KR20190026000A - 안정적 액체 피브리노겐 - Google Patents

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KR20190026000A
KR20190026000A KR1020197003577A KR20197003577A KR20190026000A KR 20190026000 A KR20190026000 A KR 20190026000A KR 1020197003577 A KR1020197003577 A KR 1020197003577A KR 20197003577 A KR20197003577 A KR 20197003577A KR 20190026000 A KR20190026000 A KR 20190026000A
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다미앙 바따유
미셸 뗄리에
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라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스
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Abstract

본 발명은 액체 형태의 안정적 피브리노겐을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

안정적 액체 피브리노겐
본 발명은 치료법에서 유용한, 액체 형태의 안정적 피브리노겐을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
피브리노겐은 혈액 응고의 본질적 단백질이며, 그 이유는 응고를 지배하는 반응의 캐스케이드의 마지막에 형성되는 불용성 피브린으로의 그것의 중합이, 출혈의 원인이 되는, 맥관 파괴를 전색하는 혈전의 형성을 초래하기 때문이다.
출혈의 중지를 보장하기 위해서 혈전의 장소에서의 환경이 따라서 본질적이다. 또한, 상처 상에 형성된 피브린은 조직 복구, 그러므로 반흔형성을 보장하는 미소섬유망을 형성한다.
다수의 병태가 현재 피브리노겐을 함유하는 조성물을 사용하여 정맥내 치료된다. 예를 들어 언급될 수 있는 것은 자발 또는 외상후 출혈을 갖는 환자에서의 체질성 저피브리노겐혈증, 이상피브리노겐혈증 또는 무피브리노겐혈증, 후천성 저피브리노겐혈증의 틀에서 여러 비조절성 출혈을 관리함에 있어서의 부가적 치료 등이다.
특정 병태의 치료를 위해, 저장시 안정적이고 바로 사용할 수 있는 피브리노겐을 함유하는 조성물을 사용하는 것이 특히 유리할 수 있다. 이러한 형태의 투여는 실제로 투여에서 더 큰 유연성 및 신속성을 의사에게 제공하여, 출혈 환자의 긴급한 관리를 개선한다. 이 목적을 위해, 저장시 안정적이고 신속한 구성에 적합한 동결-건조된 피브리노겐을 함유하는 조성물이 개발되었다. 그러나, 그러한 동결-건조된 조성물의 재구성은 몇 분을 요구한다. 또한, 냉동건조물의 완전한 용해를 허용하여, 생성물의 농도를 보장하고, 이것이 조성물을 투여하기 곤란하거나 불가능하게 만들 거품, 혼탁함 또는 침적물을 형성하지 않게 하기 위해서 재구성은 조심스럽게 수행되어야 한다.
그러한 동결-건조된 제품을 사용하는 것은 그러므로 출혈을 치료하는데 매 분이 중요한 병원내 또는 입원전 응급 의료 상황에서 최적이 아니다.
지금까지, 피브리노겐을 포함하는 조성물은 재구성될 동결-건조된 형태로 시판되고, 특히 액체 안정성의 면에서 완전한 만족을 제공하지 않는다.
특히, Chabbat 등 (Thrombosis Research, vol. 76, No. 6, 525-533, 1994) 은, NaCl, 아미노카프로산, 글라이신, 아르기닌 및 아프로티닌을 포함하는 피브리노겐 조성물을 기재한다. 그러나 세린 프로테아제의 천연 경쟁적 저해제인 아프로티닌은, 한편으로는 그것의 동물 기원 (소 폐로부터 제조) 과 아나필락시스 쇼크의 무시할 수 없는 위험의 관점에서, 다른 한편으로는 치료될 환자의 응고 결함을 악화시킬 수 있는 그것의 항-응고제 활성과 관련하여, 정맥내 투여 동안 환자에게 불리하다.
출원 WO0021568 은 피브리노겐, 칼슘 이온, 면역자극제, 및 항-피브린용해제를 포함하는 조성물을, 피브린 전색제로서의 그들의 용도에 관해 기재한다. 그러나 그러한 조성물은 환자에게 정맥내 투여될 수 없다.
출원인의 출원 EP1648496 은, 냉동건조물의 안정화 및 가용화를 허용하는, 아르기닌, 트리소듐 시트레이트, 류신/이소류신 및 글라이신 및/또는 라이신을 첨가하여 안정화된 피브리노겐을 포함하는 조성물을 기재한다. 그러나 그러한 조성물은 피브리노겐의 액체 제형에 전적으로 적합하지는 않다.
이러한 맥락에서, 사용하기 용이한 피브리노겐을 포함하는 액체 조성물에 대한 필요가 계속 존재한다.
출원인은 액체 상태에서 안정적인, 피브리노겐, 바람직하게는 인간 피브리노겐을 포함하는 신규한 조성물을 개발했다.
본 발명은 그러므로 액체 형태의 안정적 피브리노겐을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
놀랍게도 유리하게는, 출원인은 제한된 수 및 최소량의 부형제를 사용하여 액체 형태에서 시간의 흐름에 따라 특히 안정적인 피브리노겐을 포함하는 조성물을 수득하는 것이 가능하다는 것을 밝혔다.
도 1A 는 SEQ ID NO: 1 의 앱타머의 예측된 2 차 구조를 보여준다. 기본 서열 (SEQ ID NO: 66) 에 속하는 뉴클레오티드가 회색으로 강조표시되어 있다.
도 2A 는 SEQ ID NO: 58 의 앱타머의 예측된 2 차 구조를 보여준다. 기본 서열 (SEQ ID NO: 67) 에 속하는 뉴클레오티드가 회색으로 강조표시되어 있다. 프레임 안의 루프는 식 (III) 의 공통 기를 포함하는 앱타머의 영역에 해당한다.
도 2B 는 SEQ ID NO: 67-74 의 기본 서열의 정렬을 보여준다. 프레임 안의 서열 부분은 식 (III) 의 공통 기를 포함한다.
도 3-4 는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 인간 피브리노겐에게로 향해지는 특정 앱타머의 결합 특성을 보여준다.
도 3A 는 칩 상에 부동화된 SEQ ID NO: 66 (SEQ ID NO: 1 의 기본 서열) 상의 125 nM 내지 1000 nM 의 농도로 존재하는 인간 혈장 피브리노겐의 SPR (표면 플라스몬 공명) 결합 곡선을 보여준다. 피브리노겐의 농도에 따른 신호 증가에 의해 보여지는 바와 같은 투여량-의존적 방식으로 복합체가 형성되게 하는 방식으로, 인간 혈장 피브리노겐의 각각의 용액을 pH 6.3 에서 주입했다. 0.5 M 의 NaCl 을 포함하는 pH 6.3 의 완충액의 주입은 인간 혈장 피브리노겐의 용출을 유의하게 유도하지 않았다. 그 후 피브리노겐은 pH 7.40 의 용출 완충제에 의해 복합체로부터 방출되었다. 그 후 NaOH 50 mM 의 용액의 주입에 의해 고체 지지체가 재생되었다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: SPR 응답 (단위: 임의 단위).
도 3B 는 칩 상에 부동화된 SEQ ID NO: 66 (SEQ ID NO: 1 의 기본 서열) 상의 125 nM 내지 1000 nM 의 농도로 존재하는 트랜스제닉 피브리노겐의 SPR 결합 곡선을 보여준다. 피브리노겐의 농도에 따른 신호 증가에 의해 보여지는 바와 같은 투여량-의존적 방식으로 복합체가 형성되게 하는 방식으로 트랜스제닉 피브리노겐의 각각의 용액을 pH 6.3 에서 주입했다. NaCl 0.5 M 을 포함하는 pH 6.3 의 완충액의 주입은 트랜스제닉 피브리노겐의 용출을 유의하게 유도하지 않았다. 그 후 피브리노겐은 pH 7.40 의 용출 완충제에 의해 복합체로부터 방출되었다. 그 후 NaOH 50 mM 의 용액의 주입에 의해 고체 지지체가 재생되었다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: SPR 응답 (단위: 임의 단위).
도 3C 는 칩 상에 부동화된 SEQ ID NO: 67 (SEQ ID NO: 58 의 기본 서열) 상의 125 nM 내지 1000 nM 의 농도로 존재하는 인간 혈장 피브리노겐의 SPR 결합 곡선을 보여준다. 피브리노겐의 농도에 따른 신호 증가에 의해 보여지는 바와 같은 투여량-의존적 방식으로 복합체가 형성되게 하는 방식으로 인간 혈장 피브리노겐의 각각의 용액을 pH 6.3 에서 주입했다. NaCl 1M 을 포함하는 pH 6.3 의 완충액의 주입은 인간 혈장 피브리노겐의 용출을 유의하게 유도하지 않았다. 그 후 피브리노겐은 MgCl2 2M 을 함유하는 pH 7.40 의 용출 완충제에 의해 복합체로부터 방출되었다. 그 후 NaOH 50 mM 의 용액의 주입에 의해 고체 지지체가 재생되었다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: SPR 응답 (단위: 임의 단위).
도 3D 는 칩 상에 부동화된 SEQ ID NO: 67 (SEQ ID NO: 58 의 기본 서열) 상의 125 nM 내지 1000 nM 의 농도로 존재하는 트랜스제닉 피브리노겐의 SPR 결합 곡선을 보여준다. 피브리노겐의 농도에 따른 신호 증가에 의해 보여지는 바와 같은 투여량-의존적 방식으로 복합체가 형성되게 하는 방식으로 트랜스제닉 피브리노겐의 각각의 용액을 pH 6.3 에서 주입했다. NaCl 1M 을 함유하는 pH 6.3 의 완충액의 주입은 인간 혈장 피브리노겐의 용출을 상당히 유도하지 않았다. 그 후 피브리노겐은 MgCl2 2M 을 함유하는 pH 7.40 의 용출 완충제에 의해 복합체로부터 방출되었다. 그 후 NaOH 50 mM 의 용액의 주입에 의해 고체 지지체가 재생되었다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: SPR 응답 (단위: 임의 단위).
도 4A 는 pH 에 대한 피브리노겐과 SEQ ID NO: 66 (SEQ ID NO: 1 의 기본 서열) 의 부동화된 앱타머와의 결합의 의존성을 보여주는 SPR 센소그램을 보여준다. 혈장 피브리노겐을 상이한 pH 에서 주입하고, 샘플의 주입 후에, pH 6.30 의 이행 완충제를 각각의 시험의 흐름 셀에 보낸다. pH 6.30 에서 최고 결합 수준이 수득된다. pH 가 증가할 때 결합 수준은 감소한다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: SPR 응답 (단위: 임의 단위).
도 4B 는 SEQ ID NO: 67 (SEQ ID NO: 58 의 기본 서열) 의 앱타머와 인간 혈장 피브리노겐과의 결합 친화도의 pH 에 대한 의존성을 보여주는 SPR 센소그램을 보여준다. pH 6.8 초과에서 결합이 관찰되지 않는다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: SPR 응답 (단위: 임의 단위).
도 4C 는 SPR 기술을 통해 수득된, 칩 상에 부동화된 SEQ ID NO: 60 및 SEQ ID NO: 65 (본 발명의 앱타머의 제 2 하위군에 속함) 의 앱타머에 대한 인간 혈장 피브리노겐의 결합 곡선 (센소그램) 을 보여준다. 신호 증가에 의해 보여지는 바와 같은 복합체가 형성되게 하는 방식으로 정제된 인간 혈장 피브리노겐 (250 nM) 을 pH 6.3 에서 주입했다. NaCl 0.5 M 을 포함하는 pH 6.3 의 완충액의 주입은 인간 혈장 피브리노겐의 용출을 유의하게 유도하지 않았다. 그 후 NaOH 50 mM 의 용액의 주입에 의해 고체 지지체가 재생되었다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: SPR 응답 (단위: 임의 단위).
도 5A 는 SEQ ID NO: 66 의 앱타머가 그래프팅되어 있는 친화도 지지체 상에서의 혈장에서 비롯된 피브리노겐의 정제의 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. Y-축: 280 nm 에서의 흡광도. X-축: (단위: mL).
도 5B 는 비-환원 조건에서 쿠마시 블루로 착색 후에 전기영동 겔의 사진을 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로; 1: 혈장; 2: 정지상에 유지되지 않은 혈장에서 비롯된 분획, 3: 혈장의 크로마토그래피에 의해 수득된 피브리노겐을 함유하는 용출 분획, 4: 정지 지지체의 재생 후에 수득된 분획, 및 5: 분자량 마커. 피브리노겐의 용출 분획의 순도는 분획에 함유된 단백질의 총량에 대해 95% 초과였다. 크로마토그래피에서 사용된 친화도 지지체에는 SEQ ID NO: 66 의 앱타머로 그래프팅되어 있었다.
도 6A 는 SEQ ID NO: 67 의 앱타머가 그래프팅되어 있는 친화도 지지체 상에서의 혈장에서 비롯된 피브리노겐의 정제의 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. Y-축: 280 nm 에서의 흡광도. X-축: (단위: mL).
도 6B 는 비-환원 조건에서 쿠마시 블루로 착색 후에 전기영동 겔의 사진을 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로; 1: 혈장; 2: 정지상에서 유지되지 않은 혈장에서 비롯된 분획, 3: 정지 지지체의 세정 후에 수득된 분획, 4: 혈장의 크로마토그래피에 의해 수득된 피브리노겐을 함유하는 용출 분획, 및 5: 분자량 마커. 피브리노겐의 용출 분획의 순도는 분획에 함유된 단백질의 총량에 대해 적어도 95% 였다. 크로마토그래피에서 사용된 친화도 지지체는 SEQ ID NO: 67 의 앱타머로 그래프팅되어 있었다.
도 7A 는 SEQ ID NO: 66 의 앱타머가 그래프팅되어 있는 친화도 지지체 상에서의 반-정제된 피브리노겐의 정제에 관해 수득된 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. Y-축: 280 nm 에서의 흡광도. X-축: (단위: mL).
도 7B 는 SEQ ID NO: 67 의 앱타머가 그래프팅되어 있는 친화도 지지체 상에서의 반-정제된 피브리노겐의 정제에 관해 수득된 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. Y-축: 280 nm 에서의 흡광도. X-축: (단위: mL).
도 7C 는 친화도 지지체 상에서의 피브리노겐 중간체의 정제에 의해 수득된 용출 분획의, AgNO3 로 착색된, 환원 및 비-환원 조건에서의 SDS-PAGE 를 통한 분획의 분석을 보여준다. 트랙 1: 분자량 표준, 트랙 2: 피브리노겐 중간체 (출발 물질), 트랙 3: 친화도 지지체 No. 1 (SEQ ID NO: 66 의 앱타머) 로 수득된 용출 분획, 트랙 4: 친화도 지지체 No. 1 (SEQ ID NO: 67 의 앱타머) 로 수득된 용출 분획.
도 7D 는 친화도 지지체 상에서의 피브리노겐 중간체의 정제에 의해 수득된 용출 분획의, 쿠마시 브릴리언트 블루로 착색된, 환원 및 비-환원 조건에서의 SDS-PAGE 를 통한 분획의 분석을 보여준다. 트랙 1: 분자량 표준, 트랙 2 및 3: 피브리노겐 중간체 (출발 물질), 트랙 4 및 5: 친화도 지지체 No. 1 (SEQ ID NO: 66 의 앱타머) 로 수득된 용출 분획, 트랙 6 및 7: 친화도 지지체 No. 1 (SEQ ID NO: 67 의 앱타머) 로 수득된 용출 분획. NR: 비-환원. R: 환원.
