ES2231915T3 - Aumento de la sensibilidad al f vii de un reactivo de tromboplastina. - Google Patents
Aumento de la sensibilidad al f vii de un reactivo de tromboplastina.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA INCREMENTAR LA SENSIBILIDAD F VII DE UN REACTIVO DE TROMBOPLASTINA GRACIAS A UN TRATAMIENTO TERMICO.
Description
Aumento a la sensibilidad al F VII de un reactivo
de tromboplastina.
El presente invento se refiere a un procedimiento
para aumentar la sensibilidad al F VII de un reactivo de
tromboplastina, tal como se define en las reivindicaciones 1, 9, 11
y 13.
El tiempo de tromboplastina de acuerdo con Quick
(PT) se emplea como ensayo de búsqueda para un defecto de factores
de coagulación en la sangre de pacientes. Asimismo, el PT se emplea
para la vigilancia de la terapia con agentes anticoagulantes orales.
El PT preferido para donantes normales de sangre está situado en
10-14 segundos. El PT preferido para plasmas con
defecto en factor VII debería ser mayor que 60 segundos. La
sensibilidad al F VII es definida por lo tanto como la relación
entre el tiempo de coagulación del plasma con defecto en F VII y el
tiempo de coagulación de donantes normales de sangre.
El invento describe un procedimiento para
aumentar la sensibilidad al factor VII de reactivos de
tromboplastina, en el que se prolonga el PT para plasmas con defecto
en factor VII, sin modificar esencialmente el PT para plasmas
normales.
La tromboplastina activa provoca la coagulación
en el plasma, y consta de un componente lipídico y de un componente
proteínico. La proteína, el factor tisular, está fijada a membranas
y se encuentra en muchos tejidos diferentes. La fijación entre la
proteína y el lípido se basa en interacciones hidrófobas y es
independiente del Ca^{2+}. La parte proteínica consta de una
glicoproteína con un peso molecular de 43-53 kDa.
Una molécula de factor tisular puede fijar a una molécula de F VII o
F VIIa. La fijación de F VII / F VIIa a un factor tisular es
dependiente del Ca^{2+}. El complejo de un lípido, un factor
tisular y el F VIIa disocia al F X para dar el F Xa y provoca, por
consiguiente, finalmente la coagulación a través de la activación de
protrombina.
La iniciación de la coagulación en un plasma a
los 10 hasta 14 s (segundos) después de la adición de un reactivo de
tromboplastina indica un sistema intacto de coagulación. Un tiempo
prolongado de coagulación apunta a la existencia de una
perturbación. Pueden aparecer perturbaciones por causa de
concentraciones demasiado pequeñas de uno o varios factores de
coagulación. Los reactivos de tromboplastina de diverso origen se
diferencian con frecuencia en su sensibilidad para indicar el
defecto de determinados factores. Esto puede ser debido en parte a
arrastres de pequeñas cantidades de los factores que se han de
determinar en el reactivo. Procedimientos habituales para la
eliminación específica de pequeñas cantidades de proteínas son,
entre otros, la inmunoadsorción, o, en el caso de los factores de
coagulación dependientes de la vitamina K, tales como los F II, VII,
IX y X, la adsorción a sulfato de bario (documento de solicitud de
patente internacional WO 90/05740). En el caso de reactivos de
origen humano, con frecuencia no es suficiente solamente la
sensibilidad en lo referente al F VII.
Factores esenciales de la cascada de coagulación
son las proteasas: factores VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa, calicreína
plasmática y trombina.
Las desventajas de los procedimientos descritos
hasta ahora consisten, por una parte, en que el F VII se fija a un
factor tisular y por lo tanto mediante un procedimiento de adsorción
de este tipo se reduce el rendimiento de factor tisular, y, por otra
parte, en el hecho de que ambos procedimientos, en particular a la
escala de producción, exigen un considerable esfuerzo de aparatos y
tiempo.
