ES2316989T3

ES2316989T3 - Pruebas de coagulacion a temperatura ambiente.

Info

Publication number: ES2316989T3
Application number: ES04736891T
Authority: ES
Inventors: Mats Ranby
Original assignee: Zafena AB
Current assignee: Zafena AB
Priority date: 2003-06-15
Filing date: 2004-06-15
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2024-06-15
Also published as: PL1636595T3; WO2004111656A1; ATE412912T1; US20060281140A1; SE0301785D0; DE602004017460D1; EP1636595A1; CA2546099A1; EP1636595B1

Abstract

Un procedimiento de determinación, en una prueba de coagulación, del tiempo de protrombina (TP) en una muestra de sangre completa, sangre anticoagulada, plasma sanguíneo o plasma sanguíneo anticoagulado que comprende las etapas de a) añadir un volumen definido de la muestra a un volumen definido de un reactivo líquido que comprende tromboplastina y fibrinógeno en una proporción entre los volúmenes definidos del reactivo y la muestra de al menos cuatro, aumentando esta cantidad de fibrinógeno la concentración de fibrinógeno en la mezcla en al menos 0,1 g/l, o viceversa, en un recipiente, b) determinar la temperatura de la mezcla de reacción de a) que tiene una temperatura ambiente en el intervalo de 18ºC a 35ºC. realizándose las etapas a) y b) en un orden opcional, seguido de c) determinar el tiempo de coagulación (TC) registrando el tiempo desde la adición en a) hasta que se detecta la formación de un coágulo en el recipiente, y d) calcular el tiempo de protrombrina (TP) en función de la temperatura de b) y del tiempo de coagulación (TC) de c) expresado como cociente normalizado internacional (INR), usando la ecuación en la que INR = (TC/(TCN(t)) ISI(t) TC = tiempo de coagulación de c) en la reivindicación 1, t = temperatura de b) en la reivindicación 1, TCN(t) = tiempo de coagulación normal (TCN) expresado en función de la temperatura t, e ISI(t) = índice de sensibilidad internacional (ISI), expresado en función de la temperatura t.

Description

Pruebas de coagulación a temperatura ambiente.

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La presente invención se refiere a un procedimiento de determinación del tiempo de protrombina (TP) en una muestra de sangre completa, sangre anticoagulada, plasma sanguíneo o plasma sanguíneo anticoagulado a temperatura ambiente.

Antecedentes de la invención

El tiempo de protrombina (TP) es una prueba analítica diagnóstica de coagulación por medio de la cual se valora la funcionalidad de la vía extrínseca de coagulación. Las pruebas de coagulación se definen como pruebas realizadas en fluidos biológicos, como sangre, sangre anticoagulada, plasma sanguíneo o plasma sanguíneo anticoagulado, en cuyas pruebas el punto final es un fenómeno de coagulación, como por ejemplo, la formación de un gel o un coágulo o la disolución del gel o el coágulo. En una terminología más moderna, el punto final de una prueba de coagulación implica la formación de fibrina a partir de fibrinógeno o la disolución de la fibrina en sus productos de degradación.

Las pruebas de tiempo de protrombina (TP) se usan para diagnosticar enfermedades hepáticas y anomalías de la coagulación de la sangre. Las pruebas de TP también se utilizan para controlar el tratamiento antitrombótico mediante antagonistas de la vitamina K. Al realizar una prueba de TP, la muestra y los reactivos líquidos de tromboplastina se mezclan a 37ºC y se determina el tiempo necesario para que la mezcla coagule. Cuando se concibió la prueba por primera vez hace más de cincuenta años, el tiempo de coagulación era idéntico al TP, pero actualmente, para adecuar las variaciones en las propiedades del procedimiento de la prueba, el TP se expresa en INR (cociente internacional normalizado, International Normalized Ratio); véase más adelante.

Las pruebas de TP miden el tiempo desde la exposición al factor tisular unido a membrana (tromboplastina) hasta la detección de un coágulo. Se aceptan dos tipos de pruebas de TP, TP de Quick y TP de Owren, denominadas así por el primer autor del artículo ya que fueron descritas por primera vez en la bibliografía por Quick A. y col. The prothrombin time in hemophilia and in obstructive jaundice. J Biol Chem 25 1935; 109: 73-4 y por Owren P y Aas K. The control of dicumarol therapy and quantitative determination of prothrombin and proconvertin. Scand J Clin Lab Invest 1951; 1951; 201-8. Tanto el TP de Owren como el TP de Quick son pruebas de coagulación de química húmeda, es decir, la muestra se mezcla con un reactivo líquido (no seco). La diferencia en los procedimientos reside en el hecho de que el reactivo de TP de Quick contiene sólo tromboplastina, mientras que el reactivo de TP de Owren contiene además fibrinógeno y factor de coagulación V. El contenido de fibrinógeno del reactivo puede verse como discriminatorio. Si el reactivo de TP contiene suficiente cantidad de fibrinógeno para aumentar el contenido de fibrinógeno de la mezcla de muestra y reactivo en al menos 0,1 g/l, entonces se trata de una prueba de TP de tipo Owren, no de una prueba de TP de Quick. Esto es aún más cierto cuando el aumento es de al menos 0,5 g/l. Otra característica diferenciadora importante es que la relación entre el reactivo y la muestra es mayor de cuatro, normalmente mayor de diez en un procedimiento de TP de tipo Owren, mientras que difícilmente es mayor de dos en el tipo Quick. La publicación Lindahl y col. Plasma-based calibration of Owren-type prothrombin time with results expressed in INR. Thromb Haemost 2004; 91: 1223-31, enviada para su publicación a varias revistas durante los últimos seis años, se publicó 8 meses después de presentar
la solicitud de prioridad de la presente invención, pero se puede considerar que contiene los datos generales relevantes.