도 8 은 인간 피브리노겐에게로 향해지는 앱타머를 동정하는데 사용된 SELEX 프로토콜을 보여준다.
도 9 는 부동화된 SEQ ID NO: 66 의 앱타머와 앱타머의 변이체의 존재 하에 주입된 피브리노겐과의 경쟁적 결합을 보여준다. 여기에서, 피브리노겐에 대한 변이체의 친화도가 높을수록 (SEQ ID NO: 66 의 앱타머에 관하여), 변이체/피브리노겐 혼합물의 주입 동안의 응답이 낮아진다. 하기 결실 조합 (i) 1/2, (ii) 19/20/21, (iii) 18/19/20/21, (iv) 15/16/19/20 및 (v) 14/15/16/20/21/22 중 하나를 포함하는 SEQ ID NO: 66 의 변이체는 피브리노겐에 대해 강한 친화도를 갖는다.
도 10A 는 SPR 기술을 통해 수득된, 센서 칩 상에 부동화된 염기 쌍 생명공학 (Base Pair Biotechnologies) (레퍼런스 6F01 올리고#370) 에서 비롯된 앱타머에 대한 인간 트랜스제닉 및 혈장 피브리노겐의 결합 곡선 (센소그램) 을 보여준다. 인간 트랜스제닉 및 혈장 피브리노겐 (1000 nM) 을 염기쌍 생명공학에 의해 권장되는 완충제를 사용하여 pH 7.40 에서 주입했다. 매우 낮은 결합 수준이 인간 트랜스제닉 및 혈장 피브리노겐에 대해 관찰되었다. 그 후 NaOH 50 mM 의 용액의 주입에 의해 고체 지지체가 재생되었다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: 응답 (단위: 임의 단위).
도 10B 는 SPR 기술을 통해 수득된, 센서 칩 상에 부동화된 Li 등 (J Am Chem Soc, 2008, 130 (38):12636-12638) 의 부가적 데이타에 기재된 3 가지 앱타머 (앱타머 85A, 121A 및 121B) 에 대한 인간 혈장 피브리노겐의 결합 곡선 (센소그램) 을 보여준다. 인간 혈장 피브리노겐 (1000 nM) 을 Li 등에 의해 권장되는 바와 같이 pH 7.40 에서 주입했다. 매우 낮은 결합 수준이 인간 트랜스제닉 및 혈장 피브리노겐에 대해 관찰되었다. 그 후 NaOH 50 mM 의 용액의 주입에 의해 고체 지지체가 재생되었다. X-축: 시간 (단위: 초). Y-축: 응답 (단위: 임의 단위).
주석:
완충제 MBS 는 50 mM 의 MOPS / 150 mM 의 NaCl 을 나타낸다.
완충제 NaCl 1M MBS 는 50 mM 의 MOPS / 1 M 의 NaCl 을 나타낸다.
완충제 M5 MBS 는 50 mM 의 MOPS pH 6.30 / 150 mM 의 NaCl / 5 mM 의 MgCl2 을 나타낸다.
완충제 0.5M M5 MBS 는 50 mM 의 MOPS pH 6.30 / 0.5 M of NaCl / 5 mM 의 MgCl2 을 나타낸다.
피브리노겐은 알파, 베타 및 감마로 명명되는 세 개의 폴리펩티드 사슬의 이합체로 구성되는 단백질이다. 그러므로 피브리노겐은 이합체이고, 각각의 단량체는 세 개의 사슬 (알파, 베타, 감마) 을 포함한다. 피브리노겐의 주요 형태는 340 kDa 의 분자량 (MW) 을 갖는다. 피브리노겐은, 분자에게 3 개의 소구체: 하나의 중심 (도메인 E) 및 두 개의 원위 (도메인 D) 를 포함하는 섬유의 형태를 제공하는 다이설파이드 가교에 의해 연결된 두 개의 동일한 서브유닛으로부터 형성된다. 전체 분자는 2,964 개의 아미노산을 함유한다: 알파 사슬 (α) 에 대한 610 개의 아미노산, 베타 사슬 (β) 에 대한 461 개의 아미노산, 및 감마 사슬 (γ) 에 대한 411 개의 아미노산. 피브리노겐은 일차 지혈 뿐만 아니라 응고에 개입한다. 피브리노겐은 체질성 또는 여러 무피브리노겐혈증과 관련된 합병증 및 출혈 증후군 또는 저피브리노겐혈증과 관련되는 출혈의 위험을 치료하기 위해 가장 흔히 처방된다.
용어 "안정적" 은 피브리노겐을 포함하는 조성물의 물리적 및/또는 화학적 안정성에 해당한다. 용어 "물리적 안정성" 은 피브리노겐의 이합체, 올리고머 또는 중합체 형태의 불용성 또는 가용성 응집물의 형성의 감소 또는 부재, 및 침전물의 형성의 감소 또는 부재, 뿐만 아니라 분자의 임의의 구조적 변성의 감소 또는 부재를 언급한다.
용어 "화학적 안정성" 은, 가속되는 조건에서, 액체 상태에서, 저장 동안 피브리노겐을 포함하는 조성물의 임의의 화학적 변형의 감소 또는 부재를 언급한다.
안정성 시험은 온도, 습도, 및 광의 상이한 조건에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 관점에서, 안정성 시험은 적어도 1 주, 바람직하게는 적어도 1 개월, 바람직하게는 적어도 2 개월, 바람직하게는 적어도 3 개월, 바람직하게는 적어도 4 개월, 바람직하게는 적어도 5 개월, 더욱 바람직하게는 적어도 6 개월 지속될 수 있다.
전형적으로, 이후 정의된 바와 같은, 안정성 파라미터의 측정은
- 피브리노겐을 포함하는 조성물의 안정성 시험 전에 (이는 그 때 초기 비율로 언급됨); 및
- 상기 안정성 시험 동안 또는 후에
수행되며,
상기 안정성 시험은 적어도 1 주, 바람직하게는 적어도 1 개월, 바람직하게는 적어도 2 개월, 바람직하게는 적어도 3 개월, 바람직하게는 적어도 4 개월, 바람직하게는 적어도 5 개월, 더욱 바람직하게는 적어도 6 개월 지속될 수 있다고 이해된다.
피브리노겐을 포함하는 조성물의 안정성은 특히 유럽 약전 검사기 (유백광, 입자의 형성) 를 사용하여 시각적 검사를 통해, 약 1 nm 내지 1 μm 크기의 용액 중 입자를 측정하는 것을 가능하게 하는, 흡광도 또는 400 nm 에서의 광학 밀도를 측정하는 분광광도계를 사용하여 혼탁도를 측정함으로써, 평가될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 피브리노겐을 포함하는 조성물의 안정성은 고압 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC) 또는 동적 광 산란 (DLS) 방법을 사용하여 안정성 시험 동안 유지된 단량체의 비율의 측정에 의해 정의된다. 이들 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
유리하게는 안정성 시험 동안 유지된 피브리노겐 단량체의 양이 피브리노겐 단량체의 초기 비율의 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과인 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다.
더욱 바람직하게는, 안정성 시험 동안 유지된 피브리노겐 단량체의 양은 피브리노겐 단량체의 초기 비율의 70% 초과이다.
용어 "피브리노겐 단량체의 초기 비율" 은 안정성 시험 전에 관찰된 단량체의 비율을 의미한다. 전형적으로, 피브리노겐 단량체의 양은 안정성 시험 전에 및 상기 안정성 시험 동안 또는 후에 측정된다.
대안적으로, 안정성 시험 동안 피브리노겐 단량체의 양의 변화가 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만인 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다.
또다른 실시양태에서, 피브리노겐을 포함하는 조성물의 안정성은 HPSEC 를 사용하는 안정성 시험 동안 형성된 피브리노겐 중합체의 비율의 측정에 의해 정의된다. 피브리노겐 중합체는 피브리노겐의 적어도 2 개의 알파 폴리펩티드 사슬, 2 개의 베타 폴리펩티드 사슬 및 2 개의 감마 폴리펩티드 사슬을 포함하는 중합체이다. 이러한 용어는 또한 피브리노겐 삼합체를 포함한다.
유리하게는 안정성 시험 동안 형성된 피브리노겐 중합체의 양이 피브리노겐 중합체의 초기 비율에 비해 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만인 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다. 전형적으로, 피브리노겐 중합체의 초기 비율은 안정성 시험 전의 피브리노겐의 중합체 형태 (삼합체 이상) 의 전부에 해당한다.
더욱 바람직하게는, 안정성 시험 동안 형성된 피브리노겐 중합체의 양은 30% 미만이다. 전형적으로, 피브리노겐 중합체의 양은 안정성 시험 전에 및 상기 안정성 시험 동안 또는 후에 측정된다.
대안적으로, 안정성 시험 동안 피브리노겐 중합체의 양의 변화가 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만인 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다.
또다른 실시양태에서, 피브리노겐을 포함하는 조성물의 안정성은 피브리노겐의 항원 측정값 (또한 특이적 활성으로 호칭됨) 에 대한 피브리노겐의 응고성 활성을 측정함으로써 평가된다. 특히 유리하게는, 안정적 피브리노겐 조성물은 0.5 초과; 바람직하게는 0.6 초과; 0.7 초과; 0.8 초과; 0.9 초과; 더욱더 바람직하게는 약 1.0 의 응고성 피브리노겐 / 피브리노겐 항원 비를 갖는다. 더욱더 유리하게는, 시험의 마지막에 그것의 응고성 활성 대 그것의 항원 활성의 비가 이러한 비의 초기 값 (안정성 시험 전의 그것의 값) 의 적어도 60% 초과, 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 인 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다.
용어 "응고성 피브리노겐" 은 폰 클라우스 (von Clauss) 의 방법에 따라 확인되는, 응고 기술을 통한 기능적 피브리노겐의 측정을 의미한다. 응고성 활성은 g/L (피브리노겐 용액의 L) 로 표현된다. 이러한 기술은 출판물 Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, 237-246 을 참조할 수 있는 통상의 기술자에게 알려져 있다.
용어 "항원 피브리노겐" 은, 그것이 활성이든 아니든, 혼탁측정 방법에 의해 측정되는 피브리노겐의 양을 의미한다. 항원 피브리노겐의 양은 g/L 로 표현된다.
피브리노겐을 포함하는 조성물의 안정성은 또한, 바람직하게는 본 발명의 관점에서 정의된 바와 같은 안정성 시험 전에 및 후에, 피브리노겐의 알파, 베타 및 감마 사슬의 유지의 SDS PAGE 에서의 측정에 의해 평가된다. 따라서, 유리하게는 하기와 같은 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다:
- 알파 사슬의 전부가 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 에서 유지되며; 더욱 바람직하게는 약 100% 에서 유지되는 경우, 및/또는
- 베타 사슬의 전부가 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 에서 유지되며; 더욱 바람직하게는 약 100% 에서 유지되는 경우, 및/또는
- 감마 사슬의 전부가 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 에서 유지되며; 더욱 바람직하게는 약 100% 에서 유지되는 경우.
특히, 알파 및 감마 사슬의 프로파일이 안정성 시험의 마지막에 유지되는 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다. 용어 알파 및 감마 사슬의 프로파일의 유지는 알파 및 감마 사슬의 상이한 형태의 분포의 유지를 의미한다.
따라서 알파 사슬의 형태 Aα1, Aα2 및 Aα3 의 분포가 안정성 시험 전에 측정된 초기 측정값과 안정성 시험 기간의 마지막에 측정된 측정값 사이에서 유지되는 경우에 알파 사슬의 프로파일은 안정성 시험 동안 유지된 것으로 여겨진다. 안정성 시험 후의 형태 Aα1 의 정도 (알파 사슬의 형태의 전부의 백분율로서 표현됨) 가 안정성 시험 전의 형태 Aα1 의 정도 (알파 사슬의 형태의 전부의 백분율로서 표현됨) 의 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 에 해당하는 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨질 수 있다.
따라서 감마 사슬의 형태 γ' 및 γ 의 분포가 안정성 시험 전에 측정된 초기 측정값과 안정성 시험 기간의 마지막에 측정된 측정값 사이에서 유지되는 경우에 감마 사슬의 프로파일은 안정성 시험 동안 유지된 것으로 여겨진다.
피브리노겐을 포함하는 조성물의 안정성은 또한 UV 분광광도법을 사용하는 400 nm 에서의 혼탁도의 측정에 의해 정의된다. 실제로, 혼탁도는 용액을 흐리게 만드는 물질의 양을 반영한다. 유리하게는 본 발명에서 정의된 바와 같은 안정성 시험 후에 측정된 혼탁도가 안정성 시험 전에 측정된 혼탁도와 비슷한 경우에 피브리노겐 조성물은 안정적인 것으로 여겨진다.
유리하게는, 안정성 시험 후에 측정된 혼탁도는 안정성 시험 전에 측정된 혼탁도의 130% 미만, 120% 미만, 110% 미만에 해당하며; 유리하게는 100% 에 해당한다.
본 발명의 유리한 실시양태에서, 피브리노겐을 포함하는 조성물은 4℃ 에서 적어도 1 개월, 적어도 2 개월, 적어도 3 개월, 적어도 4 개월, 적어도 5 개월, 적어도 6 개월 동안 안정적이다.
용어 "본 발명에 따른 조성물" 은 피브리노겐을 포함하는 조성물로서, 액체 형태에서 안정적인 조성물을 지칭하는 것이 의도된다. 바람직하게는, 상기 조성물은 피브리노겐, 아르기닌 및 시트레이트로 구성된다.
용어 "액체 형태의 피브리노겐 조성물" 은, 바람직하게는 동결-건조, 데시케이션, 탈수 또는 건조의 단계에 적용된 적이 없고, 그러므로 사용 전에 재구성될 필요가 없는, 용액 중 피브리노겐을 포함하는 조성물을 의미한다.
본 발명의 목적은 그러므로 동결-건조 후에 재구성되지 않는 액체 형태의 안정적 피브리노겐을 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 또다른 목적은 액체 형태에서 안정적인, 피브리노겐 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다.
용어 "약학적으로 허용가능한 부형제" 는, 특히 염, 아미노산, 당, 계면활성제 또는 임의의 기타 부형제로부터 선택되는 물질과 함께, 인간 단백질의 제형화에 유리하게 사용될 수 있는 임의의 부형제에 해당한다.
본 발명의 약학적으로 허용가능한 부형제는 특히 이소류신, 글라이신, 및 NaCl 을 배제한다.
유리하게는, 본 발명에 따른 약학적으로 허용가능한 부형제는 아르기닌 및/또는 시트레이트를 포함한다. 출원인은 피브리노겐, 아르기닌 및 시트레이트를 포함하는 액체 형태에서 시간의 흐름에 따라 특히 안정적인 조성물을 수득하는 것이 가능하다는 것을 밝혔다. 그러한 조성물은 최적이며, 그 이유는 부형제의 수 및 그러므로 제형의 성분으로 인한 부작용의 위험을 제한하는 한편 즉시 사용할 수 있는 조성물의 액체 형태에서의 저장을 여전히 허용하기 때문이다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 액체 형태에서 안정적인, 피브리노겐, 아르기닌, 및 시트레이트를 포함하는, 바람직하게는 그것으로 구성되는, 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 피브리노겐은 인간 피브리노겐이다.
