ES2964819T3 - Fibrinógeno líquido estable - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a una composición que comprende fibrinógeno estable en forma líquida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Fibrinógeno líquido estable
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición que comprende fibrinógeno estable en forma líquida, útil en terapia.
Contexto de la invención
El fibrinógeno es una proteína esencial para la coagulación de la sangre, debido a que su polimerización en fibrina insoluble formada al final de la cascada de reacciones que gobiernan la coagulación, resulta en la formación de un coágulo que obtura la brecha vascular, responsable del sangrado.
La implementación del coágulo es así esencial para asegurar que se detenga el sangrado. Además, la fibrina que se forma a nivel de la herida constituye una red fibrilar que asegura la reparación del tejido y, por lo tanto, la cicatrización. Actualmente, muchas patologías se tratan por vía intravenosa utilizando composiciones que comprenden fibrinógeno. Se pueden citar, por ejemplo, las hipo-fibrinogenemias, las dis-fibrinogenemias o las a-fibrinogenemias constitucionales en pacientes que tienen hemorragia espontánea o postraumática, el tratamiento complementario en el manejo de una hemorragia grave no controlada en el contexto de una hipofibrinogenemia adquirida, etc.
Para el tratamiento de determinadas patologías, el uso de composiciones que comprenden fibrinógeno estable al almacenamiento y listo para su uso puede resultar especialmente ventajoso. En efecto, esta forma de administración ofrece más flexibilidad y velocidad de administración a los médicos, mejorando la atención urgente de los pacientes hemorrágicos. Para este fin, se han desarrollado composiciones que comprenden fibrinógeno liofilizado, estables al almacenamiento y adecuadas para una rápida constitución. Sin embargo, la reconstitución de tales composiciones liofilizadas requiere unos pocos minutos. Además, la reconstitución debe llevar a cabose suavemente para permitir la completa disolución del liofilizado, garantizando la concentración del producto, sin formación de espuma, turbiedad o depósitos que harían la composición difícilmente o no administrable.
El uso de tales productos liofilizados no es por lo tanto óptimo en un contexto de medicina de urgencia intra- o perihospitalaria, en el que cada minuto cuenta para el tratamiento de la hemorragia.
Hasta la fecha, las composiciones que contienen fibrinógeno se comercializan en forma liofilizada para ser reconstituidas y no ofrecen una entera satisfacción, en particular en términos de la estabilidad del líquido.
En particular, Chabbat et al (Thrombosis Research, vol. 76, N° 6, 525-533, 1994), describe una composición de fibrinógeno que comprende NaCl, ácido aminocaproico, glicina, arginina y aprotinina. La aprotinina, un inhibidor competitivo de las serina proteasas natural, es no obstante desfavorable para los pacientes cuando se administra por vía intravenosa, por un lado desde el punto de vista de su origen animal (preparado a partir de pulmón bovino), con un riesgo importante de choque anafiláctico, y por otro lado en cuanto a su actividad anticoagulante que puede agravar el defecto de coagulación del paciente a tratar.
La solicitud WO0021568 describe composiciones que comprenden fibrinógeno, iones calcio, un inmunoestimulador y antifibrinolíticos, para su uso como pegamento de fibrina. Sin embargo, tales composiciones no pueden administrarse por vía intravenosa a los pacientes.
La solicitud EP1648496 de la solicitante describe ella composiciones que comprenden fibrinógeno, estabilizado mediante la adición de arginina, citrato trisódico, leucina/isoleucina y glicina y/o lisina, que permiten la estabilización y la solubilización del liofilizado. Sin embargo, tal composición no es completamente adecuada para una formulación líquida de fibrinógeno.
El documento US7550567 describe una formulación que comprende 2% de fibrinógeno degradado. En el documento US7550567, la degradación del fibrinógeno significa la obtención de fragmentos de fibrinógeno. La cantidad de estos fragmentos de fibrinógeno degradado se determina mediante cromatografía de exclusión sérica SEC-HPLC. Esta técnica no da ninguna información sobre la actividad coagulante del fibrinógeno y de ninguna manera es representativa de la actividad coagulante del fibrinógeno. El fibrinógeno no degradado descrito en el documento US7550567 no puede asimilarse directamente con el fibrinógeno coagulable.
El documento WO2015/136217 describe un procedimiento para preparar concentrados de proteínas plasmáticas que son las inmunoglobulinas, el fibrinógeno y/o la albúmina. El procedimiento del documento WO2015/136217 permite en particular obtener fibrinógeno, por lo que se puede usar. Sin embargo, el documento WO2015/136217 no tiene como objetivo específica y únicamente obtener fibrinógeno. Las condiciones no son por lo tanto óptimas para la obtención de fibrinógeno. El objetivo del documento WO2015/136217 no es obtener el mejor rendimiento de fibrinógeno ni el fibrinógeno más puro, sino por el contrario estar en condiciones que permiten el mejor compromiso para la obtención al mismo tiempo de inmunoglobulinas, de fibrinógeno y de albúmina, a partir del mismo lote inicial de plasma.
Por ejemplo, en el Ejemplo 4 del documento WO2015/136217 la captura de fibrinógeno se lleva a cabo a partir de un plasma empobrecido en IgG y albúminas durante purificaciones previas.
Está claro que el plasma utilizado en el Ejemplo 4 del documento WO2015/136217 se ha sometido a otras etapas previamente, ya que, en este ejemplo, página 44, se indica claramente "plasma empobrecido en IgG y albúmina, recuperado al final del procedimiento de purificación de albúmina según el Ejemplo 3”. El Ejemplo 3 del documento WO2015/136217 indica el mismo, página 42, “plasma empobrecido en IgG, recuperado tras el procedimiento de purificación de IgG según el Ejemplo 2”.
El fibrinógeno en el documento WO2015/136217 se obtiene por lo tanto después de llevar a cabo las etapas descritas en el Ejemplo 2, en el Ejemplo 3 y en el Ejemplo 4, en particular las cromatografías en las condiciones descritas en la Tabla 9, la Tabla 15 y la Tabla 18 del documento WO2015/136217.
A título de ilustración, el pH se ajusta a 7,4 para la cromatografía del Ejemplo 2, después se ajusta a pH 6,5 para la cromatografía del Ejemplo 3 y después se vuelve a ajustar a pH 7,4 para la cromatografía del Ejemplo 4.
Todas estas manipulaciones y cambios en las condiciones pueden degradar el fibrinógeno y su capacidad de coagulación.
En este contexto, persiste la necesidad de composiciones líquidas que comprendan fibrinógeno fácil de usar.
La Solicitante ha desarrollado una nueva composición que comprende fibrinógeno, preferiblemente fibrinógeno humano, que es estable en estado líquido.
La invención se refiere por lo tanto a una composición que comprende fibrinógeno estable en forma líquida.
Resumen de la invención
Sorprendente y ventajosamente, la solicitante ha puesto en evidencia que es posible obtener composiciones que contienen fibrinógeno particularmente estable en el tiempo en forma líquida, utilizando un número limitado y cantidades mínimas de excipientes.
La invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A representa la estructura secundaria predicha de un aptámero de SEQ ID N°: 1. Los nucleótidos que pertenecen a la secuencia de base (SEQ ID N°: 66) están resaltados en gris.
La Figura 2A representa la estructura secundaria predicha de un aptámero de SEQ ID N°: 58. Los nucleótidos que pertenecen a la secuencia de bases (SEQ ID N°: 67) están resaltados en gris. El bucle encuadrado corresponde a la región del aptámero que comprende el grupo consenso de fórmula (III).
La Figura 2B representa las alineaciones de las secuencias de bases de SEQ ID N°: 67-74 Las porciones encuadradas de las secuencias comprenden la agrupación consenso de fórmula (III).
Las figuras 3-4 representan las propiedades de unión de ciertos aptámeros dirigidos contra un fibrinógeno humano obtenido mediante el procedimiento de la invención.
La Figura 3A representa las curvas de unión de SPR (resonancia de plasmón superficial) de un fibrinógeno plasmático humano presente a una concentración de 125 nM a 1000 nM en SEQ ID N°: 66 (la secuencia de base de SEQ ID N°: 1) inmovilizado en un chip. Cada disolución de fibrinógeno plasmático humano se inyectó a pH 6,3 de modo que se formó un complejo de una manera dependiente de la dosis, como lo muestra el aumento de las señales que dependen de la concentración de fibrinógeno. La inyección de una disolución amortiguador a pH 6,3 que comprende NaCl 0,5 M no indujo significativamente la elución del fibrinógeno plasmático humano. Se liberó entonces el fibrinógeno del complejo mediante amortiguador de elución a pH 7,40. Se regeneró entonces el soporte sólido mediante inyección de una disolución de NaOH 50 mM. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta SPR en unidad arbitraria.
La Figura 3B representa las curvas de unión de SPR de un fibrinógeno transgénico presente a una concentración de 125 nM a 1000 nM en SEQ ID N°: 66 (la secuencia de base de SEQ ID N°: 1) inmovilizado en un chip. Cada disolución de fibrinógeno transgénico se inyectó a pH 6,3 de modo que se formó un complejo de una manera dependiente de la dosis, como lo muestra el aumento de las señales que dependen de la concentración de fibrinógeno. La inyección de una disolución amortiguador a pH 6,3 que comprende NaCI 0,5 M no indujo significativamente la elución del fibrinógeno transgénico. Se liberó entonces el fibrinógeno del complejo mediante amortiguador de elución a pH 7,40. Se regeneró entonces el soporte sólido mediante inyección de una disolución de NaOH 50 mM. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta SPR en unidad arbitraria.
La Figura 3C representa las curvas de unión de SPR de un fibrinógeno plasmático humano presente a una concentración de 125 nM a 1000 nM en SEQ ID N°: 67 (la secuencia de base de SEQ ID N°: 58) inmovilizado en un chip. Cada disolución de fibrinógeno de plasma humano se inyectó a pH 6,3 de modo que se formó un complejo de una manera dependiente de la dosis, como lo muestra el aumento de las señales que dependen de la concentración de fibrinógeno.
La inyección de una disolución amortiguador a pH 6,3 que comprende NaCl 1M no indujo significativamente la elución del fibrinógeno plasmático humano. Se liberó entonces el fibrinógeno del complejo mediante amortiguador de elución a pH 7,40 y que contiene MgCl22M. Se regeneró entonces el soporte sólido mediante inyección de una disolución de NaOH 50 mM. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta SPR en unidad arbitraria.
La Figura 3D representa las curvas de unión de SPR de un fibrinógeno transgénico presente a una concentración de 125 nM a 1000 nM en SEQ ID N°: 67 (la secuencia de base de SEQ ID N°: 58) inmovilizado en un chip. Cada disolución de fibrinógeno transgénico se inyectó a pH 6,3 de modo que se formó un complejo de una manera dependiente de la dosis, como lo muestra el aumento de las señales que dependen de la concentración de fibrinógeno. La inyección de una disolución amortiguador a pH 6,3 que comprende NaCl 1M no indujo considerablemente la elución del fibrinógeno plasmático humano. Se liberó entonces el fibrinógeno del complejo mediante amortiguador de elución a pH 7,40 y que contiene MgCl22M. Se regeneró entonces el soporte sólido mediante inyección de una disolución de NaOH 50 mM. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta SPR en unidad arbitraria.
La Figura 4A representa sensogramas de SPR que ilustran la dependencia de la unión del fibrinógeno al aptámero inmovilizado de SEQ ID N°: 66 (la secuencia de base de SEQ ID N°: 1) con respecto al pH. El fibrinógeno plasmático se inyecta a diferentes pH, después de inyectar una muestra, se envía un amortiguador de migración a pH 6,30 en la célula de flujo en cada ensayo. El nivel más alto de unión se obtiene a pH 6,30. El nivel de unión disminuye a medida que aumenta el pH. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta SPR en unidad arbitraria.
La Figura 4B representa sensogramas de SPR que ilustran la dependencia con respecto al pH de la afinidad de unión del aptámero de SEQ ID N°: 67 (la secuencia de base de SEQ ID N°: 58) al fibrinógeno plasmático humano. No se observa ninguna unión para un pH superior a 6,8. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta SPR en unidad arbitraria.
La Figura 4C representa la curva de unión de un fibrinógeno plasmático humano (sensograma) para aptámeros de SEQ ID N°: 60 y SEQ ID N°: 65 (que pertenece al segundo subgrupo de aptámeros de la invención) inmovilizados en un chip, obtenidos mediante tecnología SPR. Se inyectó fibrinógeno plasmático humano purificado (250 nM) a pH 6,3, de modo que se formó un complejo como lo muestra el aumento de la señal. La inyección de una disolución amortiguador a pH 6,3 que comprende NaCl 0,5 M no indujo significativamente la elución del fibrinógeno plasmático humano. Se regeneró entonces el soporte sólido mediante inyección de una disolución de NaOH 50 mM. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta SPR en unidad arbitraria.
La Figura 5A representa el perfil cromatográfico de la purificación del fibrinógeno que proviene del plasma sobre un soporte de afinidad sobre el que se injerta un aptámero de SEQ ID N°: 66. Eje Y: absorbancia a 280 nm. Eje X: en ml.
La Figura 5B representa la fotografía de los geles de electroforesis después de la coloración con azul de Coomassie en condiciones no reducidas. De izquierda a derecha; 1: plasma; 2: la fracción que proviene del plasma que no fue retenida en la fase estacionaria, 3: fracción de elución que contiene fibrinógeno obtenida por cromatografía de plasma, 4: fracción obtenida después de la regeneración del soporte estacionario, y 5: marcadores de masa molecular. La pureza de la fracción de elución del fibrinógeno fue superior a 95% en función de la cantidad total de proteínas contenidas en la fracción. El soporte de afinidad utilizado en la cromatografía fue injertado con aptámeros de SEQ ID N°: 66.
La Figura 6A representa el perfil cromatográfico de la purificación de fibrinógeno que proviene de un plasma sobre un soporte de afinidad sobre el que se injerta un aptámero de SEQ ID N°: 67. Eje Y: absorbancia a 280 nm. Eje X: en ml.
La Figura 6B representa la fotografía de los geles de electroforesis después de la coloración con azul de coomassie en condiciones no reducidas. De izquierda a derecha; 1: plasma; 2: la fracción que proviene del plasma que no fue retenida en la fase estacionaria, 3: fracción obtenida después de lavar el soporte estacionario, 4: fracción de elución que contiene fibrinógeno obtenida por cromatografía de plasma, y 5: marcadores de masa molecular. La pureza de la fracción de elución de fibrinógeno fue de al menos 95% basándose en la cantidad total de proteínas contenidas en la fracción. El soporte de afinidad utilizado en la cromatografía fue injertado con aptámeros de SEQ ID N°: 67.
La Figura 7A representa el perfil cromatográfico obtenido para la purificación de fibrinógeno semi-purificado sobre un soporte de afinidad sobre el que se injerta un aptámero de SEQ ID N°: 66. Eje Y: absorbancia a 280 nm. Eje X: en ml.
La Figura 7B representa el perfil cromatográfico obtenido para la purificación de fibrinógeno semi-purificado sobre un soporte de afinidad sobre el que se injerta un aptámero de SEQ ID N°: 67. Eje Y: absorbancia a 280 nm. Eje X: en ml.
La Figura 7C representa el análisis de las fracciones mediante SDS-PAGE en condiciones reducidas y no reducidas, con una coloración con AgNOs, de las fracciones de elución obtenidas por purificación del fibrinógeno intermedio sobre los soportes de afinidad. Pista 1: estándar de masa molecular, Pista 2: intermedio de fibrinógeno (material de partida), Pista 3: Fracción de elución obtenida con el soporte de afinidad N° 1 (aptámeros de SEQ ID N°: 66), pista 4: Fracción de elución obtenida con el soporte de afinidad N° 1 (aptámeros de SEQ ID N°: 67).
La Figura 7D representa el análisis de las fracciones mediante SDS-PAGE en condiciones reducidas y no reducidas, con una coloración con Coomassie, de las fracciones de elución obtenidas por purificación del fibrinógeno intermedio sobre los soportes de afinidad. Pista 1: estándar de masa molecular, pistas 2 y 3: intermedio de fibrinógeno (material de partida), pista 4 y 5: Fracción de elución obtenida con el soporte de afinidad N° 1 (aptámeros de SEQ ID N°: 66), pistas 6 y 7: Fracción de elución obtenida con el soporte de afinidad N° 1 (aptámeros de SEQ ID N°: 67). NR: no reducido. R: reducido.
La Figura 8 representa el protocolo SELEX utilizado para identificar aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno humano.
La Figura 9 representa la unión competitiva de un aptámero de SEQ ID N°: 66 inmovilizado con fibrinógeno inyectado en presencia de variantes de aptámero. Aquí, cuanto mayor sea la afinidad de la variante por el fibrinógeno (en comparación con el aptámero de SEQ ID N°: 66), más débil será la respuesta durante la inyección de la mezcla variante/fibrinógeno. La variantes de SEQ ID N°: 66 que comprende una de las combinaciones de deleción (i) 1/2, (ii) 19/20/21, (iii) 18/19/20/21, (iv) 15/16/19/20 y (v) 14/15/16/20/21/22 siguientes tienen una fuerte afinidad por el fibrinógeno.
La Figura 10A representa las curvas de unión de fibrinógeno plasmático y transgénico humano (sensograma) para un aptámero que proviene de Base Pair Biotechnologies (referencia 6F01 oligo#370) inmovilizado en un chip de sensor, obtenido mediante la tecnología SPR. Se inyectó fibrinógeno plasmático y transgénico humano (1000 nM) a pH 7,40 utilizando el amortiguador recomendado por Base Pair Biotechnologies. Se observaron niveles de unión muy bajos para el fibrinógeno plasmático y transgénico humano. Se regeneró entonces el soporte sólido mediante inyección de una disolución de NaOH 50 mM. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta en unidad arbitraria.
