JP4297200B2 - トロンボプラスチン試薬のｆｖｉｉ感受性の増大方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱処理によってトロンボプラスチン試薬のＦVII感受性を増大させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
患者血液中における凝固因子の欠損をスクリーニングする試験としてＱｕｉｃｋのトロンボプラスチン時間（ＰＴ）が使用されている。ＰＴはまた、経口抗凝固剤による治療のモニターにも用いられる。正常血液ドナーの好ましいＰＴは１０〜１４秒である。VII因子欠損血漿の好ましいＰＴは６０秒以上でなければならない。したがって、ＦVII感受性はＦVII欠損血漿の凝固時間と正常血液ドナーの凝固時間の比として定義される。
【０００３】
本発明は、正常血漿に対するＰＴを有意に変動させることなく、VII因子欠損血漿に対するＰＴを増大させることによってトロンボプラスチン試薬のVII因子感受性を増大させる方法を記述する。
【０００４】
活性なトロンボプラスチンは血漿中で凝固を誘導し、脂質成分とタンパク質成分から構成される。蛋白質すなわち組織因子は膜に結合し、多くの様々な組織に見出される。蛋白質と脂質の間の結合は疎水性相互作用に基づきＣａ2+−非依存性である。蛋白質残基は分子量４３〜５３kDaを有する糖蛋白質からなる。組織因子の１分子はＦVIIまたはＦVIIａの１分子に結合することができる。ＦVII／ＦVIIａの組織因子への結合はＣａ2+−依存性である。脂質、組織因子およびＦVIIａからなる複合体はＦＸを切断してＦＸａを形成し、それによって最終的に活性化プロトロンビンによる血液凝固を誘発する。
【０００５】
トロンボプラスチン試薬の添加後１０〜１４秒での血漿中における凝固の開始は、凝固系が無傷であることを指示する。凝固時間の増大は、ある障害を示す。障害は１種または２種以上の凝固因子の濃度が低すぎる結果として起こる。様々な起源のトロンボプラスチン試薬は、特定の因子の欠損を指示するそれらの感受性において異なることが多い。これは、測定すべき因子の少量が試薬中に持ち込まれることによる場合がある。少量の蛋白質を特異的に除去する一般的な方法は特に免疫吸着または、ビタミンＫ依存性凝固因子たとえばＦII、VII、IXおよびＸの場合には、硫酸バリウム吸着（WO 90／05740）である。ヒト起源の試薬の場合には、不適当なのはＦVIIに関する感受性のみであることが多い。
【０００６】
プロテアーゼ、すなわちVIIａ、IXａ、Ｘａ、XIａおよびXIIａ因子ならびに血漿カリクレインおよびトロンビンは、凝固カスケードの必須因子である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以前に報告されている方法の欠点は、第一に、ＦVIIが組織因子に結合し、そのためこのような吸着法により達成される組織因子の収率は低下することであり、第二に、いずれの方法も、かなりの装置の導入と時間を、特に生産規模で要求することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明においては驚くべきことに、特定の条件下に、試薬の残留ＦVIIａ活性を選択的に阻害することが可能であり、したがって組織因子または凝固カスケードの他の因子を障害することなく単純な様式で所望の結果に到達できることが証明された。ＦVII感受性と命名された、ＦVII欠損血漿の凝固時間と正常血漿の凝固時間の比は、好ましくは＞４であり、特に好ましくは＞６であり、特に極めて好ましくは＞１０である。
【０００９】
VII因子は、プロテアーゼ活性を有し、他の凝固因子IXａ、Ｘａ、XIａ、XIIａ、血漿カリクレインおよびトロンビンと同様に、セリンプロテアーゼ群に属する。これらの凝固因子に共通の他の特徴は、それらが最初は酵素前駆体の形態で存在し、それらがプロテアーゼ活性を発現するためには蛋白結合が切断されなければならないことである。
【００１０】
少なくともこれらの酵素前駆体の活性型たとえばトロンビンを阻害する多数のプロテアーゼ阻害剤が、これまで報告されている（W.B.Lawsonら, 1982, Folia Haematol. Leipzig 109 (1982) 1, pp.52-60)。それらにはスルホニルフルオリド、たとえばフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、ｐ−アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド（AEBSF）および４−アミノフェニルメタンスルホニルフルオリド（p-APMSF）、有機フルオロホスフェートたとえばジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、クロロメチルケトンならびにペプチドたとえばロイペプチンまたはセルピンファミリーのタンパク質たとえばＣ１インヒビター、アンチトロンビンIIIおよびアプロチニンが包含される。
【００１１】
プロテアーゼ阻害剤はＰＴにおいて、それらが持ち込まれたＦVIIまたはＦVIIａ因子の阻害に加え、測定すべきサンプル中の凝固因子IXａ、Ｘａ、XIａ、XIIａ、血漿カリクレインおよびトロンビンを阻害する欠点を有する。これに基づいて、それらは凝固時間を延長し、病理的数値の誤った結果を与えることになる。したがって、これらの阻害剤はＰＴ試薬中における使用に適当ではない。しかしながら、驚くべきことに特定の条件下には、サンプルの凝固時間を延長することなくこれらの阻害剤を使用することが可能であり、しかもその試薬のＦVII感受性は改良されることが見出された。
【００１２】