본 발명에 따르면, 피브리노겐을 함유하는 원료의 여러 공급원이 사용될 수 있다. 피브리노겐 조성물은 따라서 혈액 혈장 (또한 혈장 분획으로 호칭됨), 세포 배양물의 상청액 또는 트랜스제닉 동물의 젖에서 비롯될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 동결-건조, 데시케이션, 탈수 또는 건조의 임의의 사전 단계에 적용된 적이 없다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 냉동건조물을 재구성하는 임의의 사전 단계에 적용된 적이 없다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 혈장 분획, 더욱 바람직하게는 예비정제된 혈액 혈장으로부터 수득된 혈장 분획이다.
용어 "예비정제된 혈액 혈장으로부터 수득된 혈장 분획" 은 하나 또는 여러 개의 정제 단계에 적용된 인간 혈액 혈장의 임의의 부분 또는 하위부분을 의미한다. 상기 혈장 분획은 따라서 혈장 저온상청액 (cryosupernatant) 침전물, 혈장 저온침전물 (cryoprecipitate) (재현탁됨), 에탄올 분획화 (Cohn 방법 또는 Kistler & Nitschmann 방법에 따름) 에 의해 수득된 분획 I, 크로마토그래피 용출액 및 크로마토그래피 칼럼의 미흡착 분획 (멀티-칼럼 크로마토그래피를 포함), 및 여과물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 크로마토그래피 용출액 또는 미흡착 크로마토그래피 칼럼 분획 (멀티-칼럼 크로마토그래피를 포함) 에서 비롯된다.
본 발명의 더욱더 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 크로마토그래피 용출액 또는 미흡착 크로마토그래피 칼럼 분획 (멀티-칼럼 크로마토그래피는 제외) 에서 비롯된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 저온상청액 또는 재현탁된 저온침전물로부터 수득된 혈장 분획에서 비롯된다.
본 발명에 따르면, "혈장 저온상청액 침전물", 또는 "저온상청액" 은 동결된 혈장 (저온침전) 의 해동 후에 수득된 액체 상에 해당한다. 특히, 저온상청액은 -10℃ 내지 -40℃ 의 온도에서 혈액 혈장을 해동하고, 그 후 0℃ 내지 +6℃, 바람직하게는 0℃ 내지 +1℃ 의 온도에서 서서히 해동하고, 그에 뒤이어 저온침전물 및 저온상청액을 분리하기 위해 해동된 혈장을 원심분리하여 수득될 수 있다. 저온침전물은 피브리노겐, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자 및 인자 VIII 농축물이며, 한편 저온상청액은 보체 인자, 비타민 K-의존적 인자 예컨대 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X, 피브리노겐, 면역글로불린 및 알부민을 함유한다.
본 발명의 유리한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 출원 EP1739093 또는 출원 WO2015/136217 에서 출원인에 의해 기재된 방법에 따라 수득될 수 있다.
본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은, 예를 들어 WO00/17234 또는 WO00/17239 에 기재된 방법에 따라 수득된, 트랜스제닉 동물의 젖에서 비롯된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 사전에 단백질 예컨대 면역글로불린 또는 알부민이 고갈되지 않은 혈장에서 비롯된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다:
- 친화도 크로마토그래피에 의한 정제의 단계;
- 생물 보안의 적어도 하나의 단계; 및
- 액체 형태의 제형화의 단계.
본 발명의 특정 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피에 의한 정제의 단계는 항체, 항체의 단편, 항체의 유도체 또는 화학적 리간드 예컨대 펩티드, 펩티드 모방체, 펩토이드, 나노피틴스 (nanofitins) 또는 올리고뉴클레오티드 리간드 예컨대 앱타머로부터 선택되는 친화도 리간드를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 수행된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피에 의한 정제의 단계는 앱타머인 친화도 리간드를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 수행된다.
출원인은 그 자신의 연구를 수행했고, 피브리노겐에게로 향해지는 앱타머의 신규한 패밀리를 동정했다. 이러한 앱타머의 신규한 패밀리는 내부적으로 출원인에 의해 디자인된 SELEX 방법에 의해 동정되었다. 이들 앱타머는, 단백질의 글리코실화 상태에 독립적으로, 인간 트랜스제닉 및 혈장 피브리노겐 둘 모두와 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 출원인에 의해 동정된 앱타머는 결합의 면에서 독특한 특성을 갖는다. 특히, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 pH-의존적 방식으로 결합한다. 그것은 pH 7.0 초과, 예컨대 7.4 에 비해 약산성 pH 예컨대 pH 약 6.3 에서 피브리노겐에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다는 점에 주목한다. 이들 특성은 친화도 크로마토그래피에서 특히 적합하며, 그 이유는 정제될 단백질, 즉 피브리노겐, 및 앱타머 사이의 복합체의 형성, 및 복합체로부터의 단백질의 나중의 방출이 용출 완충제의 pH 를 조정함으로써 제어될 수 있기 때문이다. 특히, 복합체로부터의 단백질의 방출은, 단백질의 특성을 변경할 수 없는, 적당한 용출 조건에서 수행될 수 있다.
■ 본 발명에 따라 사용되는 앱타머
앱타머는, 예를 들어 크로마토그래피에 의한, 피브리노겐의 정제에서 친화도 리간드로서 본 발명에 따라 사용된다. 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 그러므로 피브리노겐에게로 향해지며, 즉 피브리노겐과 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 pH-의존적 방식으로 결합한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 pH 7.0 초과에서 피브리노겐에 결합하지 않고, 산 pH 에서, 예를 들어 6.0 내지 6.6 로부터 선택되는 pH 값, 예컨대 pH 6.3 ± 0.1 에서 피브리노겐에 결합한다.
본원에서 의미되는, "앱타머" (또한 핵 앱타머로 호칭됨) 는 전형적으로 20 내지 150 개 뉴클레오티드 길이를 갖고 큰 친화도로 목표 분자에 결합할 수 있는 합성 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 앱타머는 그들의 목표 분자와의 그들의 상호작용의 수준에서 핵심 역할을 수행할 수 있는 하나 이상의 3 차원 입체구조를 특징으로 한다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐과 복합체를 형성할 수 있다. 앱타머와 그것의 목표 분자 사이의 상호작용은 정전기 상호작용, 수소 결합, 및 방향족 스택의 형태의 상보성을 망라할 수 있다.
"그것의 목표 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머" 는 앱타머가 목표 분자에 대해 큰 친화도를 갖는다는 것을 의미한다. 그것의 목표 분자에 대한 앱타머의 해리 상수 (Kd) 는 전형적으로 10-6 내지 10-12 M 이다. 용어 "특이적으로 결합한다" 는 본원에서 앱타머가 그것의 목표 분자를 인지하고 그것과 특이적으로 상호작용하는 능력을 갖는 한편, 샘플에 존재할 수 있는 다른 분자와의 상대적으로 낮은 검출가능한 반응성을 여전히 갖는다는 것을 나타내는데 사용된다. 바람직하게는, 목표 분자와 구조적으로 가까운 분자를 포함하는, 다른 분자에 대한 그것의 친화도보다, 목표 분자에 대한 그것의 친화도가 유의하게 더 높은 경우에 앱타머는 그것의 목표 분자에 특이적으로 결합한다.
예를 들어, 앱타머는 인간 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한편, 상기 인간 단백질의 등가물에 대해 더 낮은 친화도를 여전히 갖는다.
본원에서 의미되는, "그것의 목표 분자에 대해서보다 소정의 분자에 대해서 더 낮은 친화도를 갖는 앱타머" 또는 "소정의 분자에 비해 그것의 목표 분자에 특이적인 앱타머" 는 상기 소정의 분자에 대한 앱타머의 Kd 가 목표 분자에 대한 상기 앱타머의 Kd 보다 적어도 5 배, 더욱 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 배 더 높다는 것을 의미한다.
앱타머는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 일 수 있다. 앱타머는 하나 또는 여러 개의 화학적으로 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 화학적으로 개질된 뉴클레오티드는, 그에 제한되는 것은 아니나, 2'-아미노 또는 2'-플루오로-뉴클레오티드, 2'-리보퓨린, 포스포라미다이트, 잠긴 (locked) 핵산 (LNA), 보론산, 5-아이오도- 또는 5-브로모-우라실로 개질된 뉴클레오티드, 및 5-개질된 데옥시우리딘 예컨대 벤질-dU, 이소부틸-dU, 및 나프틸-dU 를 망라한다. 5-개질된 데옥시우리딘에 관해, Rohloff et al., Molecular Therapy-Nucleic acids, 2014, 3, e201 (참고, 도 1 페이지 4) (이 문헌의 기재는 본원에 참조로 포함됨) 을 참조할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머에는 보론산에 의해 개질된 임의의 뉴클레오티드, 특히 WO2010/019847 에 기재된 것들이 없다. 특정 기타 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머에는 임의의 5-개질된 데옥시우리딘이 없다. 특정 실시양태에서, 앱타머는 오직 그것의 3' 말단 및/또는 그것의 5' 말단 의 수준에서 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (즉, 앱타머의 제 1 뉴클레오티드 및/또는 마지막 뉴클레오티드만이 화학적으로-개질된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들임). 바람직하게는, 상기 개질된 뉴클레오티드는 고체 지지체 상의 앱타머의 그래프팅, 또는 임의의 관심의 기 (예를 들어, 검출 또는 부동화에 유용한 것) 에 대한 상기 앱타머의 커플링을 허용할 수 있다.
앱타머의 서열이 식별되었을 때, 앱타머는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 통상적 방법에 의해, 즉, 예를 들어 고체 상에서의, 화학적 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 의미되는, "피브리노겐으로 향해지는 앱타머", "피브리노겐에게로 향해지는 앱타머" 또는 "항-피브리노겐 앱타머" 는 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 합성 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에서 의미되는, 용어 "피브리노겐" 은, 글리코실화의 상태에 독립적으로, 야생형 피브리노겐 및 그의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 임의의 단백질을 지칭한다. 용어 "피브리노겐" 은 피브리노겐의 임의의 동형 및 유전자 변이체, 뿐만 아니라 피브리노겐의 임의의 글리코실화 형태, 임의의 비-글리코실화 형태 또는 임의의 번역후 형태를 망라한다.
본원에서 의미되는, 야생형 피브리노겐의 변이체는 상기 야생형 피브리노겐과 적어도 80% 의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 또는 95% 의 서열 동일성을 갖고, 상기 야생형 피브리노겐과 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 피브리노겐의 응고성 활성은 van Clauss 응고 방법에 의해 측정될 수 있다. 피브리노겐의 변이체는 상응하는 야생형 피브리노겐에 비해 증가된 또는 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 피브리노겐은 야생형 인간 피브리노겐 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. 상기 피브리노겐은 인간 혈장 피브리노겐, 인간 재조합 또는 트랜스제닉 피브리노겐일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는, 그것의 글리코실화에 독립적으로, 인간 피브리노겐에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 앱타머는 인간 혈장 피브리노겐 및 재조합 인간 피브리노겐, 예를 들어 다세포 트랜스제닉 유기체로부터 수득된 재조합 피브리노겐 또는 재조합 숙주 세포로부터 수득된 재조합 피브리노겐에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 약산성 pH 에서, 예를 들어 pH 6.3 에서 피브리노겐에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 최대 10-6 M 의 인간 혈장 피브리노겐에 대한 또는 인간 트랜스제닉 피브리노겐에 대한 해리 상수 (Kd) 를 갖는다. 전형적으로, 인간 피브리노겐에 대한 본 발명에 따라 사용되는 앱타머의 Kd 는 pH 약 6.3 에서 1·10-12 M 내지 1·10-6 M 일 수 있다. Kd 는 더욱 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 시험에 의해 확인되며, 상기 시험에서 앱타머는 바이오센서 칩 상에 부동화되고, 관심의 pH 에서, 및 다양한 농도에서, kon 및 koff 및 그러므로 Kd 의 측정을 초래하는 흐름 조건에서 피브리노겐은 부동화된 앱타머에게 보내진다. 실시예 3 에 제공된 프로토콜을 참조할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 비-인간 피브리노겐에 비해 인간 피브리노겐에 특이적이다.
특정 기타 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 혈장에 존재하는 다른 단백질, 예컨대 응고 인자에 비해 인간 피브리노겐에 특이적이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 인자 FII, FXI 또는 XIII 에 비해 피브리노겐에 특이적으로 결합한다. 부가적 또는 대안적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브로넥틴에 비해 피브리노겐에 특이적으로 결합한다. 부가적 또는 대안적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 플라스미노겐에 비해 피브리노겐에 특이적으로 결합한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 pH 7.0 이상에서 피브리노겐에 결합하지 않는다. pH 7.0 이상에서 피브리노겐에 결합하는 것에 대한 본 발명에 따라 사용되는 앱타머의 무능력은 전형적으로 실시예 3 에 기재된 바와 같이 SPR 에 의해 확인될 수 있다. 실시예 3 의 프로토콜에서, 결합의 부재는 관심의 pH 에서 완충되는 완충제 내에 피브리노겐의 주입 후에 SPR 신호가 기준선의 수준에서 유지된다는 사실에 의해 나타난다.
본 발명의 특정 양상에서, 앱타머는 그들의 입체구조에서 특이적 기의 존재를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 도 1A 또는 도 2A 에 제시된 것과 같은 기를 포함할 수 있다. 임의의 이론에 구속되는 것을 의도하지 않으면서, 출원인은 상기 2 차원 입체구조의 존재가 피브리노겐과의 특이적 상호작용에서 관여될 수 있다고 생각한다.
상기 특이적 입체구조 기의 존재는 앱타머 서열 내의 특이적 폴리뉴클레오티드 ("기본 폴리뉴클레오티드" 또는 "기본 서열" 로 호칭됨) 의 존재에서 비롯될 수 있다. 본원에서 의미되는, 소정의 앱타머의 "기본 서열" 은 전형적으로 피브리노겐에 결합할 수 있는 상기 앱타머에서 비롯되는 최소 서열을 포함하거나, 또는 그것을 지칭한다.
그 자신의 연구에 의해 동정된 앱타머를 연구하여, 출원인은 여러 관심의 기본 서열, 특히 SEQ ID NO: 66 및 SEQ ID NO: 67 의 폴리뉴클레오티드를 동정했다.
출원인은 게다가 SEQ ID NO: 58-65 에서 공통 서열의 기를 확인했다. 도 2B 에 제시된 바와 같이, SEQ ID NO: 58-65 의 앱타머는 그들의 서열에 두 개의 공통 기, 즉 GGTGTAT (SEQ ID NO: 78) 의 상류에 있는 GTTGGTAGGG (SEQ ID NO: 77) 를 포함한다. 이들 공통 기는 SEQ ID NO: 58 의 앱타머에 관한 도 2A 에서 보여지는 루프를 형성하는 앱타머의 영역에 위치한다. 임의의 이론에 구속되는 것을 의도하지 않으면서, 출원인은 이러한 입체구조 기가 피브리노겐에 대한 상기 앱타머의 결합에서 역할을 수행할 수 있다고 생각한다.