En el presente invento se muestra que, de modo
sorprendente, es posible inhibir selectivamente en condiciones
definidas la actividad remanente de F VII del reactivo, y por
consiguiente llegar de una manera sencilla al resultado deseado, sin
perjudicar al factor tisular ni a otros factores de la cascada de
coagulación. La relación entre el tiempo de coagulación, designada
como sensibilidad al F VII, del plasma con defecto en F VII y el
tiempo de coagulación de un plasma normal es de manera preferida
> 4, de manera especialmente preferida > 6 y de manera muy
especialmente preferida > 10.
El factor VIIa posee una actividad de proteasa y
pertenece a la clase de las serina proteasas, tales como los demás
factores de coagulación IXa, Xa, XIa, XIIa, calicreína plasmática y
trombina. Estos factores de coagulación tienen en común además el
hecho de que en primer término se presentan como forma zimógena y de
que para el desarrollo de la actividad de proteasa se deben disociar
enlaces proteínicos.
Se han descrito en gran número agentes
inhibidores de proteasas, que inhiben por lo menos a las formas
activas de estos zimógenos, tales como p.ej. la trombina (W.B.
Lawson y colaboradores 1982, Folia Haematol. Leipzig 109 (1982) 1,
páginas 52-60). A ellos pertenecen fluoruros de
sulfonilo, tales como fluoruro de
fenilmetil-sulfonilo (PMSF), fluoruro de
p-aminoetil-benceno-sulfonilo
(AEBSF), fluoruro de
4-amino-fenil-metano-sulfonilo
(p-APMSF), fluorofosfatos orgánicos tales como
fluorofosfato de diisopropilo (DFP),
clorometil-cetonas, así como también péptidos tales
como leupeptina o proteínas de la familia de las serpinas, tales
como el agente inhibidor de C1, antitrombina III y aprotinina.
Los agentes inhibidores de proteasas tienen la
desventaja de que inhiben no solamente a los factores F VII o F VIIa
arrastrados en el PT sino también a los factores de coagulación IXa,
Xa, XIa, XIIa, calicreína plasmática y trombina en la muestra que se
ha de determinar. Con ello prolongarían el tiempo de coagulación y
simularían un valor patológico. Es de esperar, por lo tanto, que
estos agentes inhibidores no sean apropiados para emplearse en un
reactivo de PT. Sorprendentemente, estos agentes inhibidores se
pueden emplear en determinadas condiciones, sin que se prolonguen
los tiempos de coagulación de la muestra, pero a pesar de todo se
mejore la sensibilidad al F VII del reactivo.
Una posibilidad adicional de inhibir la actividad
enzimática de una proteína, consiste en la producción de anticuerpos
específicos, que inhiban al centro activo de la proteína. Son
obtenibles diferentes anticuerpos contra el factor de coagulación
VII, de los cuales por lo menos un anticuerpo policlonal inhibe a la
actividad enzimática de los F VII / F VIIa. La simple adición del
anticuerpo a un reactivo de PT debería ser desventajosa, puesto que
el anticuerpo inhibe también a los F VII / F VIIa de la muestra. En
el presente invento se muestra que, de manera sorprendente, existe
un intervalo de concentraciones para la adición del anticuerpo anti
- F VII, en el que no se prolonga el tiempo de coagulación de un
plasma normal, pero se aumenta manifiestamente, sin embargo, el
tiempo de coagulación de un plasma con defecto de F VII y por
consiguiente se aumenta manifiestamente la sensibilidad al F VII
del
reactivo.
reactivo.
Ya se ha descrito también que las serina
proteasas se pueden inhibir por oxidación (S.E. Lind y colaboradores
1993, Blood 82, 5 15522-1531). Este procedimiento,
junto a la desventaja de que son inhibidas las serina proteasas de
la cascada de coagulación en la muestra, tiene la desventaja de que
adicionalmente se pueden oxidar los ácidos grasos de los
fosfolípidos (Dasgupta A. y colaboradores Live Science 1992, 50,
875-882). Los productos de oxidación resultantes en
tal caso inhiben asimismo al PT (T. W. Barrowcliffe y colaboradores,
1975, Thrombos. Diathes. Haemorrh. 33,
271).
