ES2318803T3 - Preparaciones estabilizadas de serina - endopeptidasas, su produccion y uso. - Google Patents
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Abstract
Formulación, que contiene por lo menos una serina - endopeptidasa, caracterizada porque están contenidos a) acetato de amonio y/o b) por lo menos un poli(aminoácido) y/o c) glicerol en común con por lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado por ácido aspártico y sus sales, ácido glutámico y sus sales, histidina y glicina
Description
Preparaciones estabilizadas de
serina-endopeptidasas, su producción y uso.
El presente invento se sitúa en el sector de la
preparación de formulaciones, que están previstas para una
utilización terapéutica o para una utilización como reactivo de
ensayo en un procedimiento de diagnóstico, y se refiere en
particular a unas formulaciones de serina - endopeptidasas, las
cuales, mediante la adición de diferentes aditivos, muestran una
estabilidad mejorada y, por consiguiente, una durabilidad
mejorada.
Las proteasas (sinónimo: peptidasas) son unas
enzimas, que disponen de la capacidad de hidrolizar a enlaces
peptídicos. La estabilidad de las formulaciones, que contienen
proteasas, constituye uno de los parámetros más importantes, que
determinan las posibilidades de utilización comercial de proteasas
en procesos industriales. La estabilidad de las proteasas debe de
ser tomada en cuenta durante su producción, su aislamiento, su
purificación, su almacenamiento y en último lugar, también, en el
caso de la utilización del producto que contiene la proteasa. Para
que se pueda garantizar una actividad biológica suficiente durante
un período de tiempo aceptable, las formulaciones, que contienen
una proteasa, al igual que también muchos otros productos
proteínicos, se tienen que almacenar en condiciones refrigeradas o
incluso liofilizadas.
Para la estabilización de enzimas o de proteínas
en general se conocen diferentes estrategias. El objetivo de las
estrategias de estabilización es esencialmente la evitación de la
desnaturalización de la proteína. Como estructura natural de una
proteína se designa, por lo general, a la conformación proteínica
que es la más estable (la conformación con la energía mínima) y que
adopta la proteína en su entorno celular o en la que la proteína
aislada posee su máxima actividad biológica. La desnaturalización de
una proteína designa al proceso, que conduce a una modificación de
la estructura tridimensional natural de la proteína, sin que se
modifique la secuencia de aminoácidos (la estructura primaria). Una
modificación en la estructura molecular de una enzima puede tener
repercusiones sobre la disposición correcta de su centro activo y,
por lo tanto, puede conducir a una desactivación de la enzima. Por
la estabilización de una molécula proteínica o respectivamente de
una formulación, que contiene moléculas proteínicas, el químico
especializado en proteínas entiende la evitación de modificaciones
de la conformación dentro de la molécula proteínica. Una
estabilización conduce, como consecuencia de ello, a la
conservación de la estructura natural y, por consiguiente, también
al mantenimiento de la actividad biológica. A través de la
determinación de la actividad de una enzima, por ejemplo de una
proteasa, se pueden sacar inversamente conclusiones acerca del buen
estado de la estructura proteínica natural.
En el contexto de los productos medicinales o de
los productos para el diagnóstico in vitro, se entiende
usualmente por estabilidad el hecho de que un producto cumpla sus
especificaciones necesarias a lo largo de su almacenamiento o de su
uso, o respectivamente, en el caso más favorable, que conserve sus
propiedades y características tal como en el momento de su
producción.
Para la predicción de la estabilidad de una
formulación proteínica se llevan a cabo frecuentemente unos estudios
acelerados de la estabilidad (en inglés "accelerated stability
studies"). Estos estudios están ejecutados de tal manera que se
acelera la degradación química o física de un producto proteínico en
condiciones de estrés aumentado (p.ej. temperatura aumentada, alta
humedad del aire, luz, sacudidas). A partir de las investigaciones
de la estabilidad en condiciones de estrés aumentado se pueden sacar
conclusiones acerca de la estabilidad real a largo plazo (en inglés
"long term stability") de una proteína. Esto se puede efectuar
sobre la base de las experiencias adquiridas con productos
proteínicos similares y/o mediando utilización de la ecuación de
Arrhenius o de otros modelos matemáticos fijamente establecidos.
Habitualmente, la velocidad de los procesos de
degradación en soluciones de proteínas en las condiciones reales de
almacenamiento (p.ej. +2 hasta +8ºC) es lenta. A unas temperaturas
elevadas, aumentan los movimientos de las moléculas y sus
amplitudes de oscilación. De esta manera se llega a unas colisiones
más frecuentes de las moléculas y, como consecuencia de ello,
también a una degradación más fuerte de las moléculas. La relación
entre la velocidad de reacción y la temperatura fue recopilada por
van't Hoff en la regla de la velocidad de reacción y la temperatura
(regla RGT). Esta regla expresa que una elevación de la temperatura
en torno a 10 grados Kelvin tiene como consecuencia un aumento de
la velocidad de reacción en el múltiplo de dos hasta cuatro veces.
En términos matemáticos y físicos, este fenómeno es descrito por
medio de la ecuación de Arrhenius, según la cual la dependencia de
la velocidad de reacción con respecto de la temperatura es una
función exponencial.
La adición de agentes estabilizadores a una
formulación proteínica es frecuentemente el medio a elegir, a fin
de mejorar la estabilidad de una proteína. No obstante, hasta ahora
no se ha conseguido desarrollar una estrategia universal de
estabilización, que se pueda aplicar a todas las proteínas. Se
especula que el efecto protector de una sustancia estabilizadora es
dependiente de las propiedades estructurales específicas de la
proteína que se debe de estabilizar. A causa de este fenómeno, las
sustancias estabilizadoras para determinadas proteínas se escogen
predominantemente con ayuda de estudios empíricos. Como posibles
agentes estabilizadores se utilizan, entre otros, agentes
antioxidantes o agentes reductores destinados a impedir la
degradación oxidativa, agentes inhibidores de proteinasas
destinados a la evitación de procesos proteolíticos, agentes
quelantes para la exclusión de iones de metales pesados, o agentes
bacteriostáticos y fungicidas destinados a la evitación del
crecimiento de microbios. Las pérdidas de actividad por medio
defectos físicos, tales como los de adsorción, desnaturalización a
través de superficies, desnaturalización por calor, desecación, y
congelaciones y descongelaciones repetidas, se pueden reducir
manifiestamente en muchos casos mediante la adición de glicerol,
hidratos de carbono, aminoácidos, polímeros hidrófilos o proteínas
inertes. Una albúmina de suero humano (HSA), una albúmina de suero
bovino (BSA) o una ovalbúmina son utilizadas frecuentemente como
agentes estabilizadores para proteínas liofilizadas. Una desventaja
en el caso de la utilización de tales aditivos para proteínas es la
posible contaminación con materiales biológicamente activos, tales
como p.ej. proteasas o agentes inhibidores de proteasas, que
influyen negativamente sobre la actividad biológica de la proteína,
que propiamente debe de ser estabilizada. Además de esto, la
adición de grandes cantidades de albúminas excluye, en la mayoría de
los casos, la posibilidad de un subsiguiente análisis
físico-químico de la proteína deseada.
El documento de patente de los EE.UU.