특정 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합할 수 있고, 하기 특성 중 하나를 갖는다:
- 상기 앱타머는 SEQ ID NO: 66 의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는
- 상기 앱타머는 뉴클레오티드 기 GTTGGTAGGG (SEQ ID NO: 77) 및 GGTGTAT (SEQ ID NO: 78) 를 포함하며, SEQ ID NO: 77 의 기는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 78 의 상류에 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합할 수 있고, 하기 특성 중 하나를 갖는다:
- 상기 앱타머는 SEQ ID NO: 66 의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는
- 상기 앱타머는 하기 식 (III) 의 뉴클레오티드 기를 포함한다:
5'-[SEQ ID NO: 79]-[X1]-[SEQ ID NO: 77]-[X2]-[SEQ ID NO: 78]-3' (III)
식에서:
- [X2] 및 [X1] 는 독립적으로 뉴클레오티드 또는 2 내지 5 개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 2 또는 3 개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 지칭하고,
- [SEQ ID NO: 77] 는 SEQ ID NO: 77 (즉 GTTGGTAGGG) 의 올리고뉴클레오티드이고,
- [SEQ ID NO: 78] 는 SEQ ID NO: 78 (즉 GGTGTAT) 의 올리고뉴클레오티드이고,
- [SEQ ID NO: 79] 는 SEQ ID NO: 79 (즉 TGT) 의 올리고뉴클레오티드임.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 하기와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
- SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, 및 SEQ ID NO: 95 를 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드의 적어도 하나의 서열과 적어도 70% 의 서열 동일성을 갖고,
- 위에서 정의된 바와 같은 식 (III) 의 뉴클레오티드 기를 포함함.
예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는, SEQ ID NO: 67 과 적어도 70% 의 서열 동일성을 갖고 식 (III) 의 뉴클레오티드 기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 66 또는 SEQ ID NO: 67 과 적어도 70% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 의미되는, 적어도 70% 의 서열 동일성은 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 의 서열 동일성을 망라한다. 뉴클레오티드 (A) 및 (B) 의 두 서열 사이의 "백분율 동일성" 은 비교 윈도우를 통해, 최적 방식으로 정렬된 두 서열을 비교하여 확인될 수 있다. 상기 서열 정렬은 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, Needleman-Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 정렬이 수득되었을 때, 백분율 동일성은 정렬된 동등한 아미노산 잔기의 총수를 서열 (A) 및 (B) 사이의 가장 긴 서열에 함유된 잔기의 총수로 나누어서 수득될 수 있다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 확인된다. 두 핵산 서열을 비교하기 위해, 예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleodite.html 에서 입수가능한 EMBL-EBI 를 제공하기 위한 쌍별 서열 정렬의 "Emboss Needle" 툴을 하기 디폴트 설정을 사용하여 사용할 수 있다: (i) 매트릭스 (Matrix): 전체 DNA, (ii) 스페이스 오프닝 (space opening): 10, (iii) 스페이스 레벨 ( space level): 0.5, (iv) 아웃풋 포맷 (output format): 이븐 (even), (v) 터미널 스페이스 페널티 (terminal space penalty): 거짓, (vi) 스페이스 오프닝 터미널 (space opening terminal): 10, (vii) 스페이스 레벨 터미널 (space level terminal): 0.5.
본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 전형적으로 20 내지 150 개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 30 내지 100 개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 25 내지 90 개 뉴클레오티드 길이, 30 내지 80 개 뉴클레오티드 길이 또는 30 내지 60 개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 또는 90 개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 1 내지 15 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 개 뉴클레오티드 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 66 및 SEQ ID NO: 67 의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 의미되는, "뉴클레오티드 변형" 은 레퍼런스 서열에 비해 뉴클레오티드의 결실, 뉴클레오티드의 삽입 또는 또다른 뉴클레오티드로의 뉴클레오티드의 치환을 지칭한다.
본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 또한 PCR 에 의한 그것의 증폭에 유용한 프라이머를 3' 및 5' 말단에 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 프라이머 서열은 기본 서열 내로 통합되거나 또는 부분적으로 통합될 수 있고, 그러므로 피브리노겐과의 결합 상호작용에 참여할 수 있다. 특정 기타 실시양태에서, 이들 프라이머 서열은 기본 서열 밖에 있고, 앱타머와 피브리노겐의 상호작용에서 어떠한 역할도 수행할 수 없다. 특정 기타 실시양태에서, 앱타머에는 프라이머 서열이 없다.
특정 대안적 또는 부가적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 기본 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 결합된 2 내지 40 개 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합하고, 하기 식 (I) 에 대응한다
5'-[NUC1]m-[중심]-[NUC2]n-3' (I)
식에서
n 및 m 은 0 및 1 로부터 독립적으로 선택되는 정수이고,
- [NUC1] 는 2 내지 40 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 개 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고,
- [NUC2] 는 2 내지 40 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 개 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고,
- [중심] 은 SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 94 및 SEQ ID NO: 95 를 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 70% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드임.
n=m=0 일 때, [NUC1] 및 [NUC2] 는 부재하고, 앱타머는 서열 [중심] 로 구성된다. n=0 및 m=1 일 때, [NUC2] 는 부재하고, [NUC1] 는 존재하고, 앱타머는 그러므로 하기 식 (Ia) 에 대응한다
5'-[NUC1]-[중심]-3',
n=1 및 m=0 일 때, [NUC1] 는 부재하고, [NUC2] 는 존재하고, 앱타머는 그러므로 하기 식 (Ib) 에 대응한다
5'-[중심]-[NUC2]-3'.
특정 실시양태에서, [NUC1] 는 SEQ ID NO: 75 의 폴리뉴클레오티드 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 75 와 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 그것으로 구성된다. 특정 기타 부가적 실시양태에서, [NUC2] 는 SEQ ID NO: 76 의 폴리뉴클레오티드 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 76 과 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 그것으로 구성된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 피브리노겐에게로 향해지고 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 67 을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 70%, 예컨대 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 의 서열 동일성을 갖는 앱타머에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 및 SEQ ID NO: 67 로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 의 서열 동일성을 가질 수 있다.
출원인은 위에서 정의된 앱타머의 서열 및 가능한 입체구조의 심도 있는 분석을 수행했다. 이러한 분석은 앱타머의 두 개의 하위군의 동정을 초래했으며, 각각의 하위군은 특정 기능적 및 구조적 특성을 특징으로 한다.
- 본 발명에 따라 사용되는 앱타머의 제 1 하위군
앱타머의 제 1 하위군은 SEQ ID NO: 66 의 기본 서열과 큰 서열 동일성을 갖는 기본 서열을 포함하는 피브리노겐에게로 향해지는 앱타머를 망라한다. 앱타머의 이러한 제 1 하위군은 SEQ ID NO: 1-57 의 앱타머 및 SEQ ID NO: 66 의 기본 서열로 구성된다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 66 과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 앱타머는 20 내지 110 개 뉴클레오티드 길이, 특히 25 내지 100 개 뉴클레오티드 길이, 예컨대 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특히, 앱타머는 35 내지 65 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 앱타머는 SEQ ID NO: 66 의 폴리뉴클레오티드, 또는 1 내지 16 개 뉴클레오티드 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 66 과 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 위에서 언급된 바와 같이, 뉴클레오티드 변형 또는 변형들은 임의의 유형의 것일 수 있다. 뉴클레오티드 변형은 뉴클레오티드의 결실, 뉴클레오티드의 삽입 또는 또다른 뉴클레오티드로의 뉴클레오티드의 치환/대체일 수 있다.
SEQ ID NO: 66 의 기본 서열과 SEQ ID NO: 1-57 의 앱타머의 정렬은 제 1 하위군에 속하는 앱타머 사이에서 특정 뉴클레오티드가 유지되지 않는다는 것을 보여줬다. 상기 위치는 위치 19, 20, 21, 24, 27, 32, 33, 35, 42, 45, 46, 47, 50, 54, 55 및 57 (번호매김은 SEQ ID NO: 66 에서의 뉴클레오티드의 번호매김을 나타냄) 을 망라한다.
다른 변형, 특히 하나 또는 여러 개의 결실이, SEQ ID NO: 66 의 위치 1 및 2 에 뿐만 아니라 도 1A 에서 보여지는 바와 같은 SEQ ID NO: 66 의 기본 서열의 제 3 막대 (rod) 에 도입될 수 있다. 특히, 출원인은 SEQ ID NO: 66 의 부모 기본 서열에 비해 피브리노겐에 대한 친화도의 임의의 유의한 상실 없이 SEQ ID NO: 66 의 앱타머의 제 3 막대 내에, 특히 위치 14-22 에, 1 내지 6 개의 결실을 도입했다.
따라서, SEQ ID NO: 66 에 대한 뉴클레오티드 변형 또는 변형들은 이들 뉴클레오티드 위치 중 하나 또는 여러 위치에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 1, 2, 11-25, 32-35, 42, 45-47, 50 및 54-58 로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에서, 더욱 바람직하게는 1, 2, 14-22, 24, 27, 32, 33, 35, 42, 45, 46, 47, 50, 54, 55 및 57 (번호매김은 SEQ ID NO: 66 에서의 뉴클레오티드 번호매김을 나타냄) 로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에서, 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 14, 특히 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 66 과 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 변형 또는 변형들은 하나 이상의 뉴클레오티드 대체 또는 결실이다.
특정 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 변형 또는 변형들은 20, 35, 42 및 55 로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에 존재한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 더욱 바람직하게는 20, 35, 42 및 55 (번호매김은 SEQ ID NO: 66 에서의 뉴클레오티드 번호매김을 나타냄) 로부터 선택되는 위치에 존재하는 최대 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 66 과 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 SEQ ID NO: 66 의 폴리뉴클레오티드, 또는 1, 2 또는 3 개 뉴클레오티드 변형 또는 변형들의 비율에서, 더욱 바람직하게는 1, 2 또는 3 개 뉴클레오티드 변형 또는 변형들의 비율에서 SEQ ID NO: 66 과 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 뉴클레오티드 변형 또는 변형들은 19, 20, 21, 24, 27, 32, 33, 35, 42, 45, 46, 47, 50, 54, 55 및 57 (번호매김은 SEQ ID NO: 66 에서의 뉴클레오티드 번호매김을 나타냄) 를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 있다.
특정 기타 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 SEQ ID NO: 66 의 폴리뉴클레오티드, 또는 1-14 개 뉴클레오티드 결실 또는 결실들의 비율에서, 더욱 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개 뉴클레오티드 결실 또는 결실들의 비율에서 SEQ ID NO: 66 과 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 뉴클레오티드 결실 또는 결실들은 1, 2, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22 (번호매김은 SEQ ID NO: 66 에서의 뉴클레오티드 번호매김을 나타냄) 를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 있다.
특정 부가적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 SEQ ID NO: 66 의 폴리뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 결실의 하기 조합 중 하나의 비율에서 SEQ ID NO: 66 과 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다:
- 위치 19, 20, 및 21 에서의 뉴클레오티드의 결실,
- 위치 18, 19, 20 및 21 에서의 뉴클레오티드의 결실,
- 위치 15, 16, 19 및 20 에서의 뉴클레오티드의 결실,
- 위치 14, 15, 16, 20 및 21 에서의 뉴클레오티드의 결실, 및
- 위치 14, 15, 16, 20, 21 및 22 에서의 뉴클레오티드의 결실
(상기 번호매김은 SEQ ID NO: 66 에서의 뉴클레오티드 번호매김을 나타냄).
대안적으로 또는 그에 더하여, 뉴클레오티드 결실은 위치 1 및 2 (번호매김은 SEQ ID NO: 66 에서의 뉴클레오티드 번호매김을 나타냄) 에 존재할 수 있다.
실시예 7 에서 보여지는 바와 같이, 출원인은 피브리노겐에 동시에 결합할 수 있는 SEQ ID NO: 66 의 변이체를 동정했다.
특정 부가적 또는 대안적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는, 피브리노겐에 선택적으로 결합하고 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 및 SEQ ID NO: 93 로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 또는 SEQ ID NO: 80-93 로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열과 1, 2, 3, 4 또는 5 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머이다.
SEQ ID NO: 66 의 바람직한 변이체는 SEQ ID NO: 80-87 의 앱타머를 망라한다.
본 발명에 따라 사용되는 앱타머의 제 1 하위군은 또한, 피브리노겐에게로 향해지고 SEQ ID NO: 1 과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 의 서열 동일성을 갖는 앱타머를 망라한다.
특히, 앱타머는 SEQ ID NO: 1 을 가질 수 있거나 또는 앱타머는 1-20, 특히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 1 과 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변형 또는 변형들은 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 66 에 대해 위에 기재된 위치 또는 위치들에 존재할 수 있다.
아래에서 표제 "본 발명에 따라 사용되는 앱타머를 수득하기 위한 방법" 의 부분에서 설명되는 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 특정 앱타머는 다수의 단일 가닥 DNA (ssDNA) 로 구성되는 후보의 혼합물로부터 동정되었으며, 여기에서 각각의 ssDNA 는 PCR 을 통한 증폭을 위한 프라이머의 역할을 수행하는 약 15 내지 40 개 뉴클레오티드의 특정 서열이 측면에 있는 약 20 내지 100 개 뉴클레오티드의 무작위 중심 서열을 포함한다.
특정 대안적 또는 부가적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 하기 식 (I) 에 대응한다:
5'-[NUC1]m-[중심]-[NUC2]n-3' (I)
식에서:
- [중심] 은 SEQ ID NO: 94 와 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드이고,
- n 및 m 은 0 및 1 로부터 독립적으로 선택되는 정수이고,
- [NUC1] 는 2 내지 40 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 개 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고,
- [NUC2] 는 2 내지 40 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 개 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드임.
바람직한 실시양태에서, m=1 이고, [NUC1] 는 SEQ ID NO: 75 의 폴리뉴클레오티드 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 75 와 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 그것으로 구성된다.
식 (I) 의 앱타머의 예는 SEQ ID NO: 66 의 앱타머이다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 하기 식에 대응한다:
5'-[NUC1]-[중심]-[NUC2]n-3'
식에서 n 은 0 또는 1 임.
특정 기타 실시양태에서, [NUC2] 는 SEQ ID NO: 76 의 폴리뉴클레오티드 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 76 과 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 그것으로 구성된다.
특정 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 하기 식 (I) 의 앱타머일 수 있다:
5'-[NUC1]m-[중심]-[NUC2]n-3' (I)
식에서:
- m 은 1 이고,
- n 은 0 또는 1 이고,
- [NUC1] 은 SEQ ID NO: 75 의 폴리뉴클레오티드 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형, 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 결실의 비율에서 SEQ ID NO: 75 와 상이한 폴리뉴클레오티드이고,
- [NUC2] 는 2 내지 40 개 뉴클레오티드 길이를 갖는 폴리뉴클레오티드이고,
- [중심] 은 SEQ ID NO: 94 의 폴리뉴클레오티드이거나, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 뉴클레오티드 변형, 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 결실의 비율에서 SEQ ID NO: 94 와 상이한 뉴클레오티드의 서열임.
특정 실시양태에서, [NUC2] 는 SEQ ID NO: 76 의 폴리뉴클레오티드이거나, 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 76 과 상이한 서열을 가지며, 상기 뉴클레오티드 변형은 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 치환 및 뉴클레오티드 결실로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 제 1 하위군의 앱타머는 도 1A 에서 강조표시된 뉴클레오티드에 의해 보여지는 바와 같은 입체구조 기를 포함할 수 있다. 더욱 일반적 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 하기를 보유하는 15 내지 19 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 17 개 뉴클레오티드를 포함하는 중심 루프를 포함하는 입체구조 기를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 도메인을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 가질 수 있다:
- 4 내지 6 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 5 개 뉴클레오티드 길이를 갖는 제 1 막대,
- 13 내지 15, 더욱 바람직하게는 14 개 뉴클레오티드를 포함하는 루프에 연결된 2 내지 4 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 3 개 뉴클레오티드를 갖는 제 2 막대, 및
- 가능하게는 내지 4, 더욱 바람직하게는 3 개 뉴클레오티드를 포함하는 루프에 연결된 2 내지 8, 더욱 바람직하게는 7 개 뉴클레오티드를 갖는 제 3 막대.