La Figura 10B representa las curvas de unión de fibrinógeno plasmático humano (sensograma) para 3 aptámeros (aptámeros 85A, 121A y 121B) descritos en los datos complementarios de Li et al. (J Am Chem Soc, 2008, 130 (38): 12636-12638) inmovilizados en un chip de sensor, obtenidos mediante tecnología SPR. Se inyectó fibrinógeno plasmático humano (1000 nM) a pH 7,40, según lo recomendado por Li et al.Se observaron niveles de unión muy bajos para el fibrinógeno plasmático y transgénico humano. Se regeneró después el soporte sólido mediante inyección de una disolución de NaOH 50 mM. Eje X: tiempo en s. Eje Y: respuesta en unidad arbitraria.
Observaciones:
El amortiguador MBS designa 50 mM de MOPS/150 mM de NaCl.
El amortiguador de NaCl 1 M MBS significa 50 mM de MOPS 1 M y de NaCl.
El amortiguador M5 MBS designa: 50 mM de MOPS pH 6,30 / 150 mM de NaCl / 5 mM de MgCl2.
El amortiguador 0,5M M5 MBS designa 50 mM de MOPS pH 6,30 / 0,5 M de NaCl / 5 mM de MgCl2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El fibrinógeno es una proteína constituida por un dímero de tres cadenas polipeptídicas denominadas alfa, beta y gamma. El fibrinógeno es por lo tanto un dímero, y cada monómero está compuesto por tres cadenas (alfa, beta, gamma). La forma principal de fibrinógeno tiene un peso molecular (PM) de 340 kDa. El fibrinógeno está formado por dos subunidades idénticas unidas por puentes disulfuro, lo que le da a la molécula una forma de fibra que comprende 3 glóbulos: uno central (dominio E) y dos distales (dominio D). La molécula entera contiene 2964 aminoácidos: 610 aminoácidos para la cadena alfa (a), 461 aminoácidos para la cadena beta (p) y 411 aminoácidos para la cadena gamma (y). El fibrinógeno interviene en la hemostasia primaria y en la coagulación. Se prescribe con mayor frecuencia para el tratamiento de complicaciones asociadas con afibrinogenemia constitucional o grave, y síndromes hemorrágicos o riesgos de hemorragia asociados con hipofibrinogenemia.
Según la invención, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se evalúa midiendo la actividad coagulable del fibrinógeno con respecto a la medida antigénica del fibrinógeno (también denominada actividad específica). Según la invención, la composición de fibrinógeno estable tiene una relación fibrinógeno coagulable/fibrinógeno antígeno mayor que 0,5; preferiblemente mayor que 0,6; mayor que 0,7; mayor que 0,8; mayor que 0,9; incluso más preferiblemente aproximadamente igual a 1,0. De manera aún más ventajosa, una composición de fibrinógeno se considera estable si la relación entre su actividad coagulable y su actividad antigénica al final del ensayo es mayor que al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% en el valor inicial de esta relación (su valor antes del ensayo de estabilidad).
Por "fibrinógeno coagulable" se entiende la medida del fibrinógeno funcional mediante una técnica de coagulación, determinada según el método de von Clauss. La actividad coagulable se expresa en g/l de disolución de fibrinógeno. Esta técnica es conocida por el experto en la técnica que puede consultar la publicación Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, 237-246.
Por "antígeno de fibrinógeno" se entiende la cantidad de fibrinógeno, ya sea activo o no, medida mediante el método nefelométrico. La cantidad de fibrinógeno antigénico se expresa en g/l.
La composición según la invención está libre de proteasas y de activadores de fibrinólisis.
Por "composición de fibrinógeno libre de proteasas y de activadores de fibrinólisis", se entiende que la composición de fibrinógeno se ha sometido a una o más etapas que permiten la eliminación de proteasas tales como trombina, protrombina, plasmina, plasminógeno de tal manera que la cantidad residual de proteasas y de activadores de la fibrinólisis es:
• muy fuertemente reducida en comparación con la disolución de fibrinógeno prepurificada antes de la etapa de cromatografía, y/o
• nula, y/o
• inferior a los umbrales de detección de los métodos comúnmente utilizados por el experto en la técnica.
Se puede llevar a cabo un ensayo de estabilidad en diferentes condiciones de temperatura, humedad y luz. Preferiblemente, en el contexto de la presente invención, el ensayo de estabilidad puede durar como mínimo 1 semana, preferiblemente al menos 1 mes, preferiblemente al menos 2 meses, preferiblemente al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, preferiblemente al menos 5 meses, más preferiblemente al menos 6 meses.
Típicamente, la medida de los parámetros de estabilidad, como se define a continuación, se lleva a cabo
• antes de ensayar la estabilidad de una composición que comprende fibrinógeno; se puede entonces hablar de porcentaje inicial; y
• durante o al final de dicho ensayo de estabilidad,
Entendiéndose que dicho ensayo de estabilidad puede durar como mínimo 1 semana, preferiblemente al menos 1 mes, preferiblemente al menos 2 meses, preferiblemente al menos 3 meses, preferiblemente al menos 4 meses, preferiblemente al menos 5 meses, más preferiblemente al menos 6 meses.
Además, según una realización particular, la estabilidad de una composición que comprende fibrinógeno puede evaluarse mediante inspección visual utilizando en particular un controlador de la farmacopea europea (opalescencia, formación de partículas), mediante la medida de la turbidez por un espectrofotómetro que mide la absorbancia o la densidad óptica a 400 nm, lo que permite medir las partículas en disolución con tamaños comprendidos entre aproximadamente 1 nm y 1 pm.
Además, según una realización particular, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se define midiendo el porcentaje de monómeros conservados durante el ensayo de estabilidad utilizando el método High Pressure Size Exclusion Chromatography (HPSEC) o Dynamic Light Scattering (DLS). Estos métodos son bien conocidos por el experto en la técnica.
Según una realización particular, una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente estable si, además, la cantidad de monómeros de fibrinógeno conservados durante el ensayo de estabilidad es mayor que 50%, preferentemente mayor que 60%, preferentemente mayor que 70%, preferentemente mayor que 80%, preferentemente mayor que 90%, preferentemente mayor que 95% del nivel inicial de monómeros de fibrinógeno.
Más preferiblemente, la cantidad de monómeros de fibrinógeno conservados durante el ensayo de estabilidad mayor que 70% del porcentaje inicial de monómeros de fibrinógeno.
Por "porcentaje inicial de monómero de fibrinógeno" se entiende el porcentaje de monómero observado antes del ensayo de estabilidad. Típicamente, la cantidad de monómero de fibrinógeno se mide antes del ensayo de estabilidad y durante o al final de dicho ensayo de estabilidad.
Según una realización particular, una composición de fibrinógeno se considera estable si, además, la variación en la cantidad de monómeros de fibrinógeno durante el ensayo de estabilidad es menor que 20%, preferentemente menor que 10%, preferentemente menor que 5%, preferentemente menor que 1%.
En otra realización particular, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno es, además, definida mediante la medida del porcentaje de polímeros de fibrinógeno formados durante el ensayo de estabilidad usando HPSEC. Los polímeros de fibrinógeno son polímeros que comprenden al menos 2 cadenas polipeptídicas alfa, 2 cadenas polipeptídicas beta, y 2 cadenas polipeptídicas gamma del fibrinógeno. Este término también incluye trímeros de fibrinógeno.
Según una realización particular, una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente estable si, además, la cantidad de polímeros de fibrinógeno formados durante el ensayo de estabilidad es menor que 50%, preferentemente menor que 40%, preferentemente menor que 30%, preferentemente menor que 20%, preferiblemente menor que 10% con respecto al nivel inicial de polímeros de fibrinógeno. Típicamente, el porcentaje inicial de polímeros de fibrinógeno corresponde a todas las formas poliméricas (trímeros y más) de fibrinógeno antes del ensayo de estabilidad.
Más preferiblemente, la cantidad de polímeros de fibrinógeno formados durante el ensayo de estabilidad es menor que 30%. Típicamente, la cantidad de polímeros de fibrinógeno se mide antes del ensayo de estabilidad y durante o al final de dicho ensayo de estabilidad.
Según una realización particular, una composición de fibrinógeno se considera estable si, además, la variación en la cantidad de polímeros de fibrinógeno durante el ensayo de estabilidad es menor que 20%, preferentemente menor que 10%, preferentemente menor que 5%, preferentemente menor que 1%.
Según una realización particular, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se evalúa además mediante medida SDS PAGE de la conservación de las cadenas alfa, beta y gamma de fibrinógeno, preferiblemente antes y después de un ensayo de estabilidad como se define en el ámbito de la presente invención. Así, una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente estable si además:
• todas las cadenas alfa se conservan a al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 90%; más preferiblemente se conservan a aproximadamente 100%, y/o
• todas las cadenas beta se conservan a al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 90%; más preferiblemente se conservan a aproximadamente 100%, y/o
• todas las cadenas gamma se conservan a al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 90%; más preferiblemente se conservan a aproximadamente 100%.
Según una realización particular, la composición de fibrinógeno se considera estable si, además, los perfiles de las cadenas alfa y gamma se conservan al final del ensayo de estabilidad. Por conservación de los perfiles de las cadenas alfa y gamma se entiende la conservación de la distribución de las diferentes formas de las cadenas alfa y gamma.
Así, se considera que el perfil de las cadenas alfa se conserva durante el ensayo de estabilidad si la distribución de las formas Aa1, Aa2 y Aa3 de la cadena alfa se conserva entre la medida inicial llevada a cabo antes de la estabilidad y la llevada a cabo al final del ensayo del período de estabilidad. Una composición de fibrinógeno se puede considerar estable si la importancia de la forma Aa1 (expresada en porcentaje de todas las formas de las cadenas alfas) después de ser estabilizada corresponde a al menos 50%, preferentemente al menos 60%, 70%, 80% o 90% de la importancia de la forma Aa1 (expresada como porcentaje de todas las formas de las cadenas alfas) antes de ser estabilizada.
Así, se considera que el perfil de las cadenas gamma se conserva durante el ensayo de estabilidad si la distribución de las formas y’ y Y’ de la cadena gamma se conserva entre la medida inicial llevada a cabo antes de la estabilidad y la llevada a cabo al final del ensayo del período de estabilidad.
Según una realización particular, la estabilidad de la composición que comprende fibrinógeno se define además midiendo la turbidez usando espectrofotometría UV a 400 nm. De hecho, la turbidez refleja la cantidad de material que enturbia la disolución. Una composición de fibrinógeno se considera ventajosamente estable si, además, la turbidez medida después del ensayo de estabilidad, tal como se define en la presente invención, es comparable a la turbidez medida antes de la estabilidad.
Ventajosamente, la turbidez medida después del ensayo de estabilidad corresponde a menos de 130%, menos de 120%, menos de 110%; corresponde ventajosamente a 100% de la turbidez medida antes de la estabilidad.
En una realización ventajosa de la invención, la composición que comprende fibrinógeno es estable durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses a 4°C. Por "composición de fibrinógeno en forma líquida" se entiende una composición que comprende fibrinógeno en disolución, preferiblemente que no se ha sometido a una etapa de liofilización, desecación, deshidratación o secado, y que, por lo tanto, no necesita ser reconstituida antes de su uso.
La composición que comprende fibrinógeno tal como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto puede estar en forma de una composición farmacéutica no reconstituida después de la liofilización.
La composición que comprende fibrinógeno como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto puede estar en forma de una composición farmacéutica, comprendiendo además dicha composición farmacéutica uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" corresponde a cualquier excipiente que se puede usar ventajosamente para la formulación de proteínas humanas, en particular a sustancias seleccionadas entre sales, aminoácidos, azúcares, tensioactivos o cualquier otro excipiente.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables de la invención excluyen en particular la isoleucina, la glicina y el NaCl. Ventajosamente, los excipientes farmacéuticamente aceptables según la invención incluyen arginina y/o citrato. La Solicitante ha puesto en evidencia que es posible obtener composiciones particularmente estables en el tiempo en forma líquida que comprenden fibrinógeno, arginina y citrato. Tal composición es óptima ya que limita el número de excipientes y, por lo tanto, el riesgo de efectos secundarios debidos a los componentes de la formulación, permitiendo al mismo tiempo la conservación en forma líquida de la composición lista para su uso.
Así, en una realización preferida, la invención se refiere a una composición que comprende, preferentemente que consiste en, fibrinógeno, arginina y citrato, y que es estable en forma líquida.
Preferiblemente, dicho fibrinógeno es un fibrinógeno humano.
Según la invención, se pueden utilizar varias fuentes de materia prima que contienen fibrinógeno. La composición de fibrinógeno puede por lo tanto proceder de plasma sanguíneo, también denominado fracciones plasmáticas, de sobrenadante de cultivo celular o de leche de animales transgénicos.
En una realización preferida, la composición de la invención no se ha sometido a ninguna etapa previa de liofilización, desecación, deshidratación o secado.
En una realización preferida, la composición de la invención no se ha sometido a ninguna etapa previa de reconstitución de un liofilizado.
En una realización particular, la composición según la invención es una fracción plasmática, preferentemente una fracción plasmática obtenida a partir de plasma sanguíneo prepurificado.
Por "fracción plasmática obtenida a partir de plasma sanguíneo prepurificado" se entiende cualquier parte o subparte del plasma sanguíneo humano, que ha sido objeto de una o más etapas de purificación. Dichas fracciones plasmáticas incluyen así el sobrenadante de plasma crioprecipitado, el crioprecipitado de plasma (resuspendido), la fracción I obtenida por fraccionamiento etanólico (según el método de Cohn o Kistler & Nitschmann), los eluatos de cromatografía, y las fracciones no adsorbidas en columnas de cromatografía, incluyendo cromatografías multicolumnas, y filtrados.
En una realización preferida de la invención, la composición según la invención procede de un eluato de cromatografía o de una fracción no adsorbida de una columna de cromatografía, incluyendo cromatografía multicolumnas.
En una realización aún más preferida de la invención, la composición según la invención procede de un eluato de cromatografía o de una fracción no adsorbida de una columna de cromatografía, con la excepción de cromatografía multicolumnas.
Así, en una forma de realización preferida de la invención, la composición según la invención procede de una fracción plasmática obtenida a partir de criosobrenadante o crioprecipitado resuspendido.
Según la invención, el “sobrenadante de plasma crioprecipitado”, o “criosobrenadante”, corresponde a la fase líquida obtenida después de la descongelación del plasma congelado (crioprecipitación). En particular, el criosobrenadante se puede obtener por congelación del plasma sanguíneo a una temperatura comprendida entre -10°C y -402C, después descongelación suave a una temperatura comprendida entre 0°C y 6°C, preferiblemente entre 0°C y 1°C, seguida de una centrifugación del plasma descongelado para separar el crioprecipitado y el criosobrenadante. El crioprecipitado es un concentrado de fibrinógeno, fibronectina, factor von Willebrand y factor VIII, mientras que el criosobrenadante contiene factores del complemento, factores dependientes de la vitamina K tales como proteína C, proteína S, proteína Z, factor II, factor VII, factor IX y factor X, del fibrinógeno, las inmunoglobulinas y la albúmina.
En una realización, la composición según la invención procede de plasma que no se ha empobrecido previamente en proteínas tales como inmunoglobulinas o la albúmina.
En una realización, la composición de la invención es susceptible de obtenerse mediante el procedimiento que comprende las siguientes etapas:
• una etapa de purificación por cromatografía por afinidad utilizando ligandos de tipo anticuerpos de llama o aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno;
• al menos una etapa de seguridad biológica; y
• Una etapa de formulación en forma líquida.
En una realización particular de la invención, la etapa de purificación por cromatografía por afinidad se lleva a cabo mediante cromatografía por afinidad utilizando ligandos de afinidad seleccionados entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos o ligandos químicos tales como péptidos, péptidos miméticos, peptoides, nanofitinas o incluso ligandos oligonucleotídicos tales como como aptámeros.
En una realización particular de la invención, la etapa de purificación por cromatografía por afinidad se lleva a cabo mediante cromatografía por afinidad utilizando ligandos de afinidad que son aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno.
La solicitante llevó a cabo su propia investigación e identificó una nueva familia de aptámeros, dirigidos contra el fibrinógeno. Esta nueva familia de aptámeros se identificó mediante un procedimiento SELEX en interno diseñado por la solicitante. Se ha descubierto que estos aptámeros se unen específicamente al mismo tiempo al fibrinógeno transgénico y plasmático humano, independientemente del estado de glicosilación de la proteína. Los aptámeros identificados por la solicitante tienen propiedades únicas en términos de unión. En particular, los aptámeros utilizados según la invención se unen al fibrinógeno de manera dependiente del pH. Cabe señalar que tienen una mayor afinidad de unión para el fibrinógeno a un pH ligeramente ácido, tal como un pH de alrededor de 6,3, en comparación con un pH superior a 7,0, como 7,4. Estas propiedades convienen particularmente para su uso en cromatografía por afinidad ya que la formación del complejo entre la proteína a purificar, a saber el fibrinógeno, y el aptámero, y la posterior liberación de la proteína del complejo se pueden controlar mediante la modificación del pH del amortiguador de elución. En particular, la liberación de fibrinógeno del complejo puede llevarse a cabo en condiciones de elución moderadas, que no son susceptible de alterar las propiedades de la proteína.
■ Aptámeros utilizados según la invención
Los aptámeros se utilizan según la invención como ligandos de afinidad en la purificación de fibrinógeno mediante cromatografía. Los aptámeros utilizados según la invención están por lo tanto dirigidos contra el fibrinógeno, a saber, son capaces de unirse específicamente al fibrinógeno. Los aptámeros utilizados según la invención se unen al fibrinógeno de manera dependiente del pH.
Preferiblemente, los aptámeros utilizados según la invención no se unen al fibrinógeno a un pH mayor que 7,0 y se unen al fibrinógeno a un pH ácido, por ejemplo a un valor de pH elegido entre 6,0 y 6,6, tal que pH 6,3 ± 0,1.