271).
Sorprendentemente, los procesos de oxidación se
pueden controlar sin embargo de tal manera que se puedan despreciar
las reacciones secundarias indeseadas, es decir que no se prolongue
el tiempo de coagulación de los plasmas normales pero se mejore la
sensibilidad al F VII del reactivo. Como agentes de oxidación son
apropiados un hipoclorito, peróxido de hidrógeno, un permanganato y
dióxido de manganeso. Muchos antioxidantes tales como p.ej. ácido
ascórbico, tioles, tales como p.ej. glutatión,
acetil-cisteína, ditiotreitol y tocoferoles así como
derivados de tocoferoles, tales como p.ej.
di-terc.-butil-p-hidroxianisol
(BHA),
di-terc.-butil-p-cresol
(BHT), Trolox y galato de propilo, están en situación de actuar de
manera oxidante en presencia de iones metálicos. A los iones
metálicos, que catalizan la oxidación, pertenecen en particular
hierro, cobre y zinc. La oxidación catalizada por metales es
especialmente apropiada para inhibir las actividades remanentes de
los F VII / F VIIa.
El procedimiento del presente invento aprovecha
procedimientos sencillos para el tratamiento térmico del extracto
tisular de una manera selectiva sin limitarnos con ello a un
determinado mecanismo de reacción, la eficacia del procedimiento se
podría explicar por el hecho de que mediante el tratamiento térmico
específico se suprimen las actividades remanentes de los F VII / F
VIIa. El tratamiento térmico se lleva a cabo de manera ventajosa
durante breve tiempo a altas temperaturas.
A bajas temperaturas, comprendidas entre +40 y
+60ºC, la desactivación de las actividades de F VII es dependiente
de una serie de factores, que en parte son imposibles de controlar,
entre otros de las dimensiones y de la conductibilidad térmica del
recipiente empleado y de la solución empleada. El tiempo de
calentamiento puede variar asimismo en gran manera. La temperatura
de calentamiento está situada ventajosamente entre +65ºC y +160ºC,
de manera preferida entre +80ºC y +140ºC, de manera especialmente
preferida entre +90 y +120ºC.
Para que el líquido aportado sea calentado en el
transcurso de un tiempo lo más corto que sea posible a la respectiva
temperatura de calentamiento y a continuación se pueda enfriar de
nuevo en un tiempo comparablemente breve, la instalación, en la que
se calienta, está equipada convenientemente con por lo menos sendas
conexiones para los medios de calefacción y enfriamiento. La
instalación consta ventajosamente de tres zonas o tramos: un tramo
de calentamiento, en el que el reactivo es calentado a la
temperatura necesaria, un tramo de retención, en el que el reactivo
es retenido durante un determinado tiempo a esta temperatura, y un
tramo de enfriamiento, en el que el reactivo es enfriado de nuevo a
una baja temperatura.
La estructuración constructiva de los
transmisores de calor deberá ser tal que resulte lo más pequeña
posible la diferencia entre la temperatura de calentamiento para la
solución y la temperatura del medio de calentamiento, lo cual a
causa de la pequeña sobretemperatura, resultante de ello, de la
pared que entra en contacto con el producto, tiene como consecuencia
la mayor protección posible del producto.
De modo preferido, se describe un procedimiento
para el calentamiento continuo en breve tiempo, tal como en el
documento de solicitud de patente europea
EP-A-0571771, para la desactivación
de virus.
Los tiempos de calentamiento y/o enfriamiento
deberían ser en cada caso menores que 30 segundos, pero de manera
preferida menores que 5 segundos. El tiempo de retención puede estar
situado entre 0,1 y 30 segundos, pero de modo preferido entre 0,5 y
20 segundos.