특정 바람직한 실시양태에서, 제 1 막대는 제 2 막대에 인접해 있고, 제 3 막대로부터 비롯되는 2 개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다.
본 발명의 제 1 하위군에 속하는 앱타머는 위에서 정의된 약산성 pH 에서, 더욱 바람직하게는 pH 약 6.3 에서 피브리노겐에 결합할 수 있다. 특히, 제 1 군의 앱타머는 피브리노겐에 pH-의존적 방식으로 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 앱타머는 약알칼리성 pH 예컨대 pH 7.4 에서와 비교할 때 pH 6.3 에서 피브리노겐에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 앱타머는 pH 7.0 이상에서 피브리노겐에 결합하지 않는다.
앱타머의 상기 하위군은 또한 Mg2+ 의 존재 하에 피브리노겐에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 앱타머는 pH 및/또는 매질 중 Mg2+ 의 존재에 따라 좌우되는 피브리노겐에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다. 예를 들어, 피브리노겐에 대한 앱타머의 결합 친화도는 Mg2+ 이 없는 동일한 매질에 비해 mM 범위의, 예를 들어 1 내지 10 mM 의 농도의 Mg2+ 의 존재 하에 증가될 수 있다. 또다른 예로서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 pH 약 6.3 에서 피브리노겐에 특이적으로 결합하고, pH 7.0 초과, 예컨대 pH 7.4 에서 피브리노겐에 결합하지 않는다.
이들 특성은 예를 들어 본원에서 아래의 표제 "실시예" 의 부분에서 SEQ ID NO: 66 의 앱타머에 관해 보여진다.
- 본 발명에 따라 사용되는 앱타머의 제 2 하위군
앱타머의 제 2 하위군은, 그에 제한되는 것은 아니나, SEQ ID NO: 58-65 의 앱타머 및 SEQ ID NO: 67 의 기본 서열을 망라한다.
SEQ ID NO: 58-65 및 SEQ ID NO: 67 의 앱타머는 그들의 서열에 두 개의 공통 기, 즉 도 1C 의 서열 정렬에서 보여지는 바와 같은 GGTGTAT (SEQ ID NO: 78) 의 상류에 있는 GTTGGTAGGG (SEQ ID NO: 77) 를 포함한다. 임의의 이론에 구속되는 것을 의도하지 않으면서, 출원인은 이들 공통 기가 SEQ ID NO: 58 의 앱타머에 관한 도 1B 에서 보여지는 루프를 형성하는 앱타머의 영역에 위치한다고 생각한다. 이러한 입체구조 기는 피브리노겐에 대한 상기 앱타머의 결합에서 역할을 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 앱타머의 제 2 하위군은, 피브리노겐에 특이적으로 결합하고 SEQ ID NO: 77 및 SEQ ID NO: 78 (SEQ ID NO: 77 은 SEQ ID NO: 78 의 상류에 있다) 의 뉴클레오티드 기를 상기 앱타머의 기본 서열에 포함하는 앱타머를 망라한다.
바람직하게는, 상기 앱타머는 하기 식 (III) 의 뉴클레오티드 기를 포함한다:
5'-[SEQ ID NO: 79]-[X1]-[SEQ ID NO: 77]-[X2]-[SEQ ID NO: 78]-3'
식에서:
- [X2] 및 [X1] 는 독립적으로 뉴클레오티드 또는 2 내지 5 개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 2 또는 3 개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 지칭하고,
- [SEQ ID NO: 77] 는 SEQ ID NO: 77 (즉 GTTGGTAGGG) 의 올리고뉴클레오티드이고,
- [SEQ ID NO: 78] 는 SEQ ID NO: 78 (즉 GGTGTAT) 의 올리고뉴클레오티드이고,
- [SEQ ID NO: 79] 는 SEQ ID NO: 79 (즉 TGT) 의 올리고뉴클레오티드임.
예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 식 (III) 의 기를 포함할 수 있으며, 식에서 X1 은 뉴클레오티드, 예를 들어 G 또는 T 를 지칭하고, X2 는 3 개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 앱타머는 게다가 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, 및 SEQ ID NO: 95 로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
따라서, 앱타머의 제 2 하위군은, 피브리노겐에 특이적으로 결합하고 하기와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 앱타머를 망라한다:
- SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, 및 SEQ ID NO: 95 를 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 의 서열 동일성을 갖고,
- 하기 식 (III) 의 뉴클레오티드 기를 포함함:
5'-[SEQ ID NO: 79]-[X1]-[SEQ ID NO: 77]-[X2]-[SEQ ID NO: 78]-3'
식에서:
- [X2] 및 [X1] 는 독립적으로 뉴클레오티드 또는 2 내지 5 개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 2 또는 3 개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 지칭하고,
- [SEQ ID NO: 77] 는 SEQ ID NO: 77 (즉 GTTGGTAGGG) 의 올리고뉴클레오티드이고,
- [SEQ ID NO: 78] 는 SEQ ID NO: 78 (즉 GGTGTAT) 의 올리고뉴클레오티드이고,
- [SEQ ID NO: 79] 는 SEQ ID NO: 79 (즉 TGT) 의 올리고뉴클레오티드임.
본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 더욱 바람직하게는 20 내지 150 개 뉴클레오티드 길이, 특히 25 내지 100 개 뉴클레오티드 길이, 예컨대 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
부가적 또는 대안적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 결합하고, SEQ ID NO: 67 의 기본 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 67 의 폴리뉴클레오티드, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 67 과 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합하고, 하기 식 (I) 에 대응한다
5'-[NUC1]m-[중심]-[NUC2]n-3'
식에서
- n 및 m 은 0 및 1 로부터 독립적으로 선택되는 정수이고,
- [NUC1] 는 2 내지 40 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 개 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고,
- [NUC2] 는 2 내지 40 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 15 내지 25 개 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이고,
- [중심] 은 SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 94 및 SEQ ID NO: 95 를 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 의 서열 동일성을 갖고 위에서 정의된 식 (III) 의 뉴클레오티드 기를 포함하는 폴리뉴클레오티드임.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 하기 특성 중 적어도 1, 2, 3 개 또는 전부를 포함하는 식 (I) 의 앱타머이다:
- n = m = 1,
- [NUC1] 는 SEQ ID NO: 75 의 폴리뉴클레오티드 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 75 와 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 그것으로 구성됨,
- [NUC2] 는 SEQ ID NO: 76 의 폴리뉴클레오티드 또는 1, 2, 3 또는 4 개 뉴클레오티드 변형의 비율에서 SEQ ID NO: 76 과 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 그것으로 구성됨,
- [중심] 은 SEQ ID NO: 95 와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 의 서열 동일성을 갖고 위에서 정의된 식 (III) 의 뉴클레오티드 기를 포함하는 폴리뉴클레오티드임.
또다른 대안적 또는 특정 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, 및 SEQ ID NO: 67 로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 제 2 하위군의 앱타머는 도 1B 에서 강조표시된 뉴클레오티드에 의해 보여지는 바와 같은 입체구조 기를 포함할 수 있다. 더욱 일반적 양상에서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 23 내지 27 개 뉴클레오티드의 루프에 결합된 2 내지 5 개 뉴클레오티드, 예를 들어 4 개 뉴클레오티드 길이를 갖는 막대를 포함하는 입체구조 기를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 도메인을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 루프에는 임의의 막대-루프 기 또는 부가적 막대 기가 없다.
상기 제 2 하위군에 속하는 앱타머는 약산성 pH 에서, 더욱 바람직하게는 pH 약 6.3 에서 피브리노겐에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 앱타머는 pH 7.0 초과, 예컨대 pH 7.4 에서와 비교할 때 pH 6.3 에서 피브리노겐과의 증가된 결합을 갖는다. 바람직하게는, 상기 앱타머는 pH 7.0 초과에서 피브리노겐에 결합하지 않는다. 더욱 일반적으로, 제 2 하위군의 앱타머는 피브리노겐에 pH-의존적 방식으로 결합할 수 있다.
앱타머의 이러한 하위군은 또한 Mg2+ 의 부재 하에 피브리노겐에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 앱타머는 pH 및/또는 매질 중 Mg2+ 의 존재에 따라 좌우되는 피브리노겐에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다. 예를 들어, 피브리노겐에 대한 앱타머의 결합 친화도는 Mg2+ 의 존재 하에, 예를 들어 mM 범위의 Mg2+ 를 포함하는 매질에서, Mg2+ 이 없는 동일한 매질에 비해 감소될 수 있다.
- 친화도 리간드로서의 본 발명에 따른 앱타머의 용도
피브리노겐에게로 향해지는 앱타머를 포함하는 친화도 리간드가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 친화도 리간드는 피브리노겐의 정제를 위한 고체 지지체 상에 부동화될 수 있다.
전형적으로, 본 발명에 따라 사용되는 친화도 리간드는 적합한 기재 (substrate) 상의 부동화에 유용한 적어도 하나의 (ii) 비-앱타머 개체 (entity) 에 결합된 (i) 앱타머 기, 즉 위에서 정의된 바와 같은 피브리노겐에게로 향해지는 앱타머를 포함한다. 바람직하게는, 비-앱타머 개체는 더욱 바람직하게는 앱타머의 5'- 또는 3' 말단에 결합된다.
특정 실시양태에서, 친화도 리간드는 직접 또는 스페이서 기에 의해 앱타머 기에 결합된 부동화 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 친화도 리간드는 하기 식 (IV) 의 화합물을 포함하거나, 또는 그것으로 구성될 수 있다:
[IMM]-([스페이서])p-[앱타머]
식에서
- [앱타머] 는 위에서 정의된 바와 같은 앱타머를 지칭하고,
- [스페이서] 는 스페이서 기이고,
- [IMM] 는 지지체 상의 앱타머의 부동화를 위한 기이고,
- p 는 0 또는 1 임.
p = 0 은 스페이서가 부재하고, [IMM] 가 [앱타머] 에, 더욱 바람직하게는 앱타머의 3' 또는 5' 말단에 직접 결합한다는 것을 의미한다.
p = 1 은 스페이서가 존재하고, [IMM] 및 [앱타머] 를 결합시킨다는 것을 의미한다.
스페이서 기는 전형적으로 앱타머가 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 능력을 여전히 유지시키면서 앱타머 기의 입체 장애를 감소시키고 그것의 접근가능성을 개선하도록 선택된다. 스페이서 기는 임의의 유형의 것일 수 있다. 스페이서는 비-특이적 단일 가닥 뉴클레오티드일 수 있으며, 즉 피브리노겐을 포함하는, 단백질에 결합할 수 없다. 전형적으로, 스페이서는 2 내지 20 개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 적합한 핵 스페이서의 예는 폴리A 및 폴리T 이다. 특정 기타 실시양태에서, 스페이서는 비-핵 화학적 개체일 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 펩티드, 폴리펩티드, 올리고당 또는 다당, 가능하게는 하나 또는 여러 개의 헤테로원자에 의해 중단되고 가능하게는 하나 또는 여러 개의 치환기 예컨대 히드록실, 할로겐 또는 C1-C3 알킬로 치환되는 탄화수소 사슬; 서열분석된 단독중합체, 공중합체 및 중합체, 및 후자의 조합을 포함하는 중합체로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 폴리에테르 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리실리콘, 및 후자의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 임의의 적합한 기, 예컨대 헤테로원자, 더욱 바람직하게는 -O- 또는 -S-, -NHC(O)-, -OC(O)-, -NH-, -NH-CO-NH-, -O-CO-NH-, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트에 의해 결합된 여러 탄화수소, 올리고머 또는 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 이들 스페이서 사슬은 2 내지 200 개의 탄소 원자, 예컨대 5 내지 50 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 스페이서는 비-특이적 올리고뉴클레오티드, 탄화수소 사슬, 폴리에테르, 특히 폴리에틸렌 글리콜 및 후자의 조합으로부터 선택된다.
예를 들어, 스페이서는 2 내지 20 개의 단량체를 포함하는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함한다. 예를 들어, 스페이서는 적합한 결합 분절에 의해 함께 결합된 1 내지 4 개의 트리에틸렌 글리콜 블록을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 C12 친수성 에틸아민 트리에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있다. 대안적으로, 스페이서는 C2-C20 탄화수소 사슬, 특히 C2-C20 알킬 사슬 예컨대 C12 메틸렌 사슬일 수 있다.
스페이서는 더욱 바람직하게는 앱타머 기의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합된다.
[IMM] 은 기재, 더욱 바람직하게는 고체 지지체 상에 친화도 리간드를 부동화하는 것을 가능하게 하는 임의의 적합한 기를 지칭한다. [IMM] 은 기재 상에 친화도 리간드를 부동화하기 위해 추구되는 상호작용의 유형에 따라 좌우된다.
예를 들어, 친화도 리간드는 수소 결합, 정전기력 또는 반데르발스힘을 포함하는 특정 비-공유적 상호작용으로 인해 부동화될 수 있다. 예를 들어, 지지체 상의 친화도 리간드의 부동화는 리간드/항-리간드 쌍 (예를 들어, 항체/항원 예컨대 비오틴/항-비오틴 항체 및 디곡시게닌/항-디곡시게닌 항체, 또는 리간드/수용체) 및 결합 단백질 표지에 따라 좌우될 수 있다. 다수의 단백질 표지가 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 비오틴 (스트렙타비딘 또는 아비딘 유도체와의 결합을 위해), 글루타티온 (단백질과의 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제에 결합된 기타 물질과의 결합을 위해), 말토오스 (단백질과의 또는 말토오스에 대한 결합 단백질에 결합된 기타 물질과의 결합을 위해), 렉틴 (당 기에 대한 결합을 위해), c-myc 표지, 헤마글루티닌 항원 표지 (HA), 티오레독신 표지, FLAG 표지, 폴리Arg 표지, 폴리His 표지, Strep 표지, 키틴 결합 도메인, 셀룰로스 결합 도메인, 및 유사한 것을 망라한다. 특정 실시양태에서, [IMM] 은 비오틴을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 친화도 리간드는 아비딘 또는 스트렙타비딘이 그래프팅되는 지지체 상의 부동화에 적합하다.
대안적으로, 친화도 리간드는 고체 지지체 상의 공유적 그래프팅에 적합할 수 있다. [IMM] 은 그러므로 화학적 반응성 기를 포함하는 화학적 개체를 지칭한다. 화학적 개체는 전형적으로 1000 g·mol-1 미만, 바람직하게는 800 g·mol-1 미만, 예컨대 700, 600, 500 또는 400 g·mol-1 미만의 분자량을 갖는다. 반응성 기는 임의의 유형의 것일 수 있고, 일차 아민, 말레이미드 기, 설프히드릴 기, 및 유사한 것을 망라한다.
예를 들어, 화학적 개체는 SIAB 화합물, SMCC 화합물 또는 후자의 유도체에서 유래할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 부동화하기 위한 술포-SIAB 의 사용은, 예를 들어, Allerson et al., RNA, 2003, 9:364-374 에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, [IMM] 은 일차 아미노 기를 포함한다. 예를 들어, [IMM] 은 -NH2 또는 C1-C30 아미노알킬, 더욱 바람직하게는 C1-C6 아미노알킬일 수 있다. 일차 기를 포함하는 [IMM] 을 포함하는 친화도 리간드는 활성화된 카르복시산 기를 보유하는 지지체 상의 부동화에 적합하다. 활성화된 카르복시산 기는, 그에 제한되는 것은 아니나, 산 클로라이드, 혼합 에스테르 및 무수 기를 망라한다. 바람직한 활성 카르복시산 기는 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.