Como se entiende aquí, un "aptámero" (también denominado aptámero nucleico) designa un polinucleótido monocatenario sintético que típicamente tiene una longitud de 20 a 150 nucleótidos y es capaz de unirse con alta afinidad a una molécula diana. Los aptámeros se caracterizan por una o más conformaciones tridimensionales que pueden desempeñar un papel clave a nivel de sus interacciones con su molécula diana. Por consiguiente, el aptámero utilizado según la invención es capaz de formar un complejo con el fibrinógeno. Las interacciones entre un aptámero y su molécula diana pueden incluir interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno, y complementariedad de forma de apilamiento aromático.
"Un aptámero que se une específicamente a su molécula diana" significa que el aptámero tiene una alta afinidad por la molécula diana. La constante de disociación (Kd) de un aptámero para su molécula diana es típicamente de 10-6 a 10-12 M. La expresión "se une específicamente" se utiliza aquí para indicar que el aptámero tiene la capacidad de reconocer e interactuar específicamente con su molécula diana, y presentar al mismo tiempo una reactividad detectable relativamente baja con otras moléculas que puedan estar presentes en la muestra. Preferiblemente, el aptámero se une específicamente a su molécula diana si su afinidad es significativamente mayor para la molécula diana que para otras moléculas, incluyendo moléculas estructuralmente cercanas a la molécula diana.
Por ejemplo, un aptámero es capaz de unirse específicamente a una proteína humana y presentar al mismo tiempo una menor afinidad para un homólogo de dicha proteína humana.
Tal como lo entendemos aquí, “un aptámero que presenta una menor afinidad por una molécula dada que por su molécula diana” o “un aptámero que es específico para su molécula diana con respecto a una molécula dada” significa que la Kd del aptámero para dicha molécula dada es al menos 5 veces, preferiblemente al menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces mayor que la Kd de dicho aptámero para la molécula diana.
Los aptámeros pueden ser un ácido desoxirribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN). Los aptámeros pueden comprender uno o más nucleótidos químicamente modificados. Los nucleótidos químicamente modificados incluyen, sin limitarse a, 2 '-amino o 2 '-fluoro-nucleótidos, 2 '-ribopurina, fosforamidita, ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleótidos modificados con ácido borónico, 5-yodo- o 5-bromo-uracilo, y desoxiuridina 5-modificada tal como bencildU, isobutil-dU y naftil-dU. Para la desoxiuridina 5-modificada, se puede hacer referencia a Rohloff et al., Molecular Therapy-Nucleic acids, 2014, 3, e201 (véase la Figura 1, página 4), cuya descripción se incorpora aquí como referencia. En ciertas realizaciones, el aptámero utilizado según la invención está libre de cualquier nucleótido modificado por el ácido borónico, en particular los enseñados en el documento WO2010/019847. En ciertas otras realizaciones, el aptámero utilizado según la invención está libre de cualquier desoxiuridina 5-modificada. En ciertas realizaciones, el aptámero puede comprender un nucleótido modificado a nivel de su extremo 3' y/o de su extremo 5' únicamente (es decir, el primer nucleótido y/o el último nucleótido del aptámero es o son los únicos nucleótidos químicamente modificados). Preferiblemente, dicho nucleótido modificado puede permitir el injerto del aptámero sobre un soporte sólido, o el acoplamiento de dicho aptámero a cualquier grupo de interés (por ejemplo, útil para una detección o una inmovilización).
Cuando se identifica la secuencia del aptámero, el aptámero se puede preparar mediante cualquier procedimiento rutinario conocido por el experto en la técnica, a saber mediante síntesis química de oligonucleótidos, por ejemplo en fase sólida.
Como se entiende aquí, "un aptámero dirigido a fibrinógeno", "un aptámero dirigido contra fibrinógeno" o "un aptámero antifibrinógeno" designa un polinucleótido monocatenario sintético que se une específicamente al fibrinógeno.
Como se usa aquí, el término "fibrinógeno" designa cualquier proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del fibrinógeno de tipo salvaje y variantes del mismo, independientemente del estado de glicosilación. El término "fibrinógeno" incluye cualquier isoforma y variante alélica de fibrinógeno, así como cualquier forma glicosilada, cualquier forma no glicosilada o cualquier forma postraduccional de fibrinógeno.
Como se entiende aquí, una variante del fibrinógeno salvaje designa una proteína que tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 85%, 90% o 95%, con dicho fibrinógeno salvaje y que tiene una actividad biológica similar a la de dicho fibrinógeno salvaje. Por ejemplo, la actividad de coagulación del fibrinógeno se puede medir mediante el procedimiento de coagulación de Van Clauss. La variante de fibrinógeno puede tener una actividad biológica aumentada o reducida con respecto al fibrinógeno de tipo salvaje correspondiente. En ciertas realizaciones, el fibrinógeno designa una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del fibrinógeno humano de tipo salvaje o una variante del mismo. Dicho fibrinógeno puede ser el fibrinógeno plasmático humano, el fibrinógeno humano recombinante o transgénico. En ciertas realizaciones, el aptámero utilizado según la invención es capaz de unirse al fibrinógeno humano, independientemente de su glicosilación. Por ejemplo, un aptámero de la invención puede ser capaz de unirse específicamente al fibrinógeno plasmático humano y al fibrinógeno humano recombinante, por ejemplo el fibrinógeno recombinante obtenido de un organismo transgénico multicelular o el fibrinógeno recombinante obtenido a partir de una célula huésped recombinante.
Los aptámeros utilizados según la invención pueden ser capaces de unirse específicamente al fibrinógeno a un pH ligeramente ácido, por ejemplo a un pH de 6,3.
Preferiblemente, el aptámero utilizado según la invención tiene una constante de disociación (Kd) para el fibrinógeno plasmático humano o para el fibrinógeno transgénico humano de como máximo 10-6 M. Típicamente, la Kd de los aptámeros usados según la invención para el fibrinógeno humano puede ser de 1.10-12 M a 1.10-6 M a un pH de aproximadamente 6,3. La Kd se determina preferentemente mediante un ensayo de resonancia plasmónica superficial (SPR) en el que el aptámero se inmoviliza en el chip de biosensor y se envía fibrinógeno a los aptámeros inmovilizados, a un pH de interés y a diversas concentraciones, en condiciones de flujo que conducen a medidas de kon y de koff y por lo tanto de Kd. Se puede referirse al protocolo proporcionado en el Ejemplo 3.
En ciertas realizaciones, el aptámero utilizado según la invención es específico para el fibrinógeno humano, con respecto al fibrinógeno no humano.
En ciertas otras realizaciones, el aptámero utilizado según la invención es específico para el fibrinógeno humano en comparación con otras proteínas presentes en el plasma, tales como factores de coagulación. Preferiblemente, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno con respecto al factor FII, FXI o XIII. En realizaciones adicionales o alternativas, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno con respecto a una fibronectina. En realizaciones adicionales o alternativas, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno con respecto a un plasminógeno.
Preferiblemente, el aptámero utilizado según la invención no se une al fibrinógeno a un pH de 7,0 o superior. La incapacidad del aptámero utilizado según la invención para unirse al fibrinógeno a un pH de 7,0 y superior típicamente puede determinarse mediante SPR, como se describe en el Ejemplo 3. En el protocolo del Ejemplo 3, la ausencia de unión está representada por el hecho de que la señal SPR permanece en el nivel después de la inyección de fibrinógeno en un amortiguador tamponado a un pH de interés.
En cierto aspecto de la invención, los aptámeros pueden caracterizarse por la presencia de un grupo específico en su conformación. Por ejemplo, los aptámeros usados según la invención pueden comprender un grupo tal como se representa en la Figura 1A o en la Figura 2A. Sin estar ligado a ninguna teoría, la solicitante cree que la presencia de dicha conformación bidimensional puede estar implicada en las interacciones específicas con el fibrinógeno.
La presencia de dicho grupo conformacional específico puede surgir de la presencia de un polinucleótido específico (denominado "polinucleótido de base" o "secuencia de base") dentro de la secuencia del aptámero. Como se entiende aquí, una "secuencia de base" de un aptámero dado típicamente comprende, o designa, la secuencia mínima que se origina a partir de dicho aptámero capaz de unirse al fibrinógeno.
Mediante el estudio de los aptámeros identificados por su propia investigación, la solicitante ha identificado varias secuencias de base de interés, entre otros los polinucleótidos de SEQ ID N°: 66 y de SEQ ID N°: 67.
La solicitante ha determinado además los agrupamientos de la secuencia consenso en SEQ ID N°: 58-65 Como se muestra en la Figura 2B, los aptámeros de SEQ ID N°: 58-65 comprenden dos grupos consenso en sus secuencias, a saber GTTGGTAGGG (SEQ ID N°: 77) que está aguas arriba de GGTGTAT (SEQ ID N°: 78). Estos grupos consenso están ubicados en una región de los aptámeros que forma un bucle que se representa en la Figura 2A para el aptámero de SEQ ID N°: 58. Sin estar ligado a ninguna teoría, la solicitante cree que este grupo conformacional puede desempeñar un papel en la unión de dichos aptámeros al fibrinógeno.
En un cierto aspecto, el aptámero utilizado según la invención es capaz de unirse específicamente al fibrinógeno y tiene una de las siguientes características:
• Dicho aptámero comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N°: 66, o
• Dicho aptámero comprende los grupos de nucleótidos GTTGGTAGGG (SEQ ID N°: 77) y GGTGTAT (SEQ ID N°: 78), en el que el grupo de SEQ ID N°: 77 está preferiblemente aguas arriba de s EQ ID N°: 78.
En ciertas realizaciones, el aptámero utilizado según la invención es capaz de unirse específicamente al fibrinógeno y tiene una de las siguientes características:
• Dicho aptámero comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N°: 66, o
• Dicho aptámero comprende el grupo de nucleótido de fórmula (III): 5'-[SEQ ID N°: 79]-[X1]-[SEQ ID N°: 77]-[X2]-[SEQ ID N2: 78]-3' (III) en la que:
• [X2] y [X1] designan independientemente un nucleótido o un oligonucleótido con una longitud de 2 a 5 nucleótidos, preferiblemente con una longitud de 2 o 3 nucleótidos,
• [SEQ ID N°: 77] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 77 (a saber, GTTGGTAGGG),
• [SEQ ID N°: 78] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 78 (a saber, GGTGTAT), y
• [SEQ ID N°: 79] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 79 (a saber, TGT).
En una realización particular, el aptámero utilizado según la invención comprende un polinucleótido que:
• tiene al menos 70% de identidad de secuencia con al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N°: 67, SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73, SEC ID N°: 74, y SEQ ID N°: 95, y
• comprende el grupo nucleótido de fórmula (III) tal como se define anteriormente.
Por ejemplo, el aptámero utilizado según la invención puede comprender un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con SEQ ID N°: 67, y que comprende el grupo nucleótido de fórmula (III).
En otro aspecto, el aptámero utilizado según la invención es capaz de unirse específicamente al fibrinógeno y comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con SEQ ID N°: 66 o SEQ ID N°: 67.
Como se usa aquí, una identidad de secuencia de al menos 70% abarca una identidad de secuencia de al menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o 98%. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de nucleótidos (A) y (B) se puede determinar comparando las dos secuencias alineadas de manera óptima, a través de una ventana de comparación. Dicha alineación de secuencias se puede llevar a cabo mediante métodos bien conocidos, por ejemplo, utilizando el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch. Cuando se obtiene la alineación, el porcentaje de identidad se puede obtener dividiendo el número total de restos de aminoácidos idénticos alineados por el número total de restos contenidos en la secuencia más larga entre las secuencias (A) y (B). La identidad de la secuencia se determina típicamente utilizando un software de análisis de secuencia. Para comparar dos secuencias de ácidos nucleicos, se puede utilizar, por ejemplo, la herramienta «Emboss Needle» para un alineamiento de secuencias por pares para proporcionar un EMBL-EBI, y está disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleodite.html usando la configuración predeterminada: (i) Matriz: ADN completo, (ii) apertura de espacio: 10, (iii) nivel de espacio: 0,5, (iv) formato de salida: par, (v) penalización de espacio terminal: falso, (vi) apertura de espacio terminal: 10 , (vii) nivel del espacio terminal: 0,5.
El aptámero utilizado según la invención tiene típicamente una longitud de 20 a 150 nucleótidos, preferentemente una longitud de 30 a 100 nucleótidos, por ejemplo una longitud de 25 a 90 nucleótidos, una longitud de 30 a 80 nucleótidos, o una longitud de 30 a 60 nucleótidos. Por consiguiente, el aptámero utilizado según la invención puede tener una longitud de 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90 nucleótidos.
En una realización particular, el aptámero utilizado según la invención comprende un polinucleótido que se diferencia de un polinucleótido elegido del grupo de SEQ ID N°: 66 y de SEQ ID N°: 67, debido a 1 a 15 modificaciones de nucleótido, preferiblemente debido a 1 a 10 modificaciones de nucleótido, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de nucleótidos.
Como se usa aquí, una "modificación de nucleótido" significa la deleción de un nucleótido, la inserción de un nucleótido o la sustitución de un nucleótido por otro nucleótido con respecto a la secuencia de referencia.
Los aptámeros utilizados según la invención pueden comprender también cebadores en sus extremos 3' y 5' útiles para su amplificación por PCR. En ciertas realizaciones, estas secuencias de cebadores pueden incorporarse o incorporarse parcialmente a la secuencia de base y, por lo tanto, pueden participar en interacciones de unión con el fibrinógeno. En algunas otras realizaciones, estas secuencias de cebadores están fuera de la secuencia de base y pueden no desempeñar ningún papel en la interacción del aptámero con fibrinógeno. En ciertas otras realizaciones, el aptámero carece de secuencias de cebadores.
En ciertas realizaciones alternativas o adicionales, el aptámero utilizado según la invención puede comprender un polinucleótido con una longitud de 2 a 40 nucleótidos unido al extremo 5' y/o al extremo 3' de la secuencia de base.
En un cierto aspecto, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno y responde a la fórmula (I)
5'-[NUCl]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3' (I)
en la que
n y m son números enteros elegidos independientemente de 0 y 1 ,
• [NUC1] es un polinucleótido que comprende de 2 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos • [NUC2] es un polinucleótido que comprende de 2 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos, y
• [CENTRAL] es un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 69, SEC ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73, SEQ ID N°: 74, SEQ ID N°: 94, y SEQ ID N°: 95.
Cuando n=m=0, [NUC1 ] y [NUC2] están ausentes y el aptámero está constituido por la secuencia [CENTRAL]. Cuando n=0 y m=1, [NUC2] está ausente y [NUC1] está presente, el aptámero corresponde por lo tanto a la Fórmula (Ia) 5'-[NUCl]-[CENTRAL]-3',
Cuando n=1 y m=0, [NUC1] está ausente y [NUC2] está presente, el aptámero corresponde por lo tanto a la Fórmula (Ib)
5'-[CENTRAL]-[NUC2]-3'.
En ciertas realizaciones, [NUC1] comprende, o consiste en, un polinucleótido de SEQ ID N°: 75, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID N°: 75, debido a 1, 2, 3 o 4 modificaciones de nucleótidos. En otras ciertas realizaciones adicionales, [NUC2] comprende, o consiste en, un polinucleótido de SEQ ID N°: 76, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID N°: 76, debido a 1,2, 3 o 4 modificaciones de nucleótidos.
En otro aspecto, la invención se refiere a un aptámero dirigido contra el fibrinógeno y que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, tal como al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% con una secuencia de nucleótidos elegida del grupo que consta de SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 67. Por ejemplo, el aptámero utilizado según la invención puede tener una identidad de secuencia de al menos 70% con una secuencia de nucleótidos elegida entre SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 58, SEQ ID N°: 60, SEQ ID N°: 65, SEQ ID N°: 66, y SEQ ID N°: 67.
La solicitante ha llevado a cabo un análisis en profundidad de las secuencias y posibles conformaciones de los aptámeros definidos anteriormente. Este análisis ha llevado a la identificación de dos subgrupos de aptámeros, estando cada subgrupo caracterizado por propiedades estructurales y funcionales específicas.
- Primer subgrupo de aptámeros utilizados según la invención
El primer subgrupo de aptámeros incluye aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno que comprende una secuencia de base que tiene una alta identidad de secuencia con la secuencia de base de SEQ ID N°: 66. Este primer subgrupo incluye aptámeros de SEQ ID N°: 1 -57, y el aptámero que consiste en la secuencia de base de SEQ ID N°: 66. Por consiguiente, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno y comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97% o 98% con SEQ ID N°: 66. Preferiblemente, dicho aptámero tiene una longitud de 20 a 110 nucleótidos, en particular una longitud de 25 a 100 nucleótidos, tal como una longitud de 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99. En particular, el aptámero puede tener una longitud de 35 a 65 nucleótidos.
En ciertas realizaciones, el aptámero comprende un polinucleótido de SEQ ID N°: 66, o un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N°: 66, debido a 1 a 16 modificaciones de nucleótido, tales como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 modificaciones de nucleótido. Como se mencionó anteriormente, la o las modificaciones de nucleótido pueden ser de cualquier tipo. Una modificación de nucleótido puede ser una deleción de un nucleótido, la inserción de un nucleótido o la sustitución/reemplazo de un nucleótido por otro nucleótido.
La alineación de la secuencia de base de SEQ ID N°: 66 con aptámeros de SEQ ID N°: 1-57 mostró que ciertos nucleótidos no se conservan entre los aptámeros que pertenecen al primer subgrupo. Dichas posiciones incluyen las posiciones 19, 20, 21,24, 27, 32, 33, 35, 42, 45, 46, 47, 50, 54, 55 y 57, designando la numeración una numeración de nucleótidos en SEQ ID N°: 66.
Se pueden introducir otras modificaciones, en particular una o más deleciones, en las posiciones 1 y 2 de SEQ ID N°: 66, pero también en el tercer tallo de la secuencia de base de SEQ ID N°: 66, como se muestra en la Figura 1A. En particular, la solicitante ha introducido de una a seis deleciones en el tercer tallo del aptámero de SEQ ID N°: 66, en particular en las posiciones 14-22, sin ninguna pérdida significativa de afinidad por el fibrinógeno con respecto a la secuencia de base original de SEQ ID N°: 66.