US-B2-6.514.940 divulga una
formulación líquida de antitrombina III, que está protegida por
ciertos agentes estabilizadores (p.ej. sacarosa, aminoácidos, y
adicionalmente sulfato de amonio):
El presente invento se basó en la misión de
poner a disposición un procedimiento para la estabilización de
serina - endopeptidasas.
En el caso de una serina - endopeptidasa se
trata, en el sentido del presente invento, de una enzima, que tiene
las siguientes características estructurales o respectivamente
funcionales:
- I.
- En el caso de una serina - endopeptidasa se trata siempre de una hidrolasa, que disocia enlaces peptídicos;
- II.
- esta actividad depende de un conjunto de radicales de aminoácidos, que, referido a la estructura primaria de la enzima, pueden estar situados muy alejados unos de otros, pero que, a través de una estructura de rango más alto, están situados en proximidad en el centro catalítico activo ("triada catalítica"), siendo uno de estos radicales de aminoácidos siempre un radical de serina;
- III.
- al contrario que las denominadas exopeptidasas, que disocian a un polipéptido desde el extremo terminal de C o N, y que, según sea su especificidad, ponen en libertad a tripéptidos, dipéptidos o también a aminoácidos individuales, una serina - endopeptidasa disocia a unos enlaces peptídicos, que se encuentran dentro de una proteína o de un polipéptido;
- IV.
- una serina - endopeptidasa es inhibida irreversiblemente por el fluoruro de fenil-metil-sulfonilo (PMSF), puesto que el PMSF sulfonila al radical de serina, que está situado en el centro activo.
- V.
- una serina - endopeptidasa es inhibida irreversiblemente por el fluoro-fosfato de diisopropilo (DFP), puesto que el DFP fosforila al radical de serina, que está situado en el centro activo.
De acuerdo con la Clasificación Internacional de
Enzimas (en inglés "Enzyme Clasification" = E.C.), que fue
creada por la International Union of Pure and Applied Chemistry
[Unión Internacional de Química Pura y Aplicada] (IUPAC) y por la
International Union of Biochemistry [Unión Internacional de
Bioquimica], a cada enzima se le asigna un número de E.C., que se
compone de cuatro dígitos (véase también
www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme). Las serina - endopeptidasas, que
tienen las características antes mencionadas, se recopilan en la
clase de enzimas E.C.3.4.21. Los miembros individuales de esta
clase reciben en cada caso un dígito adicional. En la Tabla 1 se
enumeran los miembros conocidos hasta ahora de la clase enzimática
de las serina - endopeptidasas E.C. 3.4.21.
\vskip1.000000\baselineskip
La mayoría de las serina - endopeptidasas son de
origen animal o respectivamente humano, son segregadas y disponen
de un péptido de señal situado en el terminal de N. Las serina -
endopeptidasas, que disponen de uno de tales péptidos de señal,
situado en el terminal de N, son sintetizadas primeramente como
compuestos precursores con un propéptido situado en el terminal de
N. En el transcurso de la activación de una tal serina -
endopeptidasa se separa el propéptido situado en el terminal de N,
no siendo necesaria siempre una separación total del propéptido
para la activación, sino que en algunos casos el propéptido, después
de su disociación, permanece unido a la cadena pesada de la
proteasa a través de puentes de disulfuro. No obstante, la
disociación del precursor conduce a una modificación estructural
dentro de la molécula proteínica, con lo cual el centro catalítico
de la proteasa se transforma en el estado activo.
A las serina - endopeptidasas pertenecen, entre
otros, también los factores de coagulación de la sangre factor II
(F II), factor VII (F VII), factor IX (F IX), factor X (F X), factor
XI (F XI) y factor XII (F XII). En la forma activada, los factores
son hechos reconocibles por el apéndice "a": factor IIa (F IIa,
trombina), factor VIIa (F VIIa), factor IXa (F IXa), factor Xa (F
Xa), factor XIa (F IXa) y factor XIIa (F XIIa). En lo sucesivo, se
ha de explicar el presente invento con el ejemplo de los factores de
coagulación de la sangre, sin que el alcance del invento tenga que
estar limitado a este conjunto.
Las formulaciones de factores de coagulación de
la sangre aislados o enriquecidos se requieren para finalidades
tanto terapéuticas como también diagnósticas. En el caso del
tratamiento de enfermedades, que están condicionadas por una
deficiencia congénita o adquirida de uno o varios factores de
coagulación de la sangre, se inyectan al paciente frecuentemente
unas formulaciones de sustitución, que contienen, en una forma
concentrada, el o los factor(es) de coagulación de la
sangre, que faltan. En este caso, los factores de coagulación de la
sangre son parte componente de una formulación farmacéuticamente
compatible. En el sector del diagnóstico se utilizan unos factores
de coagulación de la sangre, de manera preferida unos factores
activados de coagulación de la sangre, como parte componente de
unos reactivos, que se requieren en procedimientos de ensayo para la
determinación cuantitativa o cualitativa de una actividad biológica
o de un analito en una muestra de un paciente. Como ejemplos se
citarán unos reactivos, que contienen el F Xa o la trombina, que se
pasan a emplearse en procedimientos de ensayo cromógenos para la
determinación de antitrombina o heparina.
En lo que se refiere a los estuches de ensayo,
los reactivos o los productos empleables terapéuticamente, es
especialmente digno de pretenderse poner a disposición los
componentes individuales de un estuche de ensayo, los reactivos o
los productos, que están previstos para la aplicación terapéutica,
en forma de formulaciones líquidas prestas para el uso, puesto que
de esta manera se pueden evitar unas etapas adicionales de trabajo,
tales como p.ej. la reconstitución de productos liofilizados, y
además se pueden disminuir ciertas fuentes de errores, tales como
p.ej. la disolución insuficiente de una sustancia, la utilización de
un disolvente incorrecto o de un volumen de solución incorrecto,
así como las contaminaciones en el caso de la preparación de
soluciones o suspensiones a partir de un polvo liofilizado, las
cuales pueden repercutir negativamente sobre la calidad y la
seguridad del procedimiento de ensayo global. Tampoco se ha de
subestimar el riesgo para la salud de los pacientes, que puede
resultar por medio de la administración de un agente terapéutico
reconstituido de una manera incorrecta. Un criterio especialmente
importante en el caso del desarrollo de reactivos de ensayo
líquidos o de productos farmacéuticos líquidos lo constituye una
durabilidad estable lo más larga que sea posible (de por lo menos
varios meses) en el estado líquido en unas condiciones de
almacenamiento, tales como p.ej. a una temperatura del ambiente
comprendida entre +15 y +25ºC, o a unas temperaturas de un armario
frigorífico situadas entre +2 y +8ºC.
Es especialmente problemática la puesta a
disposición de unas formulaciones líquidas estables a largo plazo,
prestas para el uso, que contienen una enzima activa, tal como p.ej.
un factor activo de coagulación de la sangre, ya que muchas enzimas
activas se distinguen por una inestabilidad inmanente. Así, p.ej. el
F Xa activado, en comparación con el F X inactivo, es una enzima
inestable, lo que conduce a que la actividad catalítica del F Xa
purificado disminuya con la duración del almacenamiento. Por este
motivo, los reactivos, que contienen un factor activado de
coagulación de la sangre, tal como p.ej. la trombina o el F Xa, son
puestos a disposición hasta ahora en una forma liofilizada, y son
reconstituidos tan sólo poco antes de su uso mediante disolución en
un disolvente adecuado, tal como agua o un tampón, o ellos son
conservados en el estado profundamente enfriado, y son
descongelados tan sólo poco antes de su uso.