위에서 언급된 바와 같이, [IMM]-([스페이서])p 는 더욱 바람직하게는 앱타머의 3' 말단 또는 5' 말단에 결합된다. [IMM]-([스페이서])p 에 결합되지 않는 앱타머 기의 말단은 화학적으로 개질된 뉴클레오티드 예컨대 2'-o-메틸- 또는 2'-플루오로피리미딘, 2'-리보퓨린, 포스포라미다이트, 역방위 뉴클레오티드 또는 화학적 기 예컨대 PEG 또는 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 이들 변형은 리간드의 변성, 특히 효소적 변성을 방지할 수 있다. 기타 실시양태에서, 앱타머의 상기 자유 말단 (즉 이는 [IMM] 또는 [스페이서] 에 결합되지 않음) 은 위에 기재된 바와 같은 검출 수단에 연결될 수 있다.
피브리노겐에 선택적으로 결합할 수 있는 친화도 지지체가 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 그것은 이러한 지지체 상에 위에 기재된 바와 같은 복수의 친화도 리간드를 포함한다.
친화도 리간드는 비-공유적 상호작용에 의해 또는 하나 이상의 공유적 결합에 의해 고체 지지체 상에 부동화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 친화도 리간드는 상기 지지체 상에 공유적으로 그래프팅된다. 전형적으로, 그래프팅은 리간드의 기 [IMM] 에 존재하는 화학적 반응성 기와 고체 지지체의 표면에 존재하는 화학적 반응성 기와의 반응에 의해 수행된다.
바람직하게는, 리간드의 화학적 반응성 기는 일차 아민 기이고, 고체 지지체 상에 존재하는 것은 활성화된 카르복시산 기 예컨대 NHS 에 의해 활성화된 카르복시산 기 (즉 N-히드록시숙시미딜 에스테르) 이다. 이 경우에, 그래프팅 반응은 WO2012090183 (이의 기재는 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 실시예 4 에서 보여지는 바와 같이 pH 6 미만에서, 예를 들어 pH 3.5 내지 4.5 에서, 수행될 수 있다.
친화도 지지체의 고체 지지체는 임의의 유형의 것일 수 있고, 고려되는 용도에 따라 선택된다.
예를 들어, 고체 지지체는 플라스틱, 금속 및 무기 예컨대 유리, 니켈/니켈 옥시드, 티타늄, 지르코늄 옥시드, 규소, 스트레스트 (stressed) 규소, 다결정질 규소, 규소 디옥시드 또는 세라믹으로 만들어진 지지체로부터 선택될 수 있다. 상기 지지체는 장치 예컨대 마이크로전자 장치, 미세유체 장치, 센서, 바이오센서 또는 칩, 예를 들어, SPR 과 함께 사용하기에 적합한 것에 함유될 수 있다. 대안적으로, 지지체는 비드, 예컨대 중합체, 금속 또는 자기 비드의 형태일 수 있다. 이들 지지체는 검출 및 진단 필요에 적합할 수 있다.
기타 실시양태에서, 고체 지지체는 중합체 겔, 필터 또는 막일 수 있다. 특히, 고체 지지체는 아가, 가교 아가, 셀룰로스 또는 합성 중합체 예컨대 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리술폰, 및 후자의 유도체로 구성될 수 있다. 이들 지지체는 피브리노겐의 정제에 적합할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 크로마토그래피를 위한 지지체일 수 있고, 특히 액체 친화도 크로마토그래피를 위한 지지체일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 친화도 지지체는 산업적 규모에서 친화도 크로마토그래피를 수행하기에 적합할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 친화도 지지체는 그러므로 크로마토그래피 방법에서, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피 방법에서 또는 불연속 크로마토그래피 방법에서 정지상으로서 사용될 수 있다.
피브리노겐의 정제에서의 본 발명에 따른 앱타머 및 친화도 리간드의 용도
본 발명에 따라 사용되는 피브리노겐의 포획 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 본 발명에 따라 사용되는 앱타머 또는 친화도 리간드가 부동화되어 있는 고체 지지체를 공급하는 단계,
- 상기 고체 지지체를 피브리노겐을 함유하는 용액과 접촉시켜, 피브리노겐과 고체 지지체 상에 부동화된 상기 앱타머 또는 상기 친화도 리간드 사이의 복합체의 형성에 의해 피브리노겐이 포획되는 단계.
특정 실시양태에서, 방법은 하기와 같은 하나 또는 여러 개의 부가적 단계를포함할 수 있다:
- 상기 복합체로부터 피브리노겐을 방출하는 단계,
- 상기 복합체로부터 피브리노겐을 회수하는 단계,
- 피브리노겐과 상기 앱타머 또는 친화도 리간드 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계,
- 피브리노겐을 정량화하는 단계.
복합체의 검출 및 피브리노겐 (또는 복합체의 피브리노겐) 의 정량화는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다 . 예를 들어, 검출 및 정량화는 실시예에 제시된 바와 같은 SPR 에 의해 수행될 수 있다.
대안적으로, 표지된 항-피브리노겐 항체가 피브리노겐과 본 발명에 따른 친화도 리간드 사이에 형성된 복합체의 검출 또는 정량화에 사용되는 ELISA 유형의 시험을 사용하는 것이 가능하다. 항-피브리노겐 항체는 형광단으로 표지되거나 또는 검출에 적합한 효소, 예컨대 호오스래디시 퍼옥시다아제에 커플링될 수 있다.
아래에서 실시예 5 및 6 에서 상세히 제시되는 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머는 피브리노겐의 정제에서 사용하기에 특히 적합하다.
출발 조성물을 사용하여 본 발명에 따라 사용되는 피브리노겐을 정제하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. (i) 지지체 상에 부동화된 앱타머 또는 친화도 리간드와 (ii) 피브리노겐 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건에서, 상기 출발 조성물을 위에서 정의된 바와 같은 친화도 지지체와 접촉시키는 단계,
b. 상기 복합체로부터 피브리노겐을 방출하는 단계, 및
c. 정제된 형태의 피브리노겐을 회수하는 단계.
피브리노겐을 함유하는 출발 조성물을 사용하여 본 발명에 따라 사용되는 정제된 피브리노겐 조성물을 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. (i) 지지체 상에 부동화된 앱타머 또는 친화도 리간드와 (ii) 피브리노겐 사이의 복합체의 형성에 적합한 조건에서, 상기 출발 조성물을 위에서 정의된 바와 같은 친화도 지지체와 접촉시키는 단계,
b. 상기 복합체로부터 피브리노겐을 방출하는 단계, 및
c. 정제된 피브리노겐 조성물을 회수하는 단계.
본원에서 의미되는, 출발 조성물은 피브리노겐을 잠재적으로 포함하는 임의의 조성물일 수 있다. 출발 조성물은 오염물을 함유할 수 있으며, 이 오염물로부터 피브리노겐이 분리되어야 한다.
오염물은 임의의 유형의 것일 수 있고, 출발 조성물의 본질에 따라 좌우된다. 오염물은 단백질, 염, 호르몬, 비타민, 영양소, 지질, 세포 잔해물 예컨대 세포 막의 단편, 및 유사한 것을 망라한다. 특정 실시양태에서, 오염물은 혈액 단백질 예컨대 응고 인자, 피브로넥틴, 알부민, 면역글로불린, 플라스미노겐, 알파-2-마크로글로불린, 및 유사한 것을 포함할 수 있다.
특정 기타 실시양태에서, 오염물은 비-인간 단백질, 특히 재조합 숙주 예컨대 재조합 세포, 세균 또는 효모, 또는 트랜스제닉 동물에 의해 내생적으로 발현되는 비-인간 단백질을 포함할 수 있다.
전형적으로, 출발 조성물은 세포 배양물로부터, 발효 브로스로부터, 세포 용해물로부터, 조직으로부터, 기관으로부터 또는 체액으로부터의 것일 수 있거나, 또는 그로부터 유래할 수 있다. 본원에서 의미되는, "출발 조성물" 은 관심의 개체, 예컨대 젖, 혈액 또는 세포 배양물로부터 유래하며, 이는 상기 개체를 하나 또는 여러 개의 처리 단계에 적용함으로써 출발 조성물이 상기 개체로부터 수득된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 관심의 개체 예컨대 세포 용해물은 하나 또는 여러 개의 처리, 예컨대 침전 단계 예컨대 염의 침전, 저온-침전 또는 응집, 여과 단계 예컨대 강제 여과 또는 한외여과, 원심분리, 정화, 크로마토그래피, 추출 단계 예컨대 액체-액체 또는 고체-액체 추출, 바이러스 불활성화, 저온살균, 동결/해동 단계, 및 유사한 것에 적용될 수 있다. 예를 들어, 혈액에서 유래하는 출발 조성물은, 그에 제한되는 것은 아니나, 혈장, 혈장 분획 및 혈액 저온침전물을 망라한다.
특정 실시양태에서, 출발 용액은 혈액, 더욱 바람직하게는 인간 혈액으로부터 유래한다. 출발 조성물은 혈장, 혈장 분획, 예를 들어 에탄올 분획화 Cohn 방법에 의해 수득된 분획 I, 및 혈액 저온침전물로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 출발 조성물은 면역글로불린 고갈된 혈장 분획 및/또는 알부민 고갈된 혈장 분획 및/또는 비타민 K 의존적 응고 단백질 고갈된 혈액 또는 혈장 분획이다.
특정 기타 실시양태에서, 출발 조성물은 재조합 숙주로부터 수득된다. 바람직하게는, 재조합 숙주는 트랜스제닉 동물, 예컨대 비-인간 트랜스제닉 포유류이다. 비-인간 트랜스제닉 포유류는 인간 피브리노겐을 발현하도록 유전자 조작된 임의의 동물일 수 있다. 바람직하게는, 인간 피브리노겐은 상기 트랜스제닉 동물의 체액에서 발현된다.
출발 용액은 그러므로 트랜스제닉 동물의 체액으로부터의 것일 수 있거나, 또는 그로부터 유래할 수 있다. 체액은, 그에 제한되는 것은 아니나, 혈액, 모유 및 소변을 망라한다.
특정 실시양태에서, 출발 조성물은 비-인간 트랜스제닉 포유류에서 비롯된 젖이거나, 또는 그로부터 유래한다. 관심의 단백질을 젖에 분비할 수 있는 트랜스제닉 동물의 생산 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이들 방법은 비-인간 포유류의 배아 중 젖에 자연적으로 분비되는 단백질로부터의 프로모터 (예컨대 카제인 프로모터 또는 WHAP 프로모터) 에 임의로 결합된 관심의 단백질에 대한 인코딩 유전자를 포함하는 유전자 조립 산물의 도입을 망라한다. 배아는 그 후 임신을 위한 호르몬 관점에서 제조된 동일한 동물 종에 속하는 암컷의 자궁으로 옮겨진다.
특정 바람직한 실시양태에서, 출발 조성물은 인간 혈액, 트랜스제닉 젖 및 후자의 유도체로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 친화도 지지체는 위에서 기재된 임의의 친화도 지지체일 수 있다. 바람직하게는, 친화도 지지체는 친화도 크로마토그래피를 수행하기 위한 친화도 지지체이다. 실제로, 피브리노겐의 정제 방법 또는 피브리노겐의 정제된 조성물의 제조 방법은 더욱 바람직하게는 크로마토그래피 기술, 예를 들어 불연속 모드 또는 친화도 지지체가 정지상의 역할을 하는 칼럼에 기반한다. 단계 a) 에서, 피브리노겐의 분자와 상기 앱타머 기 사이에 복합체가 형성되게 하는, 친화도 지지체 상의 표면에 존재하는 항-피브리노겐 앱타머 기와 피브리노겐과의 특이적 상호작용을 선호하는 적합한 조건에서, 피브리노겐을 함유하는 출발 조성물의 적합한 부피가 친화도 지지체와 접촉된다. 단계 a) 에서, 피브리노겐은 그러므로 친화도 지지체 상에 유지된다. 단계 a) 를 약산성 pH 에서 수행함으로써 앱타머 기와 피브리노겐의 분자 사이의 결합은 강화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 a) 는 pH 7.0 미만, 바람직하게는 6.9, 6.8 또는 6.7 미만에서 수행된다. 특히, 단계 a) 는 pH 6.0 내지 6.8 에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 6.5, 예컨대 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 또는 6.5 에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 a) 는 pH 6.1 내지 6.5, 예컨대 pH 6.3 에서 수행될 수 있다. 더욱 일반적 양상에서, 단계 a) 의 pH 조건은 친화도 지지체 상의 피브리노겐의 결합을 선호하는 한편 여전히 친화도 지지체 상의 기타 분자의 결합을 최소화하는 방식으로 선택될 수 있다. 전형적으로, 단계 a) 는 완충액 (이하에서 "결합 완충제" 로 호칭됨) 의 존재 하에 수행된다. 결합 완충제는 단계 a) 전에 출발 조성물과 혼합될 수 있거나 또는 결합 완충제는 단계 a) 동안 첨가될 수 있다. 결합 완충제는 전형적으로 완충제를 함유하는 수성 용액이다. 완충제는 피브리노겐 및 친화도 지지체와 양립되게 하는 방식으로 그리고 단계 a) 에 바람직한 pH 를 제공하게 하는 방식으로 선택될 수 있다. 예를 들어, pH 약 6.3 을 수득하기 위해서, 완충제는, 그에 제한되는 것은 아니나, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), HEPES, Bis-TRIS, 시트레이트 및 아세테이트로부터 선택될 수 있다. 완충제는 약 5 mM 내지 1 mM, 예를 들어 10 mM 내지 500 mM, 예를 들어 10 mM 내지 200 mM, 예컨대 약 50 mM 의 농도로 존재할 수 있다.
임의의 이론에 구속되는 것을 의도하지 않으면서, 염의 존재는 피브리노겐과 고체 지지체의 앱타머 기 사이의 복합체의 형성을 선호하고/하거나 출발 조성물에 존재하는 기타 분자의 결합을 방지할 수 있다. 전형적으로, 단계 a) 는, 예를 들어 10 mM 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 50 mM 내지 350 mM, 또는 100 mM 내지 200 mM 범위, 예컨대 약 150 mM 의 농도의 소듐 클로라이드의 존재 하에 수행될 수 있다.
2 가 양이온의 존재는 앱타머 기에 대한 피브리노겐의 결합을 조정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 a) 는 적어도 1 mM 의 농도의, 예를 들어 약 1 mM 내지 50 mM, 예를 들어 1 mM 내지 20 mM 의 농도, 예컨대 약 5 mM 의 농도의 2 가 양이온, 예컨대 Mg2+ 의 존재 하에 수행된다.
특정 기타 실시양태에서, 단계 a) 는 Mg2+ 의 부재 하에; 더욱 일반적으로, 2 가 양이온의 부재 하에 수행된다.
따라서, 단계 a) 에서 사용되는 결합 완충제는 100 mM 내지 500 mM 의 농도의 NaCl 및 약 1 mM 내지 50 mM 의 농도의 마그네슘 염 예컨대 마그네슘 클로라이드 (MgCl2) 를 포함할 수 있고, pH 5.0 또는 6.9 를 가질 수 있다. 이러한 완충제는 고체 지지체 상에 존재하는 앱타머 기가 위에서 정의된 본 발명의 제 1 하위군에서 선택될 때 적합할 수 있다.
단계 a) 를 수행하는데 적합한 결합 완충제는, 특히 위에서 정의된 제 1 하위군에 속하는 앱타머 기가 사용될 때, pH 6.3 의 50 mM 의 MOPS, 5 mM 의 MgCl2 및 150 mM 의 NaCl 을 포함하는 완충제일 수 있다.
