MXPA06003192A - Metodo para detectar un fosfolipido procoagulante. - Google Patents
Metodo para detectar un fosfolipido procoagulante.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a un metodo para determinar la cantidad de fosfolipido procoagulante en una muestra, el metodo comprende los pasos del (i) al (iii) realizados en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra y un plasma de substrato el cual ha sido presentado libre o substancialmente libre de fosfolipido procoagulante lo suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse, en donde el plasma de substrato ha sido presentado libre o substancialmente libre de fosfolipido procoagulante mediante el tratamiento con una fosfolipidasa; (ii) poner en contacto la mezcla con un reactivo para activar la coagulacion del plasma en una condicion en donde el fosfolipido procoagulante es la cantidad que limita el componente de la mezcla; (iii) determinar el tiempo de coagulacion de la mezcla.
Description
saludables, probablemente en la forma de micropartículas derivadas de una variedad de células, principalmente plaquetas, pero estos niveles aumentan cuando las plaquetas llegan a quedar activadas, por ejemplo, en respuesta a una lesión o activación de la coagulación de la sangre y mecanismos de complementos o inmunológicos. La actividad procoagulante máxima se expresa in vitro en las plaquetas después del deshelado congelado o la activación por parte del colágeno/trombina o los agentes de interrupción de la membrana, tales como los ionóforos. La activación anormal de las plaquetas in vivo ocurre durante los episodios trombóticos, el embolismo, sepsis, coagulación intravascular diseminada e infartos. Por el contrario, la activación inadecuada de las plaquetas ocurre en ciertos padecimientos de sangrado, tales como la enfermedad de von Willebrands y con varias anormalidades de las plaquetas. Los fosfolípidos procoagulantes pueden estar detectados tradicionalmente en una muestra del plasma de sangre del paciente por medio de un ensayo de coagulación, por ejemplo, la Prueba de Veneno de Víbora de Russell (en lo sucesivo "RVVT"), aunque dichos ensayos son utilizados de una manera más convencional para el diagnóstico -anticoagulante del lupus. La prueba veneno utilizada en el RVVT contienen metaloproteasas que activan específicamente los factores V y X. Después de la adición del veneno y los
iones de calcio, ia coagulación procede con una dependencia casi absoluta del fosfolípido procoagulante en la muestra del paciente. La cantidad de fosfolípido procoagulante en la muestra del paciente es determinada con el tiempo requerido para que la mezcla de prueba forme la fibrina y el coagulado y de este modo, deja de fluir en un tubo o aumenta la turbidez óptica o bloquea un agujero o abertura. El tiempo de coagulación o tiempo requerido para que se forme un coágulo de fibrina puede ser reemplazado en esta y las descripciones posteriores como un indicador de punto final por un substrato cromogénico el cual produce un producto coloreado que se puede detectar fácilmente cuando es activado por la enzima principal de coagulación, la trombina. En donde se sospecha que el paciente tiene una deficiencia de factores, tales como un Factor X, V, II o fibrinógen insuficiente, o está recibiendo anticoagulantes, la muestra del paciente generalmente es mezclada con una muestra de una sangre libre de plaquetas humanas normales con el propósito de suministrar esos factores, de los cuales carece la muestra. Este plasma libre de plaquetas humanas normales, generalmente es conocido como "plasma del substrato". El plasma del substrato utilizado en estos ensayos generalmente está libre de plaquetas, porque de otro modo, la coagulación no dependería absolutamente del fosfolípido procoagulante contenido en la muestra del paciente.
En la prueba RVVT y otros ensayos de coagulación, el plasma del substrato generalmente es preparado por centrifugación de alta velocidad y/o filtración. Una desventaja principal de este procedimiento, es que es difícil controlar el agotamiento del fosfolípido procoagulante del plasma de substrato. El plasma fresco es esencial y éste con frecuencia no es conveniente obtenerlo. Una vez que el plasma ha sido congelado, las plaquetas contenidas en el mismo son activadas y liberan el fosfolípido procoagulante. Por consiguiente, la sensibilidad proporcionada por el ensayo RVVT u otros ensayos de coagulación para la detección del fosfolípido procoagulante en la muestra del paciente y la capacidad para regular la especificidad de estos ensayos es limitada. Una desventaja adicional es que estos procesos no eliminan algunas micropartículas celulares, las cuales pueden tener flotabilidad neutral o pueden ser demasiado pequeñas para ser filtradas. Otra desventaja de los métodos actuales para la determinación del fosfolípido procoagulante es su sensibilidad a los inhibidores de coagulación, tales como los anticuerpos. Estos anticuerpos ocurren frecuentemente en las enfermedades autoinmunes, por ejemplo, "el síndrome antifosfolípido" y ocasionan la prolongación de la mayor parte de las pruebas de coagulación, las cuales emplean reactivos que contienen fosfolípidos y por lo tanto, proporcionan
resultados negativos falsos en las pruebas actuales para los fosfolípidos procoagulantes. Sumario de la Invención En vista del rol de ios fosfolípidos procoagulantes en la patogénesis de los episodios trombóticos y su potencial como marcadores de plaquetas o activación celular, existe una necesidad de métodos mejorados para detectar la presencia de y la cantidad de fosfoiípido procoagulante en una muestra. Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar la cantidad de fosfoiípido procoagulante en una muestra, comprendiendo el método los pasos del (i) al (iii) realizados en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra y un plasma del substrato el cual es presentado libre o substancialmente libre de fosfolípidos procoagulantes suficientes para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse, en donde dicho plasma del substrato se ha presentado libre o substancialmente libre de fosfoiípido procoagulante mediante el tratamiento con una fosfolipidasa; (II) poner en contacto la mezcla con un reactivo para activar la coagulación del plasma en condiciones en donde el fosfoiípido procoagulante se encuentra en el componente que limita la cantidad de la mezcla; y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla. De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención se proporciona un método para determinar la cantidad de plaquetas activadas y micropartículas derivadas de la célula en una muestra, comprendiendo el método los pasos del (i) al (iii) realizados en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra y el plasma del substrato el cual se ha presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse; (ii) poner en contacto la mezcla con un reactivo para la activación de la coagulación del plasma en condiciones para permitir que el fosfolípido procoagulante coagule la mezcla; y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla. De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para evaluar si un paciente ha tenido un episodio trombótico reciente, comprendiendo el método los pasos del (i) al (iii) realizados en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra y un plasma del substrato el cual se ha presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse; (ii) poner en contacto la mezcla con un reactivo para la activación de la coagulación del plasma en condiciones para permitir que el fosfolípido procoagulante coagule la mezcla; y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.