Actualmente, el resultado de una prueba de TP no se expresa como tiempo de coagulación (TC), sino como cociente normalizado internacional (INR). El INR se obtiene comparando el TC de la muestra con una muestra con un tiempo de coagulación normal (TCN) individual promedio normal. El INR es el cociente entre el TC y el TCN obtenido a la potencia del ISI, el índice de sensibilidad internacional. Véanse las referencias proporcionadas anteriormente de van den Besselaar y col. y Pollar y col. El TCN y el ISI son propiedades del procedimiento de la prueba de TP en concreto y se obtienen calibrando la prueba. En la calibración de un determinado procedimiento de la prueba de TP los resultados se alinean directa o indirectamente con los del procedimiento de la prueba de TP de referencia.

Según la técnica anterior, las pruebas analíticas diagnósticas de coagulación, como el TP, se realizan a 37ºC para reproducir la situación fisiológica. Las dificultades para estandarizar una prueba de TP a esta temperatura, o a cualquier temperatura, son considerables como es evidente por el trabajo internacional en curso en este área; van den Besselaar AM. International normalized ratio: towards improved accuracy. Thromb Haemost 1999; 82: 1562-3, y Pollar L y col Concerted Action on Anticoagulation (ECAA) - the multicentre calibration of rabbit and human ECAA reference thromboplastins. Steering Committee. Thromb Haemost 1996; 76: 977-82. Sin embargo, el enclavamiento del TP a 37ºC presenta un impedimento en el diseño de los procedimientos de ensayo, especialmente para los destinados a ser usados cerca del paciente, es decir, el análisis de diagnóstico inmediato de TP. Para poder mantener una temperatura de 37ºC durante la realización de la prueba, es necesario un termostato ajustado a 37ºC y debe dejarse un tiempo para que se equilibre la temperatura. La necesidad de un termostato añade más hardware y costes a los dispositivos disponibles en la actualidad y obstaculiza el desarrollo hacia el aumento en la prueba de diagnóstico analítico inmediato. La idea de realizar una prueba de TP a temperatura ambiente, especialmente a la temperatura de una habitación, es muy atractiva.

Muchas pruebas de TP se realizan en plasma sanguíneo en laboratorios centralizados altamente automatizados. Aunque esto puede resultar económico respecto de la generación de los resultados de la prueba, puede que no sea económico a nivel global desde un punto de vista de atención al paciente. La razón es el tiempo necesario para transportar las muestras al laboratorio u obtener los resultados de vuelta. Este tiempo puede ser de horas a días. Este es un tiempo largo en comparación con los 15 minutos o menos que serían necesarios para una prueba de TP que se realizara junto al paciente, es decir, un diagnóstico analítico inmediato. El tiempo de transporte puede retrasar el inicio de un tratamiento óptimo y puede forzar a que el paciente tenga que acudir a consultas adicionales con el medico. Además, para el análisis centralizado de la TP será necesario una punción venosa, un volumen de muestra de sangre relativamente grande y un recipiente resistente para la sangre. Un diagnóstico analítico inmediato del TP sólo necesita una tira reactiva, un pequeño volumen de sangre y no es necesario recipiente para el transporte de la muestra. Las consideraciones de este tipo han impulsado el desarrollo de procedimientos de pruebas de TP de diagnóstico analítico inmediato
que se pretenden realizar en las consultas del médico, en laboratorios pequeños y en el domicilio de los pacientes.

Como se sugiere anteriormente, la prueba de TP representa un considerable desafío de normalización que requiere precaución para que no se desvíe de las condiciones de la prueba establecidas. Un movimiento tentativo en el diseño de procedimientos de diagnóstico analítico inmediato para pruebas de TP es el paso de la química húmeda establecida a la química seca ya que esta última se adapta más fácilmente a las demandas de una situación de prueba de diagnóstico analítico inmediato. Los aspectos inventivos de la prueba de TP para el diagnóstico analítico inmediato por química seca se encuentran en la patente de EE.UU. Nº 6.402.704B1 de McMorrow, la patente de EE.UU. Nº 6.103.196 de Yassinzadeh y col., la patente de EE.UU. Nº 5.302.348 de Cusack y col., la patente de EE.UU. Nº 4.849.340 de Oberhardt, la patente de EE.UU. Nº 3.951.606 de Moyer y col., la patente de EE.UU. Nº 6.338.821 de Jina y la solicitud de patente internacional WO 93/22453 de Zweing. La última de estas describe un artículo de ensayo para determinar la capacidad de coagulación de una muestra de sangre que comprende una membrana porosa con un iniciador de coagulación y una sustancia impregnada en la misma. La prueba no es una prueba de coagulación ya que el punto final no es detectar la coagulación, lo que se detecta es la escisión de un sustrato sintético mediante alguna enzima, posiblemente trombina. En la descripción de la invención se propone que la respuesta de la prueba puede hacerse, por medios matemáticos, equivalente al TP de la muestra también cuando la prueba se realiza a temperatura ambiente. No se presenta prueba cuantitativa de este aspecto.