A partir de la bibliografía se conocen unas
formulaciones de factores de coagulación de la sangre, que son
estabilizadas mediante la adición de diversos aditivos. Así, por
ejemplo, para el F Xa bovino purificado se informa que para el F Xa
disuelto en agua, mediante la adición de un 50% (v/v =
volumen/volumen) de glicerol y un almacenamiento a -20ºC, se
consigue una estabilización durante por lo menos cinco meses,
mientras que una formulación del F Xa, almacenada a +4ºC en un
tampón de imidazol, tiene ya después de una semana solamente un 90%
de la actividad original [véase la columna derecha en la página
7.736 en la cita bibliográfica de Bajaj, S.P. & Mann, K. G.
(1973) Simultaneous purification of bovine prothrombin and Factor X
[Purificación simultánea de protrombina bovina y del factor X
bovino] J. Biol. Chem. 248, 7.729-7.741]. En el
documento de patente alemana DE 43.25.872 C1 se describe una
formulación de F Xa desactivada en cuanto a virus, que se mezcla
facultativamente con sacarosa o con una albúmina humana, pero que se
liofiliza para la estabilización a largo plazo. Durante un período
de tiempo de seis semanas a +37ºC no se pudo observar ninguna
modificación de la actividad del F Xa. En el documento de solicitud
de patente europea EP 680.764 A2 se describe un procedimiento para
la preparación de formulaciones de proteínas desactivadas en cuanto
a virus, en el que las proteínas que se deben de estabilizar, tales
como p.ej. el F Xa, se asocian con vesículas lipídicas, mientras que
se prescinde dela utilización de aditivos estabilizadores. El
documento EP 1.153.608 A1 describe una solución proteínica, que
contiene uno o varios factores de coagulación de la sangre y que
está protegida por la adición de agentes estabilizadores contra una
pérdida de actividad al realizar la pasteurización. Como
estabilizadora se describe la adición de sacáridos y/o de
aminoácidos escogidos entre el conjunto formado por arginina,
lisina, histidina, fenilalanina, triptófano, tirosina, ácido
aspártico y sus sales, y ácido glutámico y sus sales.
El presente invento se basó en la misión de
poner a disposición una formulación estable a largo plazo en el
estado líquido, que contenga una serina - endopeptidasa. La solución
del problema planteado por esta misión consiste en la puesta a
disposición de los procedimientos y objetos descritos en las
reivindicaciones.
Un objeto del presente invento es una
formulación, que contiene por lo menos una serina - endopeptidasa,
estando contenida la serina - endopeptidasa en la formulación en
una pureza y una concentración deseadas. De manera preferida, en el
caso de la serina - endopeptidasa, que está contenida en la
formulación, se trata de una serina - endopeptidasa purificada. La
obtención de una serina - endopeptidasa purificada se puede efectuar
mediante un procedimiento arbitrario, que aparezca como adecuado
para un experto en la especialidad, el cual haga posible la
purificación de la serina - endopeptidasa a partir del material
orgánico en bruto, en el que se presenta por naturaleza la serina -
endopeptidasa, o que se había producido por tecnología genética.
Según sea la pureza deseada de la serina - endopeptidasa, se pueden
aplicar unos procedimientos de purificación, que hagan posible la
separación de sustancias acompañantes, tales como hidratos de
carbono, lípidos, ácidos nucleicos, proteínas y/u otras
biomoléculas. Los materiales en bruto para la obtención de una
serina - endopeptidasa pueden ser p.ej. tejidos o líquidos
corporales animales o humanos (p.ej. sangre, plasma, suero, un
líquido linfático), materiales sobrenadantes o materiales lisados
de cultivos celulares animales o humanos, o cultivos de células
eucarióticas o de microorganismos, tales como bacterias u hongos,
que expresan una serina - endopeptidasa recombinante. Ejemplos de
procedimientos, que se utilizan de una manera conocida para la
purificación de proteínas, son unos procedimientos cromatográficos
de separación, tales como las cromatografías por intercambio de
iones, por filtración a través de un gel, por interacción hidrófoba
o la por afinidad. Junto a éstas, se pueden utilizar también la
electroforesis preparativa en gel, el enfoque isoeléctrico
preparativo, el enfoque por cromatografía, la precipitación y la
ultracentrifugación para la purificación de proteínas a partir de un
extracto de proteínas.
El presente invento se refiere a una
formulación, que contiene por lo menos una serina - endopeptidasa y
adicionalmente o bien a) acetato de amonio (CH_{3}COONH_{4}) o
b) por lo menos un poli(aminoácido) o c) glicerol, en común
con por lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado
por ácido aspártico y sus sales, ácido glutámico y sus sales,
histidina y glicina, o d) una combinación arbitraria de los aditivos
a), b) y c).
Se encontró que la sola adición de a) acetato de
amonio, la sola adición de b) por lo menos un
poli(aminoácido), la sola adición de c) glicerol en común
con por lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado
por ácido aspártico y sus sales, ácido glutámico y sus sales,
histidina y glicina, así como la adición de una combinación de los
aditivos a) y b), o a) y c), o b) y c), o a) y b) y c), dan lugar a
una estabilización de la serina - endopeptidasa. Sorprendentemente,
una formulación conforme al invento en el estado líquido dispone de
una estabilidad más alta y, por consiguiente, de una capacidad de
almacenamiento más larga que una correspondiente formulación en
ausencia de los aditivos que se han mencionado.
Para la determinación de la estabilidad de una
formulación conforme al invento se llevaron a cabo estudios de
estabilidad en condiciones aceleradas de estrés (véase p.ej. el
Ejemplo 1). Se investigó la estabilidad de una formulación en el
estado líquido a una temperatura de +52ºC. Como estabilidad se
designa en el presente contexto la conservación de la actividad
biológica de una formulación. La estabilidad de una formulación es
tanto más alta cuanto más pequeña sea la pérdida de la actividad
biológica de la serina - endopeptidasa que está contenida, o cuanto
más pequeño sea el número de productos de degradación de la serina -
endopeptidasa que está contenida.
Se pudo observar que p.ej. la serina -
endopeptidasa F Xa, en una formulación conforme al invento presenta
en el estado líquido, durante un período de tiempo de 48 horas a una
temperatura de almacenamiento de +52ºC, una pérdida de actividad de
menos que 50%. Con ayuda de la ecuación de Arrhenius, basándose en
la estabilidad de la formulación a +52ºC, se puede estimar de un
modo basto la estabilidad, que se ha de esperar de la formulación a
otras temperaturas. Según la ecuación de Arrhenius, la estabilidad
de una muestra a +2ºC, frente a la estabilidad a +52ºC, estimada de
un modo basto, aumenta aproximadamente en un múltiplo de 32 veces,
es decir que p.ej. unas actividades, que se miden después de una
incubación durante dos días a +52ºC p.ej, se pueden esperar todavía
después de aproximadamente 64 días a una temperatura de
almacenamiento de sólo +2ºC,. Para la determinación de la pérdida
de actividad, se determina de manera preferida la actividad de la
serina - endopeptidasa, que está contenida en la formulación, y
ciertamente una vez en el momento t_{o}, es decir inmediatamente
después de la preparación de la formulación líquida, y por lo menos
una vez más, después de un almacenamiento de la formulación líquida
a +52ºC durante un período de tiempo definido, de manera preferida
durante un período de tiempo de 48 horas. La pérdida de actividad
se establece por medio de la comparación de la actividad medida en
el momento t_{o} (que corresponde a un 100%) con la actividad, que
se mide todavía después de un almacenamiento de la formulación
líquida a +52ºC. Para la determinación de la estabilidad de una
formulación, que contiene, por ejemplo, el F Xa en una forma
enriquecida, se adecua p.ej. un procedimiento, en el que se mide la
actividad proteolítica del F Xa con ayuda del desdoblamiento de un
substrato peptídico cromógeno (véase el Ejemplo 1).