蛋白質の酵素活性を阻害する他の選択には、その蛋白質の活性中心を阻害する特異的抗体を調製する方法がある。凝固因子VIIに対しては多様な抗体を得ることが可能であり、これにはたとえばＦVII／ＦVIIａの酵素活性を阻害する少なくとも１種のポリクローナル抗体が包含される。ＰＴ試薬に単純に抗体を添加するのでは、抗体はサンプルのＦVII／ＦVIIａも阻害するので不利である。本発明においては驚くべきことに、添加する抗−ＦVII抗体のある濃度範囲では、正常血漿の凝固時間は延長されないが、ＦVII欠損血漿の凝固時間は著しく延長され、試薬のＦVII感受性は実質的に増大することが証明された。
【００１３】
セリンプロテアーゼが酸化的に阻害できることも以前に報告されている（S.E.Lindら, 1993, Blood 82, 5, 1522-1531）。この方法には、サンプル中の凝固カスケードのセリンプロテアーゼが阻害されるという欠点に加えて、リン脂質内の脂肪酸も酸化されるという欠点がある（Dasgupta, A.ら, Life Science, 1992, 50, 875-882）。この場合に産生する酸化生成物も同様にＰＴを阻害する（T.W. Barrowcliffeら, 1975, Thrombos. Diathes. Haemorrh. 33, 271）。
【００１４】
しかしながら驚くべきことに、その酸化過程は、望ましくない副反応を無視できるように、すなわち正常血漿の凝固時間は延長しないが、試薬のＦVII感受性は改良されるように制御することができる。適当な酸化剤は次亜塩素酸塩、過酸化水素、過マンガン酸塩および二酸化マンガンである。多くの抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸、チオール類たとえばグルタチオン、アセチルシステイン、ジチオエリトレトール、ならびにトコフェロールおよびトコフェロール誘導体たとえばジ tert−ブチル−ｐ−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジ tert−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、トロロックスおよびプロピルガレートは、金属イオンの存在下に酸化作用を発揮することができる。酸化を触媒する金属イオンには、特に鉄、銅および亜鉛が包含される。金属により触媒される酸化は特に残留ＦVII／ＦVIIａ活性の阻害に適している。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では組織抽出物を選択的に熱処理する簡単な方法が使用される。本発明は特定の反応機構によって限定されるものではないが、この方法の効果は特異的な熱処理が残留ＦVII／ＦVIIａ活性を除去することに基づいて説明できるものと考えられる。熱処理は短時間、高温で行うのが有利である。
【００１６】
＋４０〜６０℃の低温では、ＦVII活性の不活性化は多くの因子、特に使用される容器および用いられる溶液の大きさおよび熱伝導度に依存し、その一部は制御できない。加熱時間も極めて広範に変動できる。加熱温度は＋６５〜＋１６０℃、好ましくは＋８０〜＋１４０℃、特に好ましくは＋９０〜＋１２０℃である。
【００１７】
供給される液体が関連加熱温度まで可能な限り短時間で加熱され、ついで同様に短時間で再び冷却されるように、加熱を行う装置には、加熱メジウムとの少なくとも１個の連結部および冷却メジウムとの少なくとも１個の連結部が適当に装着される。この装置は３つの領域または部分、すなわち試薬を要求される温度に加熱する加熱部、試薬をこの温度に特定の時間保持する保持部、および試薬を再び低温に冷却する冷却部から構成されるのが有利である。
【００１８】
熱トランスファー装置の構造は、溶液の加熱温度と加熱メジウムの温度の差を可能な限り小さくするようにしなければならない。その結果、生成物と接触する壁部に生じる低すぎる温度に対し可能な最大限の範囲が生成物に許容される。
【００１９】
ウイルスの不活性化についてEP-A 0 571 771号に記載されている短時間の連続的加熱方法が特に好ましい。
【００２０】
加熱および／または冷却時間はそれぞれ30秒以内でなければならない。しかしながら、５秒未満とすることが好ましい。保持時間は０.１〜３０秒とすることができるが、好ましくは０.５〜２０秒である。
【００２１】
本発明をヒト胎盤抽出物の例に限定するものではないが、以下の実施例によりBehringwerke AG 組織トロンボプラスチン含有のＱｕｉｃｋ試薬（Thromborel S, 製品番号：OUHP）を用いた場合、残留ＦVII／ＦVIIａ活性の加熱による不活性化が証明される。防腐剤、抗酸化剤、炭水化物、蛋白質およびアミノ酸ならびにそれらの組み合わせを安定剤として試薬に加えることが有利である。個々の物質群では、以下の化合物が特に適している。
防腐剤：メルガル、ナトリウムアジドフェノール、アンホテリシン、ゲンタマイシン、ピペラシリンおよびシプロフロキサシン；
抗酸化剤：ジ tert−ブチル−ｐ−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジ tert−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、スペルミン、プロピルガレート、トコフェロール、トロロックス、ジチオエリトレトールおよびグルタチオン；
炭水化物：トレハロース、スクロース、タイロース、マンニトール、キサンタンガム、フィタゲル、カラゲナンおよびポリエチレングリコール；
蛋白質：ラクトグロブリン、リポプロテインおよびアルブミン、たとえば血清アルブミン、ラクトアルブミンおよびオバルブミン；
アミノ酸：アセチルシステイン、アセチルメチオニン、グリシン、リジン、ヒスチジンおよびセリン。
【００２２】
【実施例】
以下の実施例は本発明をさらに明瞭にするものである。
【００２３】
実施例１
工程ａ）
１.２５mlの安定化溶液を Thromborel S のバルクウエアに添加し、全容を１０mlとした。１mlの Thromborel（７℃）を各場合１.５mlの反応管に加え、これをついで水浴中５６℃で様々な時間インキュベートし、ついで氷上で冷却した。