Por lo tanto, la o las modificaciones de nucleótido con respecto a SEQ ID NO: 66 pueden estar presentes en una o más de estas posiciones de nucleótido. En ciertas realizaciones, el aptámero utilizado según la invención comprende un polinucleótido que difiere de SEQ ID N°: 66 debido a 1 a 20, preferiblemente 1 a 14, en particular 1, 2, 3, 4, 5 o 6 modificaciones de nucleótido en posiciones de nucleótidos elegidas entre 1, 2, 11-25, 32-35, 42, 45-47, 50 y 54-58, preferiblemente en posiciones de nucleótido elegidas entre 1,2, 14-22, 24, 27, 32, 33, 35, 42, 45, 46, 47, 50, 54, 55 y 57, refiriéndose la numeración a la numeración de nucleótidos en SEQ ID N°: 66. Preferiblemente, la o las modificaciones son reemplazos o deleciones de nucleótidos.
En ciertas realizaciones particulares, dicha o dichas modificaciones de nucleótido aparecen en posiciones de nucleótidos elegidas entre 20, 35, 42 y 55. En ciertas realizaciones particulares, el aptámero utilizado según la invención puede comprender un polinucleótido que difiere de SEQ ID N°: 66 debido a como máximo 4 modificaciones de nucleótido que aparecen preferiblemente en posiciones elegidas entre 20, 35, 42 y 55, refiriéndose la numeración a la numeración de nucleótidos en SEQ ID N°: 66.
Por ejemplo, el aptámero utilizado según la invención puede comprender un polinucleótido de SEQ ID N°: 66, o un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N°: 66 debido a 1, 2 o 3 modificaciones de nucleótido, preferiblemente debido a 1,2 o 3 modificaciones de nucleótido, estando dicha o dichas modificaciones de nucleótido en posiciones de nucleótido elegidas del grupo que consiste en 19, 20, 21, 24, 27, 32, 33, 35, 42, 45, 46, 47, 50, 54, 55 y 57, refiriéndose la numeración a la numeración de nucleótidos en SEQ ID N°: 66.
En ciertas otras realizaciones, el aptámero utilizado según la invención puede comprender el polinucleótido de SEQ ID N°: 66, o un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N°: 66 debido a 1-14 deleciones de nucleótido, preferiblemente debido a 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 deleciones de nucleótido, estando dicha o dichas deleciones de nucleótido en una o más posiciones de nucleótido seleccionadas del grupo que consiste en 1,2, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22, refiriéndose la numeración a la numeración de nucleótidos en SEQ ID N°: 66.
En ciertas realizaciones adicionales, el aptámero utilizado según la invención puede comprender un polinucleótido de SEQ ID N°: 66, o un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N°: 66 debido a una de las siguientes combinaciones de deleciones de nucleótidos:
• deleciones de nucleótidos en las posiciones 19, 20 y 21,
• deleciones de nucleótidos en las posiciones 18, 19, 20 y 21,
• deleciones de nucleótidos en las posiciones 15, 16, 19 y 20,
• deleciones de nucleótidos en las posiciones 14, 15, 16, 20 y 21, y
• deleciones de nucleótidos en las posiciones 14, 15, 16, 20, 21 y 22.
refiriéndose la numeración a la numeración de nucleótidos en SEQ ID N°: 66.
En una variante o además, las deleciones de nucleótido pueden estar presentes en las posiciones 1 y 2, refiriéndose la numeración a la numeración de nucleótidos en SEQ ID NO: 66.
Como se muestra en el Ejemplo 7, la solicitante ha identificado variantes de SEQ ID N°: 66 capaces de unirse al fibrinógeno de manera competitiva.
En ciertas realizaciones adicionales o alternativas, el aptámero utilizado según la invención es un aptámero que se une selectivamente al fibrinógeno y que comprende un polinucleótido elegido del grupo formado por SEQ ID NO: 80, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 84, SEQ ID N°: 85, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 87, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 89, SEQ ID N°: 90, SEQ<i>D N°: 91, SEQ<i>D N°: 92, y SEQ ID N°: 93, o que tiene una secuencia de nucleótidos que difiere debido a 1,2, 3, 4 o 5 modificaciones de nucleótidos con respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO: 80-93
Variantes preferidas de SEQ ID N°: 66 incluyen aptámeros de SEQ ID N°: 80-87
El primer subgrupo de aptámeros utilizados según la invención también incluye aptámeros dirigidos contra fibrinógeno y que tienen una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97% o 98% con SEQ ID N°: 1.
En particular, el aptámero puede ser de SEQ ID N°: 1, o puede tener una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N°: 1 debido a 1-20, especialmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de nucleótidos. Dicha o dichas modificaciones de nucleótidos pueden estar presentes preferiblemente en la o las posiciones descritas anteriormente para SEQ ID N°: 66. Como se explica en el apartado siguiente titulado "procedimiento de obtención de aptámeros utilizados según la invención", ciertos aptámeros utilizados según la invención se identificaron a partir de una mezcla de candidatos formada por una multitud de ADN monocatenarios (ADNss), en los que cada ADNss comprende una secuencia central aleatoria de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos flanqueada por secuencias específicas de aproximadamente 15 a 40 nucleótidos que actúan como cebadores para la amplificación por PCR.
En ciertas realizaciones alternativas o adicionales, el aptámero utilizado según la invención corresponde a la Fórmula (I) en la que:
5'-[NUCl]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3' (I)
en la que:
• [CENTRAL] es un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, por ejemplo al menos 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, con SEQ ID N°: 94, n y m son números enteros elegidos independientemente entre 0 y 1 ,
• [NUC1] es un polinucleótido que comprende de 2 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos, y
• [NUC2] es un polinucleótido que comprende de 2 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos. En una realización preferida, m = 1 y [NUC1] comprende, o consiste en, un polinucleótido de SEQ ID N°: 75 o que difiere de SEQ ID N°: 75, debido a 1,2, 3 o 4 modificaciones de nucleótidos.
Un ejemplo de un aptámero de fórmula (I) es el aptámero de SEQ ID N°: 66.
Por consiguiente, el aptámero utilizado según la invención corresponde a la siguiente fórmula:
5'-[NUCl]-[CENTRAL]-[NUC2]n-3'
en la que n es 0 o 1.
En ciertas otras realizaciones, [NUC2] puede comprender o consistir en un polinucleótido de SEQ ID NO: 76, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID N°: 76, debido a 1,2, 3 o 4 modificaciones de nucleótidos.
En un aspecto específico, el aptámero utilizado según la invención puede ser un aptámero de fórmula (I):
5'-[NUCl]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3' (I)
en la que:
• m es 1 ,
• n es 0 o 1 ,
[NUC1 ] es un polinucleótido de SEQ ID N°: 75 o que difiere de SEQ ID N°: 75 debido a 1,2, 3 o 4 modificaciones de nucleótido, preferiblemente deleciones de nucleótido, y
• [NUC2] es un polinucleótido que tiene una longitud de 2 a 40 nucleótidos, y
[CENTRAL] es un polinucleótido de SEQ ID N°: 94, o tiene una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N°: 94 debido a 1,2, 3, 4, 5 o 6 modificaciones de nucleótido, preferiblemente deleciones de nucleótido. En ciertas realizaciones, [NUC2] es un polinucleótido de SEQ ID N°: 76, o tiene una secuencia que difiere de SEQ ID N°: 76 debido a 1, 2, 3 o 4 modificaciones de nucleótido, eligiéndose dichas modificaciones de nucleótido preferiblemente entre sustituciones de nucleótidos y deleciones de nucleótidos.
En ciertas realizaciones, los aptámeros de dicho primer subgrupo pueden comprender un grupo de conformación, como se muestra en la Figura 1A mediante los nucleótidos subrayados. En un aspecto más general, los aptámeros utilizados según la invención pueden tener una secuencia de nucleótidos que comprende dominios de nucleótidos capaces de formar un grupo de conformación que comprende un bucle central que comprende de 15 a 19 nucleótidos, preferiblemente 17 nucleótidos que tienen:
• un primer tallo que tiene una longitud de 4 a 6 nucleótidos, preferiblemente 5 nucleótidos,
• un segundo tallo que tiene de 2 a 4 nucleótidos, preferiblemente 3 nucleótidos unida a un bucle que comprende de 13 a 15, preferiblemente 14, nucleótidos, y
• eventualmente un tercer tallo que tiene de 2 a 8, preferiblemente 7 nucleótidos unido a un bucle que comprende de 2 a 4, preferiblemente 3, nucleótidos.
En ciertas realizaciones preferidas, el primer tallo es adyacente al segundo tallo y está separado por 2 nucleótidos que provienen del tercer tallo.
Los aptámeros que pertenecen al primer subgrupo de la invención pueden ser capaces de unirse al fibrinógeno a un pH ligeramente ácido definido anteriormente, preferiblemente a un pH de aproximadamente 6,3. En particular, los aptámeros del primer grupo pueden unirse al fibrinógeno de manera dependiente del pH.
En ciertas realizaciones, dichos aptámeros tienen una mayor afinidad por el fibrinógeno a pH 6,3 con respecto a un pH ligeramente básico tal como pH 7,4. En ciertas realizaciones, dicho aptámero no se une al fibrinógeno a pH 7,0 o mayor. Dicho subgrupo de aptámeros también puede ser capaz de unirse a fibrinógeno en presencia de Mg2+. En ciertas realizaciones, dichos aptámeros pueden tener una afinidad de unión para el fibrinógeno que depende del pH y/o de la presencia de Mg2+ en el medio. Por ejemplo, la afinidad de unión del aptámero para el fibrinógeno se puede aumentar en presencia de Mg2+ a una concentración en el intervalo de mM, por ejemplo de 1 a 10 mM, con respecto al mismo medio desprovisto de Mg2+. Como otro ejemplo, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno a un pH de aproximadamente 6,3 y no se une al fibrinógeno a un pH superior a 7,0, tal como pH 7,4.
Estas propiedades se ilustran aquí, por ejemplo, para el aptámero de SEQ ID N°: 66, en la sección a continuación titulada “Ejemplos”.
- Segundo subgrupo de aptámeros utilizados según la invención
El segundo subgrupo de aptámeros incluye, sin limitarse a, los aptámeros de SEQ ID N°: 58-65 y la secuencia de base de SEQ ID N°: 67.
Los aptámeros de SEQ ID N°: 58-65 y de SEQ ID N°: 67 comprenden dos grupos consenso en sus secuencias, a saber GTTGGTAGGG (SEQ ID N°: 77) que está aguas arriba de GGTGTAT (SEQ ID N°: 78), como se muestra en la alineación de secuencias en la Figura 1C. Sin estar vinculado a ninguna teoría, la solicitante cree que estos grupos consenso están ubicados en una región de los aptámeros que forma un bucle representado en la Figura 1B para el aptámero de SEQ ID N°: 58. Este grupo conformacional puede desempeñar un papel en la unión de dichos aptámeros al fibrinógeno. Por lo tanto, este segundo subgrupo de aptámeros engloba aptámeros que se unen específicamente al fibrinógeno y que comprenden los grupos de nucleótidos de SEQ ID NO: 77 y de SEQ ID N°: 78, estando SEQ ID N°: 77 aguas arriba de SEQ ID N°: 78 en la secuencia de base de dicho aptámero.
Preferiblemente, dicho aptámero comprende un grupo de nucleótido de fórmula (III):
en la que:
• [X2] y [X1] designan independientemente un nucleótido o un oligonucleótido con una longitud de 2 a 5 nucleótidos, preferiblemente con una longitud de 2 o 3 nucleótidos,
• [SEQ ID N°: 77] es un oligonucleótido SEQ ID N°: 77 (a saber, GTTGGTAGGG),
• [SEQ ID N°: 78] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 78 (a saber, GGTGTAT), y
• [SEQ ID N°: 79] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 79 (a saber, TGT).
Por ejemplo, el aptámero utilizado según la invención puede comprender un grupo de fórmula (III) en la que X1 designa un nucleótido, por ejemplo G o T, y X2 es un oligonucleótido con una longitud de 3 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los aptámeros pueden comprender además un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N°: 67, SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73, SEC ID N°: 74, y SEQ ID N°: 95.
Por lo tanto, el segundo subgrupo de aptámeros engloba aptámeros que se unen específicamente al fibrinógeno y comprenden un polinucleótido:
• Que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N°: 67, SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 69, SEQ ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73, SEC ID N°: 74, y SEQ ID N°: 95, y
• que comprende el grupo de nucleótido de fórmula (III):
en la que:
• [X2] y [X1] designan independientemente un nucleótido o un oligonucleótido con una longitud de 2 a 5 nucleótidos, preferiblemente con una longitud de 2 o 3 nucleótidos,
• [SEQ ID N°: 77] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 77 (a saber, GTTGGTAGGG),
• [SEQ ID N°: 78] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 78 (a saber, GGTGTAT), y
• [SEQ ID N°: 79] es un oligonucleótido de SEQ ID N°: 79 (a saber, TGT).
El aptámero utilizado según la invención tiene preferiblemente una longitud de 20 a 150 nucleótidos, en particular una longitud de 25 a 100 nucleótidos, tal como una longitud de 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99.
En una realización adicional o alternativa, el aptámero utilizado según la invención se une al fibrinógeno y comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% con la secuencia de base de SEQ ID N°: 67.
En ciertas realizaciones, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno y comprende un polinucleótido SEQ ID N°: 67, o que difiere de SEQ ID N°: 67, debido a 1,2, 3, 4, 5 o 6 modificaciones de nucleótidos.
• En un aspecto particular, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno y corresponde a la Fórmula (I) 5'-[NUC1]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3' en la que n y m son números enteros elegidos independientemente entre 0 y 1 ,
• [NUC1] es un polinucleótido que comprende de 2 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos, • [NUC2] es un polinucleótido que comprende de 2 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos, y
• [CENTRAL] es un polinucleótido que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N°: 68, SEQ ID N°: 69, SEC ID N°: 70, SEQ ID N°: 71, SEQ ID N°: 72, SEQ ID N°: 73, SEQ ID N°: 74, SEQ ID N°: 94, y SEQ ID N°: 95, y que comprende un grupo nucleótido de fórmula (III) definido anteriormente.
En ciertas realizaciones, el aptámero utilizado según la invención es un aptámero de Fórmula (I) que comprende al menos 1, 2, 3 o todas las siguientes características:
• n = m = 1 ,
[NUC1] comprende, o está constituido, de un polinucleótido de SEQ ID N°: 75, o un polinucleótido que difiere de SEQ ID N°: 75 debido a 1,2, 3 o 4 modificaciones de nucleótido,
[NUC2] comprende, o está constituido, de un polinucleótido de SEQ ID N°: 76 o un polinucleótido que difiere de la SEQ ID N°: 76 debido a 1,2, 3 o 4 modificaciones de nucleótido,
• [CENTRAL] es un polinucleótido que tiene al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 95, y que comprende un grupo de nucleótido de Fórmula (III) definida anteriormente.
En otro aspecto alternativo o particular, el aptámero utilizado según la invención se une específicamente al fibrinógeno y comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% con un polinucleótido elegido de SEQ ID N2: 58, SEQ ID N2: 59, SEQ ID N2: 60, SEQ ID N2: 61, SEQ ID N2: 62, SEQ ID N2: 63, SEQ ID N2: 64, SEQ ID N2: 65, y SEQ ID N2: 67.
En ciertas realizaciones, los aptámeros de dicho segundo subgrupo pueden comprender un grupo de conformación, como se muestra en la Figura 1B mediante los nucleótidos subrayados. En un aspecto más general, los aptámeros utilizados según la invención pueden tener una secuencia de nucleótidos que comprende dominios de nucleótidos capaces de formar un grupo de conformación que comprende un tallo que tiene una longitud de 2 a 5 nucleótidos, por ejemplo 4 nucleótidos, unido a un bucle de 23 a 27 nucleótidos. Preferiblemente, el bucle está libre de cualquier grupo tallo-bucle o grupo de tallo adicional.
Los aptámeros que pertenecen a dicho segundo subgrupo pueden ser capaces de unirse al fibrinógeno a un pH ligeramente ácido, preferiblemente a un pH de aproximadamente 6,3. En ciertas realizaciones, dichos aptámeros tienen una mayor unión al fibrinógeno a pH 6,3 con respecto a un pH superior a 7,0, tal como pH 7,4. Preferiblemente, dichos aptámeros no se unen al fibrinógeno a un pH superior a 7,0. De manera más general, los aptámeros del segundo subgrupo pueden unirse al fibrinógeno de manera dependiente del pH.
Este subgrupo de aptámeros también es capaz de unirse al fibrinógeno en ausencia de Mg2+. En ciertas realizaciones, dichos aptámeros pueden tener una afinidad de unión para el fibrinógeno que depende del pH y/o de la presencia de Mg2+ en el medio. Por ejemplo, la afinidad de unión del aptámero por el fibrinógeno se puede reducir en presencia de Mg2+, por ejemplo en un medio que comprende Mg2+ en el intervalo de mM, con respecto al mismo medio desprovisto de Mg2+.
- Uso de aptámeros según la invención como ligandos de afinidad
Según la invención, se pueden utilizar ligandos de afinidad que comprenden un aptámero dirigido contra el fibrinógeno. Dichos ligandos de afinidad pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido para la purificación de fibrinógeno.
Típicamente, el ligando de afinidad utilizado según la invención comprende (i) un grupo de aptámero, a saber un aptámero dirigido contra el fibrinógeno como se define anteriormente unido a al menos una (ii) entidad no aptámero útil para la inmovilización sobre un sustrato adecuado. Preferiblemente, la entidad no aptámero está unida preferiblemente al extremo 5' o 3' del aptámero. En una cierta realización, el ligando de afinidad puede comprender un medio de inmovilización unido al grupo de aptámero directamente o mediante un grupo espaciador. En consecuencia, el ligando de afinidad puede comprender, o consistir en, un compuesto de fórmula (IV):
[IMM]-([ES PACIADOR])p-[APTAM ERO]
en la que
• [APTÁMERO] designa un aptámero como se define anteriormente,
• [ESPACIADOR] es un grupo espaciador,
• [IMM] es un grupo para la inmovilización del aptámero sobre un soporte, y
• p es 0 o 1.
p igual a 0 significa que el espaciador está ausente y que [IMM] está directamente unido a [APTÁMERO], preferiblemente en el extremo 3' o 5' del aptámero.
p igual a 1 significa que el espaciador está presente y conecta [IMM] y [APTÁMERO].