Hay aproximadamente 4 millones de pacientes en Europa en tratamiento con antagonistas de la vitamina K que necesitan la determinación del TP aproximadamente 20 veces al año. Esto supone un total de 80 millones de pruebas de TP al año, cada una de las cuales requiere aproximadamente 15 minutos de tiempo de asistencia sanitaria y contribuye con aproximadamente 10 euros por prueba a los costes de asistencia sanitaria, sin contar los materiales del ensayo que añaden aproximadamente 0,5 euros por prueba. El coste de la asistencia sanitaria de las pruebas de TP para el control del tratamiento antitrombótico, sin contar los materiales de la prueba es, por tanto, de aproximadamente 800 millones de euros. Si estos costes de atención sanitaria pudieran reducirse un 20% aumentando la frecuencia de diagnósticos analíticos inmediatos del TP a domicilio, a la vez que se potencia la calidad de vida del paciente, se podría obtener un ahorro en atención sanitaria de 160 millones de euros. Incluso después de un desbalance de aproximadamente 2 euros por prueba en el aumento de los costes del material, el ahorro en el sector de la atención sanitaria podría ser de aproximadamente 130 millones de euros.

Descripción de la invención

La presente invención está dirigida a un procedimiento de determinación, en una prueba de coagulación, del tiempo de protrombina (TP) en una muestra de sangre completa, sangre anticoagulada, plasma sanguíneo o plasma sanguíneo anticoagulado. El procedimiento comprende las etapas de:

a) añadir un volumen definido de la muestra a un volumen definido de un reactivo líquido que comprende tromboplastina y fibrinógeno en una proporción entre los volúmenes definidos del reactivo y la muestra de al menos cuatro, aumentado esta cantidad de fibrinógeno la concentración de fibrinógeno en la mezcla en al menos 0,1 g/l, o viceversa, en un recipiente,

b) determinar la temperatura de la mezcla de reacción de a) que tiene una temperatura ambiente dentro del intervalo de 18ºC a 35ºC.

realizándose las etapas a) y b) en un orden opcional, seguido de

c) determinar el tiempo de coagulación (TC) registrando el tiempo desde la adición en a) hasta que se detecta la formación de un coágulo en el recipiente, y

d) calcular el tiempo de protrombrina (TP) en función de la temperatura de b) y del tiempo de coagulación (TC) de c) expresado como cociente normalizado internacional (INR), usando la ecuación

INR = (TC/(TCN(t))^{ISI(t)}

en la que

TC = tiempo de coagulación de c) en la reivindicación 1,

t = temperatura de b) en la reivindicación 1,

TCN(t) = tiempo de coagulación normal (TCN) expresado en función de la temperatura t, e

ISI(t) = índice de sensibilidad internacional (ISI), expresado en función de la temperatura t.

Debe entenderse que el uso del término "recipiente" comprende todo tipo de recipientes para líquidos, como tubos de ensayo, cubetas, viales, etc.

En una realización de la invención, el reactivo líquido comprende dos o tres reactivos diferentes.

En otra realización, el reactivo líquido contiene una cantidad de fibrinógeno que aumenta la concentración de fibrinógeno en la mezcla de a) en al menos 0,5 g/l y la proporción entre el volumen definido del reactivo y la muestra en a) es de al menos 10.

En una variante del procedimiento de la invención, la determinación de la temperatura en la etapa b) se realiza determinando la temperatura ambiente de la habitación, siempre que el reactivo líquido esté a la misma temperatura.

Como se ha mencionado, el procedimiento de la invención puede realizarse a una temperatura ambiente de entre 18ºC y 35ºC. El intervalo de temperatura más preferido en las condiciones utilizadas en los ejemplos es de 30ºC a 35ºC.

En otra realización adicional de la invención el tiempo de protrombina (TP) se obtiene a partir de una tabla con filas y columnas en la que las unas son tiempos de coagulación diversos y las otras temperaturas diversas, y el TP se encuentra en la intersección entre el tiempo de coagulación y la temperatura.

Un kit de la prueba para realizar un análisis según el aspecto del procedimiento de la invención comprende sistemas de registro de temperatura y uno o varios recipientes independientes sellados, como tubos de ensayo, cubetas, viales, etc., que contienen los reactivos para la coagulación de uno o más volúmenes definidos de una muestra de sangre completa, sangre anticoagulada, plasma sanguíneo o plasma sanguíneo anticoagulado.

Los sistemas de registro de temperatura pueden ser cualquier sistema con el que pueda registrarse la temperatura ambiente en el intervalo de registro de 15ºC a 45ºC, como un termómetro de vidrio normal, un termopar sensible al calor, etc. También el termómetro puede ser un termómetro diseñado especialmente para que tenga un gancho en un extremo, de modo que permita la detección visual de la formación del coágulo en el recipiente mientras que el termómetro se mueve hacia adelante y hacia atrás.

Un reactivo del recipiente contiene fibrinógeno en cantidad tal que se obtenga una concentración final de fibrinógeno de al menos 0,1 g/l en el recipiente cuando se mezcla con la muestra que se va a ensayar.