친화도 지지체 상에 존재하는 앱타머 기가 위에서 정의된 앱타머의 제 2 하위군에서 선택될 때, 결합 완충제에는 Mg2+, 더욱 일반적으로 2 가 양이온이 없을 수 있다. 단계 a) 를 수행하는데 적합한 결합 완충제는 그러므로 pH 6.3 의 50 mM 의 MOPS 및 150 mM 의 NaCl 을 포함하는 완충제일 수 있다.
단계 a) 의 마지막에, 및 단계 b) 전에, 특이적으로 결합되지 않으나, 지지체 상에 흡착되는 물질을 제거하는 방식으로 친화도 지지체는 적합한 세정 완충제로 세정될 수 있다. 세정 완충제는 피브리노겐과 앱타머 기 사이의 복합체를 유의하게 변경하지 않는 한편 여전히 친화도 지지체에 특이적으로 결합되지 않은 물질의 탈착을 선호하는 것은 말할 필요도 없다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 a) 의 마지막에 및 단계 b) 전에 친화도 지지체를 세정하는 단계를 포함한다. 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는, 임의의 종래의 세정 완충제가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세정 완충제는 단계 a) 에서 사용되는 결합 완충제와 동일한 조성을 갖는다. 기타 실시양태에서, 세정 완충제는 단계 a) 에서 사용되는 결합 완충제와 동일한 성분을, 그러나 상이한 농도로 포함할 수 있다. 부가적 또는 대안적 실시양태에서, 세정 완충제의 pH 는 결합 완충제의 pH 와 동일하다.
세정 완충제는 pH 7 미만, 예를 들어 pH 5.0 내지 6.9, 더욱 바람직하게는 6.1 내지 6.5, 예컨대 pH 6.3 을 가질 수 있다. 세정 완충제는 또한 NaCl 을 포함할 수 있다. 전형적으로, 세정 완충제의 이온 강도는 결합 완충제의 이온 강도보다 높을 수 있다. 실제로, 출원인은, 본 발명의 특정 앱타머에 대해, 높은 이온 강도가 앱타머 기에 대한 피브리노겐의 결합을 유의하게 변경하지 않을 수 있다는 것을 밝혔다. 다른 면에서, 높은 이온 강도의 존재 하에서도, 피브리노겐과 본 발명에 따라 사용되는 특정 앱타머 사이의 복합체는 안정적일 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 세정 용액은 단계 a) 에서 사용되는 결합 완충제의 이온 강도보다 높은 이온 강도를 갖는다. 대안적 또는 부가적 실시양태에서, 세정 완충제는 적어도 100 mM 내지 10 M 이하의 농도의 NaCl 을 포함할 수 있다. 예를 들어, NaCl 의 농도는 약 100 mM 내지 5 mM, 더욱 바람직하게는 150 mM 내지 2 mM 일 수 있다. 가능하게는, 세정 완충제는 약 0.1 mM 내지 20 mM, 더욱 바람직하게는 1 mM 내지 10 mM 의 농도, 예컨대 약 5 mM 의 농도의 2 가 양이온, 특히 Mg2+ 를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세정 완충제에는 Mg2+, 더욱 일반적으로 2 가 양이온이 없다.
특정 기타 부가적 실시양태에서, 세정 완충제는, 더욱 바람직하게는 알킬디올로부터, 특히 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적 성분을 포함할 수 있다. 실제로, 본 발명에 따라 사용되는 특정 앱타머에 대해, 세정 용액 중 알킬디올 예컨대 에틸렌 글리콜의 존재는 피브리노겐과 앱타머 사이의 복합체를 변경하지 않는다. 세정 완충제는 그러므로 알킬디올 예컨대 에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜을 1 중량% 내지 70 중량%, 더욱 바람직하게는 10 중량% 내지 60 중량%, 예컨대 50 중량% 의 양으로 포함할 수 있다.
오직 설명을 목적으로, 세정 완충제는 pH 6.3 의 MOPS 50 mM, NaCl 2M 및 가능하게는 50 중량% 의 글리콜을 포함한다. 이러한 세정 완충제는 위에 기재된 앱타머의 제 2 하위군에 속하는 앱타머 기를 보유하는 친화도 지지체의 세정을 수행하는데 적합할 수 있다. 세정 완충제의 또다른 예는 pH 6.3 의 MOPS 50 mM, NaCl 0.5 M 및 MgCl2 5 mM 을 포함하는 용액이다.
단계 b) 는 단계 a) 에서 형성된 복합체로부터 피브리노겐을 방출하는 목적을 위한 것이다. 이러한 방출은 피브리노겐과 앱타머 기 사이의 복합체의 탈안정화에 의해, 즉 피브리노겐에 대한 앱타머의 친화도를 감소시키는 조건을 사용하여 달성될 수 있다. 앱타머 기와 피브리노겐 사이의 복합체는 피브리노겐을 변경할 수 없는 적당한 조건에서 탈안정화될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
위에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머의 피브리노겐에 결합하는 능력은 매질의 pH 에 따라 좌우될 수 있다. 7.0 초과로의 pH 의 증가는 피브리노겐의 방출을 선호하는 것을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 단계 b) 는 pH 를 7.0 초과로 증가시킴으로써 수행된다. 바람직하게는, 단계 b) 의 pH 는 7.0 내지 8.0, 예를 들어 7.2 내지 7.8, 예컨대 pH 7.4 이다. 다른 면에서, pH 7.0 초과의 용출 완충제는 피브리노겐의 방출을 선호하기 위해 사용될 수 있다. 오직 설명을 목적으로, 적합한 용출 완충제는 pH 7.4 의 MOPS 50 mM 로 완충되고 NaCl 150 mM 을 포함하는 용액일 수 있다.
위에서 설명된 바와 같이, 피브리노겐에 결합하는 앱타머의 능력은 또한 2 가 양이온, 예컨대 Mg2+ 의 존재에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 피브리노겐에 대한 앱타머 기의 결합은 Mg2+ 의 존재에 의해 선호될 수 있다. 따라서, 단계 b) 에서 복합체로부터의 단백질의 방출은 2 가 양이온이 없고/없거나 2 가 양이온의 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 EGTA 를 포함하는 용출 완충제를 사용하여 선호될 수 있다. 예를 들어, 2 가 양이온의 킬레이트화제는 단계 b) 에서 사용되는 용출 완충제에 적어도 1 mM 및 최대 500 mM 의 농도로 존재할 수 있다. 2 가 양이온을 킬레이트화하는 킬레이트화제의 이용은 위에 기재된 제 1 하위군에 속하는 앱타머를 보유하는 친화도 지지체에 적합할 수 있다.
기타 실시양태에서, 피브리노겐에 대한 앱타머 기의 결합은 2 가 양이온 예컨대 Mg2+ 의 존재 하에 감소될 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 용출 완충제는 약 0.1 mM 내지 20 mM, 더욱 바람직하게는 1 mM 내지 10 mM 의 농도, 예컨대 약 5 mM 의 농도의 2 가 양이온, 특히 Mg2+ 를 포함할 수 있다. 이러한 용출은 위에서 정의된 제 2 하위군에 속하는 앱타머 기와 함께 형성된 복합체로부터의 단백질의 방출에 적합할 수 있다.
단계 b) 에서 사용될 수 있는 용출 완충제의 또다른 예는 MgCl2 2 M 을 포함하는 pH 7.4 의 MOPS 50 mM 의 용액이다.
단계 c) 의 마지막에, 정제된 피브리노겐은 전형적으로 정제된 액체 조성물의 형태로 수득된다. 이러한 정제된 액체 조성물은 하나 이상의 부가적 단계에 적용될 수 있다. 상기 액체 조성물은 농축되고/되거나 불활성화 또는 바이러스 제거, 예를 들어 멸균 여과를 통하는 또는 세제를 통하는 것, 투석여과, 하나 또는 여러 개의 약학적으로 허용가능한 부형제를 이용한 제형화 단계, 냉동건조, 포장, 더욱 바람직하게는 멸균 조건에서 수행되는 것, 및 후자의 조합에 적용될 수 있다.
더욱 일반적 양상에서, 피브리노겐의 정제 방법 또는 정제된 피브리노겐 조성물의 제조 방법은, 그에 제한되는 것은 아니나, 하나 또는 여러 개의 크로마토그래피 단계 예컨대 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 멀티모달 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 또는 친화도 크로마토그래피, 침전 단계, 하나 또는 여러 개의 여과 단계 예컨대 강제 여과, 한외여과, 접선 한외여과, 나노여과, 및 역삼투, 정화 단계, 불활성화 또는 바이러스 제거 단계, 멸균, 제형화, 냉동건조, 포장 및 후자의 조합을 포함하는 하나 또는 여러 개의 부가적 단계를 포함할 수 있다.
특정 부가적 실시양태에서, 피브리노겐의 정제 방법 또는 정제된 피브리노겐 조성물의 제조 방법은 특성의 하기 조합 중 하나를 포함한다:
- 조합 1: (i) 앱타머 기는 위에서 정의된 제 1 하위군의 앱타머로부터 선택됨, (ii) 단계 (a) 는 pH 5.8 내지 6.5, 더욱 바람직하게는 6.3 에서, Mg2+ 의 존재 하에 수행됨, 및 (iii) 단계 (b) 는 pH 7.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 7.4 에서, 가능하게는 2 가 양이온의 킬레이트화제의 존재 하에 수행됨, 및
- 조합 2: (i) 앱타머 기는 위에서 정의된 제 2 하위군의 앱타머로부터 선택됨, (ii) 단계 (a) 는 pH 5.8 내지 6.5, 더욱 바람직하게는 6.3 에서, Mg2+ 의 부재 하에 수행됨, 및 (iii) 단계 (b) 는 pH 7.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 7.4 에서, Mg2+ 의 존재 하에 수행됨.
부가적 양상에서, 본 발명의 앱타머 및 친화도 리간드는 혈액 혈장의 분획화 방법에서 사용될 수 있다. 혈액 혈장의 분획화 방법은 친화도 크로마토그래피의 여러 연속적 단계를 포함할 수 있으며, 친화도 크로마토그래피의 각각의 단계는 관심의 혈장 단백질 예컨대 피브리노겐, 면역글로불린, 알부민 및 기타 응고 인자, 예컨대 비타민 K-의존적 응고 인자를 회수하는 것을 가능하게 한다. 각각의 단계에서 사용되는 친화도 리간드는 임의의 유형의 것, 특히 앱타머일 수 있다. 이와 관련하여, 출원인은 놀랍게도 앱타머에 기반하는 친화도 크로마토그래피의 연속적 단계를 수행함으로써 혈액 혈장을 사용하여 혈장 단백질 예컨대 피브리노겐, 알부민 및 면역글로불린이, 회수 및 정제될 수 있다는 것을 밝혔다. 앱타머에 기반하는 친화도 크로마토그래피의 연속적 단계를 포함하는 혈액 혈장의 분획화 방법은 피브리노겐의 농축물 및 면역글로불린의 농축물을 적어도 96%, 심지어는 적어도 99% 의 단백질 순도로, 면역글로불린의 경우 혈장의 리터 당 약 9-12 g 및 피브리노겐의 경우 혈장의 리터 당 2-4 g 의 산출량으로 수득하는 것을 가능하게 한다는 점에 주목한다. 출원인은 또한 이들 양호한 산출량 및 이들 양호한 순도 비율이 미가공 (raw) 혈액 혈장을 사용하여 달성될 수 있다는 것을 밝혔다. 다른 면에서, 앱타머에 기반하는 친화도 크로마토그래피의 단계는 임의의 전처리 예컨대 에탄올 분획화 (Cohn 방법), 저온침전, 카프릴레이트 분획화 또는 PEG 를 이용하는 침전 없이 미가공 혈액 혈장에 대해 수행될 수 있다. 이러한 분획화 방법은 일시적 중간 냉장 저장을 회피하는 것을 가능하게 한다는 점에 주목한다.
본 발명의 또다른 목적은 그러므로 하기 단계를 포함하는 혈액 혈장의 분획화 방법이다:
(a) 친화도 리간드가 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 앱타머인, 피브리노겐을 회수하기 위한 친화도 크로마토그래피의 단계, 및
(b) 친화도 리간드는 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 앱타머인, 면역글로불린 (Ig) 을 회수하기 위한 친화도 크로마토그래피의 단계,
상기 친화도 크로마토그래피의 단계 (a) 및 (b) 는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
바람직하게는, 동형 G 의 면역글로불린이 단계 (b) 에서 회수된다.
피브리노겐을 회수하기 위한 친화도 크로마토그래피의 단계는 Ig 을 회수하기 위한 친화도 크로마토그래피 전에 수행될 수 있고 그 반대일 수도 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 혈액 혈장의 분획화 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 친화도 리간드가 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 앱타머인 친화도 크로마토그래피의 단계에 혈액 혈장 또는 후자의 유도체를 적용하는 단계, 및
- 친화도 리간드가 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 앱타머인 친화도 크로마토그래피의 단계에 피브리노겐이 실질적으로 없는 비-유지 (not-retained) 분획을 적용하는 단계.
상기 단계가 각각 친화도 지지체 상에 유지된 피브리노겐 및 Ig 의 회수를 포함할 수 있다는 것은 말할 필요도 없다.
특정 기타 실시양태에서, 혈액 혈장의 분획화 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 친화도 리간드가 Ig 에 특이적으로 결합하는 앱타머인 친화도 크로마토그래피의 단계에 혈액 혈장 또는 후자의 유도체를 적용하는 단계, 및
- 친화도 리간드가 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 앱타머인 친화도 크로마토그래피의 단계에 Ig 이 실질적으로 없는 비-유지 분획을 적용하는 단계.
상기 단계가 각각 친화도 지지체 상에 유지된 Ig 및 피브리노겐의 회수를 포함할 수 있다는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명의 방법에서, 출발 조성물은 혈액 혈장 또는 후자의 유도체일 수 있다. 혈액 혈장의 유도체는, 그에 제한되는 것은 아니나, 정화된 혈액 혈장, 지질-고갈된 혈액 혈장, 혈액 혈장의 저온침전물, 혈액 혈장의 저온침전물의 상청액, 혈장 분획, 및 유사한 것을 망라한다. 특정 실시양태에서, 출발 조성물은 미가공 혈액 혈장이다.
바람직하게는, 동형 G 의 면역글로불린이 회수된다. 동형 G 의 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 를 망라한다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린에게로 향해지는 앱타머는, IgG 의 하위범주에 독립적으로, IgG 에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG 의 하위범주 전부를 회수하기 위해 여러 유형의 항-IgG 앱타머가 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 분획화 방법에서 회수되는 IgG 의 분획은 출발 혈액 혈장의 하위범주의 분포와 근사한 하위범주의 분포를 가지며, 즉, 그것은 50% 내지 70% 의 IgG1, 25% 내지 35% 의 IgG2, 2% 내지 8% 의 IgG3 및 1% 내지 8% 의 IgG4 를 포하한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 혈액 혈장의 분획화 방법은 하나 또는 여러 개의 부가적 단계, 특히 (c) 알부민의 정제 단계를 포함한다.
정제된 알부민은 임의의 종래의 방법 예컨대 크로마토그래피 예를 들어 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 에탄올을 이용하는 침전에 뒤이은 여과에 의해 회수될 수 있다.
예를 들어, 단계 (c) 는 친화도 리간드가 알부민에 특이적으로 결합하는 앱타머인 친화도 크로마토그래피의 단계일 수 있다.