Una forma de realización preferida del invento
se refiere a una formulación, que contiene por lo menos una serina
- endopeptidasa y adicionalmente acetato de amonio para la
estabilización. Una tal formulación puede contener adicionalmente
glicerol o adicionalmente por lo menos un aminoácido escogido entre
el conjunto formado por ácido aspártico y sus sales, ácido
glutámico y sus sales, histidina y glicina.
Una forma de realización adicional del invento
se refiere a una formulación, en la que está contenida por lo menos
una serina - endopeptidasa y adicionalmente por lo menos un
poli(aminoácido) para realizar la estabilización. Una tal
formulación puede contener adicionalmente glicerol o adicionalmente
por lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado por
ácido aspártico y sus sales, ácido glutámico y sus sales, histidina
y glicina.
Siempre y cuando que se haya añadido acetato de
amonio a una formulación conforme al invento, el acetato de amonio
está contenido de manera preferida en una concentración final de 25
a 1.000 mM, de manera más preferida de 400 a 1.000 mM, de manera
especialmente preferida de 700 a 1.000 mM.
Siempre y cuando que se haya añadido un
poli(aminoácido) a una formulación conforme al invento, se
puede tratar de manera preferida de un poli(aminoácido)
escogido entre el conjunto formado por un
poli-L-glutamato y un
poli-L-aspartato. Un
poli(aminoácido) está contenido de manera preferida en una
concentración final de 1 a 10 mM, de manera más preferida de 2 a 10
mM, de manera especialmente preferida de 2 a 5 mM.
Diferentes formas de realización de la
formulación conforme al invento pueden contener glicerol. Siempre y
cuando que a una formulación conforme al invento se le haya añadido
glicerol, el glicerol estará contenido de manera preferida en una
concentración final de 0,5 a 50 tantos por ciento en volumen, de
manera más preferida de 10 a 50 tantos por ciento en volumen, de
manera especialmente preferida de 30 a 50 tantos por ciento en
volumen.
Otras formas de realización de la formulación
conforme al invento pueden contener uno o varios aminoácidos
escogidos entre el conjunto formado por ácido aspártico y sus sales,
ácido glutámico y sus sales, histidina y glicina. Siempre y cuando
que a una formulación conforme al invento se le haya añadido un
aminoácido escogido entre el conjunto formado por histidina y
glicina, la histidina o la glicina estará contenida de manera
preferida en una concentración final de 10 a 250 mM, de manera más
preferida de 25 a 200 mM, de manera especialmente preferida de 100
a 150 mM. Siempre y cuando que a una formulación conforme al invento
se le haya añadido un aminoácido escogido entre el conjunto formado
por el ácido aspártico y sus sales y el ácido glutámico y sus
sales, el aminoácido o su sal estará contenido(a) de manera
preferida en una concentración final de 10 a 1.000 mM, de manera
más preferida de 400 a 1.000 mM, de manera especialmente preferida
de 500 y 800 mM.
Sorprendentemente, se encontró que la adición
del aminoácido lisina a una formulación, que contiene una serina -
endopeptidasa, al contrario que los aminoácidos antes mencionados,
actúa de un modo desestabilizador, y ciertamente en cualquier
combinación con uno o varios de los otros aditivos conformes al
invento. Por lo tanto, a unas formas de realización de las
formulaciones conformes al invento, que se deben de preferir
especialmente, no se les añade nada de lisina.
Otras formas de realización de la formulación
conforme al invento pueden contener adicionalmente uno o varios
azúcares no reductores, de manera preferida escogidos entre el
conjunto formado por sacarosa y trehalosa. Siempre y cuando que a
una formulación conforme al invento se le haya añadido un azúcar no
reductor, éste azúcar estará contenido de manera preferida en una
concentración final de 20 a 500 mM, de manera más preferida de 50 a
400 mM, de manera especialmente preferida de 200 a 300 mM.
A una formulación conforme al invento se le
pueden añadir, además de esto, todavía otros aditivos, tales como
p.ej. un poli(etilenglicol), una poli(etilenimina),
detergentes iónicos o no iónicos (p.ej. Triton®
X-100, Tween® 20, Brij® 35), agentes inhibidores de
proteasas, sales, tales como p.ej. iones de Ca^{2+}, heparinas,
albúminas, agentes conservantes con un efecto bactericida, fungicida
o algicida (p.ej. aziduro de sodio, Kathon®, Mergal®, etc.) y
otros, siempre y cuando que la presencia de un tal componente
adicional no disminuya la estabilidad de la formulación conforme al
invento, o no perjudique a la utilización de la formulación para una
finalidad específica. Así, en particular en el caso de una
formulación conforme al invento, que está prevista para una
utilización terapéutica, es necesario prescindir de aditivos
farmacéuticamente incompatibles.
El valor del pH de una formulación conforme al
invento puede estar situado entre 6,5 y 9,5, de manera preferida
entre 7,4 y 8,5, y es de una manera especialmente preferida de
8,0.
Unas formas preferidas de realización de la
formulación conforme al invento contienen una serina - endopeptidasa
escogida entre el conjunto formado por los factores de coagulación
de la sangre de procedencia animal o humana, en particular un
factor de coagulación de la sangre escogido entre el conjunto
formado por los F II, F VII, F IX, F X, F XI y F XII o
respectivamente entre el conjunto formado por los factores activados
de coagulación de la sangre F IIa, F VIIa, F IXa, F Xa, F XIa y F
XIIa. Además, se prefieren factores de coagulación de la sangre de
origen bovino.
Otras formas de realización de la formulación
conforme al invento contienen una serina - endopeptidasa escogida
entre el conjunto formado por los factores del complemento de
procedencia animal o humana, que comprenden los factores del
complemento C1r, C1s, el factor del complemento D y el factor del
complemento I.
Otras formas de realización de la formulación
conforme al invento contienen una o varias de las serina -
endopeptidasas que se enumeran en la Tabla 1. Unas formas de
realización especialmente preferidas contienen una serina -
endopeptidasa escogida entre el conjunto formado por quimotripsina,
tripsina, plasmina, acrosina, catepsina G, calicreína plasmática,
calicreína tisular, elastasa pancreática, elastasa de leucocitos,
convertasa de C3/C5 (clásica), convertasa de C3/C5 (alternativa),
subtilisina, proteinasa K, la proteína C activada, el activador del
plasminógeno de tejidos, el activador de la urocinasa y del
plasminógeno, furina, el factor de coagulación C de Limulus, el
factor de coagulación B de Limulus, la enzima de coagulación de
Limulus y el activador del factor V de veneno de
serpiente.
serpiente.