Los reactivos de los recipientes pueden estar en forma liofilizada para su reconstitución con uno o más volúmenes de líquido definidos antes de su uso.

Incluso si no es necesario proporcionar sistemas de registro de tiempo, como un cronómetro manual o electrónico con el kit de la prueba, será conveniente que el usuario final disponga de todo el equipo necesario en un único kit de la prueba. Por tanto, también será adecuado incluir dentro del kit de ensayo un sistema para determinar el volumen, como pipetas o similares.

El calibrado de una prueba de TP abarca el procedimiento o método completo. Esto supone los reactivos, el aparato, el equipo volumétrico y las instrucciones de uso. Puesto que muchos usuarios, especialmente los usuarios de pruebas de TP para diagnóstico analítico inmediato, dependen del calibrado del fabricante tiene sentido que el calibrado de un fabricante sea fiable si el producto administrado, el kit del equipo, contiene todo lo necesario para realizar la prueba de TP. Sin embargo, según la técnica anterior, este no es el caso. Debido a los elevados costes del aparato, éste se suministrará por separado y se usará durante un amplio periodo de tiempo, por ejemplo, de tres a cinco años. El aparato no se sustituirá cada vez que se utilice un nuevo lote de reactivos, lo que puede ser aproximadamente cada 6 a 12 meses. Sin embargo, la presente invención será útil para el desarrollo de un aparato barato que pueda desecharse después del uso del lote de reactivos que compone el kit de la prueba.

La razón principal para realizar pruebas de coagulación a temperatura ambiente es eliminar la necesidad de un equipo de control de temperatura caro y que consume energía. Según la presente invención, es posible realizar pruebas de coagulación a las temperaturas ambiente típicas de las viviendas humanas. Según la presente invención, es posible realizar una prueba de coagulación a temperatura ambiente en la que se determinen el tiempo de coagulación y la temperatura, y se usen para obtener los resultados de la prueba. Durante la realización de una prueba de coagulación según la invención, existe también una segunda razón para medir la temperatura. Esta es optimizar las condiciones de temperatura de la prueba.

Los resultados de la prueba para una prueba de TP se expresan como INR. Según la técnica anterior, la prueba de TP se realiza a una temperatura fija de 37ºC y el INR es función del tiempo de coagulación, INR(TC). A diferencia de esto, la prueba de TP se realiza según la invención a cualquier temperatura dentro de los límites especificados. Se determina tanto el tiempo de coagulación como la temperatura (t) y el INR está en función de ambos, INR(TC,t). La temperatura también se determina para establecer que ésta está dentro del intervalo en el que puede realizarse la prueba de TP.

Se pretende que la prueba de coagulación se realice a temperaturas típicas de las viviendas humanas. Por tanto, se asume que el intervalo de temperatura ambiente es el intervalo de temperatura en el interior de dichas viviendas, es decir, entre 15ºC y 45ºC. Dentro del alcance de la presente invención se asume que la temperatura ambiente se limite al intervalo de 18ºC a 35ºC.

Es probable que una marcada dependencia del tiempo de coagulación con respecto a la temperatura reduzca la precisión del ensayo. Como se muestra en el Ejemplo 1, la velocidad de formación del coágulo se reduce a temperaturas inferiores a 18ºC, lo que hace que la coagulación sea menos obvia y más difícil de detectar. También a temperaturas superiores a 35ºC, los resultados del TP dependían de la temperatura. Por tanto, en la presente invención se prefiere que la prueba de TP se realice mediante un procedimiento a temperatura ambiente en el intervalo de 18ºC a 35ºC.

En el tratamiento antitrombótico con antagonistas de la vitamina K, el nivel óptimo de TP en sangre está en el intervalo de INR 2 a INR 3. Los resultados del trabajo experimental descrito en el Ejemplo 1 indican que existe un intervalo óptimo de temperatura para la determinación del TP en muestras con INR de aproximadamente 2; véase la Figura 3. Este intervalo óptimo de temperatura es de aproximadamente 30ºC a 35ºC. En la realización de la prueba de coagulación según la invención, puede que sea favorable que se haga dentro del intervalo de temperatura ambiente de 30ºC a 35ºC.

Son posibles otros límites de temperatura distintos a los mencionados anteriormente. Como se ha indicado, parece que el límite inferior del intervalo de temperaturas permitidas es el más crítico y puede que sea necesario ajustarlo con precisión, por ejemplo, especificado a 22ºC. Aunque, no existen razones por las que el límite superior de temperaturas permitidas deba ser inferior a 35ºC, dicha razón podría aparecer. Dentro del alcance de la presente invención es posible la reducción del límite superior, por ejemplo, hasta 30ºC.

Como se menciona anteriormente, parece que es un intervalo óptimo de temperatura para la determinación del TP en muestras con un INR en el intervalo de 2 a 3 o, incluso de 2 a 7. En este intervalo óptimo de temperatura, la dependencia de la temperatura del resultado de la prueba es pequeña lo que minimizará el impacto de un mal equilibrado y/o determinación de la temperatura. En los ejemplos recogidos a continuación, este intervalo optimo de temperatura era de aproximadamente 30ºC a 35ºC. La observación importante es que existe un intervalo óptimo de temperatura y puede considerarse que las alteraciones en la composición del reactivo y/o en los detalles del procedimiento puedan desplazar este intervalo óptimo de temperatura hasta temperaturas más bajas, donde se incluyan aquellas temperaturas que normalmente se encuentran en las viviendas humanas, es decir, de 20ºC a 30ºC. Si puede lograrse este desplazamiento de la temperatura optima, entonces existen razones para ajustar en consecuencia los límites de temperatura permitidos.