Por ejemplo, un episodio trombótico, puede ser una trombosis venosa profunda, embolismo o infarto. El término "reciente" significa dentro del limite de tiempo en el que el fosfolípido procoagulante derivado del evento trombótico puede ser detectado en la circulación. Un estimado sería hasta de 12 horas desde dicho evento, si no ocurre una activación adicional de las plaquetas. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir un plasma del substrato para utilizarlo para determinar el nivel de fosfolípido procoagulante en una muestra, comprendiendo el método tratar el plasma del substrato con una fosfolipidasa para degradar el fosfolípido procoagulante lo suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse. De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención se proporciona un plasma del substrato producido mediante el método del cuarto aspecto. Éste incluye el concepto de incubación y la prueba del plasma que contiene una cantidad desconocida de fosfolípido procoagulante solamente con fosfolipidasa y comparar el resultado de una prueba de sensibilidad del fosfolípido antes y después de dicha incubación. Una prolongación importante de la prueba confirma que el fosfolípido procoaguiante ha estado presente sin necesidad alguna de la adición de un plasma de substrato
libre de fosfolípido. De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención se proporciona un equipo para determinar el nivel de fosfolípido procoagulante en una muestra, comprendiendo el equipo: (i) un plasma del substrato el cual ha sido tratado con fosfolipidasa para degradar el fosfolípido lo suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse; (ii) un reactivo para la activación de la coagulación del plasma de una manera dependiente de fosfolípido; y (¡ii) hacer referencia a preparaciones que contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante. Las preparaciones de referencia, que contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante pueden ser utilizadas como agentes de calibración para construir una gráfica de referencia. La presente invención busca solucionar las desventajas identificadas anteriormente y en una modalidad proporciona un método para determinar si una muestra contiene un fosfolípido procoagulante que se puede detectar arriba del límite inferior de sensibilidad del método y en una segunda modalidad, la cantidad de fosfolípido. El método comprende formar una mezcla de la muestra y un plasma del substrato el cual se ha presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse en una
prueba de coagulación dependiente del fosfolípido. El plasma del substrato puede ser presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante mediante el tratamiento con una fosfolipidasa. La prueba de coagulación dependiente del fosfolípido puede ser una que es iniciada por la prueba de veneno de víbora de Russell o el factor activador X de ese veneno, o el activador de protrombina dependiente del fosfolípido del veneno de Pseudonaja Textilis o más preferentemente el factor Xa de origen humano, animal o recombinante. El plasma puede ser plasma humano o plasma no humano y preferentemente es un plasma no humano y más preferentemente un plasma animal. El plasma se puede presentar libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante mediante, por ejemplo, el tratamiento con una enzima la cual degrada el fosfolípido en el plasma. Por ejemplo, para prolongar el tiempo de coagulación activada por el factor Xa del plasma de caballo de 50 a 120 segundos, se requiere 1 hora de incubación a una temperatura de 37°C, con 2 x 10-5% de veneno de Naja nigricollfs veneno. Los detalles de diferentes protocolos del tratamiento previo del plasma, se muestran en el ejemplo 1 siguiente. La mezcla entonces se pone en contacto con un reactivo para activar la coagulación del plasma en
condiciones en donde la concentración del fosfolípido procoagulante influye en el tiempo de coagulación. Se toma una determinación con respecto a si la muestra comprende fosfolípido procoagulante, determinando cuando ha ocurrido la coagulación de la mezcla. Como se describe en este documento, el inventor ha descubierto que la sensibilidad de una prueba de coagulación para detectar fosfolípido procoagulante en una muestra, tal como preferentemente con una prueba basada en el factor Xa, es mejorada utilizando como plasma del substrato, una composición en la cual el fosfolípido procoagulante ha sido degradado mediante el tratamiento con fosfolipidasa. Más específicamente, se observó que una mezcla que comprende el plasma del substrato tratado con fosfolipidasa tenía un tiempo de coagulación aumentado, en relación con el tiempo de coagulación de una mezcla que comprende el plasma deficiente de plaquetas sin tratar, o plasma centrifugado tratado normalmente. (Ejemplo 2). Debido a que las mismas cantidades de plasma de prueba y por lo tanto, las mismas cantidades de fosfolípido procoagulante agregadas fueron proporcionadas en todas las mezclas, se considera que el tiempo de coagulación disminuido en la mezcla comprende plasma del substrato centrifugado y sin tratar que fue ocasionado mediante la detección del fosfolípido procoagulante de ambos el plasma del substrato y la muestra.