En el siguiente Ejemplo se muestra la
desactivación de las actividades remanentes de los F VII / F VIIa,
por calentamiento sin restricción del invento, en el ejemplo de un
extracto de placenta humana, tal como se emplea para un reactivo de
Quick que contiene tromboplastina tisular, de la entidad
Behringwerke AG (Thromborel S, nº de producto OUHP). Ventajosamente,
el reactivo se mezcla con agentes de conservación, antioxidantes,
hidratos de carbono, proteínas, aminoácidos y combinaciones de estos
productos como estabilizadores. Son especialmente apropiados en las
clases de sustancias individuales, los siguientes compuestos:
Agentes de conservación:
Mergal, aziduro de sodio, fenol, anfotericina,
gentamicina, piperacilina, ciprofloxacina.
Antioxidantes:
Di-terc.-butil-p-hidroxianisol
(BHA),
di-terc.-butil-p-cresol
(BHT), espermina, galato de propilo, tocoferoles, Trolox,
ditioeritreíta, glutatión.
Hidratos de carbono:
Trehalosa, sacarosa, Tylose, manita, goma de
xantano, Phytagel, carragenano, poli(etilenglicol).
Proteínas:
Lactoglobulina, lipoproteínas y albúminas tales
como p.ej. albúmina de suero, lactoalbúmina, ovalbúmina,
Aminoácidos:
Acetil-cisteína,
acetil-metionina, glicina, lisina, histidina,
serina.
Los siguientes Ejemplos explican el invento:
Etapa
a)
Se mezcló el Thromborel S Bulkware (material a
granel) con 1,25 ml de una solución para estabilización y se
completó hasta 10 ml. Se vertió en cada caso 1 ml de Thromborel (a
7ºC) en recipientes de reacción con una capacidad de 1,5 ml y se
incubó en un baño de agua a 56ºC durante un período de tiempo de
diversa duración y a continuación se enfrió sobre hielo.
Etapa
b)
A continuación se determinó el tiempo de
tromboplastina (PT) de acuerdo con Quick con un aparato de Schnitger
& Gross, de la siguiente manera:
- -
- Se calientan a 37ºC los reactivos y tubitos
- -
- Se disponen previamente en los tubitos 100 \mul de plasma testigo N o plasma con defecto en F VII
- -
- Se incuba durante 1 min. en un bloque térmico;
- -
- Se añaden 200 \mul de tromboplastina y al mismo tiempo se inicia el proceso de medición; se agitan los tubitos durante un breve período de tiempo, se colocan en el sitio de medición del aparato de Schnitger & Gross y se introduce el soporte de electrodos hasta llegar al tope;
- -
- se lee el tiempo de coagulación.
Los tiempos de coagulación leídos se exponen en
la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó el Thromborel S Bulkware a unas
temperaturas de 60ºC a 80ºC con un tiempo de permanencia de 2,05 s
(véase la Tabla 2).
El tiempo de coagulación se determinó tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1, etapa b).
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó el Thromborel S Bulkware a unas
temperaturas de 75ºC a 95ºC con un tiempo de permanencia de
0,5-2,05 s (véase la Tabla 3).
El tiempo de coagulación se determinó tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1, etapa b).
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó el Thromborel S, preparado de acuerdo
con el procedimiento de los Ejemplos 1a) - 1b), a unas temperaturas
de 65ºC y respectivamente 75ºC con un tiempo de permanencia de 2 -
16 s (véase la Tabla 4).
El tiempo de coagulación se determinó tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1, etapa b).
Se calentó el Thromborel S, preparado de acuerdo
con el procedimiento en los Ejemplos 1a) - 1b), a una temperatura de
90ºC con un tiempo de permanencia de 3-18 s (véase
la Tabla 4).
El tiempo de coagulación se determinó tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1, etapa b).
Se calentó el Thromborel S Bulkware a una
temperatura de 120ºC con un tiempo de permanencia de 0,5 a 1,5
s.
El tiempo de coagulación se determinó con el
medidor del tiempo de coagulación de Behring con el método P.T.sec
Thromborel S.