La invención también se refiere a cómo obtener los resultados de las pruebas de TP realizadas según la invención. En un procedimiento de TP según la invención, se determinan el tiempo de coagulación y la temperatura. Como se muestra en la Figura 1 y en la Figura 2, el TCN y el ISI para un procedimiento de TP determinado pueden considerarse como funciones de la temperatura y la naturaleza de estas funciones puede determinarse mediante calibrado. El procedimiento de TP según la invención puede calibrarse determinando el tiempo de coagulación a diversas temperaturas dentro del intervalo permitido para muestras con un INR conocido. A estas temperaturas, se determinan el TCN y el ISI del procedimiento de TP y se establece una relación funcional entre el TCN normal y la temperatura y el ISI y la temperatura. Estos últimos se indican como TCN(t) e ISI(t), respectivamente. Una vez que se han determinado TCN(t) e ISI(t), puede determinarse el INR como función del tiempo de coagulación (TC) y de la temperatura,
INR(CT,t) como sigue:

INR(TC,t) = (TC/TCN(t))^{ISI(t)}

En los ejemplos, TCN(t) e ISI(t) eran polinomios de segundo grado. Por supuesto, pueden utilizarse en este contexto muchos otros tipos de funciones. Puede usarse cualquier función que se adapte bien a los datos de calibrado.

Puede construirse una tabla como alternativa para deducir la relación funcional entre INR, t y TC, es decir, deducir una expresión con dos variables TCN(t,TC) y calcular los resultados del ensayo usando esta expresión. Esta tabla será una matriz donde cada fila es un tiempo de coagulación (TC) y cada columna una temperatura. Cada par de valores de temperatura y TC dado se corresponderá con un INR. Por tanto, no supone apartarse de la invención si los resultados del procedimiento de TP se presentan en una tabla en la que los resultados del ensayo están en una posición definida por una temperatura y un tiempo de coagulación.

Puede emplearse cualquier procedimiento según la reivindicación 1 que permita deducir un valor de INR a partir de un TC y una temperatura. Se cumple lo mismo para las condiciones del ensayo. Estas pueden incluir cualquier intervalo de temperatura permitido limitado según la reivindicación 1 y cualquier intervalo de tiempo de coagulación permitido limitado. En el trabajo experimental existen intervalos de temperatura identificados en los cuales la dependencia de la temperatura es despreciable lo cual hace que el valor de INR esté en función sólo del tiempo de coagulación. También en este caso es posible realizar la prueba de TP según la invención. Se determina tanto el tiempo de coagulación como la temperatura y ambos se usan para obtener los resultados del ensayo. La temperatura se determina para confirmar que está dentro del intervalo permitido.

La invención permite proporcionar a los usuarios el equipo necesario para realizar el procedimiento de TP según la invención. El kit de la prueba puede, además de los componentes ya mencionados, contener un aparato e instrucciones para su uso. Por ejemplo, el kit de la prueba puede contener reactivos para de 10 a 100 análisis del TP.

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Descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama en el que los círculos rellenos muestran los TCN de la Tabla 1. La línea continua es un polinomio de segundo grado ajustado a los puntos de datos experimentales obtenidos por el procedimiento de mínimos cuadrados. Los círculos vacíos muestran los valores de TCN para el procedimiento de TP estimados con las muestras de plasma de pacientes y los valores de INR para estos suministrados por el departamento. La función ajustada fue TCN(t) = 136,4 - 6,165t + 0,0837t^{2}.

La Fig. 2 es un diagrama en el que los círculos rellenos muestran los datos de ISI determinados experimentalmente de la Tabla 1. La línea continua es un polinomio de segundo grado ajustado a los puntos de datos experimentales obtenidos por el procedimiento de mínimos cuadrados. Los círculos vacíos muestran los valores de TCN para el procedimiento de TP estimados con las muestras de plasma de pacientes y los valores de INR para estos suministrados por el departamento. La función ajustada fue TCN(t) = 1,0584 + 0,04201t - 0,0011t^{2}.

La Fig. 3 es un diagrama en el que las líneas continuas muestran el tiempo de coagulación esperado con el procedimiento de TP para muestras con valores de INR de 1, 2, 3, 4, 5 y 7 en el intervalo de temperatura de 18ºC a 40ºC. Los cálculos se hicieron con la relación INR = (TC/TCN)^{ISI}, reordenada como INR = (TC/TCN(t))^{ISI(t)}, con las inserciones de los TCN(t) e ISI(t) proporcionados en las leyendas de las Figuras 1 y 2.

La Fig. 4 es un diagrama en el que los valores de INR de 23 muestras de plasma de pacientes tratados con citrato determinados según la invención a 22,7ºC se comparan con los valores de INR de las mismas muestras determinadas según la técnica anterior en el Departamento de Química Clínica del Hospital Universitario de Linköping, Suecia.