工程ｂ）
Ｑｕｉｃｋのトロンボプラスチン時間（ＰＴ）はついで、Schnitger & Gross を用いて以下のように測定した。
−試薬および反応管を３７℃に加熱する；
−反応管に１００μlの正常血漿ＮまたはＦVII欠損血漿を導入する；
−断熱装置内で１分間インキュベートする；
−トロンボプラスチン２００μlを加え、同時に測定操作を開始する；
反応管を短時間振盪し、Schnitger & Gross の測定位置に置き、停止限界まで電極ホルダーを挿入する；
−凝固時間を読み取る。
読み取った凝固時間を表１に掲げる。
【００２４】
【表１】
【００２５】
実施例２
滞留時間2.05秒を用い Thromborel S バルクウエアを６０〜８０℃の温度に加熱する（表２参照）。
凝固時間を実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
実施例３
滞留時間０.５〜2.05秒を用い Thromborel S バルクウエアを７５〜９５℃の温度に加熱した(表３)。凝固時間を実施例１の工程ｂ)のようにして測定した。
【００２８】
【表３】
【００２９】
実施例４
実施例１ａ)〜１ｂ)に記載の方法によって調製した Thromborel S を滞留時間２〜１６秒を用い、それぞれ６５℃および７５℃の温度に加熱した（表４参照）。凝固時間を実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
【００３０】
【表４】
【００３１】
実施例５
実施例１ａ)〜１ｂ)に記載の方法によって調製した Thromborel S を滞留時間３〜１８秒を用い、９５℃の温度に加熱した（表５参照）。凝固時間を実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
【００３２】
【表５】
【００３３】
実施例６
滞留時間０.５〜１.５秒を用い Thromborel S バルクウエアを温度１２０℃に加熱した。凝固時間はＰＴ秒 Thromborel S 法を用い、Behring Coagulation Timer で測定した。
【００３４】
【表６】
【００３５】
実施例７
滞留時間３秒を用いて Thromborel S バルクウエアを８５℃の温度に加熱した。様々なサンプルを用い、市販品を入手できる Thromborel S と加熱 Thromborel（TB-190）を比較した。
凝固時間は実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
サンプル：
PT−100：標準ヒト血漿 バッチ記号：502556（st.の98％)
Ctrl.P：対照血漿Ｐ バッチ記号：512628
MAC I：マークマ−ル血漿Ｉ バッチ記号：951201
MAC II：マークマール血漿II バッチ記号：951202
PATH I：疾病血漿Ｉ バッチ記号：502883
PATH II：疾病血漿II バッチ記号：502973
ＦVII：ＦVII欠損血漿 バッチ記号：500756
１IU/ml Hep：１IU/mlヘパリン補充標準ヒト血漿
MAC-02およびMAC-03：経口抗凝固剤処置患者からの血漿プール
50％ＦVIIおよび２％ＦVII：ＦVII欠損血漿の標準ヒト血漿による希釈
PT16.75：生理食塩溶液中16.75％に希釈した標準ヒト血漿
st.％：標準の％（以下の関係式を用いて推定)：
【数１】
ＩＳＩ：国際感受性指数
ＰＲ：ＰＴ(Marcumar plasma)／ＰＴ(standard human plasma)
ＩＳＩk：検量試薬のＩＳＩ
ＩＳＩX：非検量試薬のＩＳＩ
【数２】
【００３６】
【表７】
【００３７】
実施例８
ａ) Thromborel S バルクウエアを短時間加熱し（温度95℃、滞留時間0.5秒）ついでアリコートを様々なプロテアーゼ阻害剤で処置した（表８）。サンプルを一夜インキュベートしたのち、安定剤を加えた。対照は阻害剤を含んでいない。
ｂ) ついでＱｕｉｃｋのトロンボプラスチン時間（ＰＴ）を、Schnitger & Gross を用いて以下のように測定した。
−試薬および反応管を３７℃に加熱する；
−反応管に１００μlの血漿を導入する；
−断熱装置内で１分間インキュベートする；
−トロンボプラスチン２００μlを加え、同時に測定操作を開始する；
−反応管を短時間振盪し、Schnitger & Gross の測定位置に置き、停止限界まで電極ホルダーを挿入する；
−凝固時間を読み取る。
読み取った凝固時間を表８に掲げる。
サンプルとしては、ほぼ１００％の血液凝固活性を有する標準ヒト血漿（Behring Diagnostics)、標準ヒト血漿の生理食塩溶液中１：４希釈（２５％）(ＳｔＨＰｌ）およびＦVII欠損血漿（ＦVII−ＭＰ，Behring Diagnostics）を使用した。延長（spread）は、ＳｔＨＰｌの希釈液およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００３８】
【表８】
【００３９】
実施例９
実施例８ａ)による Thromborel S バルクウエアに安定剤を加え、そのバルクウエアを温度８５℃、滞留時間３秒を用いて短時間加熱し、一部のアリコートにはプロテアーゼ阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）を様々な濃度で加えた。対照は阻害剤を含んでいない。
凝固時間は Behring Coagulation Timer（ＰＴ秒、Thromborel S）を用い測定した。サンプルとしては標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II（Behringwerke AG）およびＦVII欠損血漿を使用した。
延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４０】