La mezcla que comprende el plasma del substrato tratado, para tener un tiempo de coagulación aumentada, ha mejorado la sensibilidad debido a que el único fosfolípido procoagulante contribuyó a la mezcla y por lo tanto, el que es detectado en el ensayo, es derivado de la muestra. Los resultados son sorprendentes debido a que muchas enzimas generalmente no tienen la capacidad de actividad cuando son agregadas al plasma. Esto se debe a que el plasma es una mezcla completa de moléculas heterogéneas las cuales pueden evitar la actividad de la enzima. Por ejemplo, el plasma contiene proteínas las cuales se enlazan de manera fuerte a los fosfolípidos tales como apolipoproteínas, anexinas, beta-2-gIicoproteína 1 y estas pueden interferir con la disponibilidad del substrato para una fosfolipidasa. Además, las fosfolipidasas generalmente requieren calcio para su actividad enzimática y esto se reduce en gran parte, por el anticoagulante de citrato generalmente utilizado en el plasma recolectado de las pruebas de coagulación de sangre. Además, el plasma también comprende moléculas inhibidoras con capacidad de inhibir la actividad de enzimas específicas. Por ejemplo, la antitripsina la cual se enlaza e inhibe la tripsina, la antitrombina la cual inhibe la trombina y los antiplasminos los cuales inhiben la actividad del plasmino. Probablemente el inhibidor principal de la mayor parte de las fosfolipidasas en
el plasma humano es la anexina V. Generalmente, el plasma del substrato es uno el cual ha sido tratado con una fosfolipidasa. Un ejemplo de dicha fosfolipidasa es una fosfolipidasa A2 básica. La fosfolipidasa puede ser producida sintéticamente, por ejemplo, mediante la tecnología de ADN recombinante, o puede ser derivada de un organismo. Por ejemplo, la fosfolipidasa puede ser derivada del veneno de víbora. Como se ejemplifica en la presente descripción, las fosfolipidasas derivadas del veneno de Naja mossambica y N nigricollis son particularmente útiles para el tratamiento del plasma del substrato. Otros tipos de venenos que son útiles son derivados de las especies Agkistrodon halys, Víborae, especialmente Berus y Russelli, Crotalus durissus, Enhydrina schistosa, Oxyuranus scutellatus y Apis melífera. Las características principales de las fosfolipidasas de veneno que las hacen efectivas en los plasmas es probablemente su carácter básico como se muestra en un pH isoeléctrico alto. La mayor parte de las fosfolipidasas derivadas de veneno comparten la homología estructural. Otros organismos que pueden proporcionar una fosfolipidasa para utilizarse en el tratamiento del plasma del substrato incluyen las especies Streptomyces violaceoruber, Vibrio, Clostridium perfringens, Bacillus cereus. Después, los fosfolípidos aniónicos, tales como la serina fosfatidilo son importantes en la trombosis, generalmente la
enzima para degradar el fosfolípido procoagulante en el plasma del substrato debería de ser uno que tuviera la capacidad de degradar la serina fosfatidilo en el plasma. Como se observó anteriormente, el uso de un plasma del substrato tratado de manera correspondiente mejora la especificidad de la detección de la serina fosfatidilo en un ensayo de coagulación para la detección de un fosfolípido procoagulante, tal como el ensayo RVVT o el ensayo basado en el factor Xa. Deberá quedar entendido que el plasma del substrato para utilizarse en el método de la presente invención no necesita ser tratado para degradar todos los fosfolípidos en el mismo. Sin embargo, el plasma del substrato generalmente es tratado de modo que su capacidad para coagularse, cuando es activado por un activador de coagulación dependiente del fosfolípido procoagulante, por ejemplo, el Veneno de Víbora de Russell, es por lo menos reducido mediante la degradación del fosfolípido procoagulante en el plasma del substrato por la enzima. Generalmente, la capacidad del plasma del substrato para coagularse cuando es activado por dicho reactivo se reduce cuando substancialmente todo el fosfolípido procoagulante, principalmente el componente de serina fosfatidilo del fosfolípido en el plasma del substrato, ha sido degradado por la enzima. El tratamiento del plasma del substrato con 1 x 10-
5% total, de veneno de N nigricollis (que contiene substancialmente menos de la enzima purificada) durante aproximadamente 1 hora a una temperatura de 37°C es generalmente suficiente para degradar substancialmente todo el fosfolípido procoagulante en el plasma del substrato deficiente de plaquetas por la enzima. Las condiciones reales para el agotamiento de los plasmas individuales dependen en gran parte de su contenido inicial de fosfolípido procoagulante libre y esto depende a la vez del grado de contaminación por las plaquetas u otros desechos celulares (por ejemplo, ver ejemplo 1). Por lo tanto, los plasmas que contiene niveles altos de plaquetas requieren un tiempo de incubación más largo o una concentración mayor de fosfolipidasa que aquellos que ya son bajos en fosfolípidos. Se prefiere comenzar con plasmas que ya son bajos en fosfolípidos. Este tratamiento de fosfolipidasa degrada solamente aproximadamente el 0.001% del fosfolípido total 0.1% en la mayor parte de los plasmas deficientes de plaquetas. Generalmente, la proporción de serina fosfatidilo libre:fosfolípido es de aproximadamente 1:100,000. Una prueba sensible al fosfolípido tal como el tiempo de coagulación activado por el factor Xa (en lo sucesivo "XACT") detecta de manera rutinaria de 100 a 1000 ng/mL en los plasmas del paciente. Deberá quedar entendido que se podría utilizar un tiempo de incubación más corto con una
concentración más alta de fosfolipidasa y sería necesario un tiempo de incubación más largo con una concentración más baja de fosfolipidasa. Por lo tanto, 400 ng/mL de veneno de N nigricollis veneno en un plasma porcino normal requiere 40 minutos a una temperatura de 37°C para prolongar el tiempo de coagulación activado por el factor X de 48 segundos a 100 segundos mientras que 200 ng/mL de NNV requieren 90 minutos para lograr un resultado XACT óptimo similar a 100 segundos (ver ejemplo 1 para mayor detalle). También deberá quedar entendido que el método de la presente invención será más sensible para el fosfolípido procoagulante cuando todo el fosfolípido procoagulante del plasma del substrato ha sido degradado mediante el tratamiento con la enzima. Debido a que la actividad de los venenos útiles en la presente invención es progresiva en la naturaleza se desea detener su interacción con el plasma, una vez que el nivel del fosfolípido ha sido agotado de manera adecuada. Esto se puede hacer con antisuero diluido y anticuerpos dirigidos contra el veneno que está siendo utilizado. Los antivenenos que se consiguen comercialmente contra la clase particular de veneno, por ejemplo, de cobra, que están siendo utilizados son efectivos en concentraciones del 0.01% al 1%. El plasma del substrato puede ser cualquier composición que corrige un factor o factores de los cuales es deficiente la muestra del paciente. Por ejemplo, en donde la muestra del