La Fig. 5 es un diagrama en el que el valor medio de INR de tres determinaciones según la invención para muestras de plasma de 12 pacientes, a 18,5ºC, 22,7ºC y 28,4ºC, se compara con los valores de INR de las mismas muestras determinados según la técnica anterior. Las determinaciones según la invención y según la técnica anterior se indican como INR de la invención e INR del Dept. Quim. Clin., respectivamente.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se proporcionan para un mejor entendimiento de la invención y para mostrar que ésta tiene importancia práctica y económica. Los ejemplos son sólo una pequeña muestra de todas las posibles realizaciones de la invención. Por tanto, los ejemplos no limitan en modo alguno la presente invención.

Materiales y procedimientos

El reactivo para determinar el TP fue GHI 131, lote C225F, que es del tipo Owren ya que contiene tromboplastina de cerebro de conejo, factor V bovino y fibrinógeno bovino. El reactivo se suministraba como polvo liofilizado. Cada vial de reactivo se reconstituyó primero con 5 ml de agua y, a continuación, con 5 ml de CaCl_{2} 25 mM. El reactivo se usó entre 4 y 10 horas después de la reconstitución. En el procedimiento de ensayo del TP, se colocaron 300 \mul del reactivo en el recipiente de reacción a los que se añadieron 25 \mul de muestra, en una proporción 1:12. La cantidad de fibrinógeno en el reactivo era suficiente para aumentar la concentración de fibrinógeno en la mezcla de la muestra y el reactivo en aproximadamente 0,8 g/l.

Las muestras de plasma control con INR conocido eran muestra de plasma liofilizadas con un INR conocido. Un plasma control, con número de producto GHI 162, tenía un INR de 1,11 y el otro, con número de producto GHI 167, tenía un INR de 2,82. Las muestras de plasma control liofilizadas se reconstituyeron primero con 1 ml de agua según la recomendación del fabricante y, a continuación, para llevar el plasma control reconstituido a aproximadamente la misma potencia de TP que la sangre con un volumen de fracción de eritrocitos (VFE) de 0,45, el plasma control se diluyó añadiendo 0,82 ml de NaCl 150 mM. El reactivo de TP y las muestras de plasma control fueron fabricados por Global Hemostasis Institutet MGR AB, Linköping, Suecia.

Las muestras de plasma tratado con citrato procedían del Departamento de Química Clínica del Hospital Universitario de Linköping, Suecia. Las 23 muestras procedían de las muestras que llegaron al departamento para el análisis del TP durante aproximadamente 3 horas en la tarde del 12 de junio de 2003. Las muestras se analizaron según la invención antes de 4 horas después de haber sido analizadas por el procedimiento rutinario del departamento. Las muestras se convirtieron en no trazables para mantener el anonimato de los pacientes y se proporcionaron con los valores de TP obtenidos por el departamento. Antes del ensayo según la invención, se diluyó una porción de 200 \mul de cada plasma 1:1,82 con la adición de 164 \mul de NaCl 150 mM. Esto las hizo equipotentes a las muestras de sangre con un VFE de 0,45. Los experimentos clínicos se realizaron en colaboración con el Profesor Tomas L. Lindahl del Departamento de Química Clínica, Universidad de Linköping y fueron aprobados por el comité de ética local de la Facultad de Medicina de la Universidad de Linköping.

Los capilares de vidrio con un volumen de 25 \mul (50 mm de longitud), con número de producto 111.395-25, eran de KEBO-lab, Estocolmo, Suecia.

El reactivo de TP se añadió a tubos de poliestireno de 8 mm de diámetro interno a razón de 300 \mul de reactivo por tubo. Los tubos se taparon y su temperatura se equilibró en un baño. A tiempo cero, se añadieron 25 \mul de muestra al tubo del reactivo y se volvió a tapar. El tubo se inclinaba cada varios segundos de modo que el fondo del mismo estuviera fuera del baño cuando se inclinaba y se devolvía al baño colocándolo de nuevo derecho. El contenido del tubo se inspeccionaba cada vez que éste se inclinaba. Cuando se detectaban los primeros signos de coagulación, se registraba el tiempo. La temperatura del baño se variaba entre 14ºC y 40ºC. Los 25 \mul de muestra se añadieron tanto mediante capilares de vidrio como con una pipeta de punta de plástico desechable.

Ejemplo 1

El tiempo de coagulación (TC) se determinó con un procedimiento de TP en dos muestras de plasma control cada dos grados centígrados en el intervalo de temperatura de 18ºC a 38ºC. Las muestras de plasma control tenían valores de INR de 1,14 a 2,82. A partir de estos valores se calcularon el tiempo de coagulación normal (TCN) y el índice de sensibilidad internacional (ISI) del procedimiento de TP para cada una de las once temperaturas. El TCN estaba en el intervalo de 55 s a 22 s, y el ISI en el intervalo de 1,0 a 1,5; véanse las figuras 1 y 2. Los polinomios de segundo grado se ajustaron por el procedimiento de mínimos cuadrado para proporcionar el TCN y el ISI como funciones de la temperatura. Los polinomios de segundo grado que proporcionaban el mejor ajuste de los datos fueron:

TCN(t): = 136,4 - 6,165t + 0,0837t^{2}

ISI(t): = 1,0584 + 0,0420t - 0,0011t^{2}

También se determinaron los TCN y los ISI para el mismo procedimiento de TP a tres temperaturas, 18,5ºC, 22,7ºC y 28,4ºC con muestras de plasma de pacientes del Departamento de Química Clínica. Las Figuras 1 y 2 también muestran que las estimaciones de TCN e ISI hechas con las muestras de plasma de los pacientes y los valores de INR suministrados por el departamento estaban en concordancia.