【表９】
【００４１】
実施例１０
抗−ＦVII抗体の調製
ＦVII免疫抗原はヒト血漿から単離した。水酸化アルミニウムに吸着させたのち結合した蛋白質を０.３Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で溶出した。１６％エタノールで沈殿させたのち、上清を再び２５％エタノールで沈殿させ、沈降物をさらにＡＥセルロースを用いて精製した。吸着した蛋白質を３％クエン酸ナトリウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０.０９％ＥＤＴＡを含有する溶液、ｐＨ８.０で溶出した。さらにＰＶＣ電気泳動および Sephadex-G 100 を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製したのち、純粋なＦVIIを免疫処置に使用した。
ヒツジを標準方法によって免疫処置し、抗−ＦVII抗体をその血清から単離した。
実施例８ａ)による Thromborel S バルクウエアを滞留時間３秒を用い８５℃の温度に短時間加熱し、さらに上述のポリクローナル抗体を様々な濃度で加えた。
凝固時間は Behring Coagulation Timer（ＰＴ秒、Thromborel S）を用いて測定した。サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II およびＦVII欠損血漿を使用した。延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４２】
【表１０】
【００４３】
実施例１１
実施例８ａ)による Thromborel S バルクウエアを滞留時間３秒を用い８５℃に短時間加熱し、さらにアスコルビン酸、アスコルビン酸と鉄およびアスコルビン酸と銅でも処理した。１〜６時間インキュベートしたのち、安定剤を加えた。
凝固時間は実施例８ｂ)に記載したように測定した。
サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II およびＦVII欠損血漿を使用した。試薬を４℃および３７℃で保存し、７および１４日後に凝固時価の測定を反復した。延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４４】
【表１１】
【００４５】
実施例１２
実施例８ａ)に従って調製した Thromborel S バルクウエア滞留時間０.７５秒を用い１２０℃に短時間加熱し、ついで０.１６mM炭酸ナトリウムでｐＨを７.５に調整した。ついで様々な濃度のＨ2Ｏ2を加えて、混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。この溶液に安定剤および６mMアセチルシステインを加えた。ｐＨ値を６.５に調整し、凝固時間を実施例８ｂ)に従って測定した。
サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿およびＦVII欠損血漿を使用した。ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４６】
【表１２】
【００４７】
実施例１３
実施例８ａ)に従って調製した Thromborel S バルクウエアを滞留時間０.７５秒を用い１２０℃に短時間加熱し、ついで０.１６mM炭酸ナトリウムでｐＨを７.５に調整した。ついで様々な濃度のクロラミンＴを加えて、混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。溶液に安定剤および６ｍＭアセチルシステインを加えた。ｐＨ値を６.５に調整して、凝固時間を Behring Coagulation Timer（ＰＴ秒， Thromborel S）を用いて測定した。
サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II およびＦVII欠損血漿を使用した。延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰおよびＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４８】
【表１３】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱処理によってトロンボプラスチン試薬のＦVII感受性を増大させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
患者血液中における凝固因子の欠損をスクリーニングする試験としてＱｕｉｃｋのトロンボプラスチン時間（ＰＴ）が使用されている。ＰＴはまた、経口抗凝固剤による治療のモニターにも用いられる。正常血液ドナーの好ましいＰＴは１０〜１４秒である。VII因子欠損血漿の好ましいＰＴは６０秒以上でなければならない。したがって、ＦVII感受性はＦVII欠損血漿の凝固時間と正常血液ドナーの凝固時間の比として定義される。
【０００３】
本発明は、正常血漿に対するＰＴを有意に変動させることなく、VII因子欠損血漿に対するＰＴを増大させることによってトロンボプラスチン試薬のVII因子感受性を増大させる方法を記述する。
【０００４】
活性なトロンボプラスチンは血漿中で凝固を誘導し、脂質成分とタンパク質成分から構成される。蛋白質すなわち組織因子は膜に結合し、多くの様々な組織に見出される。蛋白質と脂質の間の結合は疎水性相互作用に基づきＣａ2+−非依存性である。蛋白質残基は分子量４３〜５３kDaを有する糖蛋白質からなる。組織因子の１分子はＦVIIまたはＦVIIａの１分子に結合することができる。ＦVII／ＦVIIａの組織因子への結合はＣａ2+−依存性である。脂質、組織因子およびＦVIIａからなる複合体はＦＸを切断してＦＸａを形成し、それによって最終的に活性化プロトロンビンによる血液凝固を誘発する。