El grupo espaciador se elige típicamente de manera a reducir el impedimento estérico del grupo de aptámero y mejorar su accesibilidad conservando al mismo tiempo la capacidad del aptámero para unirse específicamente al fibrinógeno. El grupo espaciador puede ser de cualquier tipo. El espaciador puede ser un nucleótido monocatenario no específico, es decir, que no es capaz de unirse a ninguna proteína, incluyendo el fibrinógeno. Típicamente, el espaciador puede tener una longitud de 2 a 20 nucleótidos. Ejemplos de espaciadores nucleicos adecuados son poliA y poliT. En ciertas otras realizaciones, el espaciador puede ser una entidad química no nuclear. Por ejemplo, el espaciador puede elegirse del grupo que consiste en un péptido, un polipéptido, un oligo- o un polisacárido, una cadena hidrocarbonada eventualmente interrumpida por uno o más heteroátomos y eventualmente sustituida por uno o más sustituyentes tales como hidroxilo, halógenos o alquilo de C1-C3; polímeros que incluyen homopolímeros, copolímeros y polímeros secuenciados, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el espaciador puede seleccionarse del grupo que consiste en poliéteres tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol, poli(alcohol vinílico), poliacrilato, polimetacrilato, polisilicona, y una combinación de los mismos. Por ejemplo, el espaciador puede comprender varias cadenas hidrocarbonadas, oligómeros o polímeros unidos por cualquier grupo adecuado, tal como un heteroátomo, preferiblemente -O- o -S-, -NHC(O)-, -OC(O)-, -NH-, -NH-CO-NH-, -O-CO-NH-, un fosfodiéster o un fosforotioato. Estas cadenas de espaciador pueden incluir de 2 a 200 átomos de carbono, tal como de 5 a 50 átomos de carbono. Preferiblemente, el espaciador se elige entre los oligonucleótidos no específicos, las cadenas hidrocarbonadas, los poliéteres, en particular el polietilenglicol, y sus combinaciones.
Por ejemplo, el espaciador comprende al menos un grupo de polietilenglicol que comprende de 2 a 20 monómeros. Por ejemplo, el espaciador puede comprender de 1 a 4 bloques de trietilenglicol unidos entre sí mediante segmentos de unión apropiados. Por ejemplo, el espaciador puede ser un derivado de trietilenglicol etilamina hidrófilo de C12. En una variante, el espaciador puede ser una cadena hidrocarbonada de C2-C20, en particular una cadena de alquilo de C2-C20 tal como una cadena de metileno de C12.
El espaciador está preferiblemente unido al extremo 3' o al extremo 5 del grupo de aptámero. [IMM] designa cualquier grupo adecuado que permite inmovilizar el ligando de afinidad sobre un sustrato, preferentemente un soporte sólido.
[IMM] depende del tipo de interacciones buscado para inmovilizar el ligando de afinidad sobre el sustrato.
Por ejemplo, el ligando de afinidad puede inmovilizarse mediante interacciones no covalentes específicas que incluyen enlaces de hidrógeno, fuerzas electrostáticas o fuerzas de Van der Waals. Por ejemplo, la inmovilización del ligando de afinidad sobre el soporte puede depender de pares ligando/antiligando (por ejemplo, anticuerpo/antígeno tal como biotina/anticuerpo antibiotina y anticuerpo digoxigenina/antidigoxigenina, o ligando/receptor) y etiquetas de unión de proteína. Una multitud de etiquetas de proteína son bien conocidas por el experto en la técnica, e incluyen, por ejemplo, biotina (para una unión a derivados de estreptavidina o de avidina), glutatión (para unirse a proteínas u otras sustancias unidas a la glutatión-S-transferasa), maltosa (para unirse a proteínas u otras sustancias unidas a una proteína de unión a maltosa), lectinas (para unirse a grupos de azúcar), etiqueta c-myc, etiqueta del antígeno de hemaglutinina (HA), etiqueta de tiorredoxina, etiqueta FLAG, etiqueta poliArg, etiqueta poliHis, etiqueta Strep, dominio de unión a quitina, un dominio de unión a celulosa, y similares. En ciertas realizaciones, [IMM] designa la biotina. Por consiguiente, el ligando de afinidad utilizado según la invención conviene para la inmovilización sobre soportes en los que se injerta avidina o estreptavidina.
En una variante, el ligando de afinidad puede convenir para un injerto covalente sobre un soporte sólido.
[IMM] puede, por lo tanto, designar una entidad química que comprende un grupo químico reactivo. La entidad química tiene típicamente una masa molecular menor que 1000 g.mol-1 , preferiblemente menor que 800 g.mol-1 , tal como menor que 700, 600, 500 o 400 g.mol-1. Los grupos reactivos pueden ser de cualquier tipo e incluyen una amina primaria, un grupo maleimida, un grupo sulfhidrilo, y similares.
Por ejemplo, la entidad química puede derivar de un compuesto SIAB, un compuesto SMCC, o derivados de los mismos. El uso de sulfo-SIAB para inmovilizar oligonucleótidos se describe, por ejemplo, en Allerson et al., RNA, 2003, 9:364-374.
En ciertas realizaciones, [IMM] comprende un grupo amino primario. Por ejemplo, [IMM] puede ser -NH2 o aminoalquilo de C1-C30, preferiblemente aminoalquilo de C1-C6. Un ligando de afinidad en el que [IMM] comprende un grupo primario adecuado conviene para una inmovilización sobre un soporte que porta grupos de ácido carboxílico activados. Los grupos de ácido carboxílico activados incluyen, sin limitarse a, cloruro de ácido, grupos anhídrido y éster mixtos. Un grupo de ácido carboxílico activado preferido es el éster de N-hidroxisuccinimida.
Como se mencionó anteriormente, [IMM]-([ESPACIADOR])p está preferiblemente unido al extremo 3' o al extremo 5' del aptámero. El extremo del grupo de aptámero que no está unido a [IMM]-([ESPACIADOR])p puede comprender un nucleótido químicamente modificado tal como 2 '-o-metil- o 2 '-fluoropirimidina, 2 '-ribopurina, fosforamidita, un nucleótido invertido o un grupo químico tal como PEG o el colesterol. Estas modificaciones pueden prevenir la degradación, particularmente la degradación enzimática de ligandos. En otras realizaciones, dicho extremo libre del aptámero (es decir, que no está unido a [IMM] o a [ESPACIADOR]) se puede unir a un medio de detección tal como se describe anteriormente.
Según la invención, también se puede utilizar un soporte de afinidad capaz de unirse selectivamente al fibrinógeno, que comprende sobre este soporte una pluralidad de ligandos de afinidad como se han descrito anteriormente.
Los ligandos de afinidad pueden inmovilizarse sobre el soporte sólido mediante interacciones no covalentes o mediante uno o más enlaces covalentes.
En ciertas realizaciones, los ligandos de afinidad se injertan covalentemente sobre dicho soporte. Típicamente, el injerto se lleva a cabo mediante reacción del grupo químico reactivo presente en el grupo [IMM] del ligando con un grupo químico reactivo presente en la superficie del soporte sólido.
Preferiblemente, el grupo químico reactivo del ligando es un grupo amina primaria y el presente en el soporte sólido es un grupo ácido carboxílico activado tal como un grupo carboxílico activado por NHS (es decir, éster N-hidroxisuccimidílico). En este caso, la reacción de injerto se puede llevar a cabo a un pH menor que 6, por ejemplo a un pH de 3,5 a 4,5, como se ilustra en el Ejemplo 4 y se describe en el documento WO2012090183, cuya descripción se incorpora aquí como referencia.
El soporte sólido del soporte de afinidad puede ser de cualquier tipo y se elige en función del uso considerado.
Por ejemplo, el soporte sólido puede elegirse entre un soporte de plástico, metálico e inorgánico tal como el vidrio, el níquel/óxido de níquel, el titanio, el óxido de circonio, el silicio, el silicio colado, el silicio policristalino, el dióxido de silicio o una cerámica. Dicho soporte puede estar contenido en un dispositivo tal como un dispositivo microelectrónico, un dispositivo microfluídico, un sensor, un biosensor o un chip, por ejemplo, adecuado para su uso en SPR. Alternativamente, el soporte puede estar en forma de perlas, tales como perlas poliméricas, metálicas o magnéticas. Estos soportes pueden adaptarse a las necesidades de detección y diagnóstico.
En otras realizaciones, el soporte sólido puede ser un gel polimérico, un filtro o una membrana. En particular, el soporte sólido puede consistir en agar, agar reticulado, celulosa o polímeros sintéticos tales como poliacrilamida, polietileno, poliamida, polisulfona, y derivados de los mismos. Estos soportes pueden ser adecuados para la purificación del fibrinógeno. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un soporte para una cromatografía, en particular para una cromatografía por afinidad de líquidos. Por ejemplo, el soporte de afinidad utilizado según la invención puede ser adecuado para la realización de una cromatografía por afinidad a escala industrial. por lo tanto, el soporte de afinidad utilizado según la invención puede utilizarse como fase estacionaria en un procedimiento de cromatografía, por ejemplo en un procedimiento de cromatografía en columna o en un procedimiento de cromatografía discontinua.
Usos de aptámeros y ligandos de afinidad según la invención en la purificación del fibrinógeno
Un procedimiento para capturar fibrinógeno utilizado según la invención comprende las siguientes etapas:
• proporcionar un soporte sólido sobre el cual se inmoviliza un aptámero o un ligando de afinidad utilizado según la invención,
• poner en contacto dicho soporte sólido con una disolución que contiene el fibrinógeno, de modo que el fibrinógeno sea capturado mediante la formación de un complejo entre el fibrinógeno y dicho aptámero o dicho ligando de afinidad inmovilizado sobre el soporte sólido.
En ciertas realizaciones, el procedimiento puede comprender una o más etapas adicionales tales como:
• una etapa de liberar fibrinógeno de dicho complejo,
• una etapa de recuperar fibrinógeno de dicho complejo,
• una etapa de detectar la formación del complejo entre el fibrinógeno y dicho aptámero o ligando de afinidad,
• una etapa de cuantificar el fibrinógeno.
La detección del complejo y la cuantificación del fibrinógeno (o la del complejo) se pueden llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, la detección y la cuantificación se pueden llevar a cabo mediante SPR, como se ilustra en los ejemplos.
En una variante, se puede utilizar un ensayo de tipo ELISA en el que se utiliza un anticuerpo antifibrinógeno marcado para la detección o la cuantificación del complejo formado entre el fibrinógeno y los ligandos de afinidad según la invención. El anticuerpo antifibrinógeno puede marcarse con un fluoróforo o acoplarse a una enzima adecuada para la detección, tal como peroxidasa de rábano picante.
Como se ilustra en detalle en los Ejemplos 5 y 6 siguientes, los aptámeros utilizados según la invención son particularmente adecuados para su uso en la purificación del fibrinógeno.
Un procedimiento para purificar el fibrinógeno utilizado según la invención a partir de una composición de partida comprende las siguientes etapas:
a. poner en contacto dicha composición de partida con un soporte de afinidad tal como se define anteriormente, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo entre (i) los aptámeros o los ligandos de afinidad inmovilizados sobre dicho soporte y (ii) el fibrinógeno,
b. liberar el fibrinógeno de dicho complejo, y
c. recuperar el fibrinógeno en forma purificada.
Un procedimiento de preparación usado según la invención de una composición de fibrinógeno purificada a partir de una composición de partida que contiene fibrinógeno comprende las siguientes etapas:
a. poner en contacto dicha composición de partida con un soporte de afinidad tal como se define anteriormente, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo entre (i) los aptámeros o los ligandos de afinidad inmovilizados sobre dicho soporte y (ii) el fibrinógeno,
b. liberar el fibrinógeno de dicho complejo, y
c. recuperar la composición de fibrinógeno purificada.
Como se entiende aquí, la composición de partida puede ser cualquier composición que comprende potencialmente el fibrinógeno. La composición de partida puede comprender contaminantes de los cuales se debe separar el fibrinógeno.
Los contaminantes pueden ser de cualquier tipo y dependen de la naturaleza de la composición de partida. Los contaminantes incluyen proteínas, sales, hormonas, vitaminas, nutrientes, lípidos, restos celulares tales como fragmentos de membranas celulares, y similares. En ciertas realizaciones, los contaminantes pueden comprender proteínas sanguíneas tales como factores de coagulación, fibronectina, albúmina, inmunoglobulina, plasminógeno, alfa-2-macroglobulina, y similares.
En ciertas otras realizaciones, el contaminante puede comprender proteínas no humanas, particularmente proteínas no humanas expresadas de manera endógena por un huésped recombinante tal como una célula recombinante, una bacteria o una levadura, o un animal transgénico.
Típicamente, la composición de partida puede ser, o puede derivarse de, un cultivo celular, un caldo de fermentación, un lisado celular, un tejido, un órgano o un fluido corporal. Como se entiende aquí, una "composición de partida" deriva de una entidad de interés, tal como leche, sangre o un cultivo celular, lo que significa que la composición de partida se obtiene de dicha entidad sometiendo dicha entidad a una o más etapas de procesamiento. Por ejemplo, la entidad de interés puede someterse a uno o más tratamientos tales como lisis celular, una etapa de precipitación tal como precipitación de una sal, crioprecipitación o floculación, una etapa de filtración tal como filtración extensiva o ultrafiltración, centrifugación, clarificación, cromatografía, una etapa de extracción tal como extracción líquido-líquido o sólido-líquido, inactivación viral, pasteurización, etapas de congelación/descongelación, y similares. Por ejemplo, una composición de partida derivada de sangre incluye, sin limitarse a, plasma, una fracción plasmática y un crioprecipitado de sangre.
En ciertas realizaciones, la disolución de partida deriva de sangre, preferiblemente sangre humana. La composición de partida puede elegirse entre plasma, una fracción plasmática, por ejemplo la fracción I obtenida mediante un procedimiento de fraccionamiento con etanol de Cohn, y un crioprecipitado de sangre. En ciertas realizaciones, la composición de partida es una fracción plasmática empobrecida en inmunoglobulina y/o una fracción plasmática empobrecida en albúmina, y/o una fracción sanguínea o plasmática empobrecida en proteína de coagulación dependiente de la vitamina K.
En ciertas otras realizaciones, la composición de partida se obtiene a partir de un huésped recombinante. Preferiblemente, el huésped recombinante es un animal transgénico, tal como un mamífero transgénico no humano. El mamífero transgénico no humano puede ser cualquier animal que se haya modificado genéticamente de manera a expresar el fibrinógeno humano. Preferiblemente, el fibrinógeno humano se expresa en un fluido corporal de dicho animal transgénico.
La disolución de partida puede por lo tanto proceder o derivarse de un fluido corporal de un animal transgénico. Los fluidos corporales incluyen, sin limitarse a, sangre, leche materna y orina. En una realización particular, la composición de partida es, o deriva de, leche que proviene de un mamífero transgénico no humano. Los procedimientos para producir un animal transgénico capaz de segregar una proteína de interés en la leche son bien conocidos en la técnica. Típicamente, estos procedimientos incluyen introducir un producto de construcción genética que comprende un gen que codifica la proteína de interés operativamente unida a un promotor a partir de una proteína que se segrega naturalmente en la leche (tal como un promotor de caseína o un promotor WHAP) en un embrión de una especie mamífero no humana. El embrión se transfiere entonces al útero de una hembra que pertenece a la misma especie animal y que se ha preparado hormonalmente para un embarazo.
En ciertas realizaciones preferidas, la composición de partida puede elegirse entre sangre humana, leche transgénica, y sus derivados.
El soporte de afinidad utilizado en los procedimientos de la invención puede ser cualquier soporte de afinidad descrito anteriormente. Preferiblemente, el soporte de afinidad es un soporte de afinidad para llevar a cabo una cromatografía por afinidad. De hecho, los procedimientos para purificar fibrinógeno o preparar una composición purificada de fibrinógeno se basan preferiblemente en tecnologías de cromatografía, por ejemplo modos discontinuos o en columna, en las que el soporte de afinidad desempeña el papel de fase estacionaria. En la etapa a), un volumen apropiado de la composición de partida que contiene el fibrinógeno se pone en contacto con un soporte de afinidad en condiciones adecuadas para favorecer las interacciones específicas de los grupos de aptámero antifibrinógeno presentes en la superficie del soporte de afinidad con el fibrinógeno, de modo que se forma un complejo entre las moléculas de fibrinógeno y dichos grupos de aptámero. En la etapa a), el fibrinógeno está retenido por lo tanto en el soporte de afinidad. La unión entre los grupos de aptámero y las moléculas de fibrinógeno se puede reforzar llevando a cabo la etapa a) a un pH ligeramente ácido. En ciertas realizaciones, la etapa a) se lleva a cabo a un pH menor que 7,0, preferiblemente menor que 6,9, 6,8 o 6,7. En particular, la etapa a) se puede llevar a cabo a un pH de 6,0 a 6,8, preferiblemente a un pH de 6,0 a 6,5, tal como 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4 o 6,5. Por ejemplo, la etapa a) se puede llevar a cabo a un pH de 6,1 a 6,5, tal como un pH de 6,3. En un aspecto más general, la condición de pH de la etapa a) se puede elegir de manera a favorecer la unión del fibrinógeno sobre el soporte de afinidad minimizando al mismo tiempo la unión de otras moléculas sobre el soporte de afinidad. Típicamente, la etapa a) se lleva a cabo en presencia de una disolución amortiguador (en lo sucesivo denominada "amortiguador de unión"). El amortiguador de unión se puede mezclar con la composición de partida antes de la etapa a) o se puede añadir durante la etapa a). El amortiguador de unión es típicamente una disolución acuosa que contiene un agente amortiguador. El agente amortiguador se puede elegir de manera a ser compatible con el fibrinógeno y el soporte de afinidad y de manera a dar el pH deseado para la etapa a). Por ejemplo, para obtener un pH de aproximadamente 6,3, el agente amortiguador se puede elegir, sin limitarse a, entre ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), HEPES, Bis-TRIS, citrato y acetato. El agente amortiguador puede estar presente en una concentración de aproximadamente 5 mM a 1 mM, por ejemplo de 10 mM a 500 mM, por ejemplo de 10 mM a 200 mM, o de aproximadamente 50 mM.