Se calentó el Thromborel S Bulkware a una
temperatura de 85ºC con un tiempo de permanencia de 3 s. El
Thromborel S obtenible comercialmente y el Thromborel calentado
(TB-190) se compararon con ayuda de diferentes
muestras.
El tiempo de coagulación se determinó tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1, etapa b).
| PT 100: | Plasma humano patrón | Ch. B.: 502556 (98% d. N.) |
| Ktrl. P: | Plasma testigo P | Ch. B.: 512628 |
| MACI: | Plasma Marcumar I. | Ch. B.: 951201 |
| MACII: | Plasma Marcumar II. | Ch. B.: 951202 |
| PATH-I: | Pathoplasma I. | Ch. B.: 502883 |
| PATH-II: | Pathoplasma II. | Ch. B.: 502973 |
| F VII: | Plasma con defecto en factor VII | Ch. B.: 500756 |
1 UI./ml de Hep: plasma humano patrón aumentado
de concentración con 1 UI/ml de heparina
MAC-02 y MAC-03:
agrupaciones de plasmas de pacientes anticoagulados por vía oral
50% F VII, 2% F VII: diluciones de un plasma con
defecto en F VII en un plasma humano patrón.
PT 16,75: plasma humano patrón diluido a 16,75%
en una solución fisiológica de NaCl
d. N: % de la norma (estimación con la siguiente
relación:
C_{x}=(PT_{16,75%}-PT_{100%})/(4,97\text{*}PT_{x}4\text{*}PT_{100%}+PT_{16,75%})
ISI: Índice de sensibilidad internacional:
PR: PT _{(plasma \ Marcumar)}/PT_{(plasma \
humano \ patrón)}
ISI_{k}: ISI del reactivo calibrado; ISI_{x}:
ISIn del reactivo no calibrado
ISI_{k}=ISI_{x} \text{*}
log(PR_{x})/log
(PR_{k})
a)
El Thromborel S Bulkware se calienta durante
breve tiempo (temperatura 95ºC, tiempo de permanencia 0,5 s) y se
mezclaron partes alicuotas con diferentes agentes inhibidores de
proteasas (Tabla 8). Después de una incubación durante la noche, se
añadieron a ello los estabilizadores. La referencia no contiene
ningún inhibidor.
b)
A continuación se determina el tiempo de
tromboplastina (PT) de acuerdo con Quick con un aparato Schnitger
& Gross:
- -
- Se calientan a 37ºC los reactivos y los tubitos
- -
- Se disponen previamente 100 \mul de plasma en los tubitos
- -
- Se incuba durante 1 min en un bloque térmico
- -
- Se añaden 200 ml de tromboplastina y al mismo tiempo se comienza el proceso de medición; se agitan brevemente los tubitos, se colocan en el puesto de medición del aparato Schnitger & Gross y se introduce el soporte de electrodos hasta llegar al tope;
- -
- Se lee el tiempo de coagulación.
Los tiempos de coagulación leídos se exponen en
la Tabla 8:
Como muestras se emplearon un plasma humano
patrón (de Behring Diagnostics) con una actividad de coagulación de
aproximadamente 100%, una dilución a 1:4 del plasma humano patrón
(StHPI) en una solución fisiológica (al 25%) de cloruro de sodio y
un plasma con defecto en F VII (F VII - MP, Behring Diagnostics). A
partir de la relación entre los tiempos de coagulación para la
dilución del StHPI y el StHPI se calculó la diseminación y a partir
de la relación entre los tiempos de coagulación para F VII - MP y
STHPL se calculó la sensibilidad al F VII.
El Thromborel S Bulkware de acuerdo con el
Ejemplo 8a), calentado durante breve tiempo a una temperatura de
85ºC y con un tiempo de permanencia de 3 s, se mezcló con
estabilizadores y a algunas partes alicuotas se les añadieron
adicionalmente diferentes concentraciones del agente inhibidor de
proteasa fluorofosfato de diisopropilo (DFP); la referencia no
contiene ningún agente inhibidor.