【０００５】
トロンボプラスチン試薬の添加後１０〜１４秒での血漿中における凝固の開始は、凝固系が無傷であることを指示する。凝固時間の増大は、ある障害を示す。障害は１種または２種以上の凝固因子の濃度が低すぎる結果として起こる。様々な起源のトロンボプラスチン試薬は、特定の因子の欠損を指示するそれらの感受性において異なることが多い。これは、測定すべき因子の少量が試薬中に持ち込まれることによる場合がある。少量の蛋白質を特異的に除去する一般的な方法は特に免疫吸着または、ビタミンＫ依存性凝固因子たとえばＦII、VII、IXおよびＸの場合には、硫酸バリウム吸着（WO 90／05740）である。ヒト起源の試薬の場合には、不適当なのはＦVIIに関する感受性のみであることが多い。
【０００６】
プロテアーゼ、すなわちVIIａ、IXａ、Ｘａ、XIａおよびXIIａ因子ならびに血漿カリクレインおよびトロンビンは、凝固カスケードの必須因子である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以前に報告されている方法の欠点は、第一に、ＦVIIが組織因子に結合し、そのためこのような吸着法により達成される組織因子の収率は低下することであり、第二に、いずれの方法も、かなりの装置の導入と時間を、特に生産規模で要求することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明においては驚くべきことに、特定の条件下に、試薬の残留ＦVIIａ活性を選択的に阻害することが可能であり、したがって組織因子または凝固カスケードの他の因子を障害することなく単純な様式で所望の結果に到達できることが証明された。ＦVII感受性と命名された、ＦVII欠損血漿の凝固時間と正常血漿の凝固時間の比は、好ましくは＞４であり、特に好ましくは＞６であり、特に極めて好ましくは＞１０である。
【０００９】
VII因子は、プロテアーゼ活性を有し、他の凝固因子IXａ、Ｘａ、XIａ、XIIａ、血漿カリクレインおよびトロンビンと同様に、セリンプロテアーゼ群に属する。これらの凝固因子に共通の他の特徴は、それらが最初は酵素前駆体の形態で存在し、それらがプロテアーゼ活性を発現するためには蛋白結合が切断されなければならないことである。
【００１０】
少なくともこれらの酵素前駆体の活性型たとえばトロンビンを阻害する多数のプロテアーゼ阻害剤が、これまで報告されている（W.B.Lawsonら, 1982, Folia Haematol. Leipzig 109 (1982) 1, pp.52-60)。それらにはスルホニルフルオリド、たとえばフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、ｐ−アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド（AEBSF）および４−アミノフェニルメタンスルホニルフルオリド（p-APMSF）、有機フルオロホスフェートたとえばジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、クロロメチルケトンならびにペプチドたとえばロイペプチンまたはセルピンファミリーのタンパク質たとえばＣ１インヒビター、アンチトロンビンIIIおよびアプロチニンが包含される。
【００１１】
プロテアーゼ阻害剤はＰＴにおいて、それらが持ち込まれたＦVIIまたはＦVIIａ因子の阻害に加え、測定すべきサンプル中の凝固因子IXａ、Ｘａ、XIａ、XIIａ、血漿カリクレインおよびトロンビンを阻害する欠点を有する。これに基づいて、それらは凝固時間を延長し、病理的数値の誤った結果を与えることになる。したがって、これらの阻害剤はＰＴ試薬中における使用に適当ではない。しかしながら、驚くべきことに特定の条件下には、サンプルの凝固時間を延長することなくこれらの阻害剤を使用することが可能であり、しかもその試薬のＦVII感受性は改良されることが見出された。
【００１２】
蛋白質の酵素活性を阻害する他の選択には、その蛋白質の活性中心を阻害する特異的抗体を調製する方法がある。凝固因子VIIに対しては多様な抗体を得ることが可能であり、これにはたとえばＦVII／ＦVIIａの酵素活性を阻害する少なくとも１種のポリクローナル抗体が包含される。ＰＴ試薬に単純に抗体を添加するのでは、抗体はサンプルのＦVII／ＦVIIａも阻害するので不利である。本発明においては驚くべきことに、添加する抗−ＦVII抗体のある濃度範囲では、正常血漿の凝固時間は延長されないが、ＦVII欠損血漿の凝固時間は著しく延長され、試薬のＦVII感受性は実質的に増大することが証明された。
【００１３】
セリンプロテアーゼが酸化的に阻害できることも以前に報告されている（S.E.Lindら, 1993, Blood 82, 5, 1522-1531）。この方法には、サンプル中の凝固カスケードのセリンプロテアーゼが阻害されるという欠点に加えて、リン脂質内の脂肪酸も酸化されるという欠点がある（Dasgupta, A.ら, Life Science, 1992, 50, 875-882）。この場合に産生する酸化生成物も同様にＰＴを阻害する（T.W. Barrowcliffeら, 1975, Thrombos. Diathes. Haemorrh. 33, 271）。
【００１４】