paciente está deficiente del Factor V, el substrato del plasma contendría un Factor V excedente como para tener la capacidad de efectuar la coagulación de la muestra de plasma del paciente. Otro ejemplo de un plasma del substrato es uno el cual contiene todos los factores seleccionados del grupo consistente de: factor XII, precalicreína, quininogén de alto peso molecular, el factor XI, el factor VIII, el factor IX, el factor X, el factor V, protrombina y fibrinogén en niveles funcionales suficientes para compensar cualesquiera defectos en la muestra mezclada. Dicho plasma del substrato sería utilizado en una prueba de tiempo de coagulación activada en la superficie o por caolina. Cuando es utilizada una prueba que emplea factor de tejido como un activador el plasma del substrato debe contener los factores VII, X, V, II y I (fibrinogén) para el mismo propósito. Cuando va a ser utilizada una prueba tal como la Prueba Veneno Víbora de Russell, se requieren solamente los factores de coagulación X, y que estén presentes debajo de la cascada de coagulación, por ejemplo, los factores X, el factor V, el factor II y el fibrinogén. Los factores arriba del factor X no necesitan estar presentes para un resultado normal. Si va a ser utilizada una prueba basada en el factor Xa, ni el factor X es necesario en el sistema para un resultado normal, entonces solamente se requieren los factores V, II y I (fibrinogén). Los activadores de protrombina dependientes del
fosfolípido de los venenos de elápidos no requieren factores arriba del factor II (protrombina) para inducir la coagulación. Por lo tanto, si se fuera a utilizar una prueba basada en el veneno Taipan solamente necesitarían proporcionarse protrombina y fibrinogén para un resultado normal. El fibrinogén o el factor I es necesario solamente para proporcionar un marcador para el punto final de coagulación. La cantidad máxima de generación de trombina puede ser detectada alternativamente utilizando substratos de tripéptidos cromogénicos, los cuales son convertidos por la trombina en productos finales coloreados los cuales pueden ser detectados espectrofotométricamente. Generalmente, el plasma del substrato es derivado de sangre citratada. Los plasmas adecuados son aquellos que son conocidos como efectivos para promover la coagulación de una muestra de plasma humano, debido a que proporcionan un factor presente de manera variable en la muestra de prueba. Los ejemplos de dichos plasmas incluyen la mayor parte de plasmas de mamíferos. Aquellos los cuales se ejemplifican en la presente descripción como útiles en el método de la presente invención, incluyen un plasma derivado de cerdo, caballo, vaca, oveja, cabra, camello, mono, perro, gato, zorro, elefante, llama, conejo, mink, mapache, canguro, humano y mezclas de los mismos. El plasma para proporcionar el plasma de substrato
puede ser derivado de un individuo que está siendo probado por la presencia y/o cantidad de fosfolípido procoagulante. En este caso, la muestra de plasma puede ser probada con un tiempo de coagulación activado por el factor Xa antes y después de la incubación con una cantidad conocida de fosfolipidasa (por ejemplo, 100 ng/mL de veneno de N nlgricollis). La diferencia entre el primer y segundo resultados es proporcional la cantidad de fosfolípido procoagulante que fue destruido por el tratamiento de fosfolipidasa. Sin embargo, conforme se generan anticuerpos en algunos humanos, los cuales tienen actividad serológica contra las proteínas humanas las cuales se enlazan a los fosfolípidos procoagulantes, tales como la beta 2 glicoproteína 1 y protrombina (por ejemplo, anticuerpos inhibidores de lupus), el uso del plasma humano como el plasma del substrato en el método de la presente invención es portador de algún tipo de sensibilidad no deseada para dichos inhibidores. Por consiguiente, dichas muestras deben de ser ensayadas por la presencia de estos anticuerpos. En donde se utiliza un plasma animal para proporcionar el plasma del substrato, una ventaja de la presente invención es que el método es mucho menos sensible a los anticuerpos dirigidos contra los factores de coagulación humano o co-factores de lupus que un método basado en el plasma humano. Dichos anticuerpos pueden ocurrir inesperadamente
entre pacientes, los cuales ocasionan confusión y falta de confiabilidad de los métodos de prueba de coagulación existentes. Deberá quedar entendido que cuando una muestra de prueba ha alterado la capacidad de coagulación, particularmente en donde el individuo que va a ser probado ha sido administrado con un anti-coagulante, puede ser necesario que el plasma del substrato comprenda además por lo menos un agente para controlar la capacidad del anti-coagulante para inhibir la coagulación. Aquellos agentes que es más probable que sean útiles como los que tienen capacidad para controlar la capacidad de la heparina para inhibir la coagulación, debido a que la heparina es ampliamente usada como un anticoagulante. Estos agentes incluyen sulfato de protamina y sulfato de polibreno y protamina. Sin embargo, otros agentes incluyen anticuerpos contra hirudina y sus análogos u otros antagonistas anticoagulantes. El plasma del substrato generalmente sería utilizado en una forma líquida o reconstituida. Sin embargo, para utilizarlo en un aparato de "punto de cuidado" podría estar presente como parte de una composición seca reconstituida por la muestra aplicada de sangre o plasma mismo. El reactivo para activar la coagulación de la mezcla en la prueba debe activar la coagulación para proceder
posteriormente de una manera dependiente del fosfolípido procoagulante. Los ejemplos de dichos reactivos son aquellos que tienen la capacidad para convertir el factor X en factor Xa, o que tienen la capacidad para convertir la protrombina en trombina. Por consiguiente, el reactivo para utilizarse en el método de la presente invención, puede ser el Veneno de Víbora de Russell o el activador del factor X de un veneno relacionado con la familia víboraidae o el factor Xa u otro activador de protrombina dependiente de fosfolípidos derivado de los venenoes elápidos, tales como la cobra Australiana de la familia Pseudonaja u Oxyuranus scutellatus. Los reactivos derivados de mamíferos que no son humanos son particularmente útiles, por ejemplo, el factor Xa de origen bovino (ver ejemplo 4). Los reactivos que actúan más alto hasta el mecanismo de coagulación tales como los activadores de contacto, factores de tejido, el factor IXa, el factor Xla, y el factor Vlla, pueden ser utilizados, pero esto hace que el sistema sea menos específico para el fosfolípido y más vulnerable a la interferencia de las variables del plasma del paciente. Los activadores de coagulación también pueden ser enzimas de precursores recombinantes basados en secuencias novedosas de ADN. Dichos procoagulantes podrían ser presentados de manera insensible para inhibir anticuerpos mediante la eliminación de los epítopes comunes
reconocidos por dichos anticuerpos. Estos reactivos generalmente serían utilizados en forma líquida pero podrían también ser proporcionados en una forma seca para la aplicación en un aparato de "punto de cuidado", en cuyo caso serían reconstituidos por una muestra de plasma o una muestra de sangre aplicada. Aunque se anticipa que el método de la presente invención sería aplicado de una manera más amplia en relación con un plasma o muestra de plasma derivado de un paciente humano, deberá quedar entendido que el método puede ser utilizado para detectar el fosfolípido procoagulante en un rango de animales. Esta modalidad sería útil en estudios de experimentos de animales para la evaluación in vitro o in vivo de la biocompatibilidad de las superficies de los materiales con la sangre animal y el efecto de los fármacos experimentales. La muestra que va a ser probada por el fosfolípido procoagulante puede ser sangre, plasma, suero o cualquier otro fluido. Si está anticoagulado por agentes de enlace de calcio como el citrato o EDTA, los niveles de dichos agentes deben de ser similares a aquellos utilizados en las pruebas de coagulación. En el primer aspecto de la presente invención mencionado anteriormente, se proporciona un método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra.