Sin estar ligado a ninguna teoría, la presencia de sales puede favorecer la formación del complejo entre el fibrinógeno y los grupos de aptámero del soporte sólido y/o impedir la unión de otras moléculas presentes en la composición de partida. Típicamente, la etapa a) se puede llevar a cabo en presencia de cloruro de sodio, por ejemplo en una concentración que varía de 10 mM a 500 mM, preferiblemente de 50 mM a 350 mM, o de 100 mM a 200 mM, como de aproximadamente 150 mM.
La presencia de cationes divalentes puede modular la unión del fibrinógeno a grupos de aptámero. En ciertas realizaciones, la etapa a) se lleva a cabo en presencia de cationes divalentes, tales como Mg2+, en una concentración de al menos 1 mM, por ejemplo en una concentración de aproximadamente 1 mM a 50 mM, por ejemplo de 1 mM a 20 mM, como una concentración de aproximadamente 5 mM.
En ciertas otras realizaciones, la etapa a) se lleva a cabo en ausencia de Mg2+; y más generalmente, en ausencia de cationes divalentes.
Por lo tanto, el amortiguador de unión utilizado en la etapa a) puede comprender NaCl en una concentración de 100 mM a 500 mM y una sal de magnesio tal como cloruro de magnesio (MgCl2) en una concentración de aproximadamente 1 mM a 50 mM, y puede tener un pH de 5,0 o 6,9. Este amortiguador puede ser adecuado cuando los grupos de aptámero presentes sobre el soporte sólido se eligen entre el primer subgrupo de la invención definido anteriormente.
Un amortiguador de unión adecuado para llevar a cabo la etapa a), en particular cuando el grupo de aptámero pertenece al primer subgrupo definido anteriormente, puede ser un amortiguador que comprende 50 mM de MOPS, 5 mM de MgCl2 y 150 mM de NaCl, a pH 6,3.
Cuando los grupos de aptámero presentes sobre el soporte de afinidad se eligen entre el segundo subgrupo de aptámeros definido anteriormente, el amortiguador de unión puede estar libre de Mg2+ y, más generalmente, de cationes divalentes. Un amortiguador de unión adecuado para llevar a cabo la etapa a) puede ser por lo tanto un amortiguador que comprende 50 mM de MOPS y 150 mM de NaCl, a pH 6,3.
Al final de la etapa a) y antes de la etapa b), el soporte de afinidad se puede lavar con un amortiguador de lavado apropiado de manera a eliminar las sustancias que no están unidas específicamente, sino adsorbidas sobre el soporte. No hace falta decir que el amortiguador de lavado no altera significativamente el complejo entre el fibrinógeno y el grupo de aptámero, favoreciendo al mismo tiempo una desorción de sustancias que no se unen específicamente al soporte de afinidad.
Así, en ciertas realizaciones, un procedimiento que no entra dentro de la invención reivindicada comprende una etapa de lavado del soporte de afinidad al final de la etapa a) y antes de la etapa b). Se puede utilizar cualquier amortiguador de lavado convencional, bien conocido por el experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el amortiguador de lavado tiene la misma composición que el amortiguador de unión utilizado en la etapa a). En otras realizaciones, el amortiguador de lavado puede comprender los mismos componentes, pero en concentraciones diferentes, con respecto al amortiguador de unión utilizado en la etapa a). En realizaciones adicionales o alternativas, el pH del amortiguador de lavado es el mismo que el del amortiguador de unión.
El amortiguador de lavado puede tener un pH menor que 7, por ejemplo pH de 5,0 a 6,9, preferiblemente de 6,1 a 6,5, tal como pH 6,3. El amortiguador de lavado puede comprender además NaCl. Típicamente, la fuerza iónica del amortiguador de lavado puede ser mayor que la del amortiguador de unión. En efecto, la solicitante ha mostrado que, para ciertos aptámeros de la invención, una fuerza iónica elevada puede no alterar significativamente la unión del fibrinógeno a los grupos de aptámero. En otras palabras, el complejo entre fibrinógeno y ciertos aptámeros utilizados según la invención puede ser estable, incluso en presencia de una fuerza iónica elevada. Así, en ciertas realizaciones, la disolución de lavado tiene una fuerza iónica mayor que la del amortiguador de unión utilizado en la etapa a). En realizaciones alternativas o adicionales, el amortiguador de lavado puede comprender una concentración de NaCl de al menos 100 mM y hasta 10 M. Por ejemplo, la concentración de NaCl puede ser de aproximadamente 100 mM a 5 mM, preferiblemente de 150 mM a 2 mM. Opcionalmente, el amortiguador de lavado comprende además cationes divalentes, en particular Mg2+, en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a 20 mM, preferiblemente de 1 mM a 10 mM, tal como una concentración de aproximadamente 5 mM. En ciertas realizaciones, el amortiguador de lavado está libre de Mg2+ y, más generalmente, de cationes divalentes.
En ciertas otras realizaciones adicionales, el amortiguador de lavado puede comprender al menos un componente adicional, preferentemente elegido entre los alquildioles, en particular entre el etilenglicol o el propilenglicol. De hecho, para ciertos aptámeros utilizados según la invención, la presencia de alquildioles tales como etilenglicol en la disolución de lavado no altera el complejo entre el fibrinógeno y el aptámero. El amortiguador de lavado puede comprender por lo tanto un alquildiol tal como etilenglicol o propilenglicol en una cantidad de 1% a 70% en peso, preferiblemente de 10% a 60% en peso, tal como 50% en peso. A título de ilustración únicamente, el amortiguador de lavado comprende MOPS 50 mM, NaCl 2 M, pH 6,3 y, eventualmente, 50% en peso de glicol. Este amortiguador de lavado puede ser adecuado para llevar a cabo el lavado de un soporte de afinidad que porta grupos de aptámero que pertenecen al segundo subgrupo de aptámeros descrito anteriormente. Otro ejemplo de amortiguador de lavado es una disolución que comprende MOPS 50 mM, NaCl 0,5 M y MgCl25 mM a pH 6,3.
La etapa b) tiene como objetivo liberar el fibrinógeno del complejo formado en la etapa a). Esta liberación se puede lograr mediante la desestabilización del complejo entre el fibrinógeno y los grupos de aptámero, a saber usando condiciones que reducen la afinidad de los aptámeros por el fibrinógeno. Cabe señalar que el complejo entre el grupo de aptámero y el fibrinógeno puede desestabilizarse en condiciones moderadas que no son susceptibles de alterar el fibrinógeno.
Como se ha explicado anteriormente, la capacidad de los aptámeros utilizados según la invención para unirse al fibrinógeno puede depender del pH del medio. Un aumento del pH por encima de 7,0 puede permitir favorecer la liberación de fibrinógeno. Así, en ciertas realizaciones, la etapa b) se lleva a cabo aumentando el Ph más allá de 7,0. Preferiblemente, el pH de la etapa b) es de 7,0 a 8,0, por ejemplo de 7,2 a 7,8, tal como un pH de 7,4. En otras palabras, se puede utilizar un amortiguador de elución a un pH superior a 7,0 para favorecer la liberación del fibrinógeno. A título ilustrativo únicamente, un amortiguador de elución adecuado puede ser una disolución tamponada de MOPS 50 mM a pH 7,4 y que comprende NaCl 150 mM.
Como se explicó anteriormente, la capacidad del aptámero para unirse al fibrinógeno también puede variar en función de la presencia de cationes divalentes, tales como Mg2+. Por ejemplo, la unión del grupo de aptámero al fibrinógeno puede ser favorecida mediante la presencia de Mg2+. Así, la liberación del fibrinógeno del complejo en la etapa b) puede ser favorecida usando un amortiguador de elución desprovisto de cationes divalentes y/o que comprende un agente quelante de cationes divalentes, tal como EDTA o EGTA. Por ejemplo, el agente quelante de cationes divalentes puede estar presente en una concentración de al menos 1 mM y como máximo 500 mM en el amortiguador de elución utilizado en la etapa b). El uso de un agente quelante de catión divalente puede ser apropiado para un soporte de afinidad que porta aptámeros que pertenecen al primer subgrupo descrito anteriormente.
En otras realizaciones, la unión del grupo de aptámero al fibrinógeno puede disminuir en presencia de cationes divalentes tales como Mg2+. Así, en esta realización, el amortiguador de elución puede comprender cationes divalentes, en particular Mg2+, en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a 20 mM, preferiblemente de 1 mM a 10 mM, tal como una concentración de aproximadamente 5 mM. Esta elución puede ser adecuada para la liberación de fibrinógeno del complejo formado con un grupo de aptámero que pertenece al segundo subgrupo definido anteriormente.
Otro ejemplo de amortiguador de elución que se puede utilizar en la etapa b) es una disolución MOPS 50 mM a pH 7,4 que comprende MgCl22 M.
Al final de la etapa c), el fibrinógeno purificado se obtiene típicamente en forma de una composición líquida purificada. Esta composición líquida purificada puede sufrir una o más etapas adicionales. Dicha composición líquida puede concentrarse y/o someterse a inactivación o eliminación viral, por ejemplo mediante filtración estéril o mediante un detergente, diafiltración, una etapa de formulación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, liofilización, envasado, preferiblemente en condiciones estériles, y combinaciones de los mismos.
En un aspecto más general, el procedimiento para purificar fibrinógeno o el procedimiento para preparar una composición de fibrinógeno purificado puede comprender una o más etapas adicionales que incluyen, sin limitarse a, una o más etapas de cromatografía tales como cromatografía de exclusión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía multimodal, cromatografía en fase inversa, cromatografía de hidroxiapatita o cromatografía por afinidad, una etapa de precipitación, una o más etapas de filtración tales como filtración avanzada, ultrafiltración, ultrafiltración tangencial, nanofiltración y ósmosis inversa, una etapa de clarificación, una etapa de inactivación o eliminación viral, esterilización, formulación, liofilización , envase, y combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones adicionales, el procedimiento para purificar fibrinógeno o el procedimiento para preparar una composición de fibrinógeno purificado comprende una de las siguientes combinaciones de características:
• combinación 1 : (i) el grupo de aptámero se elige entre los aptámeros del primer subgrupo definido anteriormente, (ii) la etapa (a) se lleva a cabo a pH de 5,8 a 6,5, preferiblemente 6,3, en presencia de Mg2+, y (iii) la etapa (b) se lleva a cabo a un pH de 7,0 a 8,0, preferiblemente 7,4, eventualmente en presencia de un agente quelante de cationes divalentes, y
• combinación 2 : (i) el grupo de aptámero se elige entre los aptámeros del segundo subgrupo definido anteriormente, (ii) la etapa (a) se lleva a cabo a pH de 5,8 a 6,5, preferiblemente 6,3, en ausencia de Mg2+, y (iii) la etapa (b) se lleva a cabo a un pH de 7,0 a 8,0, preferiblemente 7,4, en presencia de Mg2+.
Los aptámeros y los ligandos de afinidad, que no entran dentro de la invención reivindicada, pueden usarse en un procedimiento de fraccionamiento del plasma sanguíneo. El procedimiento de fraccionamiento del plasma sanguíneo puede comprender varias etapas sucesivas de cromatografía por afinidad, permitiendo cada etapa de cromatografía por afinidad recuperar una proteína plasmática de interés tal como el fibrinógeno, una inmunoglobulina, una albúmina y otros factores de coagulación, tales como factores de coagulación que dependen de la vitamina K. Los ligandos de afinidad utilizados en cada etapa pueden ser de cualquier tipo, en particular aptámeros. A este respecto, la solicitante ha mostrado de manera sorprendente que las proteínas plasmáticas tales como fibrinógeno, albúmina e inmunoglobulina, pueden recuperarse y purificarse a partir del plasma sanguíneo llevando a cabo etapas de cromatografía por afinidad basadas en aptámeros sucesivos. Cabe señalar que el procedimiento de fraccionamiento del plasma sanguíneo que comprende etapas sucesivas de cromatografía por afinidad basada en aptámeros permite obtener un concentrado de fibrinógeno y un concentrado de inmunoglobulina con una pureza de proteína de al menos 96%, e incluso al menos 99%, con rendimientos de aproximadamente 9-12 g por litro de plasma para las inmunoglobulinas, y 2-4 g por litro de plasma para el fibrinógeno. La solicitante ha mostrado además que estos buenos rendimientos y estos buenos porcentajes de pureza se pueden alcanzar a partir de plasma sanguíneo bruto. En otras palabras, las etapas de cromatografía por afinidad basadas en aptámeros se pueden llevar a cabo en plasma sanguíneo bruto sin ningún pretratamiento como tal fraccionamiento con etanol (procedimiento de Cohn), crioprecipitación, fraccionamiento con caprilato o precipitación con PEG. Cabe señalar que este procedimiento de fraccionamiento permite evitar los almacenamientos en frío intermedios temporales.
Otro objeto no cubierto por el texto de las reivindicaciones es, por lo tanto, un procedimiento de fraccionamiento de plasma sanguíneo que comprende:
(a) una etapa de cromatografía por afinidad para recuperar fibrinógeno en la que el ligando de afinidad es un aptámero que se une específicamente al fibrinógeno, y
(b) una etapa de cromatografía por afinidad para recuperar las inmunoglobulinas (Ig) en la que el ligando de afinidad es un aptámero que se une específicamente a las inmunoglobulinas, en la que las etapas de cromatografía por afinidad (a) y (b) se pueden llevar a cabo en cualquier orden.
Preferiblemente, las inmunoglobulinas del isótopo G se recuperan en la etapa (b).
La etapa de cromatografía por afinidad para recuperar el fibrinógeno se puede llevar a cabo antes de la cromatografía por afinidad para recuperar la Ig y viceversa. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el procedimiento de fraccionamiento del plasma sanguíneo comprende las etapas de:
• someter el plasma sanguíneo o un derivado del mismo a una etapa de cromatografía por afinidad, en la que el ligando de afinidad es un aptámero que se une específicamente al fibrinógeno, y
• someter la fracción no retenida, que está sustancialmente desprovista de fibrinógeno, a una etapa de cromatografía por afinidad, en la que el ligando de afinidad es un aptámero que se une específicamente a la inmunoglobulina.
No hace falta decir que las etapas anteriores pueden comprender la recuperación de fibrinógeno e Ig retenidos en el soporte de afinidad, respectivamente.
En ciertas otras realizaciones, el procedimiento de fraccionamiento del plasma sanguíneo comprende las etapas de:
• someter el plasma sanguíneo o un derivado del mismo a una etapa de cromatografía por afinidad, en la que el ligando de afinidad es un aptámero que se une específicamente a una Ig, y
• someter la fracción no retenida, que está sustancialmente desprovista de Ig, a una etapa de cromatografía por afinidad, en la que el ligando de afinidad es un aptámero que se une específicamente a un fibrinógeno.
No hace falta decir que las etapas anteriores pueden comprender la recuperación de Ig y del fibrinógeno retenidos en el soporte de afinidad, respectivamente.
En el procedimiento que no entra dentro de la invención reivindicada, la composición de partida puede ser plasma sanguíneo o derivados del mismo. Los derivados del plasma sanguíneo incluyen, sin limitarse a, plasma sanguíneo clarificado, plasma sanguíneo empobrecido en lípidos, crioprecipitado de plasma sanguíneo, sobrenadante de crioprecipitado de plasma sanguíneo, fracción plasmática, y similares. En ciertas realizaciones, la composición de partida es un plasma sanguíneo bruto.
Preferiblemente, se recuperan inmunoglobulinas del isótopo G. Las inmunoglobulinas del isótopo G incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ciertas realizaciones, el aptámero dirigido por la inmunoglobulina es capaz de unirse específicamente a IgG, independientemente de las subclases de IgG. En ciertas realizaciones, se usan varios tipos de aptámeros anti-IgG para recuperar todas las subclases de IgG. Preferiblemente, la fracción de IgG recuperada en el procedimiento de fraccionamiento que no entra dentro de la invención reivindicada tiene una distribución de subclases próxima a la del plasma sanguíneo de partida, es decir, comprende de 50% a 70% de IgG1, de 25% a 35% de IgG2, 2% a 8% de IgG3, y de 1% a 8% de IgG4.
En ciertas realizaciones, el procedimiento de fraccionamiento de plasma sanguíneo que no entra dentro de la invención reivindicada comprende una o más etapas adicionales, en particular (c) una etapa de purificación de la albúmina.
La albúmina purificada se puede recuperar mediante cualquier procedimiento convencional tal como cromatografía, incluyendo cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico y precipitación con etanol seguida de una filtración.
Por ejemplo, la etapa (c) puede ser una etapa de cromatografía por afinidad en la que el ligando de afinidad es un aptámero que se une específicamente a la albúmina.
Cuando la etapa (c) está presente, las etapas (a), (b) y (c) se pueden llevar a cabo en cualquier orden. En ciertas realizaciones, la etapa (c) se lleva a cabo sobre la fracción no retenida obtenida de la etapa (a) o de la etapa (b).
Se puede utilizar cualquier tipo de tecnología de cromatografía para llevar a cabo las etapas (a), (b) y (c) en el procedimiento que no pertenece a la invención reivindicada, tal como cromatografía discontinua, cromatografía sobre lecho móvil simulado (SMB). Las tecnologías de cromatografía preferidas son aquellas que implican el uso de varias columnas, tales como la cromatografía sobre SMB.