しかしながら驚くべきことに、その酸化過程は、望ましくない副反応を無視できるように、すなわち正常血漿の凝固時間は延長しないが、試薬のＦVII感受性は改良されるように制御することができる。適当な酸化剤は次亜塩素酸塩、過酸化水素、過マンガン酸塩および二酸化マンガンである。多くの抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸、チオール類たとえばグルタチオン、アセチルシステイン、ジチオエリトレトール、ならびにトコフェロールおよびトコフェロール誘導体たとえばジ tert−ブチル−ｐ−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジ tert−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、トロロックスおよびプロピルガレートは、金属イオンの存在下に酸化作用を発揮することができる。酸化を触媒する金属イオンには、特に鉄、銅および亜鉛が包含される。金属により触媒される酸化は特に残留ＦVII／ＦVIIａ活性の阻害に適している。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では組織抽出物を選択的に熱処理する簡単な方法が使用される。本発明は特定の反応機構によって限定されるものではないが、この方法の効果は特異的な熱処理が残留ＦVII／ＦVIIａ活性を除去することに基づいて説明できるものと考えられる。熱処理は短時間、高温で行うのが有利である。
【００１６】
＋４０〜６０℃の低温では、ＦVII活性の不活性化は多くの因子、特に使用される容器および用いられる溶液の大きさおよび熱伝導度に依存し、その一部は制御できない。加熱時間も極めて広範に変動できる。加熱温度は＋６５〜＋１６０℃、好ましくは＋８０〜＋１４０℃、特に好ましくは＋９０〜＋１２０℃である。
【００１７】
供給される液体が関連加熱温度まで可能な限り短時間で加熱され、ついで同様に短時間で再び冷却されるように、加熱を行う装置には、加熱メジウムとの少なくとも１個の連結部および冷却メジウムとの少なくとも１個の連結部が適当に装着される。この装置は３つの領域または部分、すなわち試薬を要求される温度に加熱する加熱部、試薬をこの温度に特定の時間保持する保持部、および試薬を再び低温に冷却する冷却部から構成されるのが有利である。
【００１８】
熱トランスファー装置の構造は、溶液の加熱温度と加熱メジウムの温度の差を可能な限り小さくするようにしなければならない。その結果、生成物と接触する壁部に生じる低すぎる温度に対し可能な最大限の範囲が生成物に許容される。
【００１９】
ウイルスの不活性化についてEP-A 0 571 771号に記載されている短時間の連続的加熱方法が特に好ましい。
【００２０】
加熱および／または冷却時間はそれぞれ30秒以内でなければならない。しかしながら、５秒未満とすることが好ましい。保持時間は０.１〜３０秒とすることができるが、好ましくは０.５〜２０秒である。
【００２１】
本発明をヒト胎盤抽出物の例に限定するものではないが、以下の実施例によりBehringwerke AG 組織トロンボプラスチン含有のＱｕｉｃｋ試薬（Thromborel S, 製品番号：OUHP）を用いた場合、残留ＦVII／ＦVIIａ活性の加熱による不活性化が証明される。防腐剤、抗酸化剤、炭水化物、蛋白質およびアミノ酸ならびにそれらの組み合わせを安定剤として試薬に加えることが有利である。個々の物質群では、以下の化合物が特に適している。
防腐剤：メルガル、ナトリウムアジドフェノール、アンホテリシン、ゲンタマイシン、ピペラシリンおよびシプロフロキサシン；
抗酸化剤：ジ tert−ブチル−ｐ−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジ tert−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、スペルミン、プロピルガレート、トコフェロール、トロロックス、ジチオエリトレトールおよびグルタチオン；
炭水化物：トレハロース、スクロース、タイロース、マンニトール、キサンタンガム、フィタゲル、カラゲナンおよびポリエチレングリコール；
蛋白質：ラクトグロブリン、リポプロテインおよびアルブミン、たとえば血清アルブミン、ラクトアルブミンおよびオバルブミン；
アミノ酸：アセチルシステイン、アセチルメチオニン、グリシン、リジン、ヒスチジンおよびセリン。
【００２２】
【実施例】
以下の実施例は本発明をさらに明瞭にするものである。
【００２３】
実施例１
工程ａ）
１.２５mlの安定化溶液を Thromborel S のバルクウエアに添加し、全容を１０mlとした。１mlの Thromborel（７℃）を各場合１.５mlの反応管に加え、これをついで水浴中５６℃で様々な時間インキュベートし、ついで氷上で冷却した。
工程ｂ）
Ｑｕｉｃｋのトロンボプラスチン時間（ＰＴ）はついで、Schnitger & Gross を用いて以下のように測定した。
−試薬および反応管を３７℃に加熱する；
−反応管に１００μlの正常血漿ＮまたはＦVII欠損血漿を導入する；
−断熱装置内で１分間インキュベートする；
−トロンボプラスチン２００μlを加え、同時に測定操作を開始する；
反応管を短時間振盪し、Schnitger & Gross の測定位置に置き、停止限界まで電極ホルダーを挿入する；
−凝固時間を読み取る。
読み取った凝固時間を表１に掲げる。
【００２４】
【表１】
実施例２
滞留時間2.05秒を用い Thromborel S バルクウエアを６０〜８０℃の温度に加熱する（表２参照）。
凝固時間を実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
【００２６】
【表２】
実施例３
滞留時間０.５〜2.05秒を用い Thromborel S バルクウエアを７５〜９５℃の温度に加熱した(表３)。凝固時間を実施例１の工程ｂ)のようにして測定した。
【００２８】
【表３】
実施例４
実施例１ａ)〜１ｂ)に記載の方法によって調製した Thromborel S を滞留時間２〜１６秒を用い、それぞれ６５℃および７５℃の温度に加熱した（表４参照）。凝固時間を実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
【００３０】
【表４】
実施例５
