ES2299224T3 - Reactivo de tiempo de protombina, presto para el uso, sobre la base de factor tisular recombinante. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN REACTIVO DE TIEMPO DE PROTROMBINA ESTABLE EN ALMACENAMIENTO Y LISTO PARA UTILIZARSE A BASE DE FACTOR TISULAR RECOMBINANTE, Y SU UTILIZACION EN ENSAYOS DE COAGULACION.

Description

Reactivo de tiempo de protrombina, presto para el uso, sobre la base de factor tisular recombinante.

El presente invento se refiere a un reactivo de tiempo de protrombina, estable a largo plazo, presto para el uso, sobre la base de un factor tisular recombinante y a su utilización en ensayos de coagulación.

El tiempo de protrombina (PT de Prothrombin Time) es el ensayo de escrutinio más habitual en el sector del diagnóstico de la coagulación. En este caso, se mezcla el plasma de un paciente con un reactivo, que contiene por lo menos un factor tisular, fosfolípidos y calcio. El factor tisular se puede aislar a partir de tejidos o se puede preparar por medios recombinantes (Hoppenstaedt, D.A. y colaboradores (1995) Lab.Med. 26(3), 198-203); esta proteína activa a la vía extrínseca de reacción de la coagulación. El tiempo de coagulación medido depende de la concentración de los factores de coagulación II, V, VII y X. La evaluación del PT se efectúa en segundos de tiempo de coagulación o en relaciones internacionales normalizadas (INR de Internationalen Normierten Ratios). La INR se calcula como PR^{ISI}, siendo la relación de protrombina PR (de Prothrombin Ratio) el cociente del tiempo de coagulación de la muestra y de un tiempo de coagulación normal medio, y el índice internacional de sensibilidad ISI (de International Sensitivity Index) es una constante, que depende del reactivo y del aparato de medición utilizado. La sensibilidad de un reactivo es tanto mayor cuanto más pequeña numéricamente sea la ISI. Un ISI comprendido entre 0,9 y 1,2 proporciona una sensibilidad óptima para trastornos del sistema extrínseco. Unos valores del ISI todavía menores conducen a unos tiempos de coagulación extremadamente largos, situados en el intervalo patológico, que para muchos sistemas ya no se pueden medir bien.

El PT se emplea:

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como ensayo de escrutinio para el sistema extrínseco de coagulación

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para el control de la anticoagulación oral

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para el diagnóstico de enfermedades hepáticas.

Usualmente, la mayoría de los reactivos de PT, que son obtenibles, se ofrecen en una forma liofilizada y son reconstituidos antes de su uso con un medio de reconstitución (por regla general agua destilada o una solución salina). El motivo de esto es la deficiente estabilidad de los reactivos en el estado líquido.

Adam y Eberhard (véase el documento de patente de los EE.UU. US 3.522.148) describen un reactivo de tromboplastina líquido sobre la base de una tromboplastina de cerebro de conejo. Acerca de la sensibilidad del reactivo no se proporciona ningún tipo de información.

Butler y colaboradores (véase el documento US 5.385.853) describen la preparación de un reactivo de PT a base de una tromboplastina de cerebro de conejo. Son conformes al invento la adición de un poli(etilenglicol) (PEG) y la utilización de gluconato de calcio como fuente de calcio y gentamicina como agente antimicrobiano. El valor de ISI alcanzado es, con en promedio 2,0, no obstante muy alto; esto corresponde a una sensibilidad insuficientemente baja del reactivo.

Brown (véase el documento US 5.314.695) describe la preparación de un reactivo PT sobre la base de un factor tisular natural o recombinante. Mediante la adición de determinadas mezclas de fosfolípidos se preparan unos reactivos de PT sensibles, que, sin embargo, para su almacenamiento, son liofilizados de manera preferida.

Dos reactivos líquidos de tromboplastina se pueden obtener en el mercado, uno de la entidad Pacific Hemostasis (EE.UU.), y el otro de la entidad Diamed (Basilea, Suiza). Ambos reactivos están basados en una tromboplastina de cerebro de conejo, tienen una pequeña sensibilidad (ISI > 1,6) y tienen un período de tiempo de validez de 1 mes o respectivamente 1 año.