Debido al efecto estabilizador de los aditivos
conformes al invento, una formulación conforme al invento se pone a
disposición de manera preferida en una forma líquida. No obstante,
es posible liofilizar una formulación conforme al invento. A este
fin, a la formulación conforme al invento se le pueden añadir
eventualmente otros agentes estabilizadores con un efecto
crioprotector, tales como p.ej. polisacáridos tales como manitol, o
proteínas tales como albúminas de suero, o una poligelina, un
derivado de gelatina, o polioles.
Un objeto adicional del presente invento se
refiere a procedimientos para la preparación de una formulación
estabilizada conforme al invento, que contiene una serina -
endopeptidasa en una forma enriquecida, o respectivamente a
procedimientos para la estabilización de una formulación que
contiene una serina - endopeptidasa. Por tal concepto se ha de
entender cualquier procedimiento que asegure que a una formulación,
que contiene una serina - endopeptidasa, se le añada adicionalmente
o bien a) acetato de amonio (CH_{3}COONH_{4}) o b) por lo menos
un poli(aminoácido) o c) glicerol en común con por lo menos
un aminoácido escogido entre el conjunto formado por ácido
aspártico y sus sales, ácido glutámico y sus sales, histidina y
glicina o d) una combinación arbitraria de las adiciones a), b) y
c). En una forma de realización preferida, para esto, una solución
acuosa, que contiene una serina - endopeptidasa, se mezcla con una
o varias soluciones, que contienen en cada caso uno o varios de los
aditivos conformes al invento. En otra forma de realización
preferida, para esto, una solución acuosa, que contiene una serina
- endopeptidasa, se mezcla con uno o varios materiales sólidos
solubles, que contienen uno o varios de los aditivos conformes al
invento. En otra forma adicional de realización un material
liofilizado, que contiene la serina - endopeptidasa, se puede
disolver en un medio de reconstitución, que ya contiene uno o
varios de los aditivos conformes al invento.
El presente invento se refiere además a la
utilización de a) acetato de amonio y/o de b)
poli(aminoácidos) y/o de c) glicerol en combinación con por
lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado por ácido
aspártico y sus sales, ácido glutámico y sus sales, histidina y
glicina, para la estabilización de una formulación, que contiene
una serina - endopeptidasa.
Un objeto adicional del presente invento se
refiere a la utilización de una formulación estabilizada conforme
al invento, que contiene una serina - endopeptidasa, en un
procedimiento analítico o de diagnóstico, o en un procedimiento
biocatalítico de preparación o para finalidades terapéuticas. Una
utilización preferida se refiere a la utilización de una
formulación estabilizada conforme al invento como reactivo de ensayo
en un procedimiento de ensayo destinado a la determinación de un
analito o a la determinación de una actividad biológica, tal como
p.ej. el potencial de coagulación de una muestra de sangre o de
plasma con ayuda de un período de tiempo de coagulación.
Una forma de realización del presente invento se
refiere a la utilización de una formulación estabilizada, que
contiene subtilisina, en un procedimiento para la producción de
agentes de lavado, para la producción de piensos para animales, en
un procedimiento para la producción de cuero o para el
desdoblamiento de racematos en un procedimiento de síntesis
orgánica.
Una forma de realización adicional del presente
invento se refiere a la utilización de una formulación estabilizada,
que contiene la proteinasa K, en un procedimiento destinado a la
degradación de proteínas en materiales lisados de células y/o para
la liberación de ácidos nucleicos a partir de células o tejidos, o
en un procedimiento para la identificación de proteínas priónicas
(de Scrapie, etc.).
Una forma adicional de realización del presente
invento se refiere a la utilización de una formulación estabilizada,
que contiene furina, en un procedimiento destinado a la activación
de etapas precursoras enzimáticamente inactivas de enzimas
proteolíticas (zimógenos).
Una utilización preferida de una formulación
estabilizada conforme al invento, que contiene por lo menos un
factor de coagulación de procedencia animal o humana, escogido de
manera preferida entre el conjunto formado por los F II, F VII, F
IX, F X, F XI y F XII y/o entre el conjunto formado por los F IIa, F
VIIa, F IXa, F Xa, F XIa y F XIIa, es la utilización como reactivo
de ensayo en un procedimiento de ensayo para la determinación de
parámetros de coagulación y/o de fibrinólisis en muestras de sangre
o de plasma. Un ejemplo de una tal utilización de una formulación
como reactivo de ensayo lo constituye la utilización de una
formulación conforme al invento, que contiene el F Xa o el F IIa
(la trombina). Los reactivos que contienen el F Xa se utilizan en
diferentes procedimientos de ensayo del diagnóstico de la
coagulación, tales como p.ej. en procedimientos de ensayo para la
determinación de antitrombina o de heparina en muestras de
pacientes. Unas formas de realización de procedimientos de ensayo
basados en el F Xa se describen p.ej. en los documentos de patentes
EP 216.179 B1 (Ejemplo 2) y US 5.308.755 (Ejemplo 2). Estos
procedimientos tienen como fundamento el principio general de
ensayo, de que se reúne una muestra de un paciente, que se debe de
investigar, entre otras cosas, con un exceso del F Xa y se
determina la actividad inhibidora de F Xa de la antitrombina o
heparina, que está contenida en la muestra, mediante el recurso de
que después de una fase de incubación se determina la actividad
residual del F Xa, por ejemplo, con un substrato cromógeno. En
diferentes procedimientos de ensayo del diagnóstico de la
coagulación se utilizan también reactivos que contienen el F IIa
(trombina), tal como p.ej. en procedimientos de ensayo para la
determinación del tiempo de trombina, de la fibrina coagulable según
Clauss o también en procedimientos de ensayo para la determinación
de antitrombina o del cofactor 11 de la heparina. Estos
procedimientos de ensayo se basan esencialmente en el hecho de que
a una muestra de un paciente, que se ha de investigar, se le añade
una cantidad definida del F IIa (trombina), y o bien se mide la
formación de fibrina en forma de un período de tiempo de
coagulación, o se mide la disociación de un substrato de la
trombina. Una forma de realización de un procedimiento de ensayo,
basado en el F IIa (la trombina), para la determinación de
antitrombina, se describe p.ej. en el documento de patente europea
EP 216.179 B1 (Ejemplo 1). Debido a la falta de estabilidad de las
formulaciones habituales del factor Xa o del factor F IIa
(trombina), unos reactivos de ensayo que contienen el F Xa así como
el F IIa (trombina) se ponen a disposición predominantemente en
forma de materiales liofilizados. Debido a la buena estabilidad de
una formulación conforme al invento de F Xa o de F IIa (trombina),
es ventajosa la utilización de una formulación conforme al invento
de F Xa o de F IIa (trombina) como reactivo de ensayo, que se pueda
almacenar en el estado líquido durante un prolongado período de
tiempo. Otro ejemplo de una utilización de una formulación como
reactivo de ensayo es la utilización de una formulación conforme al
invento, que contiene quimotripsina, en un procedimiento destinado a
la determinación de
alfa_{1}-anti-quimotripsina, que
es un agente inhibidor de las proteasas celulares, tal como se
describe p.ej. en el documento de patente EP 216.179 B 1 (Ejemplo
5).