La medición se hace en comparación con plasmas de referencia que contienen cantidades conocidas de fosfolípido procoagulante y los valores desconocidos pueden ser interpolados de una gráfica de calibración construida de manera correcta. Como los fosfolípidos procoagulantes generalmente están localizados en las plaquetas activadas y micropartículas de plaquetas, se debe de tener en cuenta que la medición de la cantidad de fosfolípido procoagulante en un plasma rico en plaquetas de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, haría posible que se cuantificara la cantidad de plaquetas activadas y las micropartículas de plaquetas en la muestra. Por lo tanto, en el segundo aspecto mencionado. anteriormente, la presente invención proporciona un método para determinar la cantidad de plaquetas activadas y micropartículas derivadas de células en una muestra, de acuerdo con el método del primer aspecto de la presente invención. Como se indicó anteriormente, la activación anormal de plaquetas o celular puede dar como resultado episodios trombóticos, embolismo, trauma de tejidos, procesos inmunes (incluyendo la activación del complemento), sepsis, coagulación intravascular diseminada e infartos. En casos extremos o cuando debido a procesos inmunológicos se puede
tener como resultado la trombocitopenia. Podría ser provechoso poder determinar si un individuo tiene un padecimiento clínico que comprende la activación de plaquetas, por ejemplo, trombosis, paros cardíacos o infarto al miocardio. El inventor reconoce que un método para determinar la cantidad de plaquetas activadas o micropartículas de plaquetas, determinando la cantidad de fosfolípido procoagulante permitiría la diagnosis de esos individuos con dichas condiciones. Por lo tanto, en el tercer aspecto mencionado anteriormente, la presente invención comprende un método para evaluar si un paciente ha tenido recientemente un episodio trombótico, tal como una trombosis venosa profunda, embolismo o infartos, de acuerdo con el método del segundo aspecto de la presente invención. En el cuarto aspecto mencionado anteriormente, la presente invención proporciona un método para producir un plasma de substrato para utilizarlo para determinar si un individuo tiene fosfolípidos procoagulantes. El método comprende el tratamiento del plasma del substrato con una enzima para degradar el fosfolípido procoagulante lo suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse. El uso de una enzima en el método del cuarto aspecto de la presente invención, hace posible que se pueda controlar
un pane! de plasmas del substrato que comprenden cantidades definidas del fosfolípido procoagulante. Esto permite que se controle la sensibilidad de los métodos del primer y segundo aspectos de la presente invención, seleccionando del panel para utilizarlo un plasma del substrato que comprende una cantidad deseada de fosfolípido procoagulante. Esta opción proporciona un tiempo de coagulación de línea de base razonable u optimizado para un instrumento particular. Los venenos de víbora son particularmente útiles para proporcionar una enzima para utilizarse en el cuarto aspecto de la presente invención debido a que pueden ser utilizados en concentraciones muy bajas y su actividad puede ser controlada posteriormente, por ejemplo, mediante el uso de una fosfolipidasa efectiva contra el antisuero y anticuerpos. Sin embargo, deberá quedar entendido que pueden utilizarse agentes que tienen la capacidad para controlar las enzimas de fosfolipidasa derivadas de la tecnología de ADN recombinante o de otros organismos o compuestos inhibitorios. Por lo tanto, un paso adicional del método del cuarto aspecto de la presente invención, comprende poner en contacto el plasma del substrato con al menos una agente para controlar la capacidad de la enzima para degradar el fosfolípido procoagulante. También, en otra modalidad, el método del cuarto
aspecto comprende el paso adicional de mezclar el plasma del substrato con al menos una agente tal como Polibreno o sulfato de protamina para controlar la capacidad de un anticoagulante terapéutico, tal como la heparina para inhibir la coagulación. En el quinto aspecto mencionado anteriormente, la presente invención proporciona un plasma del substrato producido mediante el método del cuarto aspecto. En el sexto aspecto mencionado anteriormente, la presente invención proporciona un equipo para determinar si un individuo tiene fosfolípidos procoagulantes, comprendiendo el equipo: (i) un plasma del substrato el cual ha sido tratado con una enzima para degradar el fosfolípido lo suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse; (ii) un reactivo para activar la coagulación del plasma de una manera que depende del fosfolípido; (iii) preparaciones de referencia que contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante, en donde las preparaciones de referencia que contienen niveles conocidos del fosfolípido procoagulante pueden ser utilizadas como agentes de calibración para construir una gráfica de referencia. Breve Descripción de los Dibujos La presente invención se describe adicionalmente haciendo referencia a los dibujos en los cuales:
La figura 1 es una representación del efecto de incubar plasmas normales de diferentes especies con o sin el veneno de N nigrlcollis tal y como se describe en el Ejemplo 1; La figura 2 es una representación del efecto del tratamiento previo con veneno de N nigricolh's en la sensibilidad de la plaqueta; y La figura 3 es una representación de la sensibilidad de varias pruebas para el fosfolípido de plaqueta. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se describirá ahora haciendo referencia a los ejemplos siguientes, los cuales no deben de ser interpretados como que limitan el alcance de la misma. Ejemplo 1 Efecto progresivo del veneno de N nigricollis en plasmas crudos de animales Objetivo: Demostrar el efecto progresivo selectivo de la fosfolipidasa de un veneno típico para reducir el fosfolípido procoagulante de los plasmas que contienen plaquetas de diferentes especies, mejorando de esta manera la sensibilidad de esos plasmas del substrato en las pruebas de coagulación para el fosfolípido procoagulante. Método: Se recolectaron muestras de sangre en una décima de su volumen final de anticoagulante de citrato trisódico al 3.2% mediante una venipunctura limpia de un voluntario humano, mediante la puntura cardíaca de un caballo de