El método de fraccionamiento del plasma sanguíneo puede comprender una o más etapas adicionales que incluyen, sin limitarse a, una etapa de cromatografía para eliminar los anticuerpos anti-A y/o anti-B, una ultrafiltración, una ultrafiltración tangencial, una nanofiltración, una ósmosis inversa, una clarificación, una etapa de desactivación viral, una etapa de eliminación viral, una esterilización, etapas de pulido tales como formulación o liofilización o combinaciones de las mismas. El procedimiento que no entra dentro de la invención reivindicada también puede comprender una o más etapas adicionales con el objetivo de prevenir y/o eliminar la obstrucción de las columnas de cromatografía tales como el tratamiento sanitario con una disolución alcalina, por ejemplo con una disolución de hidróxido de sodio.
Otro objeto que no entra dentro de la invención reivindicada es una composición de fibrinógeno purificado que comprende al menos 90% en peso, preferiblemente al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% en peso, con respecto al peso total de las proteínas presentes en dicha composición. En ciertas realizaciones, la composición de fibrinógeno purificado comprende fibrinógeno plasmático humano, por ejemplo el fibrinógeno obtenido a partir de plasma humano. En ciertas realizaciones, la composición está sustancialmente libre de factores de coagulación humanos distintos del fibrinógeno humano. En ciertas realizaciones adicionales o alternativas, dicha composición está libre de factor XIII.
En ciertas realizaciones, la composición de fibrinógeno purificada comprende fibrinógeno recombinante humano, por ejemplo fibrinógeno humano producido por un huésped recombinante tal como una célula recombinante o un animal transgénico. En esta realización, dicha composición comprende como máximo 10%, preferentemente como máximo 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% o 0,1% en peso de otras proteínas, en particular otras proteínas no humanas del huésped recombinante. En ciertas realizaciones, la composición está sustancialmente libre de proteínas no humanas. En ciertas realizaciones adicionales o alternativas, dicha composición está libre de cualquier homólogo no humano de fibrinógeno que puede encontrarse en el huésped recombinante.
La composición que comprende fibrinógeno tal como se reivindica en el conjunto de las reivindicaciones adjunto también puede estar en forma de una composición farmacéutica en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Dicha composición farmacéutica, así como la composición líquida purificada de fibrinógeno según la invención, se puede utilizar en el tratamiento de trastornos de la coagulación, en particular en los tratamientos de una deficiencia congénita o adquirida de fibrinógeno (hipo-, dis- o a-fibrinogemia). La composición de la invención se puede utilizar en el tratamiento de hemorragias postraumáticas o posquirúrgicas agudas o en el tratamiento de la deficiencia de fibrinógeno resultante de insuficiencia renal aguda.
Procedimiento para obtener los aptámeros utilizados según la invención
La solicitante ha llevado a cabo varias estrategias SELEX descritas en la técnica anterior para identificar aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno humano. Ninguna de estas estrategias tuvo éxito y un SELEX estándar permitió identificar aptámeros dirigidos contra un contaminante, lo que explica por qué se utiliza menos de 1 % de la composición de fibrinógeno purificado para elaborarlo.
En este contexto, la solicitante ha llevado a cabo una extensa investigación para desarrollar un nuevo procedimiento para obtener aptámeros dirigidos contra proteínas “resistentes a SELEX” tales como el fibrinógeno.
La solicitante ha concebido un nuevo procedimiento SELEX que permite obtener aptámeros que tienen una fuerte afinidad de unión por proteínas "resistentes a SELEX" y que pueden utilizarse como ligandos de afinidad en un procedimiento de purificación. Este nuevo procedimiento SELEX se caracteriza por una etapa de selección que se lleva a cabo en condiciones de pH adecuadas para la creación de "parches positivos" en la superficie de la proteína diana. En otras palabras, el procedimiento concebido por la solicitante se basa en fortalecer las interacciones locales entre los aptámeros potenciales y la proteína diana favoreciendo cargas positivas en un dominio superficial de la proteína. Este procedimiento se puede llevar a cabo para proteínas que tienen una o más histidinas de superficie, tales como el fibrinógeno. El pH de la etapa de selección (es decir, la etapa en el que la proteína diana se pone en contacto con la mezcla candidata de ácidos nucleicos) debe elegirse de manera que favorezca la protonación de al menos una histidina de superficie de la proteína diana. En el caso del fibrinógeno, la solicitante ha mostrado que un pH apropiado para la etapa de selección es un pH ligeramente ácido.
En consecuencia, un procedimiento para obtener un aptámero utilizado según la invención que se une específicamente al fibrinógeno comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto el fibrinógeno con una mezcla candidata de ácidos nucleicos a un pH menor que 7,0, preferiblemente de 5,8 a 6,8,
b) recuperar ácidos nucleicos que se unen al fibrinógeno, eliminando al mismo tiempo los ácidos nucleicos no unidos,
c) amplificar los ácidos nucleicos obtenidos en la etapa (b) para producir una mezcla candidata de ácidos nucleicos que tienen una afinidad aumentada por el fibrinógeno, y
d) repetir las etapas (a), (b), (c) hasta obtener uno o más aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno.
En la etapa (a), la mezcla candidata de ácidos nucleicos es generalmente una mezcla de ácidos nucleicos estadísticos sintetizados químicamente. La mezcla candidata puede comprender de 108 a 1018, típicamente alrededor de 1015 ácidos nucleicos. La mezcla candidata puede ser una mezcla de ácidos nucleicos de ADN o una mezcla de ácidos nucleicos de ARN. En ciertas realizaciones, la mezcla candidata está compuesta por una multitud de ADN monocatenarios (ADNss), en la que cada ADNss comprende una secuencia estadística central de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos flanqueada por secuencias específicas de aproximadamente 15 a 40 nucleótidos que actúan como cebadores para una amplificación por PCR. En ciertas otras realizaciones, la mezcla candidata está compuesta por una multitud de ácidos nucleicos de ARN, en la que cada ARN comprende una secuencia estadística central de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos flanqueada por secuencias cebadores de aproximadamente 15 a 40 nucleótidos para una amplificación por RT-PCR. En ciertas realizaciones, la mezcla candidata de ácidos nucleicos está constituida de ácidos nucleicos no modificados, lo que significa que los ácidos nucleicos comprenden únicamente nucleótidos que existen naturalmente. En ciertas otras realizaciones, la mezcla candidata puede comprender ácidos nucleicos químicamente modificados. En otras palabras, los ácidos nucleicos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados químicamente. En realizaciones preferidas, la mezcla candidata está constituida por ADN monocatenarios.
La etapa a) se lleva a cabo en condiciones favorables para la unión del fibrinógeno a ácidos nucleicos que tienen una afinidad por dicho fibrinógeno. Preferiblemente, el pH de la etapa a) es de 6,0 a 6,6, tal como 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 y 6,5. Un pH adecuado para la etapa a) es, por ejemplo, 6,3 ± 0,1. Este pH permite protonar al menos una histidina superficial de fibrinógeno. La etapa (a) se puede llevar a cabo en una disolución acuosa tamponada. El agente amortiguador se puede elegir entre cualquier agente amortiguador que permite obtener el pH deseado y que es compatible con las proteínas diana y la mezcla de ácidos nucleicos. El agente amortiguador se puede elegir, sin limitarse a, entre ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), HEPES, Bis-Tris, citrato y acetato. El agente amortiguador puede estar presente en una concentración de aproximadamente 5 mM a 1 M, por ejemplo de 10 mM a 500 mM, por ejemplo de 10 mM a 200 mM, o de aproximadamente 50 mM.
En una realización particular de la invención, la composición líquida, estable y que comprende fibrinógeno, se obtiene según el procedimiento que comprende las siguientes etapas:
• obtener una fracción de criosobrenadante de plasma sanguíneo,
• precipitar el criosobrenadante con 8% de etanol a fin de obtener una fracción enriquecida en fibrinógeno,
• purificar la fracción de plasma sanguíneo enriquecida en fibrinógeno después de la resuspensión mediante separación en gel de cromatografía por afinidad utilizando preferentemente ligandos de tipo derivados de anticuerpos de llama o aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno,
• recuperar la fracción adsorbida purificada que comprende fibrinógeno,
• eventualmente, añadir excipientes farmacéuticamente aceptables, preferiblemente arginina y/o citrato.
En una realización particular, el procedimiento comprende además una etapa de conservación durante al menos 3 meses a 4°C.
En una realización particular de la invención, la cromatografía por afinidad utilizada es una matriz de afinidad con ligandos de tipo fragmento derivado de anticuerpos de llama tal como la matriz Fibrinogen CaptureSelect (Life Technologies).
Ventajosamente, el porcentaje de protrombina residual es menor que 5 püi/mg de fibrinógeno, el porcentaje de plasminógeno es menor que 15 ng/mg de fibrinógeno.
En una realización particular de la invención, la composición según la invención está por lo tanto libre de proteasas tales como trombina y/o plasmina o sus correspondientes proenzimas protrombina (factor ii de la coagulación) y/o plasminógeno, que son zimógenos potencialmente activables.
En una realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención está libre de inhibidores de proteasa y de antifibrinolíticos.
Por "inhibidores de proteasa y antifibrinolíticos" se entiende cualquier molécula con actividad antiproteásica, en particular cualquier molécula con actividad inhibidora de serina proteasa y/o antifibrinolítica, en particular cualquier molécula con actividad inhibidora de trombina y/o antiplasmina, en particular hirudina, benzamidina, aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), pepstatina, leupeptina, antitrombina iii asociada o no a heparina, alfa 2 macroglobulina, alfa 1 antitripsina, ácido hexanoico o épsilon aminocaproico, ácido tranexámico, alfa 2 antiplasmina.
En una realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención está libre de hirudina y/o de benzamidina y/o de aprotinina y/o de PMSF y/o de pepstatina y/o de leupeptina y/o de antitrombina iii asociada o no a heparina y/o de alfa 2 macroglobulina y/o de alfa 1 antitripsina y/o de ácido hexanoico y/o épsilon aminocaproico y/o de ácido tranexámico y/o de alfa 2 antiplasmina.
En una realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención está libre de iones metálicos.
En una realización particular de la invención, la composición según la invención está ventajosamente libre de calcio.
En una realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención está libre de isoleucina, de glicina y/o de NaCl.
En una realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención está libre de albúmina.
Ventajosamente, la composición según la invención tiene una pureza mayor o igual a 70%, preferentemente mayor o igual a 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
En una realización particular de la invención, la composición según la invención no comprende otras proteínas copurificadas, ventajosamente ningún FXiii y/o fibronectina.
En otra realización particular de la invención, la composición de fibrinógeno según la invención también puede comprender una o más proteínas acompañantes, eventualmente copurificadas.
La composición según la invención se somete, directamente después de la purificación, a las etapas de conformación farmacéutica en forma líquida: formulación, filtración esterilizante y distribución en un recipiente (frasco u otro dispositivo de conservación/administración).
De manera particularmente ventajosa, la composición según la invención no se somete a ninguna etapa de liofilización, desecación, deshidratación o secado.
De manera particularmente ventajosa, la composición según la invención se presenta por lo tanto en forma líquida sin haberse sometido a una etapa de reconstitución de un liofilizado.
De manera particularmente ventajosa, la composición según la invención está en forma líquida y, por lo tanto, comprende agua, además de cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular de la invención, la composición en forma líquida comprende citrato y/o arginina, preferiblemente menos de 300 mM de arginina.
De manera ventajosa, la composición según la invención es particularmente adecuada para la administración por vía intravenosa.
Otro aspecto de la invención se refiere a la composición según la invención para su uso en terapia. Todas las especificaciones técnicas indicadas anteriormente se aplican aquí.
El siguiente ejemplo ilustra una realización de la presente invención sin limitar su alcance.
Ejemplo 1: Composición de fibrinógeno líquido estable
Material y método
Fracción plasmática
La materia prima de partida es un pool de plasma humano previamente sometido a una etapa de crioprecipitación y después sometido a una etapa de precipitación con 8% de etanol.
La disolución de fibrinógeno plasmático prepurificada así obtenida se diluye con 2 volúmenes de amortiguador de equilibración en gel antes de la inyección sobre la columna de cromatografía preequilibrada en pH y en conductividad. Características de la fracción plasmática: fibrinógeno antigénico ajustado por dilución a 4,7-4,8 g/l.
Disoluciones amortiguadores
La composición de las disoluciones amortiguadores utilizadas durante las diferentes etapas del procedimiento de cromatografía se resume en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1: Disoluciones amorti uadores para cromato rafía por afinidad.
Geles para cromatografía por afinidad
Para la cromatografía, se usa un gel de afinidad CaptureSelect Fibrinogen (Life Technologies ref.191291050, lotes 171013-01 y 171013-05), que tiene un ligando de afinidad constituido por un fragmento de anticuerpo de llama antifibrinógeno.
Columnas
Se usó una columna de 50 mm de diámetro (Referencia XK 50/30 GE Healthcare), volumen de gel envasado de 67 ml; para una altura de columna de 3,4 cm
Purificación por afinidad
La disolución de fibrinógeno ajustada a aproximadamente 5 g/l se inyecta sin ajustes adicionales en la columna de afinidad de fibrinógeno CaptureSelect equilibrada. Se aplicó una carga de aproximadamente 10 g/l.
El eluido de cromatografía se ultrafiltró y se preformuló entonces sobre una membrana de umbral de corte de 100 kDa (referencia Pall Omega OS100C10).
Al final del procedimiento, el producto obtenido tiene una concentración de fibrinógeno coagulable de 15,2 g/l y de fibrinógeno antigénico de 15,2 mg/ml.
Ejemplo 2: estabilidad de una composición de fibrinógeno líquido
Composición de fibrinógeno
La composición de fibrinógeno obtenida según el método ilustrado en el Ejemplo 1 se formula como mínimo con arginina 100 mM y citrato 8,5 mM a pH 7,0.
Estabilidad de la composición de fibrinógeno
La composición se coloca en estabilidad, bajo aire (al aire libre), sin agitación, en cámara fría a 5°C.
Se toman muestras antes de la estabilidad (T0) y en diferentes tiempos después del inicio de la puesta en estabilidad: dos meses (T2M) y 3 meses (T3M).
Resultados de la puesta en estabilidad a 5°C
Los resultados de este ensayo de puesta en estabilidad se presentan en la siguiente tabla.
Los resultados obtenidos a los 2 y 3 meses del inicio de la puesta en estabilidad muestran que:
• Los resultados de SDS PAGE en condiciones reducidas muestran una pequeña variación en los perfiles de las cadenas alfa, beta y gamma que permanecen estables en el tiempo, confirmando la conservación de la integridad del fibrinógeno líquido;
• La relación fibrinógeno coagulable/fibrinógeno antígeno se conserva y es estable en 1, lo que confirma la conservación de la integridad y de la funcionalidad del fibrinógeno líquido.
Los resultados de este ensayo demuestran claramente que la composición de fibrinógeno es estable en forma líquida a 5°C durante 3 meses.
Ejemplo 3: Identificación de aptámeros antifibrinógeno utilizados según la invención
1. Material y método
Bancos de oligonucleótidos
La biblioteca de ADNss utilizada para llevar a cabo el procedimiento SELEX está constituida de una región aleatoria de 40 bases flanqueada por dos regiones de cebadores constantes de 18 bases.
Fibrinógeno
La proteína diana es el fibrinógeno humano. Durante el procedimiento SELEX se utilizaron diferentes fuentes de fibrinógeno humano:
Fibrinógeno humano: Se utilizaron dos preparaciones de fibrinógeno humano y se prepararon en forma de una composición purificada a partir de plasma humano que tenía una pureza respectivamente de 95% y de 99,9%.
Fibrinógeno transgénico: El fibrinógeno transgénico se purificó a partir de leche de vacas transgénicas hasta una pureza de 97%.
Protocolo SELEX
El fibrinógeno (fibrinógeno transgénico puro al 97% para los ensayos 1 a 3, y el fibrinógeno plasmático puro al 95% para los ensayos 4 y 5, y el fibrinógeno plasmático puro al 99,9% para los ensayos 6 a 8) se inmovilizó en una resina de afinidad, mientras que la cantidad de diana inmovilizada en la la resina disminuyó de manera continua de los ensayos 1 a 8 (véase la Figura 8).
La diana inmovilizada se incubó con un banco/pool de ADNss a concentraciones decrecientes usando amortiguador de selección (MOPS 50 mM, pH 6,30, NaCl 150 mM, MgCl25 mM) durante un tiempo de incubación decreciente (véase la tabla en la Figura 8).
La resina que contiene fibrinógeno/ADNss se recuperó y se lavó con tampón de selección durante los ensayos 1 y 2, y un tampón de lavado que contiene MOPS 50 mM, pH 6,30, NaCl 500 mM, MgCl25 mM de los ensayos 3 a 8 (véase la tabla). Después del lavado, el ADNss ligado se eluyó utilizando un amortiguador de elución (Tris-HCl 50 mM, pH 7,40, EDTA 200 mM). Antes de cada ensayo (excepto el primer ensayo), se llevó a cabo una etapa de selección de contraiones incubando el conjunto de ADNss con la resina de afinidad a fin de evitar el enriquecimiento de los aptámeros anti-soporte. Los parámetros de los protocolos SELEX se describen en la Figura 8.
Determinación de la afinidad de unión de aptámeros por SPR
El aptámero elegido se sintetizó con biotina y un espaciador de trietilenglicol en el extremo 5' del oligonucleótido. Se preparó una disolución 1 pM del aptámero utilizando un amortiguador de selección SELEX. La disolución de aptámero se calentó a 90°C durante 5 min, se incubó en hielo durante 5 min y se equilibró a temperatura ambiente durante 10 min. La preparación se inyectó en un chip de sensor recubierto con estreptavidina SA de Biocore T200 instrument (GE Healthcare) a un caudal de 10 pl/ml durante 7 min. Después, se inyectaron diferentes concentraciones de la diana en el aptámero inmovilizado a razón de 30 pl/min durante 1 minuto. Después de una disociación durante 1-2 minutos, se llevó a cabo una etapa de lavado mediante inyección de un amortiguador de lavado adecuado a razón de 30 pl/min durante 1 min. Para la elución, se inyectó un amortiguador de elución adecuado a razón de 30 pl/min durante 1 -2 min. Finalmente, el chip de sensor se regeneró mediante inyección de NaOH 50 mM a razón de 30 pl/min durante 30 s. Durante el experimento, la señal de respuesta se registró en un sensograma.
