestra (3).

14. Método para realizar una prueba de diagnóstico, en particular una prueba de coagulación, preferiblemente un análisis viscoelástico, en una muestra (3), en particular una muestra de sangre o una fracción de una muestra de sangre, que comprende las siguientes etapas:

(1) proporcionar una punta de pipeta (11) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12;

(2) aspirar la muestra (3) en la punta de pipeta (11), mezclando así, preferiblemente disolviendo, el constituyente (A), p. ej., contenido en el compartimento (a), y el constituyente (B), p. ej. contenido en el compartimento (b), de dicha punta de pipeta (11) en la muestra (3) y obtener una mezcla, preferiblemente una solución, de la muestra y los constituyentes (A) y (B), en la que en dicha mezcla los constituyentes (A) y (B) forman una composición de diagnóstico que se requiere para realizar la prueba de diagnóstico de la muestra (3);

(3) opcionalmente, transferir la mezcla de la muestra (3) y la composición de diagnóstico a un recipiente de medición (1) adecuado para realizar dicha prueba de diagnóstico, tal como una cubeta;

(4) opcionalmente, colocar el recipiente de medición (1), tal como la cubeta, en un aparato adecuado para realizar dicha prueba de diagnóstico; y

(5) realizar la prueba de diagnóstico de dicha mezcla, opcionalmente en el recipiente de medición (1), tal como la cubeta.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la muestra (3) es un fluido corporal humano o de mamífero, preferiblemente una muestra de sangre humana o de mamífero o una fracción de una muestra de sangre y/o en el que la muestra (3) comprende sangre completa y/o plasma sanguíneo.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la prueba de diagnóstico en la etapa (5) comprende determinar el tiempo de coagulación, el tiempo de formación de coágulos, la firmeza del coágulo a lo largo del tiempo o la actividad de fibrinólisis como reducción de firmeza en relación con la firmeza máxima de coágulo, o cualquiera de sus combinaciones.