En el mercado se encuentran tres reactivos de PT recombinantes diferentes. Todos ellos son muy sensibles (un ISI de aproximadamente 1,0) y son ofrecidos en una forma liofilizada.

Ya se han descrito, por consiguiente, los siguientes procedimientos:

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reactivos de tromboplastina liofilizados convencionales

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reactivos de tromboplastina de cerebro de conejo, prestos para el uso, convencionales, que tienen una pequeña sensibilidad

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reactivos de tromboplastina liofilizados recombinantes, que tienen una alta sensibilidad.

Con los procedimientos conocidos hasta ahora no se ha conseguido todavía hasta ahora estabilizar a una tromboplastina recombinante de tal manera, que ésta se pueda emplear en un reactivo líquido.

La misión que constituye el fundamento del presente invento consistió, por lo tanto, en poner a disposición una formulación líquida, estable a largo plazo, de un reactivo de tromboplastina recombinante. Un reactivo de este tipo es extraordinariamente ventajoso para el laboratorio de coagulación, puesto que combina las ventajas de la fácil manejabilidad (presteza para el uso) con las ventajas de la alta sensibilidad y la buena reproducibilidad.

Sorprendentemente, se ha encontrado que una combinación de un agente antioxidante en una concentración alta con una albúmina de suero, asimismo en una concentración alta, es satisfactoria, mientras que los estabilizadores individuales no son lo suficientemente eficaces. Especialmente ventajosa es la combinación de ácido ascórbico con una albúmina de suero humano, en cada caso en una concentración milimolar. Una concentración menor de una de las sustancias conducía a una estabilidad en cada caso menor.

Para la utilidad de un reactivo de este tipo es decisiva la estabilidad a aproximadamente 4ºC. Es ventajosa una estabilidad de por lo menos 12 meses a 4ºC, es especialmente ventajosa una estabilidad de por lo menos 18 meses, y es muy especialmente ventajosa una estabilidad de por lo menos 24 meses.

Como estabilidad se define aquí la constancia en el tiempo del resultado de la medición para la determinación del PT de un plasma definido, p.ej. de un plasma normal. El resultado de la medición se considera como constante, cuando disminuye en menos de un 10, preferiblemente en menos de un 5%.

A fin de obtener una información rápida acerca de la estabilidad a 4ºC, en la práctica se acredita como más favorable someter a los reactivos primeramente a una carga de estrés a 37ºC.

La estabilidad de un material biológico se puede estimar a partir de estos experimentos de carga. Es válida la ecuación:

(1)A_{t} = A_{o} e^{-kt}

con A_{t} = actividad en el momento t, A_{o} = actividad al comienzo, t = tiempo y k = constante de la velocidad de degradación. La constante k depende de la temperatura. En una aproximación es válida la ecuación de Arrhenius:

(2)log k = const 1 + [const 2/T]

con T = temperatura absoluta.

En la práctica la estabilidad se estima aproximadamente a 4ºC mediante un experimento de carga, aproximadamente a 37ºC. Como estable se consideraba aproximadamente una formulación, cuya actividad ha disminuido en menos de un 5%. Para el correspondiente período de tiempo se realiza, tras haber transformado la ecuación (1); en cada caso que:

(3)ln (A_{t}/A_{o}) = ln 0,95 = -k t = -k_{37^{o}} t_{37^{o}} = -k_{4^{o}} t_{4^{o}}

o respectivamente

(4)t_{4^{o}}/t_{37^{o}} = k_{37^{o}}/lk_{4^{o}}

El tiempo de validez a una temperatura determinada es, por lo tanto, inversamente proporcional a la constante k a esta temperatura.

Para la magnitud relativa de las constantes de velocidad a diferentes temperaturas se ha acreditado la regla empírica, de que un aumento de la temperatura de 10º conduce a una duplicación de las constantes de velocidad. No existen todavía investigaciones comparativas acerca de la estabilidad de tromboplastinas líquidas a diferentes temperaturas. En un caso comparable (del factor de la coagulación IX líquido) se realizaron observaciones de las constantes de la velocidad de degradación a diferentes temperaturas por Kirkwood (Kirkwood, T.B.L.(1995) Biometrics 33, 736-742). Él encontró las siguientes constantes:

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En este ejemplo, la relación de las constantes k_{37^{o}}/k_{4^{o}} es, por lo tanto, de aproximadamente 30. Esto significa que la estabilidad de la formulación a 4ºC es treinta veces mayor que la estabilidad a 37ºC. Esto quiere decir que la estabilidad determinada en días a 37ºC corresponde a la estabilidad a 4ºC en meses.