carreras fresco (equina) y mediante la sangre arterial de un cerdo en un mataderor y similarmente de un buey (bovino). Las muestras fueron centrifugadas a 3,000 rpm durante 20 minutos en plasmas deficientes de plaquetas sobrenadantes con cuentas bastante variables de plaquetas (aproximadamente 5 x 109 /L para la muestra humana, pero no medidas para los plasmas animales) y fueron congeladas a una temperatura de -30°C. Las muestras deficientes de plaquetas descongeladas fueron incubadas posteriormente a una temperatura de 37°C sin tratamiento o después de mezclarlas con el veneno de N nigricollis (NNV) en las concentraciones mostradas en la figura 1. Las muestras se quitaron en intervalos de 1 ó 2 horas y fueron probadas con un reactivo de factor Xa/calcio para la prueba XACT. Resultados: Estos se muestran en los resultados XACT de la figura 1 en todos los plasmas sin las adiciones de NNV que fueron razonablemente estables. No obstante, con el NNV presente, los resultados del XACT se prolongaron por el período de incubación. Los plasmas bovino y porcino dieron los resultados iniciales más cortos, probablemente debido al exceso de fosfolípido procoagulante libre, pero estos resultados se duplicaron ambos después de una incubación por 2 horas con 4 x 10-5 % y 8 x 10-5 % de NNV. El XACT en el plasma del
caballo se prolongó de 50 a 120 segundos después de 1 hora con un porcentaje de 2 x 10-5 % de NNV. Observaciones: Estos aumentos en los resultados XACT debidos a la incubación con NNV no fueron acompañados por cambios importantes en el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo de protrombina (PT) u otras pruebas de coagulación. Esto confirma que el efecto principal del NNV no fue debido a la degradación de los factores de coagulación comprendidos en estas pruebas de coagulación, sino más bien a la pérdida de fosfolípido para el cual no son sensibles estas pruebas. Ejemplo 2 Tratamiento previo de plasma humano con veneno de N nigricollis Objetivo: Mostrar que el tratamiento de un plasma humano normal con una traza de veneno de N nigricollis proporciona un producto (plasma del substrato), con una sensibilidad mejor a las plaquetas en una prueba de coagulación basada en el factor Xa que con la centrifugación. Método: Se prepararon pruebas de plasma que contienen niveles variables de plaquetas normales descongeladas-congeladas ricas en plasma (PRP inicialmente con 250 x 109 plaquetas/L), en plaquetas de plasma humano normal "libres". El plasma libre de plaquetas (PFP) fue obtenido mediante centrifugación a alta velocidad y filtración a través de un
filtro de jeringa de 0.22 mieras. Estas pruebas de los plasmas fueron mezcladas con un volumen igual de 3 plasmas del substrato diferentes después de ser probadas en una prueba de coagulación basada en el factor Xa. Los 3 plasmas del substrato diferentes fueron: 1. Plasma humano "deficiente" de plaquetas normales (PPP). 2. El mismo PPP centrifugado en 15,000g por 10 minutos. 3. El mismo PPP con un porcentaje de 1 x 10-5 % de veneno de N nigricollis durante 20 minutos a una temperatura de 37°C (en lo sucesivo "el tratamiento NNV"). El reactivo del factor Xa contenía 0.01 U/mL del factor Xa bovino en cloruro de calcio 0.015 M, cloruro de sodio 0.1M, regulador HEPES 0.02M, pH 7.0 y fue utilizado en una proporción de mezcla de 0.05mL de plasma con 0.1 mL del reactivo en una máquina de coagulación ST4 (Diagnostica Stago, Paris, Francia) a una temperatura de 37°C. Resultados: La Tabla 1 muestra los resultados del tiempo de coagulación del factor Xa en segundos en mezclas de 1:1 de plasmas de pruebas que contienen diferentes cuentas de plaquetas y plasma del substrato normales conjuntados (PNP) previamente tratados mediante dos métodos diferentes.
Tabla 1
Plasmas de Prueba Plasmas del Substrato
Observaciones: Estos experimentos muestran que el tratamiento NNV logró un aumento mayor en los resultados de tiempo de coagulación sobre aquellos obtenidos con la centrifugación de alta velocidad. Esto dio como resultado una mejora en la sensibilidad a las plaquetas. Ejemplo 3 Efecto de un tratamiento previo con veneno de N nigricollis en la sensibilidad de plaquetas Objetivo: Demostrar el objeto del veneno N nigricollis para mejorar la sensibilidad de un sistema de prueba de coagulación de veneno de víbora de Russell basado en el plasma bovino. Método: Se hicieron una serie de diluciones de plasma rico en plaquetas humanas normales descongeladas-congeladas, aunque de otra manera (con una cuenta inicial de plaquetas de 250 x 109/L) en el plasma bovino y también en el plasma bovino previamente tratado durante 50 minutos a una
temperatura de 20°C, con 5 x 10-5% de veneno de N nigricollis. Estas muestras de plasma fueron mezcladas con un volumen igual de diferentes venenos de víbora de Russell y reactivos que contienen calcio y programados para un punto final de coagulación en 37°C, en la modalidad de tiempo de trombina (la modalidad TT utiliza volúmenes iguales de plasma y reactivo) en un instrumento de programación de coagulación ACL300 (Instrumentation Laboratory SpA, Milán, Italia). La concentración del veneno de víbora de Russell en el reactivo con el cloruro de calcio 0.025M varió de 10-5 % a 10-6 % y el reactivo anterior también fue aprobado después de la adición de veneno de 2 x 10-4 % de N nigricollis. Resultados: Los resultados obtenidos se resumen en la figura 2. Se puede apreciar que la sensibilidad del sistema de prueba utilizando 1 x 10-5 % de RVV a las plaquetas fue bastante bajo, sin detenerse en niveles de plaquetas de bajos de tiempos de coagulación 1 x 109/L que fueron prolongados reduciendo en 10 dobleces de concentración de RVV a 10-6%, pero la sensibilidad de las plaquetas como lo muestra el gradiente de la curva de capacidad de respuesta, no fue mejorada. Incluyendo 20 x 10-5 % de NNV en el reactivo RVV (RVV= 10-5 %) se aumentó ligeramente la sensibilidad. Las sensibilidad más alta a las plaquetas fue observada cuando el plasma bovino había sido previamente incubado con 5 x 10-5 % de NNV antes de ser usado para diluirse el