La relación funcional entre la temperatura y los valores de TCN e ISI permitieron construir grupos de curvas, una por cada valor específico de INR, que mostraban el tiempo esperado de coagulación en función de la temperatura. La curva para un valor de INR de 1 era plana en el intervalo de temperatura de 35ºC a 40ºC. Las curvas de valores superiores de INR mostraban un mínimo cada vez más pronunciado en el intervalo de 30ºC a 35ºC.

El ejemplo 1 demuestra que puede determinarse la relación funcional entre la temperatura y los valores de TCN e ISI, TCN(t) e ISI(t). Además, el ejemplo 1 muestra que cada par de valores (t,TC) se transforma en un valor de INR. La Figura 3 puede usarse para realizar esta transformación pero es necesaria la interpolación entre las curvas. Parece que el sistema más directo para transformar el par de valores (t,CT) en un valor INR es una relación matemática con dos variables o una tabla. La Figura 3 muestra claramente que, en la práctica, puede realizarse una transformación de este tipo.

Cuando se analiza una muestra según la invención, se determinan el tiempo de coagulación y la temperatura ambiente (t). Con estos valores y la relación funcional conocida entre TCN(t) e ISI(t) puede calcularse un valor de INR como INR = (TC/TCN(t))^{ISI(T)}. Por tanto, según la invención, siempre que la temperatura este en un intervalo permitido, cada par de valores (t,TC) generará un valor de INR. Por supuesto, el valor de TC también debe estar dentro de cierto intervalo permitido pero esto no representa nada nuevo en comparación con los procedimientos de TP más actuales y, por tanto, no se ha elaborado en este documento.

Ejemplo 2

Se obtuvieron muestras de plasma de 23 pacientes del Departamento de Química Clínica junto con los valores de INR determinados según la técnica anterior. Las 23 muestras se analizaron según la invención. Para cada muestra se determinaron la temperatura ambiente y el tiempo de coagulación. La temperatura en las series era estable a 22,7ºC. A esta temperatura se determinaron los valores de TCN y de ISI del procedimiento de TP con respecto a los valores de INR de la técnica anterior. A continuación, se calcularon los valores de INR según la invención. Los valores de INR obtenidos según la invención a 22,7ºC se compararon con los valores de INR obtenidos según la técnica anterior a 37ºC; véase la Figura 4. La comparación se realizó por regresión lineal. Se obtuvieron una pendiente cercana a la unidad (1,008), una intersección próxima a cero (0,007) y un coeficiente de correlación de 0,982. No se observaron valores atípicos obvios. Las primeras 12 muestras de las 23 se analizaron de forma similar a 18,5ºC y a 28,4ºC. Para cada una de estas 12 muestra se determinó un valor medio de INR como la media de tres determinaciones, una a cada una de las tres temperaturas mencionadas. Este valor medio de INR también se comparó mediante análisis de regresión lineal con los valores de INR proporcionados por el departamento; Figura 5. De modo interesante, los valores medios de INR se correlacionaban con más fuerza con los valores de INR proporcionados por el departamento que los valores de INR obtenidos sólo a una temperatura (22,7ºC), el coeficiente de regresión por mínimos cuadrados era de 0,995 en comparación con 0,982. La inspección de los datos de la Figura 5 muestra que no existe sesgo ni valores atípicos obvios. Parece que el INR puede determinarse según la invención a cualquier temperatura en el intervalo de 18ºC a 40ºC.

El ejemplo 2 demuestra que los valores de INR pueden determinarse a temperaturas distintas a 37ºC. Según los datos, puede realizarse una prueba de TP a temperatura ambiente siempre que se determinen el tiempo de coagulación y la temperatura y que se usen ambos valores para obtener el resultado de la prueba. Para una demostración adicional del argumento, se determinaron los valores medios de INR en las muestras de plasma de 12 pacientes. Cada valor medio de INR era una media aritmética de tres determinaciones de INR, una a 18,5ºC, la segunda a 22,7ºC y una tercera a 28,4ºC. En la Figura 5 se compararon los valores medios de INR con los valores de INR obtenidos previamente en la técnica. En este caso, los datos se alineaban incluso mejor que en la Figura 4. Los resultados se interpretan de la siguiente forma: cada valor medio de INR es la media de tres determinaciones según la invención. Cada una de estas tres estimaciones es igualmente buena, independientemente de la temperatura. Los valores medios de INR son, por tanto, mejores estimaciones del valor de INR real que la estimación única a 22,7ºC. Se obtiene una desviación típica de las determinaciones asumiendo que el valor del INR del departamento era correcto. A continuación, puede determinarse que la desviación típica de la media del INR y el INR a 22,7ºC es 0,029 y 0,043, respectivamente. La proporción entre estas desviaciones típicas es de 1,5, que está próxima a 1,73, la raíz cuadrada de tres, que es lo esperado si todas las determinaciones, independientemente de la temperatura, tienen la misma importancia.