Un objeto adicional del presente invento se
refiere a la utilización de una formulación estabilizada conforme
al invento, que contiene una serina - endopeptidasa, como una
solución testigo o patrón en un procedimiento de ensayo, que está
previsto para la determinación cuantitativa o cualitativa de la
serina - endopeptidasa. Un ejemplo de esto es la utilización de una
formulación estabilizada conforme al invento como testigo o patrón,
que contiene un factor de coagulación de la sangre de procedencia
animal o humana, de manera preferida escogido entre el conjunto
formado por los F II, F VII, F IX, F X, F XI y F XII y/o entre el
conjunto formado por los F IIa, F VIIa, F IXa, F Xa, F XIa y F
XIIa, y ciertamente en un procedimiento de ensayo, que sirve para la
determinación de la concentración o de la actividad de uno de estos
factores. Por ejemplo, se puede utilizar una formulación conforme
al invento, que contiene el F X o respectivamente el F Xa, como
patrón o testigo en un procedimiento, que se emplea para la
determinación de la concentración o de la actividad del F X o
respectivamente del F Xa en muestras de pacientes. La actividad o
respectivamente la concentración, que se había determinado en la
muestra de un paciente por medio de un correspondiente ensayo de
actividad o ensayo inmunológico, se compara entonces con la
actividad o respectivamente la concentración, determinada en una
tanda paralela, del patrón o del testigo. La comparación de los
valores medidos de la muestra de un paciente con los valores medidos
del patrón o del testigo, que contienen una cantidad o actividad
definida de la serina - endopeptidasa, hace posible una evaluación
de la serina - endopeptidasa en la muestra de un
paciente.
paciente.
Un objeto adicional del presente invento se
refiere a un estuche de ensayo para la utilización en el caso de la
realización de un procedimiento de ensayo de diagnóstico. Un tal
estuche de ensayo conforme al invento, que puede contener uno o
varios componentes de ensayo, se distingue por el hecho de que
contiene una formulación conforme al invento, que contiene una
serina - endopeptidasa, de manera preferida en forma de una
formulación líquida. Ventajosamente, un estuche de ensayo contiene
adicionalmente por lo menos un componente adicional, que es
necesario para la realización del procedimiento de ensayo de
diagnóstico. En el caso de un procedimiento de ensayo cromógeno,
que sirve para la determinación de un agente inhibidor de la serina
- endopeptidasa (véanse los ensayos antes descritos de F Xa,
trombina y
alfa_{1}-anti-quimotripsina) están
contenidos en un estuche de ensayo de manera preferida
adicionalmente otros reactivos, tales como p.ej. un reactivo, que
contiene un substrato cromógeno, que es disociado por la respectiva
proteasa. Un estuche de ensayo para la utilización en un
procedimiento destinado a la determinación de heparina en una
muestra de un paciente, puede contener adicionalmente un reactivo,
que contiene antitrombina. Otro estuche de ensayo adicional para la
utilización en un procedimiento destinado a la determinación de
antitrombina en una muestra de un paciente puede contener
adicionalmente un reactivo, que contiene heparina. Además, un
estuche de ensayo conforme al invento puede contener p.ej. una o
varias soluciones tamponadoras, una o varias soluciones de
calibración y una o varias soluciones testigo. Los estuches de
ensayo, que están previstos para la utilización en un procedimiento,
en el que se determina la actividad biológica de un parámetro,
p.ej. de un agente inhibidor de proteasas, en un muestra de plasma,
pueden contener de manera preferida uno o varios plasmas de
calibración o respectivamente uno o varios plasmas testigos, tales
como p.ej. un plasma normal y/o un plasma anormal.
Otro objeto del presente invento se refiere a la
utilización de una formulación estabilizada conforme al invento
como agente terapéutico o para la preparación de un agente
terapéutico. Se prefiere la utilización de unas formulaciones, que
contienen por lo menos un factor de coagulación de la sangre de
procedencia animal o humana, escogido de manera preferida entre el
conjunto formado por los F II, F VII, F IX, F X, F XI y F XII y/o
entre el conjunto formado por los correspondientes factores
activados de coagulación de la sangre, para el tratamiento de
perturbaciones de la coagulación o respectivamente para la
preparación de un correspondiente agente terapéutico. Una
formulación conforme al invento que contiene los F X y/o F Xa, se
adecua p.ej. para el tratamiento de pacientes que tienen defectos
del sistema de coagulación o respectivamente para la preparación de
un correspondiente agente
terapéutico.
terapéutico.
Los siguientes Ejemplos de realización sirven
para explicar el procedimiento conforme al invento.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
La Figura 1 es una representación gráfica del
efecto estabilizador de diferentes concentraciones de acetato de
amonio en una formulación líquida de F Xa, que se había incubado
durante 48 horas a +52ºC. La actividad del F Xa, que estaba
contenida en las muestras, se determinó en los momentos t = 0; 1 h;
6 h; 24 h y 48 h a través de la disociación de un substrato
cromógeno de F Xa. La actividad medida en el momento t = 0 se
equiparó a 100%. Las actividades medidas en momentos posteriores se
pusieron en relación con ella. Se puede reconocer manifiestamente
que en el caso de la presencia de acetato de amonio en la
formulación líquida de F Xa, ha aumentado la estabilidad térmica
del F Xa frente al testigo sin acetato de amonio. El aumento de la
estabilidad es dependiente de la concentración, es decir que cuanto
más alta sea la concentración de acetato de amonio tanto más alto
será el efecto
estabilizador.
estabilizador.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
La Figura 2 es una representación gráfica del
efecto estabilizador de diferentes concentraciones de los
poli(aminoácidos) poliglutamato o respectivamente
poliaspartato en una formulación líquida del F Xa, que se había
incubado durante 48 horas a +52ºC. La actividad del F Xa, que está
contenida en las muestras, se midió en los momentos t = 0; 1 h; 6
h; 24 h y 48 h. La actividad medida en el momento t = 0 se equiparó
a 100%. Las actividades medidas en momentos posteriores se pusieron
en relación con ella. Se puede reconocer manifiestamente que en el
caso de la presencia de un poli(aminoácido) en la
formulación líquida de F Xa, ha aumentado la estabilidad térmica
del F Xa frente al testigo sin acetato de amonio. El aumento de la
estabilidad es dependiente de la concentración, es decir que cuanto
más alta sea la concentración de un poli(aminoácido) tanto
más alto será el efecto
estabilizador.