Para los reactivos de tiempo de tromboplastina, preparados conforme al invento, existen datos de carga a 37ºC (véase el Ejemplo 3). En el caso de una carga a 37ºC no se pudo detectar durante un período de tiempo de 30 días ninguna disminución de la actividad. De acuerdo con las consideraciones señaladas antes, se puede estimar, por lo tanto, una estabilidad de la formulación a 4ºC de por lo menos 30 meses.

No obstante, para un reactivo de PT es decisiva no sólo la estabilidad sino también fundamentalmente la sensibilidad. Es indeseado que una estabilidad eventualmente alta se tenga que adquirir a costa de una pérdida de sensibilidad. En el caso del procedimiento conforme al invento se pudo ajustar un valor de ISI de aproximadamente 1,0, que es considerado por los expertos como una expresión de la sensibilidad óptima.

Los siguientes Ejemplos han de ilustrar el invento.

Ejemplo 1 Preparación de un reactivo de tiempo de protrombina

1 parte de Triton-X 100 al 20% se mezcla con 12 partes de una suspensión de fosfolípidos al 10% (Phospholipon 25 P, de Nattermann, Alemania) y 6 partes del factor tisular humano, recombinante, purificado, procedente de E. coli (aproximadamente 2 mg/ml, de Behring Diagnostics, Alemania). Después de una incubación durante dos horas a la temperatura ambiente para la relipidización, se diluye la tanda con un exceso de 500 veces del tampón. El tampón se compone de 50 mM de HEPES, de pH 7,0, 100 mM de glicina y 13 mM de cloruro de calcio, y contiene adicionalmente los siguientes estabilizadores:

2 mM

de ácido ascórbico

1%

de manita

1%

de albúmina de suero humano (de Behring Diagnostics, Alemania).

Ejemplo 2 Curva de referencia de la INR de un reactivo de tiempo de protrombina

Se preparó un reactivo de acuerdo con el Ejemplo 1. En el medidor del tiempo de coagulación, Behring Coagulation Timer (de Behring Diagnostics) se determinaron los tiempos de coagulación para los plasmas de calibración AK (de Immuno, Austria). Se trata de plasmas de Marcumar liofilizados con un valor de INR declarado.

A partir de los datos se pueden estimar el MNPT y el ISI (véase la Fig. 1).

Ejemplo 3 Estabilidad de un reactivo de tiempo de protrombina

El reactivo 1 se preparó de acuerdo con el Ejemplo 1. El reactivo 2 contiene, desviándose del Ejemplo 1, sólo 0,1% de albúmina de suero humano. El ISI se determinó de acuerdo con el Ejemplo 2.

Los reactivos se cargaron a 37ºC. En el transcurso del tiempo se extrajeron muestras y se determinó el tiempo de protrombina de un plasma normal liofilizado y de un plasma patológico liofilizado (plasma humano patrón y patoplasma II, de la entidad Behring Diagnostics) en el Behring Coagulation Timer (véase la Fig. 2).

Claims (10)

1. Formulación líquida de un reactivo de tiempo de protrombina sobre la base de un factor tisular recombinante, caracterizada porque contiene por lo menos un agente antioxidante y adicionalmente una albúmina de suero.

2. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se añade ácido ascórbico como agente antioxidante.

3. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque se utiliza ácido ascórbico en una concentración de 1 \muM a 0,1 M.

4. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la albúmina de suero es de origen humano, animal o recombinante.

5. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la albúmina de suero es de origen humano.

6. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque la albúmina de suero humano se añade en una concentración de 0,1 g/l a 100 g/l.

7. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor tisular recombinante utilizado, es de origen humano o animal.

8. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque se trata de un factor tisular recombinante humano.

9. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el factor tisular se clona y expresa en células de origen humano, animal, vegetal, fúngico o microbiano.

10. Reactivo de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula anfitriona es Escherichia coli.