Los datos mostrados en las Figuras 4 y 5 presentan el descubrimiento en el cual se basa la invención. El TP puede determinarse a cualquier temperatura en el intervalo de aproximadamente 15ºC a 45ºC. Sólo es necesario determinar la temperatura y utilizarla junto con el tiempo de coagulación para obtener el resultado del ensayo. El hecho de que el TP pueda determinarse en un intervalo relativamente amplio de temperatura no es algo insignificante. Es un hecho que ahora se ha verificado experimentalmente. Ahora sabemos que se abren ante nosotros nuevas posibilidades analíticas que ofrecen ventajas considerables. Puesto que no existe necesidad de definir la temperatura, sólo es necesario determinarla, puede retirarse del equipo el hardware más caro usado para determinar el TP. Perfectamente puede ser que los equipos quizás se fabriquen tan baratos que sea posible utilizar un aparato desechable para las pruebas de TP. Ésto podría ser decisivo para las pruebas de TP para diagnóstico analítico inmediato.

Es probable que la invención pueda ponerse en práctica en cualquier tipo de prueba de TP de química húmeda. En particular, se demuestra con claridad que la invención puede ponerse en práctica con una prueba de TP de química húmeda del tipo Owren, es decir, con una prueba de TP en la que el reactivo contiene cantidades suficientes de fibrinógeno como para aumentar la concentración del fibrinógeno en la mezcla al menos en el intervalo de 0,1 g/l a
0,5 g/l y en el que la proporción volumétrica entre el reactivo y la muestra está en el intervalo de cuatro a diez o superior. Sin embargo, la proporción volumétrica puede ser mucho mayor, por ejemplo, de 50 o incluso mayor.

La determinación del TP según la invención podría dar lugar a una mejora en la calidad de la prueba. Una razón para un mal resultado en el TP es un defecto en el control de la temperatura. La temperatura de la mezcla de reacción no es la que se supone que tiene que ser. Esto puede ser porque no se ha dado el tiempo suficiente para que la temperatura se equilibre o debido a algún error en el termostato. Es lógico pensar que es más fácil medir la temperatura con buena precisión que mantenerla a un cierto nivel predeterminado con la misma precisión.

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TABLA 1

El tiempo de coagulación de TP para las dos muestras de plasma control se determinó a diversas temperaturas en el intervalo de 18ºC a 38ºC. Los tiempos de coagulación se designan TC INR 1,14 y TC INR 2,82. Usando estos dos valores de TC, se determinaros los TCN y los ISI del procedimiento de TP a cada temperatura a partir de la relación INR = (TC/TCN)^{ISI}. Todos los tiempos de coagulación se proporcionan en segundos.

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TABLA 2

A continuación se recoge un fragmento del archivo de Excel que muestra que un tiempo de coagulación y una temperatura, determinados durante la práctica de un procedimiento de TP según la invención, pueden transformarse en un valor de INR. Se proporciona una fila por cada TC en segundos y una columna para cada temperatura en grados centígrados. Si, durante la práctica de un procedimiento de TP según la invención, se determinan una temperatura de 24ºC y un tiempo de coagulación de 45 segundos, entonces el INR de la muestra es de 1,34. La sección de la matriz mostrada cubre el intervalo de temperatura de 19ºC a 28ºC. Si, en conexión con la realización de una prueba de TP según la invención, se determina una temperatura inferior a 18ºC entonces, está fuera de las condiciones propuestas para la prueba y no se obtiene valor de INR. Por tanto, la temperatura medida se utiliza para el control de las condiciones de la prueba. Si la temperatura medida está fuera del intervalo permitido, entonces las condiciones de la prueba no cumplen con los requisitos y no se generarán resultados para la prueba.

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Claims

1. Un procedimiento de determinación, en una prueba de coagulación, del tiempo de protrombina (TP) en una muestra de sangre completa, sangre anticoagulada, plasma sanguíneo o plasma sanguíneo anticoagulado que comprende las etapas de

a) añadir un volumen definido de la muestra a un volumen definido de un reactivo líquido que comprende tromboplastina y fibrinógeno en una proporción entre los volúmenes definidos del reactivo y la muestra de al menos cuatro, aumentando esta cantidad de fibrinógeno la concentración de fibrinógeno en la mezcla en al menos 0,1 g/l, o viceversa, en un recipiente,

b) determinar la temperatura de la mezcla de reacción de a) que tiene una temperatura ambiente en el intervalo de 18ºC a 35ºC.

realizándose las etapas a) y b) en un orden opcional, seguido de

INR = (TC/(TCN(t))^{ISI(t)}

en la que

TC = tiempo de coagulación de c) en la reivindicación 1,

t = temperatura de b) en la reivindicación 1,

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2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el reactivo líquido comprende dos o tres reactivos diferentes.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el reactivo líquido contiene una cantidad de fibrinógeno que aumenta la concentración de fibrinógeno en la mezcla de a) en al menos 0,5 g/l y la proporción entre el volumen definido del reactivo y la muestra en a) es de al menos diez.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la determinación de la temperatura en b) se consigue midiendo la temperatura ambiente de la habitación, a condición de que el reactivo líquido esté a la misma temperatura.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la temperatura ambiente está en el intervalo de 30ºC a 35ºC.

6. El procedimiento según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5, en el que el tiempo de protrombina (TP) se obtiene a partir de una tabla con filas y columnas donde las primeras son para diversos tiempos de coagulación y las segundas para diversas temperaturas, y el TP se encuentra en la intersección entre el tiempo de coagulación y la temperatura.