estabilizador.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
La Figura 3 documenta a un experimento de
comparación y es una representación gráfica del efecto
desestabilizador de diferentes concentraciones del aminoácido
lisina en una formulación líquida de F Xa, que se había incubado
durante 48 horas a +52ºC. Se puede reconocer manifiestamente, que en
el caso de la presencia de L-lisina en la
formulación líquida de F Xa, ha disminuido la estabilidad térmica
del F Xa frente al testigo sin L-lisina. La
disminución de la estabilidad es dependiente de la concentración, es
decir que cuanto más alta sea la concentración de
L-lisina tanto mayor será el efector
desestabilizador. Al contrario que las sustancias estabilizadoras
conformes al invento, la adición de L-lisina a una
formulación líquida de F Xa no sólo no tiene ningún efecto
estabilizador, sino que da lugar incluso al efecto contrario, a
saber, una desestabilización del F Xa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
La Figura 4 es una representación gráfica del
efecto estabilizador de diferentes concentraciones de acetato de
amonio en una formulación líquida de trombina, que se había incubado
durante 48 horas a +52ºC. La actividad de trombina, que estaba
contenida en las muestras, se midió en los momentos t = 0; 1 h; 6 h;
24 h y 48 h. La actividad medida en el momento t = 0 se equiparó a
100%. Las actividades medidas en momentos posteriores se
relacionaron con ella. Se puede reconocer manifiestamente, que en el
caso de la presencia de acetato de amonio en la formulación líquida
de trombina, ha aumentado la estabilidad térmica de la trombina
frente al testigo sin acetato de amonio. El aumento de la
estabilidad es dependiente de la concentración, es decir que cuanto
más alta sea la concentración de acetato de amonio tanto más alto
será el efecto estabilizador.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para la obtención del F X humano se llevó a
disolución un material liofilizado de un complejo de protrombina,
que se había preparado a partir de un plasma humano, y las proteínas
de la formulación a base del complejo de protrombina se
precipitaron por adición de 25% (p/v = peso/volumen)) de sulfato de
amonio. La mezcla precipitada de proteínas se separó por
centrifugación con respecto del material sobrenadante, se
resuspendió, y se dializó frente a un tampón de citrato de trisodio
dihidrato (4,0 g/l), de pH 6,5. El material dializado se
cromatografió seguidamente a través de un material de sulfato de
dextrano -Sepharose. El F X se separó con respecto de los
componentes proteínicos restantes del complejo de protrombina con
ayuda de un gradiente de cloruro de sodio en un tampón de citrato
de trisodio dihidrato (de pH 6,5). Las fracciones que contenían el F
x se reunieron y se dializaron frente al volumen diez veces mayor
de un tampón (de pH 8,0), que contenía 6 g/l de
tris-hidroximetil-aminometano y 0,6
g/l de cloruro de calcio dihidrato. La activación del F X para dar
el F Xa se efectuó mediante una adición de 5 mg de RVV (de Rusell's
Viper Venom = veneno de víbora de Russell) por litro de la
agrupación del factor Xa y mediante una subsiguiente incubación a
la temperatura ambiente durante una noche. El F Xa preparado de
esta manera se concentró mediante una precipitación con sulfato de
amonio y se recogió en 30 g/l de
tris-hidroximetil-aminometano, 60
g/l de cloruro de sodio (de pH 8,0). Para el almacenamiento se
liofilizó a continuación la solución proteínica, que contenía el F
Xa. El material liofilizado contenía 2 U del F Xa por mg,
correspondiendo la unidad 1 U a la cantidad de enzima, que está
contenida en 1 ml de un plasma normalizado.
En cada caso 2 mg del material liofilizado de F
Xa se disolvieron en 5,4 ml del tampón 1 (19 mmol/l de Tris/HCl, 67
mmol/l de NaCl, 81 mmol/l de CaCl_{2}, de pH 8,0), o
respectivamente en el tampón 1, que contenía adicionalmente una o
varias de las sustancias estabilizadoras conformes al invento, y a
continuación se reunieron con 1,35 \mul de Fragmin®, que es una
heparina de bajo peso molecular (1.000 U/ml; de Pharmacia,
Kalamazoo, EE.UU.), y con 31,7 \mul de aprotinina (1,4 mg/ml). La
concentración final de la solución original del F Xa fue de 0,73
U/ml.
Para la investigación de la estabilidad de las
formulaciones conformes al invento en condiciones aceleradas de
estrés, se formularon en cada caso dos muestras de cada una de las
formulaciones líquidas del F Xa conformes al invento, que contenían
una o varias sustancias estabilizadoras conformes al invento en una
concentración determinada. Todas las muestras del F Xa conformes al
invento así como las muestras testigo del F Xa, que contenían el F
Xa en el mismo tampón, pero sin ninguna adición de una sustancia
estabilizadora conforme al invento, se incubaron durante por lo
menos 48 horas a +52ºC en un bloque térmico.
Para la determinación de la actividad del F Xa
en una muestra, en el momento t = 0, es decir inmediatamente
después de la disolución del material liofilizado del F Xa en el
tampón 1 y antes del calentamiento a 52º C, y luego, después de
diferentes períodos de tiempo de incubación a +52ºC, se sacaron en
cada caso partes alícuotas de 80 \mul, y se determinó la
actividad del F Xa en el aparato automático de medición de la
coagulación Sysmex® Ca-7000 (de Sysmex Corporation,
Kobe, Japón). Para esto, la respectiva parte alícuota fue diluida
por el aparato automático de coagulación primeramente con 40 \mul
del tampón 1. Después de una incubación durante 12 segundos a
+37ºC, a cada muestra se le añadieron 80 \mul del reactivo
substrato
(Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-metilamida,
1,5 mM) y a continuación se incubó durante otros 84 segundos a
+37ºC. La formación dependiente de F Xa del cromóforo ANBA (ácido
5-amino-2-nitro-benzoico)
se registró a una temperatura de +37ºC y a una longitud de onda de
405 nm por medio del aparato automático de medición de la
coagulación, y a partir de ella se determinó la modificación de la
extinción como medida de la actividad del F Xa en \DeltaOD/min. Se
promediaron los resultados, que se habían determinado en paralelo
para las dos muestras de una determinada formulación líquida
de
F Xa.
F Xa.
En las Tablas 2 y 3 se muestran los efectos
estabilizadores de diferentes combinaciones de varios agentes
estabilizadores conformes al invento en una formulación líquida del
F Xa. En el momento t = 0 se llevó a cabo un ensayo con cromógeno
de la actividad del F Xa, tal como se ha descrito antes, y se
cuantificó la actividad de F Xa con ayuda de la modificación de la
extinción en \DeltaOD/min. A las 24 o respectivamente 48 horas
después del comienzo de la incubación a +52ºC, se determinó la
actividad remanente del F Xa de cada tanda de ensayo y se determinó
la disminución porcentual frente a la actividad en el momento t = 0.
La formación del cociente de la disminución porcentual de la señal
de medición de la muestra testigo sin ningún agente estabilizador
conforme al invento ("testigo") y de la disminución porcentual
de la señal de medición de una formulación conforme al invento
("muestra"), en cada caso en el momento t = 24 h o
respectivamente t = 48 h (disminución de la actividad del
testigo/disminución de la actividad de la muestra) ilustra el efecto
estabilizador de una composición conforme al invento. Los cocientes
que son > 1 apuntan a un efecto estabilizador de la sustancia
añadida o respectivamente de la combinación de sustancias añadidas;
los cocientes que fuesen < 1 apuntarían a un efecto
desestabilizador de la sustancia añadida o de la combinación de
sustancias añadidas; un cociente = 1 apunta a que una sustancia
añadida o una combinación de sustancias añadidas no tiene ningún
efecto sobre la estabilidad.
Como se desprende de la Tabla 2, la actividad
del F Xa en presencia de una combinación de glicerol con aspartato
de sodio y/o con glutamato de sodio es estabilizada esencialmente
mejor que en presencia de los aditivos individuales. La adición
adicional de acetato de amonio refuerza el efecto estabilizador
todavía más.