concentrado de plaquetas. En este caso, las cuentas de plaquetas entre 0.1 y 1.0 podrían todavía ser cuantificadas de manera exacta. Ejemplo 4 Comparación de diferentes activadores de coagulación Objetivo: Comparar la sensibilidad de 4 activadores de coagulación diferentes dependientes del fosfolípido en un sistema de prueba para evaluar el fosfolípido procoagulante. Método: Se prepararon diluciones de plasma rico en plaquetas, en plasma humano normal libre de plaquetas, tal y como se muestra más adelante. Estas muestras fueron probadas con 4 sistemas de prueba de coagulación diferentes. Todas las pruebas se llevaron a cabo a una temperatura de 37°C en un ST4. Los reactivos y métodos fueron los siguientes: 1. Se llevaron a cabo pruebas de coagulación de caolina (KCT) utilizando muestras de plasma de 0.05 ml_ previamente incubadas con 0.05mL de una suspención de caolina al 1% en agua durante 3 minutos y luego recalcificadas con 0.05 ml_ de cloruro de calcio 0.025 M. El tiempo a partir de la adición del cloruro de calcio hasta la coagulación ocurrida fue determinado en una máquina de coagulación ST4 (Stago). 2. Se llevaron a cabo pruebas de Veneno de Víbora
de Russell (RVV) mezclando 0.05 ml_ de las muestras con 0.05 ml_ de un reactivo que contiene 2 x 10-6 % de RVV en cloruro de calcio 0.025M y tomando el tiempo hasta el punto final de coagulación. 3. Se llevaron a cabo pruebas de coagulación basadas en el factor Xa (FXa-CT) mezclando 0.05 ml_ de las muestras con 0.05 mL del reactivo que contiene 0.001 U/mL de factor Xa bovino en cloruro de calcio 0.025 M y tomando el tiempo hasta el punto final de coagulación. 4. Se llevaron a cabo pruebas de coagulación textarina (TM-Pentapharm, Basel, Suiza) (TX-CT) mezclando 0.05 mL de muestras con 0.05 mL de reactivo con un contenido de 2 U/mL de reactivo de textarina comercial deslipidado en cloruro de calcio 0.025 M y tomando el tiempo hasta un punto final de coagulación. Resultados: Los resultados obtenidos se muestran en la figura 3. Las pruebas RVVT y KCT mostraron sensibilidades similares a las plaquetas. La prueba de coagulación basada en el factor X activado (XACT) mostró la sensibilidad más alta a las plaquetas. La prueba con la sensibilidad más baja a las plaquetas fue la prueba basada en la textarina deslipidada. Sin embargo, es posible que esto pueda se haya debido a la remoción inadecuada del fosfolípido de este reactivo comercial que se pretendía para un propósito alternativo. Es decir, la detección de inhibidores de lupus.
Observaciones: El reactivo textarina es un activador de protrombina dependiente del fosfolípido típico derivado del veneno de Pseudonaja textil i s . uno de varios elápidos Australianos que es conocido que contienen dichos procoagulantes. Ejemplo 5 Uso típico del método y especificidad del estudio
Objetivo: Ilustrar que el método no es sensible a los defectos de todos los factores de coagulación conocidos. También detectar el fosfolípido procoagulante libre en diferentes plasmas que se consiguen comercialmente deficientes en factores de coagulación individuales. Método: Se probaron varios factores de coagulación individuales secados-congelados de plasmas deficientes comercializados para utilizarse en el ensayo del factor específico utilizando una nueva prueba para el fosfolípido procoagulante. Por lo tanto, los frascos de diferentes proveedores (Dade/Behring, IL/Beckman-Coulter y Diagnostica Stago) se reconstituyeron recientemente cada uno con 1 ml_ de agua. Las pruebas utilizaron 25 µ? de plasma del substrato tratado con NNV (lot 3004) con 25 µ? de cada plasma deficiente del factor y 50 µ? de un reactivo de factor Xa en una máquina de coagulación Stago ST4. Resultados: Estos resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Observaciones: Los plasmas deficientes de plaquetas congelados que fueron conjuntados produjeron un tiempo de coagulación FXa relativamente corto con el plasma normal libre de plaquetas, debido a que contenían aproximadamente el 5% de una cuenta normal de plaquetas (aproximadamente 10 x 109 plaquetas/L). Estos resultados muestran que la deficiencia total de cualquier factor de coagulación de plasma individual en una muestra de prueba, no prolonga la prueba FXa. También muestra que los plasmas deficientes de factor VIII, IX, y X aquí utilizados contienen cantidades apreciables de fosfolípido procoagulante que se puede detectar con esta prueba. Aplicabilidad Industrial Debe de ser claro que los métodos de la presente
invención encontrarán una aplicación amplia en la ciencia de laboratorio clínico. Lo anterior describe solamente algunas modalidades de la presente invención y se pueden hacer modificaciones obvias para los expertos en la técnica, sin salirse del alcance de la presente invención.
Claims (43)
- REIVINDICACIONES 1. Un método para determinar la cantidad de fosfolípido procoagulante en una muestra comprendiendo el método los pasos del (i) al (iii) realizados en el siguiente orden: (i) formar una mezcla de la muestra y un plasma del substrato el cual se ha presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante lo suficiente al menos para reducir la capacidad del plasma de substrato para coagularse, en donde el plasma del substrato ha sido presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante mediante el tratamiento con una fosfolípídasa. (¡i) poner en contacto la mezcla con un reactivo para activar la coagulación del plasma en condiciones en donde el fosfolípido procoagulante es la cantidad que limita el componente de la mezcla; (iii) determinar el tiempo de coagulación de la muestra.
- 2. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es seleccionada del grupo consistente de sangre, plasma y suero.
- 3. Un método tal y cómo se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la sangre es sangre anti.coagulada.
- 4. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque se hace la medición en comparación con plasmas de referencia o soluciones que contienen cantidades conocidas de fosfolípido procoagulante y valores desconocidos que pueden ser interpolados de una gráfica de calibración construida de manera correcta.
- 5. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el substrato del plasma es derivado de sangre citratada.
- 6. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el plasma del substrato es obtenido de un miembro seleccionado del grupo de animales vertebrados que consiste de cerdo, caballo, vaca, oveja, cabra, camello, mono, perro, gato, zorro, elefante, llama, conejo, mink, mapache, canguro, humano y mezclas de los mismos.