2. Resultados
El procedimiento SELEX permitió identificar 67 candidatos aptámeros antifibrinógeno, entre los cuales aptámeros de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 60 y 65 que presentaban una fuerte afinidad tanto por el fibrinógeno humano plasmático como por transgénico.
Se descubrió que estos aptámeros se unen al fibrinógeno humano de manera dependiente del pH. Se determinaron las secuencias de bases de los aptámeros de SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 58 (a saber, la secuencia mínima que se une al fibrinógeno). El aptámero de SEQ ID N° 66 corresponde a la secuencia de base del aptámero de SEQ ID N° 1. El aptámero de SEQ ID N° 67 corresponde a la secuencia de base del aptámero de SEQ ID N° 58. Las Figuras 3A-3D presentan el perfil de unión obtenido para las secuencias de base de los aptámeros de SEQ ID N° 1 y N°: 58 por SPR. Los aptámeros de SEQ ID N° 66 y 67 son capaces de unirse específicamente al fibrinógeno transgénico y al fibrinógeno plasmático a pH 6,3 de una manera dependiente de la dosis, como lo muestra el aumento de las señales cuando aumenta la concentración de fibrinógeno. El complejo entre los aptámeros y el fibrinógeno no se disociaba significativamente al aumentar la concentración de NaCl. Por otro lado, la inyección de un amortiguador a pH 7,4 permitió disociar el complejo entre los aptámeros y, por lo tanto, se eluyó el fibrinógeno (Figuras 3A-3D ).
De hecho, los aptámeros obtenidos mediante el procedimiento descrito anteriormente y no cubiertos por las reivindicaciones se unen al fibrinógeno de una manera dependiente del pH. Este resultado se ilustra en las Figuras 4A y 4B respectivamente para los aptámeros de SEQ ID N° 66 y SEQ ID N° 67. El nivel de unión del fibrinógeno disminuye cuando aumenta el pH. La unión más alta se observó a pH 6,3. Los aptámeros no se unieron al fibrinógeno para un pH mayor que 6,8.
Ejemplo 4: preparación de soportes de afinidad para los aptámeros identificados
1. Material y método
- Soportes de afinidad
Se prepararon dos soportes de afinidad injertando aptámeros en sefarosa activada por NHS (GE Healthcare). El primer soporte de afinidad (soporte de afinidad N° 1) se preparó injertando aptámeros de SEQ ID N° 66 (aptámero A5-1.9) que comprenden un espaciador C6 con un grupo amino terminal en su extremo 5' y una desoxi-timidina invertida en su extremo de 3'. El segundo soporte de afinidad (soporte de afinidad N° 2) se preparó injertando aptámeros de SEQ ID N° 67 (aptámero A5-2.9) que comprenden un espaciador C6 con un grupo amino terminal en su extremo 5' y una desoxi-timidina invertida en su extremo de 3'.
Se enjuagó 1 volumen de gel de sefarosa activada por NHS colocado en una columna con al menos 10 volúmenes de disolución fría de HCl 0,1 M, después se equilibró con al menos 8 volúmenes de disolución fría de acetato 100 mM, pH 4,0.
Después de una centrifugación a 2000 g durante 3 min, se separa el sobrenadante, y el gel escurrido se resuspende en 2 volúmenes de aptámero en una disolución de acetato 100 mM pH 4,0. Esta suspensión se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente bajo agitación.
Después, se añade 1 volumen de borato 200 mM pH 9, esta suspensión se incuba a temperatura ambiente bajo agitación durante 2h30 min.
Después de centrifugar a 2000 g durante 3 min, se reserva el sobrenadante. El gel escurrido se resuspende en 2 volúmenes de disolución de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5. La suspensión se incuba a 4°C bajo agitación durante una noche.
Después de una incubación y de una centrifugación a 2000 g durante 3 min, se reserva el sobrenadante. El gel se lava alternativamente con 2 volúmenes de acetato de sodio 0,1 M NaCl al 0,5% pH 4,2 y 2 volúmenes de disolución de Tris-HCl 0,1 M pH 8,5. Este ciclo de lavado se repite una vez.
Después de centrifugar a 2000 g durante 3 min, se separa el sobrenadante. El gel escurrido se resuspende en 2 volúmenes de amortiguador de equilibrado.
Ejemplo 5: Purificación de fibrinógeno a partir de una disolución de fibrinógeno semipurificado sobre el soporte de afinidad del Ejemplo 4
1. Material y método
- Condiciones de la cromatografía de afinidad
Soporte de afinidad n° 1: Una disolución de fibrinógeno semipurificado descongelada (IP1: El producto intermedio de fibrinógeno 1) obtenido a partir de plasma humano se diluyó 10 veces en el amortiguador de unión y el pH se ajustó a 6.3. El IP1 diluido se sometió a etapas de cromatografía sobre el soporte n° 1. Esta etapa se repitió una vez para obtener una cantidad suficiente de fibrinógeno para una etapa de ultrafiltración.
Soporte de afinidad n° 2: Una disolución de fibrinógeno semipurificado descongelada (IP1: El producto intermedio de fibrinógeno 1) obtenido a partir de plasma humano se diluyó 10 veces en el amortiguador de unión y el pH se ajustó a 6.3. El IP1 diluido se sometió a etapas de cromatografía sobre el soporte n° 2. Esta etapa se repitió una vez para obtener una cantidad suficiente de fibrinógeno para una etapa de ultrafiltración.
Las condiciones de cromatografía por afinidad se resumen para cada soporte de afinidad:
Para cada soporte de afinidad, se eluyó el fibrinógeno en condiciones moderadas mediante modificación de la composición del amortiguador. Para las dos cromatografías sobre soportes de afinidad N° 1 y N° 2, se produjeron 2 fracciones de eluato y se combinaron para una etapa de ultrafiltración.
- Condiciones de la ultrafiltración
Para cada soporte de afinidad, un conjunto de fracciones de eluato se sometió a ultrafiltración a 100 kDa a fin de concentrar el fibrinógeno y formularlo en citrato de sodio 10 mM, argilina a razón de 20 g/l a pH 7,4.
- Procedimientos analíticos
2. Resultados
Los resultados se dan en las Figuras 7A-7B y 7C-7D. Las Figuras 7A y 7B representan el perfil cromatográfico obtenido para la purificación de fibrinógeno a partir de una disolución de fibrinógeno semipurificado respectivamente sobre los soportes de afinidad N° 1 y N° 2. El fibrinógeno se eluyó mediante elevación del pH a 7,4 y añadiendo MgCL para el soporte de afinidad N° 2 y eliminando Mg2+ para el soporte de afinidad N° 1. El análisis por electroforesis de las fracciones obtenidas por cromatografía (Figuras 7C y 7D) mostró que los contaminantes presentes en el material cargado (IP1) se eliminan significativamente, siendo prácticamente sólo el fibrinógeno visible en el eluato. Además, condiciones reductoras muestran que el fibrinógeno en el eluato es una forma nativa sin degradación visible (Aa1 es la banda más importante entre las bandas de Aa).
Los rendimientos y la concentración de fibrinógeno obtenidos se resumen en la siguiente tabla:
El fibrinógeno activo se pone en evidencia mediante una relación entre el fibrinógeno coagulante y el fibrinógeno antígeno cercana a 1. En la siguiente tabla se detalla un análisis del fibrinógeno concentrado y formulado preparado con los dos soportes de afinidad:
Para ambos fibrinógenos purificados, la relación entre fibrinógeno de coagulación y antígeno fue aproximadamente 1,0 para ambos aptámeros. Las condiciones moderadas de cromatografía permitieron la preparación de fibrinógeno purificado que tiene una actividad conservada.
La siguiente tabla muestra la titulación de las proteínas contaminantes en el material de partida y en la fracción de fibrinógeno purificada obtenida con el soporte de afinidad descrito anteriormente:
Se obtiene una buena eliminación de las proteínas contaminantes con una eliminación que oscila entre 65% y 99% del material de partida.
Las condiciones de la cromatografía permitieron la eliminación de más de 99,5% del plasminógeno inicial, que es uno de los contaminantes más problemático desde la perspectiva de la estabilidad del fibrinógeno.
Los aptámeros identificados por SELEX convienen para un uso como ligando de afinidad en la purificación de fibrinógeno por cromatográfica. Cabe señalar que los aptámeros identificados mediante el procedimiento descrito anteriormente y no cubiertos por las reivindicaciones permiten la unión selectiva y después la elución del fibrinógeno en condiciones moderadas y no desnaturalizantes.
Ejemplo 6: Purificación de fibrinógeno por cromatografía a partir de plasma
Soporte de afinidad N° 1: El plasma se descongeló, se filtró a 0,45 pm, se diluyó 10 veces con amortiguador de unión y después se ajustó a pH 6,3. Una disolución diluida se sometió a etapas de cromatografía sobre el soporte N° 1. Soporte de afinidad N° 2: El plasma se descongeló, se filtró a 0,45 pm, se diluyó 10 veces con amortiguador de unión y después se ajustó a pH 6,3. Una disolución diluida se sometió a etapas de cromatografía sobre el soporte N° 2. Las condiciones de afinidad se resumen, para cada soporte de afinidad, en la siguiente tabla:
Para cada soporte de afinidad, se eluyó el fibrinógeno en condiciones moderadas mediante modificación de la composición del amortiguador.
2. Resultados
Los resultados se dan en las Figuras 5A-5B y 6A-6B. Las Figuras 5A y 6A representan el perfil cromatográfico obtenido para la purificación del fibrinógeno a partir de plasma respectivamente sobre los soportes de afinidad N° 1 y N° 2. Cabe señalar que la mayoría de las proteínas contaminantes no se habían retenido en la fase estacionaria mientras que el fibrinógeno estaba unido al soporte. El fibrinógeno se eluyó elevando el pH a 7,4 y añadiendo MgCl22 M para el soporte de afinidad N° 2 y eliminando Mg2+ para el soporte de afinidad N° 1. El análisis por electroforesis de las fracciones obtenidas por cromatografía (Figura 5B y Figura 6B) ha mostrado que el fibrinógeno estaba presente principalmente en la 1a fracción de elución mientras que las proteínas contaminantes estaban presentes en la fracción no retenida, en la fracción de lavado o en la fracción de regeneración. De hecho, las fracciones eluidas migraron como una sola banda. La pureza relativa (determinada mediante SDS PAGE) de las fracciones de fibrinógeno de eluato fue superior a 95%.
Estos resultados ponen en evidencia que los aptámeros utilizados según la invención son particularmente adecuados para su uso como ligandos de afinidad en la purificación del fibrinógeno a partir de composiciones de partida complejas.
Ejemplo 7: Optimización de la secuencia de base de SEQ ID N°: 66
1. Material y método
- Preparación de variantes de SEQ ID N°: 66:
En el primer ensayo, se concibieron 28 variantes mediante eliminación sistemática de 2 nucleótidos consecutivos por variante (1/2, 3/4, 5/6, etc.). En el siguiente ensayo, se combinaron combinaciones de deleciones que no condujeron a una pérdida de afinidad.
- Ensayo de unión competitiva
Con el fin de comparar la afinidad de las variantes concebidas con la del aptámero parental, se llevó a cabo un ensayo simultáneo. En primer lugar, se preparó una disolución 1 pM del aptámero de SEQ ID N° 66 usando el amortiguador de unión. La disolución de aptámero se calentó a 90°C durante 5 min, se incubó en hielo durante 5 min y se equilibró a temperatura ambiente durante 10 min. La preparación se inyectó en un chip de sensor recubierto con estreptavidina SA de Biacore T200 instrument (GE Healthcare) a un caudal de 10 pl/min durante 7 min. Después, se inyectaron mezclas que contenían una variante (2 pM) y el fibrinógeno plasmático humano (0,4 pM) sobre el aptámero de inmovilidad a razón de 30 pl/min durante 1 minuto. Se comparó la respuesta obtenida para las diferentes mezclas de fragmento/fibrinógeno.
2. Resultados
Como se muestra en la Figura 9, las variantes de secuencia de SEQ ID N°: 80-93 tienen una inhibición significativa de la señal de unión y, por lo tanto, poseen una afinidad considerable para el fibrinógeno. La mayor afinidad se observó para las variantes de SEQ ID N°: 80-87 que contienen deleciones en las posiciones 01/02, en las posiciones 01/02/19/20/21, en las posiciones 01/02/14/15/16/20/21/22, en las posiciones 01/02/18/19 /20/21, en las posiciones 01/02/18/19/20, en las posiciones 01/02/15/16/20/21, y en las posiciones 01/02/19/20, respectivamente.
Ejemplo 8: estabilidad de una composición de fibrinógeno líquido
Composición de fibrinógeno
La composición de fibrinógeno se obtuvo utilizando el soporte de cromatografía n° 1 que usa el aptámero A5-1.9 (SEQ ID N° 66) y se formula como mínimo con arginina 100 mM y citrato 8,5 mM a pH 7,0.
Estabilidad de la composición de fibrinógeno
La composición se coloca en estabilidad, bajo aire (al aire libre), sin agitación, en cámara fría a 5°C.
Se extrajeron muestras antes de la puesta en estabilidad (T0) y un mes después de la puesta en estabilidad (T1M).
Resultados de la puesta en estabilidad a 5°C
Los resultados de este ensayo de puesta en estabilidad se presentan en la siguiente tabla.
Los resultados después de un mes en estabilidad muestran que:
• Los resultados de SDS PAGE en condiciones reducidas muestran una pequeña variación en los perfiles de las cadenas alfa, beta y gamma que permanecen estables en el tiempo, confirmando la conservación de la integridad del fibrinógeno líquido;
• La relación fibrinógeno coagulable/fibrinógeno antígeno se conserva y es estable en 1, lo que confirma la conservación de la integridad y de la funcionalidad del fibrinógeno líquido.
Los resultados de este ensayo demuestran claramente que la composición de fibrinógeno es estable en forma líquida a 5°C durante 1 meses.
Tabla de secuencia

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Composición que comprende fibrinógeno estable en forma líquida,
caracterizado por que tiene una relación fibrinógeno coagulable/fibrinógeno antígeno mayor que 0,5; preferiblemente mayor que 0,6; mayor que 0,7; mayor que 0,8; mayor que 0,9; incluso más preferiblemente aproximadamente igual a 1 ,0, y por que dicha composición está libre de proteasas y de activadores de la fibrinólisis.
2. Composición según la reivindicación 1 caracterizada por que es estable durante al menos 3 meses a 4°C.
3. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que presenta una cantidad de monómeros de fibrinógeno conservados durante el ensayo de estabilidad mayor que 50%, preferentemente mayor que 60%, preferentemente mayor que 70%, preferentemente mayor que 80%, preferentemente mayor que 90%, preferentemente mayor que 95% del nivel inicial de monómeros de fibrinógeno.
4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que presenta una cantidad de polímeros formados durante el ensayo de estabilidad menor que 10%, preferentemente menor que 20%, preferentemente menor que 30%, preferentemente menor que 40%, preferiblemente menor que 50% del porcentaje inicial de polímeros de fibrinógeno.
5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que:
- el conjunto de las cadenas alfa se conservan en al menos 50%, preferentemente al menos 60%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 80%, preferentemente al menos 90%; más preferiblemente se conservan a aproximadamente 100%, y/o
- el conjunto de las cadenas beta se conservan a al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 90%; más preferiblemente se conservan a aproximadamente 100%, y/o
- el conjunto de las cadenas gamma se conservan a al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 90%; más preferiblemente se conservan a aproximadamente 100%.
6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que la turbidez medida después del ensayo de estabilidad corresponde a menos de 130%, menos de 120%, menos de 110%; ventajosamente corresponde a 100% de la turbidez medida antes del ensayo de estabilidad.
7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que dicha composición está libre de inhibidores de proteasa y/o de antifibrinolíticos.
8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que dicha composición comprende además excipientes farmacéuticamente aceptables.
9. Composición según la reivindicación 8, caracterizada por que dichos excipientes farmacéuticamente aceptables consisten en arginina y citrato.
10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, constituida por fibrinógeno, arginina y citrato.
11. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada por que está libre de isoleucina y/o de glicina.
12. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada por que está libre de albúmina.
13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada por que está libre de iones metálicos, en particular de calcio.
14. Composición que comprende fibrinógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, no habiéndose sometido dicha composición a ninguna etapa previa de liofilización, desecación, deshidratación o secado.
15. Composición que comprende fibrinógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, no habiéndose sometido dicha composición a ninguna etapa previa de reconstitución de un liofilizado.
16. Composición que comprende fibrinógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, susceptible de obtenerse mediante el procedimiento que comprende las siguientes etapas:
- una etapa de purificación por cromatografía por afinidad utilizando ligandos de tipo anticuerpos de llama o aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno,
- al menos una etapa de seguridad biológica, y
- una etapa de formulación en forma líquida.
17. Composición que comprende fibrinógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 susceptible de obtenerse mediante el procedimiento que comprende las siguientes etapas:
- obtener un plasma sanguíneo o una fracción criosobrenadante de plasma sanguíneo,
- purificar el plasma o la fracción de criosobrenadante del plasma sanguíneo mediante separación en gel de cromatografía de afinidad utilizando ligandos de tipo derivados de anticuerpos de llama o aptámeros dirigidos contra el fibrinógeno,
- recuperar la fracción adsorbida purificada que comprende el fibrinógeno,
- eventualmente, añadir excipientes farmacéuticamente aceptables, preferiblemente arginina y/o citrato.
18. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso en terapia.
19. Composición para uso según la reivindicación 18, caracterizada por que dicha composición es adecuada para una administración por vía intravenosa.
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