El tiempo de coagulación se determinó con el
medidor del tiempo de coagulación de Behring (PT.sec Thromborel S).
Como muestras se emplearon un plasma humano patrón, el plasma
testigo Phato II (de Behringwerke AG) y un plasma con defecto en F
VII.
A partir de la relación entre los tiempos de
coagulación del Phato II y del StHPI se calculó la diseminación y a
partir de la relación entre los tiempos de coagulación para F VII -
MP y STHPL se calculó la sensibilidad al F VII.
El antígeno para inmunización de F VII se aisló a
partir de un plasma humano. Después de una adsorción en hidróxido de
aluminio, las proteínas fijadas se eluyeron con fosfato de sodio 0,3
M, pH 7,4. Después de una subsiguiente precipitación con etanol al
16%, el material sobrenadante se precipitó de nuevo con etanol al
25% y el precipitado se purificó adicionalmente con
AE-celulosa. Las proteínas adsorbidas se eluyeron
con una solución que contenía 3% de citrato de sodio, cloruro de
sodio 0,15 M y 0,09% de EDTA de pH 8,0. Después de otras
purificaciones adicionales con electroforesis en PVC y una
cromatografía en columna con Sephadex G-100, el F
VII puro se empleó para la inmunización.
De acuerdo con métodos clásicos se inmunizaron
corderos y el anticuerpo anti - F VII se obtuvo a partir del
suero.
El Thromborel S Bulkware de acuerdo con Ejemplo
8a) se calentó a una temperatura de 85ºC durante breve tiempo con un
tiempo de permanencia de 3 s y se mezcló adicionalmente con
diferentes concentraciones del anticuerpo policonal antes
descrito.
El tiempo de coagulación se determinó con el
medidor del tiempo de coagulación de Behring (PT.sec Thromborel S).
Como muestras se emplearon un plasma humano patrón, el plasma
testigo Phato VII y un plasma con defecto en F VII. A partir de la
relación entre los tiempos de coagulación del Phato II y del StHPI
se calculó la diseminación y a partir de los tiempos de coagulación
para F VII - MP y STHPL se calculó la sensibilidad al F VII:
\vskip1.000000\baselineskip
El Thromborel S Bulkware de acuerdo con el
Ejemplo 8a) se calentó durante breve tiempo con un tiempo de
permanencia de 3 s a una temperatura de 85ºC y se mezcló
adicionalmente con ácido ascórbico, con ácido ascórbico y hierro,
así como con ácido ascórbico y cobre. Después de una incubación
durante 1 a 6 horas, se añadieron los estabilizadores.
El tiempo de coagulación se determinó tal como se
ha descrito en el Ejemplo 8b).
Como muestras se emplearon un plasma humano
patrón, el plasma testigo Phato VII y un plasma con defecto en F
VII. Los reactivos se almacenaron a 4ºC y 37ºC y la medición del
tiempo de coagulación se repitió después de 7 y 14 días. A partir de
la relación entre los tiempos de coagulación del Phato II y del
StHPI se calculó la diseminación y a partir de la relación entre los
tiempos de coagulación para F VII - MP y STHPL se calculó la
sensibilidad al
F VII.
F VII.
En el Thromborel S Bulkware de acuerdo con el
Ejemplo 8a), calentado durante breve tiempo a una temperatura de
120ºC con un tiempo de permanencia de 0,75 s se ajustó el pH de 7,5
con carbonato de sodio 0,16 mM, a continuación se añadieron
diferentes concentraciones de H_{2}O_{2} y se incubaron a 37ºC
durante 90 min. La solución se mezcló con estabilizadores y
acetil-cisteína 6 mM. El valor del pH se ajustó a
6,5 y el tiempo de coagulación se determinó de acuerdo con el
Ejemplo 8b).
Como muestras se emplearon un plasma humano
patrón, el plasma testigo y un plasma con defecto en F VII. A partir
de la relación entre los tiempos de coagulación para F VII - MP y
para STHPL se calculó la sensibilidad al F VII.