- 7. El método tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el plasma del substrato es obtenido de una fuente que no es humana.
- 8. El método tal y como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el plasma del substrato es obtenido de cerdos.
- 9. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolipidasa es obtenida de un veneno seleccionado del grupo consistente de Naja nigricollis, Agkistrodon halys, Vípera Berus, Vípera Russeli, Crotalus durissus, Enhyrdrina schistose, Oxyuranus scuteliatus y Apis mellifera.
- 10. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la fosfolípidasa es obtenida de uno seleccionado del grupo consistente de especies Steptromyces violaceoruber, Vibrio, Clostridium perfringens, ó Bacillus cereus.
- 11. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo para activar la coagulación del plasma es el factor Xa.
- 12. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo para activar la coagulación del plasma tiene la capacidad de convertir el factor X en factor Xa.
- 13. El método tal y como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque el reactivo es un Veneno de Víbora de Russeli.
- 14. El método tal y como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque el reactivo es un activador del factor X de un veneno de una familia viperidae.
- 15. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo para activar la coagulación del plasma tiene la capacidad de convertir la protrombina en trombina.
- 16. El método tal y como se describe en I reivindicación 15, caracterizado porque la conversión de protrombina a trombina es de una manera dependiente del fosfolípido.
- 17. El método tal y como se describe en la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque el reactivo es un activador de protrombina dependiente de fosfolípido derivado de los venenos de elápidos.
- 18. El método tal y como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el veneno elápido es de cobra Australiana, de la familia Pseudonaja u Oxyuranus scutellatus.
- 19. Un método para terminar la cantidad de plaquetas activadas y las micropartículas derivadas de células en una muestra, comprendiendo el método los pasos del (i) al (iii) realizados en el siguiente orden. (i) formar una mezcla de la muestra y un plasma del substrato el cual ha sido presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante lo suficiente para reducir al menos la capacidad del plasma del substrato para coagularse; (ii) poner en contacto la mezcla con un reactivo para activar la coagulación del plasma en condiciones para permitir que el fosfolípido procoagulante coagule la mezcla; y (iii) determinar el tiempo de coagulación de la mezcla.
- 20. Un método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el método determina si el paciente ha tenido un episodio trombótico reciente.
- 21. Un método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el método determina si un paciente ha tenido un padecimiento clínico que comprende la activación de plaquetas.
- 22. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el episodio trombótico es seleccionado del grupo consistente de coagulación intravascular diseminada, trombosis de la vena profunda, embolismo, trauma de tejidos, sepsis e infarto.
- 23. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el plasma del substrato ha sido presentado libre o substancialmente libre de fosfolípido procoagulante mediante el tratamiento con una fosfolipidasa.
- 24. El método tal y como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque la fosfolipidasa es obtenida del veneno seleccionado del grupo consistente de Naja mossambica, Naja nigricollis, Ag istrodon halys, Vípera Berus, Vípera Russeli, Crotalus durissus, Enhyrdrina schistose, Oxyuranus scullatus y Apis mellifera.
- 25. El método tal y como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque la fosfolipidasa es obtenida de una de un grupo seleccionado de especies Steptromyces violaceoruber, Vibrio, Clostridium perfringens ó BaciUus cereus.
- 26. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el reactivo para activar la coagulación del plasma es el factor Xa.
- 27. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el reactivo para activar la coagulación del plasma tiene la capacidad de convertir el factor X en factor Xa.
- 28. El método tal y como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque el reactivo es un Veneno de Víbora de Russell.
- 29. El método tal y como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque el reactivo es un activador del factor X de un veneno de la familia viperidae.
- 30. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el reactivo para activar la coagulación del plasma tiene la capacidad de convertir la protrombina en trombina.
- 31. El método tal y como se describe en la reivindicación 30, caracterizado porque la conversión de protrombina a trombina es de una manera dependiente del fosfolípido.
- 32. El método tal y como se describe en la reivindicación 30 ó 31, caracterizado porque el reactivo es un activador de protrombina dependiente del fosfolípido derivado de venenos elápidos.
- 33. El método tal y como se describe en la reivindicación 32, caracterizado porque el veneno de elápido es de cobra Australiana de la familia Pseudonaja u Oxyuranus scutellatus.
- 34. El método tal y como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el plasma del substrato ha sido formado de factores V y protrombina.
- 35. El método tal y como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque los factores V y la protrombina están libres de fosfolípidos.
- 36. El método tal y como se describe en la reivindicación 34, caracterizado porque los factores V y la protrombina son de origen animal o humano.
- 37. El método tal y como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque el plasma del substrato del método se pone en contacto con al menos un agente para controlar la capacidad de la enzima para degradar el fosfolípido procoagulante.
- 38. El método tal y como se describe en la reivindicación 37, el cual comprende además el paso de mezclar el plasma del substrato con al menos un agente para controlar la capacidad de un anticoagulante terapéutico para inhibir la coagulación.
- 39. El método tal y como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque el agente para controlar la capacidad del anticoagulante terapéutico para inhibir la coagulación es Polibreno o sulfato de protamina.
- 40. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 39, caracterizado porque el plasma del substrato es obtenido de un miembro seleccionado del grupo consistente de cerdo, caballo, vaca, oveja, cabra, camello, mono, perro, gato, zorro, elefante, llama, conejo, mink, mapache, canguro, humano y mezclas de los mismos.
- 41. Un método para producir un plasma del substrato para utilizarlo en la determinación del nivel de fosfolípidos de procoagulante en una muestra, comprendiendo el método tratar el plasma del substrato con una fosfolipidasa para degradar el fosfolípido procoagulante de manera suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse.
- 42. Un plasma del substrato producido por medio del método tal y como se describe en la reivindicación 41.
- 43. Un equipo para determinar el nivel de fosfolípido procoagulante en una muestra, comprendiendo el equipo: (i) un plasma del substrato el cual ha sido tratado con fosfolipidasa para degradar el fosfolípido lo suficiente para al menos reducir la capacidad del plasma del substrato para coagularse; (ü) un reactivo para activar la coagulación del plasma de una manera dependiente del fosfolípido; y (iii) preparaciones de referencia que contienen niveles conocidos de fosfolípido procoagulante.
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