A partir de la Tabla 3 se desprende que la
actividad del F Xa en presencia de acetato de amonio y, en
particular, en presencia de acetato de amonio en común con
aspartato de sodio y/o glutamato de sodio, o en común con glicerol,
es estabilizada mejor que en ausencia de acetato de amonio.
En las Figuras 1-3 y en las
descripciones pertinentes de las Figuras se representan resultados
adicionales de los estudios de estabilidad.
Ejemplo
2
Análogamente a los experimentos en el Ejemplo 1,
se llevó a cabo un experimento de comparación, en el que se
prepararon unas formulaciones del F Xa mediante la utilización del
tampón 1, que contenía diferentes concentraciones del aminoácido
L-lisina. El efecto desestabilizador de la
L-lisina se representa en la Figura 3 y en la
descripción pertinente de esta Figura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se utilizó un material liofilizado de trombina
adquirible comercialmente. En este caso se trataba de una trombina
bovina liofilizada con adición de heparina, manitol, NaCl y
aprotinina. El material liofilizado se disolvió en el tampón 2 (12
g/l de Tris, 9 g/l de NaCl, de pH 8,2) o en el tampón 2, que
contenía adicionalmente acetato de amonio en diferentes
concentraciones. Las formulaciones de trombina, obtenidas de esta
manera, contenían aproximadamente de 4 a 5 UI de trombina por
ml.
Para la investigación de la estabilidad de las
formulaciones de trombina en condiciones aceleradas de estrés se
formularon en cada caso dos muestras de cada una de las
formulaciones líquidas conformes al invento de trombina, que
contenía acetato de amonio. Todas las muestras de trombina conformes
al invento así como las muestras testigo de trombina, que contenían
la trombina en el mismo tampón sin la adición de acetato de amonio,
se incubaron durante por lo menos durante 48 horas a +52ºC en un
bloque térmico.
Para la determinación de la actividad de
trombina en una muestra, en el momento t = 0, es decir
inmediatamente después de la disolución del material liofilizado de
trombina en el tampón 2 y antes del calentamiento a +52ºC, y luego,
después de diferentes períodos de tiempo de incubación a +52ºC, se
sacaron en cada caso partes alícuotas de 175 \mul, y se determinó
la actividad de trombina en el aparato automático de medición de la
coagulación Sysmex® Ca-7000 (de Sysmex Corporation,
Kobe, Japón). Para esto, la respectiva parte alícuota se mezcló en
el aparato automático de medición de la coagulación primeramente con
24 \mul del tampón de reacción. Después de una incubación durante
180 segundos a +37ºC, a cada muestra se le añadieron 33 \mul del
reactivo substrato
(Tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-isopropilamida,
2 mM). La formación, dependiente de trombina, del cromóforo ANBA
(ácido
5-amino-2-nitro-benzoico)
se registró a una temperatura de +37ºC y a una longitud de onda de
405 nm por el aparato automático de medición de la coagulación, y a
partir de ella se determinó la modificación de la extinción como
medida de la actividad de trombina en \DeltaOD/min. Se promediaron
los resultados, que se habían determinado en paralelo para las dos
muestras de una determinada formulación líquida de trombina.
Los resultados del estudio de estabilidad se
representan en la Figura 4 y en la descripción pertinente de esta
Figura.
Claims (17)
1. Formulación, que contiene por lo menos una
serina - endopeptidasa, caracterizada porque están
contenidos
- a)
- acetato de amonio y/o
- b)
- por lo menos un poli(aminoácido) y/o
- c)
- glicerol en común con por lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado por ácido aspártico y sus sales, ácido glutámico y sus sales, histidina y glicina
2. Formulación de acuerdo con la reivindicación
1, que contiene
- a)
- acetato de amonio y/o
- b)
- por lo menos un poli(aminoácido),
caracterizada porque está
contenido adicionalmente
glicerol.
3. Formulación de acuerdo con la reivindicación
1, que contiene
- a)
- acetato de amonio y/o
- b)
- por lo menos un poli(aminoácido),
caracterizada porque está
contenido adicionalmente por lo menos un aminoácido escogido entre
el conjunto formado por ácido aspártico y sus sales, ácido
glutámico y sus sales, histidina y
glicina.
4. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque está contenido
el acetato de amonio en una concentración final de 25 a 1.000 mM,
de manera preferida de 400 a 1.000 mM, de manera especialmente
preferida de 700 a 1.000 mM.
5. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque está contenido
por lo menos un poli(aminoácido) escogido entre el conjunto
formado por un poli-L-glutamato y un
poli-L-aspartato.
6. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque está contenido
un poli(aminoácido) en una concentración final de 1 a 10 mM,
de manera preferida de 2 a 10 mM, de manera especialmente preferida
de 2 a 5 mM.
7. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque está contenido
el glicerol en una concentración final de 0,5 a 50 tantos por
ciento en volumen, de manera preferida de 10 a 50 tantos por ciento
en volumen, de manera especialmente preferida de 30 a 50 tantos por
ciento en volumen.
8. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque está contenido
el por lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado
por histidina y glicina en una concentración final de 10 a 250 mM,
de manera preferida de 25 a 200 mM, de manera especialmente
preferida de 100 a 150 mM.
9. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque está contenido
el por lo menos un aminoácido escogido entre el conjunto formado
por ácido aspártico y sus sales y ácido glutámico y sus sales, en
una concentración final de 10 a 1.000 mM, de manera preferida de 400
a 1.000 mM, de manera especialmente preferida de 500 a 800 mM.
10. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque además está
contenido por lo menos un azúcar no reductor.
11. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la serina -
endopeptidasa, que está contenida, es un factor de coagulación de
la sangre, de procedencia animal o humana, escogido entre el
conjunto formado por los F II, F VII, F IX, F X, F XI, F XII, F IIa,
F VIIa, F IXa, F Xa, F XIa y F XIIa.
12. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la serina -
endopeptidasa, que está contenida, es un factor del complemento, de
procedencia animal o humana, escogido entre el conjunto formado por
los C1r, C1s, el factor del complemento D y el factor del
complemento I.
13. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la serina -
endopeptidasa que está contenida, procede del siguiente conjunto:
quimotripsina, tripsina, plasmina, acrosina, catepsina G,
calicreína plasmática, calicreína tisular, elastasa pancreática,
elastasa de leucocitos, convertasa de C3/C5 (clásica), convertasa
de C3/C5 (alternativa), subtilisina, proteinasa K, la proteína C
activada, el activador del plasminógeno de tejidos, el activador de
la urocinasa y del plasminógeno, furina, el factor de coagulación C
de Limulus, el factor de coagulación B de Limulus, la enzima de
coagulación de Limulus y el activador del factor V de veneno de
serpiente.
14. Formulación de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque la formulación
es líquida.
15. Utilización de una formulación de acuerdo
con la reivindicación 11 en un procedimiento de ensayo para la
determinación de un parámetro de la coagulación.
16. Utilización de una formulación de acuerdo
con la reivindicación 11, que contiene el F Xa o el F IIa, en un
procedimiento de ensayo para la determinación de antitrombina.
17. Utilización de una formulación de acuerdo
con la reivindicación 11, que contiene el F Xa, en un procedimiento
de ensayo para la determinación de heparina.
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