En el Thromborel S Bulkware de acuerdo con el
Ejemplo 8a, calentado durante breve tiempo a una temperatura de
120ºC con un tiempo de permanencia de 0,75 s, se ajustó el pH de 7,5
con carbonato de sodio 0,16 mM, a continuación se añadieron
diferentes concentraciones de Cloramina T y se incubó a 37ºC durante
90 min. La solución se mezcló con estabilizadores y
acetil-cisteína 6 mM. El valor del pH se ajustó a
6,5 y el tiempo de coagulación se determinó con el medidor del
tiempo de coagulación de Behring (PT.sec Thromborel S).
Como muestras se emplearon un plasma humano
patrón, el plasma testigo Phato II y un plasma con defecto en F VII.
A partir de la relación entre los tiempos de coagulación del Phato
II y del STPHI se calculó la diseminación y a partir de la relación
entre los tiempos de coagulación F VII - MP y STHPL se calculó la
sensibilidad al F VII.
Claims (19)
1. Procedimiento para aumentar la sensibilidad al
F VII de un reactivo de tromboplastina, caracterizado porque
se inhibe selectivamente la actividad remanente de los F VII / F
VIIa del reactivo, calentando una solución de este reactivo a una
temperatura superior a 65ºC.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se calienta una solución de
tromboplastina tisular de origen humano.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se calienta una solución de una
tromboplastina tisular recombinante.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se emplea una solución de una
variante biológicamente activa de una tromboplastina tisular.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se calienta de
modo continuo en un transmisor de calor con calentamiento indirecto
y durante breve tiempo.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la temperatura
de calentamiento está situada entre +65ºC y +160ºC.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el tiempo de
calentamiento o enfriamiento es menor que 30 segundos.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque el tiempo de retención está situado
entre 0,1 y 30 segundos.
9. Procedimiento para el aumento de la
sensibilidad al F VII de un reactivo de tromboplastina,
caracterizado porque se inhibe selectivamente la actividad
remanente de los F VII / F VIIa del reactivo, mezclando el reactivo
con fluoruros de sulfonilo, fluorofosfatos orgánicos o
clorometil-cetonas como agentes inhibidores de
proteasas.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque como agentes
inhibidores de proteasas se emplean fluoruro de
fenil-metil-sulfonilo (PMSF),
fluoruro de
p-aminoetil-benceno-sulfonilo
(AEBSF), fluoruro de
4-amino-fenil-metano-sulfonilo
(p-APMSF) o fluorofosfato de diisopropilo (DFP) o
combinaciones de estos agentes inhibidores.
11. Procedimiento para aumentar la sensibilidad
al F VII de un reactivo de tromboplastina, caracterizado
porque se inhibe selectivamente la actividad remanente de los F VII
/ F VIIa del reactivo, mezclando el reactivo con anticuerpos anti -
F VII, que inhiben la actividad enzimática de los F VII / F
VIIa.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque como anticuerpo se
emplea un anticuerpo anti - F VII policlonal.
13. Procedimiento para aumentar la sensibilidad
al F VII de un reactivo de tromboplastina, caracterizado
porque se inhibe selectivamente la actividad remanente de los F VII
/ F VIIa del reactivo, mezclando el reactivo con agentes de
oxidación.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, caracterizado porque la oxidación se lleva
a cabo en presencia de los metales hierro, cobre o zinc.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, caracterizado porque para la oxidación se
utilizan ácido ascórbico, tioles, tocoferoles o derivados de
tocoferoles.
16. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, caracterizado porque como agentes de
oxidación se emplean Cloramina T, peróxido de hidrógeno o sus
combinaciones.
17. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 9, 11 ó 13, caracterizado porque como
reactivo de tromboplastina se emplea una solución de una
tromboplastina tisular de origen humano.
18. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 9, 11 ó 13, caracterizado porque se emplea
una solución de una tromboplastina tisular recombinante.
19. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 9, 11 ó 13, caracterizado porque se emplea
una solución de una variante biológicamente activa de una
tromboplastina tisular.
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