実施例１ａ)〜１ｂ)に記載の方法によって調製した Thromborel S を滞留時間３〜１８秒を用い、９５℃の温度に加熱した（表５参照）。凝固時間を実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
【００３２】
【表５】
実施例６
滞留時間０.５〜１.５秒を用い Thromborel S バルクウエアを温度１２０℃に加熱した。凝固時間はＰＴ秒 Thromborel S 法を用い、Behring Coagulation Timer で測定した。
【００３４】
【表６】
実施例７
滞留時間３秒を用いて Thromborel S バルクウエアを８５℃の温度に加熱した。様々なサンプルを用い、市販品を入手できる Thromborel S と加熱 Thromborel（TB-190）を比較した。
凝固時間は実施例１の工程ｂ)に記載のようにして測定した。
サンプル：
PT−100：標準ヒト血漿 バッチ記号：502556（st.の98％)
Ctrl.P：対照血漿Ｐ バッチ記号：512628
MAC I：マークマ−ル血漿Ｉ バッチ記号：951201
MAC II：マークマール血漿II バッチ記号：951202
PATH I：疾病血漿Ｉ バッチ記号：502883
PATH II：疾病血漿II バッチ記号：502973
ＦVII：ＦVII欠損血漿 バッチ記号：500756
１IU/ml Hep：１IU/mlヘパリン補充標準ヒト血漿
MAC-02およびMAC-03：経口抗凝固剤処置患者からの血漿プール
50％ＦVIIおよび２％ＦVII：ＦVII欠損血漿の標準ヒト血漿による希釈
PT16.75：生理食塩溶液中16.75％に希釈した標準ヒト血漿
st.％：標準の％（以下の関係式を用いて推定)：
【数１】
ＰＲ：ＰＴ(Marcumar plasma)／ＰＴ(standard human plasma)
ＩＳＩk：検量試薬のＩＳＩ
ＩＳＩX：非検量試薬のＩＳＩ
【数２】
【表７】
実施例８
ａ) Thromborel S バルクウエアを短時間加熱し（温度95℃、滞留時間0.5秒）ついでアリコートを様々なプロテアーゼ阻害剤で処置した（表８）。サンプルを一夜インキュベートしたのち、安定剤を加えた。対照は阻害剤を含んでいない。
ｂ) ついでＱｕｉｃｋのトロンボプラスチン時間（ＰＴ）を、Schnitger & Gross を用いて以下のように測定した。
−試薬および反応管を３７℃に加熱する；
−反応管に１００μlの血漿を導入する；
−断熱装置内で１分間インキュベートする；
−トロンボプラスチン２００μlを加え、同時に測定操作を開始する；
−反応管を短時間振盪し、Schnitger & Gross の測定位置に置き、停止限界まで電極ホルダーを挿入する；
−凝固時間を読み取る。
読み取った凝固時間を表８に掲げる。
サンプルとしては、ほぼ１００％の血液凝固活性を有する標準ヒト血漿（Behring Diagnostics)、標準ヒト血漿の生理食塩溶液中１：４希釈（２５％）(ＳｔＨＰｌ）およびＦVII欠損血漿（ＦVII−ＭＰ，Behring Diagnostics）を使用した。延長（spread）は、ＳｔＨＰｌの希釈液およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００３８】
【表８】
実施例９
実施例８ａ)による Thromborel S バルクウエアに安定剤を加え、そのバルクウエアを温度８５℃、滞留時間３秒を用いて短時間加熱し、一部のアリコートにはプロテアーゼ阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）を様々な濃度で加えた。対照は阻害剤を含んでいない。
凝固時間は Behring Coagulation Timer（ＰＴ秒、Thromborel S）を用い測定した。サンプルとしては標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II（Behringwerke AG）およびＦVII欠損血漿を使用した。
延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４０】
【表９】
実施例１０
抗−ＦVII抗体の調製
ＦVII免疫抗原はヒト血漿から単離した。水酸化アルミニウムに吸着させたのち結合した蛋白質を０.３Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で溶出した。１６％エタノールで沈殿させたのち、上清を再び２５％エタノールで沈殿させ、沈降物をさらにＡＥセルロースを用いて精製した。吸着した蛋白質を３％クエン酸ナトリウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０.０９％ＥＤＴＡを含有する溶液、ｐＨ８.０で溶出した。さらにＰＶＣ電気泳動および Sephadex-G 100 を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製したのち、純粋なＦVIIを免疫処置に使用した。
ヒツジを標準方法によって免疫処置し、抗−ＦVII抗体をその血清から単離した。
実施例８ａ)による Thromborel S バルクウエアを滞留時間３秒を用い８５℃の温度に短時間加熱し、さらに上述のポリクローナル抗体を様々な濃度で加えた。
凝固時間は Behring Coagulation Timer（ＰＴ秒、Thromborel S）を用いて測定した。サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II およびＦVII欠損血漿を使用した。延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４２】
【表１０】
実施例１１
実施例８ａ)による Thromborel S バルクウエアを滞留時間３秒を用い８５℃に短時間加熱し、さらにアスコルビン酸、アスコルビン酸と鉄およびアスコルビン酸と銅でも処理した。１〜６時間インキュベートしたのち、安定剤を加えた。
凝固時間は実施例８ｂ)に記載したように測定した。
サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II およびＦVII欠損血漿を使用した。試薬を４℃および３７℃で保存し、７および１４日後に凝固時価の測定を反復した。延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４４】
【表１１】
実施例１２
実施例８ａ)に従って調製した Thromborel S バルクウエア滞留時間０.７５秒を用い１２０℃に短時間加熱し、ついで０.１６mM炭酸ナトリウムでｐＨを７.５に調整した。ついで様々な濃度のＨ2Ｏ2を加えて、混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。この溶液に安定剤および６mMアセチルシステインを加えた。ｐＨ値を６.５に調整し、凝固時間を実施例８ｂ)に従って測定した。
サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿およびＦVII欠損血漿を使用した。ＦVII感受性はＦVII−ＭＰとＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４６】
【表１２】
実施例１３
実施例８ａ)に従って調製した Thromborel S バルクウエアを滞留時間０.７５秒を用い１２０℃に短時間加熱し、ついで０.１６mM炭酸ナトリウムでｐＨを７.５に調整した。ついで様々な濃度のクロラミンＴを加えて、混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。溶液に安定剤および６ｍＭアセチルシステインを加えた。ｐＨ値を６.５に調整して、凝固時間を Behring Coagulation Timer（ＰＴ秒， Thromborel S）を用いて測定した。
サンプルとしては、標準ヒト血漿、対照血漿 Patho II およびＦVII欠損血漿を使用した。延長は Patho II およびＳｔＨＰｌの凝固時間の比から計算し、ＦVII感受性はＦVII−ＭＰおよびＳＴＨＰＬについての凝固時間の比から計算した。
【００４８】
【表１３】
Claims (21)
- トロンボプラスチン試薬のＦVII感受性を増大させる方法において、該試薬の溶液を６５℃〜１６０℃に３０秒未満で加熱し、ついでこの温度を０.１〜３０秒間保持し、ついで３０秒未満で再び冷却することにより、その試薬中の残留ＦVII／ＦVIIａ活性を選択的に阻害することからなる方法。
- ヒト起源の組織トロンボプラスチンの溶液を加熱する請求項１記載の方法。
- 組み換え組織トロンボプラスチンの溶液を加熱する請求項１記載の方法。
- 組織トロンボプラスチンの生物学的に活性な変異体を使用する請求項１記載の方法。
- 加熱は間接的に加熱する熱トランスファー装置において連続的に短時間実施する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- プロテアーゼ阻害剤を、正常血漿の凝固時間は延長されないが、FVII欠損血漿の凝固時間は延長される濃度範囲でトロンボプラスチン試薬に添加する請求項１記載の方法。
- 抗ＦVII抗体を、正常血漿の凝固時間は延長されないが、FVII欠損血漿の凝固時間は延長される濃度範囲でトロンボプラスチン試薬に添加する請求項１記載の方法。
- 酸化剤を、正常血漿の凝固時間は延長されないが、FVII欠損血漿の凝固時間は延長される濃度範囲でトロンボプラスチン試薬に添加する請求項１記載の方法。
- 酸化は金属の存在下に行われる請求項８記載の方法。
- ヒト起源の組織トロンボプラスチンの溶液をトロンボプラスチン試薬として使用する請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
- 組み換え組織トロンボプラスチンの溶液を使用する請求項６〜１０のいずれかに記載の方法。
- 組織トロンボプラスチンの生物学的に活性な変異体の溶液を使用する請求項６〜１１のいずれかに記載の方法。
- フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、ｐ−アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド（AEBSF)、４−アミノフェニルメタンスルホニルフルオリド（p-APMSF）または有機フルオロホスフェートたとえばジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、またはこれらの阻害剤の組み合わせをプロテアーゼ阻害剤として使用する請求項６記載の方法。
- ポリクローナル抗−ＦVII抗体を抗体として使用する請求項７記載の方法。
- クロラミンＴ、過酸化水素、アスコルビン酸、またはそれらの組み合わせを酸化剤として使用する請求項８記載の方法。
- 金属鉄、銅もしくは亜鉛、またはそれらの組み合わせの存在下に酸化を行う請求項９記載の方法。
- プロテアーゼ阻害剤として、４−アミノフェニルメタンスルホニルフルオリドを、０.０１〜０.５ｍＭの濃度でトロンボプラスチン試薬に添加する、請求項６記載の方法。
- プロテアーゼ阻害剤として、フェニルメチルスルホニルフルオリドを、１.５ｍＭの濃度でトロンボプラスチン試薬に添加する、請求項６記載の方法。
- プロテアーゼ阻害剤として、ジイソプロピルフルオロホスフェートを、０.１〜１ｍＭの濃度でトロンボプラスチン試薬に添加する、請求項６記載の方法。
- 酸化剤として、過酸化水素を０.００００３％〜０.０３％の濃度でトロンボプラスチン試薬に添加する、請求項８記載の方法。
- 酸化剤として、クロラミンＴを、０.００１〜０.０１ｍMの濃度でトロンボプラスチン試薬に添加する、請求項８記載の方法。
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