단계 (c) 가 존재할 때, 단계 (a), (b) 및 (c) 는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 (c) 는 단계 (a) 로부터 수득된 또는 단계 (b) 의 비-유지 분획에 대해 수행된다.
본 발명의 방법의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 수행하기 위해 임의의 유형의 크로마토그래피 기술, 예컨대 불연속 크로마토그래피, 모사 이동층 크로마토그래피 (SMB) 가 사용될 수 있다. 바람직한 크로마토그래피 기술은 여러 칼럼의 사용을 포함하는 것 예컨대 모사 이동층 크로마토그래피 SMB 이다.
혈액 혈장의 분획화 방법은, 그에 제한되는 것은 아니나, 항-A 및/또는 항-B 항체를 제거하기 위한 크로마토그래피의 단계, 한외여과, 접선 한외여과, 나노여과, 역삼투, 정화, 바이러스 불활성화의 단계, 바이러스 제거의 단계, 멸균, 폴리싱 (polishing) 단계 예컨대 제형화, 또는 냉동건조 또는 또는 후자의 조합을 포함하는 하나 또는 여러 개의 부가적 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 크로마토그래피 칼럼의 오염을 방지 및/또는 제거하는 목적의 하나 또는 여러 개의 부가적 단계 예컨대 알칼리성 용액, 예를 들어 소듐 히드록시드의 용액을 이용하는 위생 처리를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 정제된 피브리노겐 조성물의 제조 방법에 의해 또는 본 발명에 따른 혈액 혈장의 분획화 방법에 의해 수득될 수 있는 또는 수득된 정제된 피브리노겐 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 조성물에 존재하는 단백질의 총 중량에 대해 적어도 90 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 99 중량%, 99.1 중량%, 99.2 중량%, 99.3 중량%, 99.4 중량%, 99.5 중량%, 99.5 중량%, 99.6 중량%, 99.7 중량%, 99.8% 또는 99.9 중량% 로 포함되는 정제된 피브리노겐 조성물이다. 특정 실시양태에서, 정제된 피브리노겐의 조성물은 인간 혈장 피브리노겐, 예를 들어 인간 혈장으로부터 수득된 피브리노겐을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 상기 조성물은 최대 10 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 9 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 5 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량%, 1 중량%, 0.9 중량%, 0.8 중량%, 0.7 중량%, 0.6 중량%, 0.5 중량%, 0.4 중량%, 0.3 중량%, 0.2 중량% 또는 0.1 중량% 의, 특히 기타 인간 응고 인자로부터의, 기타 혈장 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물에는 인간 피브리노겐 이외의 인간 응고 인자가 실질적으로 없다. 특정 부가적 또는 대안적 실시양태에서, 상기 조성물에는 인자 XIII 이 없다.
특정 실시양태에서, 정제된 피브리노겐의 조성물은 인간 재조합 피브리노겐, 예를 들어 재조합 숙주 예컨대 재조합 세포 또는 트랜스제닉 동물에 의해 생산된 인간 피브리노겐을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 상기 조성물은 최대 10 중량%, 더욱 바람직하게는 최대 9 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 5 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량%, 1 중량%, 0.9 중량%, 0.8 중량%, 0.7 중량%, 0.6 중량%, 0.5 중량%, 0.4 중량%, 0.3 중량%, 0.2 중량% 또는 0.1 중량% 의 기타 단백질, 특히 재조합 숙주에서 비롯된 기타 비-인간 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물에는 비-인간 단백질이 실질적으로 없다. 특정 부가적 또는 대안적 실시양태에서, 상기 조성물에는 재조합 숙주에서 발견될 수 있는 피브리노겐의 임의의 비-인간 등가물이 없다.
본 발명은 또한 하나 또는 여러 개의 약학적으로 허용가능한 부형제와의 조합으로 인간 피브리노겐 예컨대 위에서 정의된 바와 같은 재조합 인간 피브리노겐 또는 인간 혈장 피브리노겐의 정제된 조성물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물, 뿐만 아니라 본 발명에 따른 피브리노겐의 정제된 액체 조성물은, 응고 장애의 치료에서, 특히 피브리노겐 후천성 또는 선천성 결핍증 (저-, 이상- 또는 무-피브리노겐혈증) 의 치료에서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 급성 외상후 또는 수술후 출혈의 관리에서 또는 급성 신부전에서 초래되는 피브리노겐 결핍증의 관리에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 앱타머의 수득 방법
출원인은 인간 피브리노겐에게로 향하는 앱타머를 동정하기 위해서 선행 기술에 기재된 여러 SELEX 전략을 수행했다. 이들 전략 중 어느 것도 성공적이지 않았고, 표준 SELEX 는 오염물에게로 향하는 앱타머의 동정을 초래했으며, 이는 피브리노겐의 정제된 조성물의 1% 미만이 그것을 수행하기 위해 사용되는 이유를 설명한다.
이러한 맥락에서, 출원인은 "SELEX-저항성" 단백질 예컨대 피브리노겐에게로 향하는 앱타머를 수득하는 신규한 방법을 개발하기 위해서 심도 있는 연구를 수행했다.
출원인은 "SELEX-저항성" 단백질에 대해 강한 결합 친화도를 갖고, 정제 방법에서 친화도 리간드로서 사용될 수 있는 앱타머를 수득하는 것을 가능하게 하는 신규한 SELEX 방법을 디자인했다. 이러한 신규한 SELEX 방법은 목표 단백질의 표면 상의 "양성 패치" 의 생성에 적합한 pH 조건에서 수행되는 선별 단계를 특징으로 한다. 다른 면에서, 출원인에 의해 디자인된 방법은 단백질의 표재 도메인보다 양 전하를 선호하는 것에 의하는 잠재적 앱타머와 목표 단백질 사이의 국소적 상호작용의 강화에 기반한다. 이러한 방법은 하나 또는 여러 개의 표재 히스티딘을 갖는 단백질, 예컨대 피브리노겐에 대해 수행될 수 있다. 선별 단계 (즉 목표 단백질이 핵산의 후보 혼합물과 접촉되는 단계) 의 pH 는 목표 단백질의 적어도 하나의 표재 히스티딘의 양성자첨가를 선호하게 하는 방식으로 선택되어야 한다. 피브리노겐의 경우에, 출원인은 선별 단계에 적합한 pH 가 약산성 pH 라는 것을 밝혔다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 앱타머의 수득 방법은, 하기 단계를 포함한다:
a) pH 7.0 미만, 더욱 바람직하게는 5.8 내지 6.8 에서 피브리노겐을 핵산의 후보 혼합물과 접촉시키는 단계,
b) 피브리노겐에 결합하는 핵산을 회수하는 한편, 비-결합 핵산을 제거하는 단계,
c) 피브리노겐에 대해 증가된 친화도를 갖는 핵산의 후보 혼합물을 생산하기 위해서 단계 (b) 에서 수득된 핵산을 증폭시키는 단계, 및
d) 피브리노겐에게로 향해지는 하나 또는 여러 개의 앱타머가 수득될 때까지 단계 (a), (b), (c) 를 반복하는 단계.
단계 (a) 에서, 핵산의 후보 혼합물은 일반적으로 화학적으로-합성된 통계적 핵산의 혼합물이다. 후보 혼합물은 108 내지 1018 개, 전형적으로 약 1015 개의 핵산을 포함할 수 있다. 후보 혼합물은 DNA 의 핵산의 혼합물 또는 RNA 의 핵산의 혼합물일 수 있다. 특정 실시양태에서, 후보 혼합물은 다수의 단일 가닥 DNA (ssDNA) 로 구성되며, 여기에서 각각의 ssDNA 는 PCR 을 통한 증폭을 위한 프라이머의 역할을 수행하는 약 15 내지 40 개 뉴클레오티드의 특이적 서열이 측면에 있는 약 20 내지 100 개 뉴클레오티드의 중심 통계적 서열을 포함한다. 특정 기타 실시양태에서, 후보 혼합물은 다수의 RNA 의 핵산으로 구성되며, 여기에서 각각의 RNA 는 RT-PCR 에 의한 증폭을 위한 약 15 내지 40 개 뉴클레오티드의 프라이머 서열이 측면에 있는 약 20 내지 100 개 뉴클레오티드의 중심 통계적 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산의 후보 혼합물은 비-개질된 핵산으로 구성되며, 이는 핵산이 오직 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드만을 포함한다는 것을 의미한다. 특정 기타 실시양태에서, 후보 혼합물은 화학적으로-개질된 핵산을 포함할 수 있다. 다른 면에서, 핵산은 하나 또는 여러 개의 화학적으로 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 후보 혼합물은 단일 가닥 DNA 로 구성된다.
단계 a) 는 피브리노겐에 대해 친화도를 갖는 핵산에 대한 상기 피브리노겐의 결합을 선호하는 조건에서 수행된다. 바람직하게는, 단계 a) 의 pH 는 6.0 내지 6.6, 예컨대 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 및 6.5 이다. 단계 a) 에 적합한 pH 는, 예를 들어, 6.3 ± 0.1 이다. 이러한 pH 는 피브리노겐의 적어도 하나의 표재 히스티딘을 양성자첨가하는 것을 가능하게 한다. 단계 (a) 는 완충되는 수성 용액에서 수행될 수 있다. 완충제는 요망되는 pH 를 달성하는 것을 가능하게 해주고 목표 단백질 및 핵산의 혼합물과 양립성인 임의의 완충제로부터 선택될 수 있다. 완충제는, 그에 제한되는 것은 아니나, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), HEPES, Bis-Tris, 시트레이트 및 아세테이트로부터 선택될 수 있다. 완충제는 약 5 mM 내지 1 M, 예를 들어 10 mM 내지 500 mM, 예를 들어 10 mM 내지 200 mM, 예컨대 약 50 mM 의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 안정적인 피브리노겐을 포함하는 액체 조성물은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 수득된다:
- 혈액 혈장 저온상청액 분획을 수득하는 단계,
- 피브리노겐-강화 분획을 수득하기 위한 8% 에탄올에 의한 저온상청액의 침전 단계,
- 바람직하게는 항체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 화학적 리간드 예컨대 펩티드, 펩티드 모방체, 펩토이드, 나노피틴스 또는 올리고뉴클레오티드 리간드 예컨대 앱타머로부터 선택되는 친화도 리간드를 사용하여 친화도 겔 크로마토그래피에 의해 분리에 의해 재현탁 후에 혈액 혈장의 피브리노겐-강화 분획의 정제,
- 피브리노겐을 포함하는 정제된 흡착된 분획의 회수,
- 가능하게는, 약학적으로 허용가능한 부형제, 바람직하게는 아르기닌 및/또는 시트레이트의 첨가.
특정 실시양태에서, 방법은 4℃ 에서 적어도 3 개월 동안의 저장 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 사용되는 친화도 크로마토그래피는 라마 항체에서 유래하는 리간드 유형 모이어티가 있는 친화도 매트릭스 예컨대 피브리노겐 CaptureSelect 매트릭스 (Life Technologies) 이다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 조성물에는 프로테아제 및/또는 피브린용해의 활성화제가 없다.
"프로테아제 및/또는 피브린용해의 활성화제가 없는 피브리노겐 조성물" 은 피브리노겐 조성물이 프로테아제 및/또는 피브린용해의 활성화제의 잔류 양이 하기와 같이 되게 하는 방식으로 프로테아제 예컨대 트롬빈, 프로트롬빈, 플라스민, 플라스미노겐의 제거를 허용하는 하나 또는 여러 개의 단계에 적용되었다는 것을 의미한다고 이해된다:
- 크로마토그래피의 단계 전에 예비-정제된 피브리노겐 용액과 비교할 때 매우 많이 감소됨, 및/또는
- 영 (zero), 및/또는
- 통상의 기술자에 의해 통상적으로 사용되는 방법의 검출 역치 미만.
유리하게는, 잔류 프로트롬빈의 비율은 5 μUI / mg (피브리노겐의 mg) 미만이고, 플라스미노겐의 비율은 15 ng / mg (피브리노겐의 mg) 미만이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물에는 그러므로 프로테아제 예컨대 트롬빈 및/또는 플라스민 또는 그들의 상응하는 프로트롬빈 전구-효소 (응고의 인자 II) 및/또는 잠재적으로 활성화될 수 있는 치모겐인 플라스미노겐이 없다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 피브리노겐 조성물에는 프로테아제의 저해제 및/또는 항-피브린용해제가 없다.
용어 "프로테아제의 저해제 및/또는 항-피브린용해제" 는 항프로테아제 활성을 갖는 임의의 분자, 특히 세린 프로테아제의 저해 및/또는 항-피브린용해 활성을 갖는 임의의 분자, 특히 트롬빈의 저해 활성을 갖는 임의의 분자 및/또는 항-플라스민, 특히 히루딘, 벤즈아미딘, 아프로티닌, 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF), 펩스타틴, 류펩틴, 헤파린과 관련된 또는 관련되지 않는 항트롬빈 III, 알파 2 마크로글로불린, 알파 1 항트립신, 헥산 또는 엡실론 아미노카프로산, 트라넥사민산, 알파 2 항플라스민을 의미한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 피브리노겐 조성물에는 히루딘 및/또는 벤즈아미딘 및/또는 아프로티닌 및/또는 PMSF 및/또는 펩스타틴 및/또는 류펩틴 및/또는 헤파린과 관련된 또는 관련되지 않는 항트롬빈 III 및/또는 알파 2 마크로글로불린 및/또는 알파 1 항트립신 및/또는 헥산산 및/또는 엡실론 아미노카프로산 및/또는 트라넥사민산 및/또는 알파 2 항플라스민이 없다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 피브리노겐 조성물에는 금속 이온이 없다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물에는 유리하게는 칼슘이 없다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 피브리노겐 조성물에는 이소류신, 글라이신 및/또는 NaCl 이 없다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 피브리노겐 조성물에는 알부민이 없다.
유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 70% 이상, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 순도를 갖는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 다른 동시-정제된 단백질, 유리하게는 FXIII 및/또는 피브로넥틴을 함유하지 않는다.
본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 피브리노겐 조성물은 또한, 가능하게는 동시-정제된, 하나 또는 여러 개의 동반 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게는 FXIII 을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은, 정제 직후에, 액체 형태의 약학적 형태의 생산 단계에 적용된다: 제형화, 멸균 여과 및 용기 (병 또는 저장/투여를 위한 기타 장치) 내로의 분배.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 동결-건조, 데시케이션, 탈수 또는 건조의 어떠한 단계에도 적용되지 않는다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 그러므로 냉동건조물의 재구성의 단계에 적용된 적이 없는 액체 형태이다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 액체 형태이고, 그러므로, 가능한 약학적으로 허용가능한 부형제에 더하여, 물을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 액체 형태의 조성물은 시트레이트 및/또는 아르기닌, 더욱 바람직하게는 300 mM 미만의 아르기닌을 포함한다.
유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 정맥내 투여에 특히 적합하다.
본 발명의 또다른 양상은 치료법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 위에서 언급된 기술적 특성의 전부가 여기에 적용된다.
하기 실시예는 본 발명의 실시양태를 보여주지만 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 안정적 액체 피브리노겐의 조성물
물질 & 방법
혈장 분획
출발 물질은 먼저 저온침전 단계에 적용된 후 8% 에탄올을 사용하는 침전 단계에 적용된 인간 혈장의 푸울 (pool) 이다.
그에 따라 수득된 예비-정제된 혈장 피브리노겐 용액을 pH 및 전도성에서 예비-밸런싱된 (pre-balanced) 크로마토그래피 칼럼 상에 주입 전에 겔의 평형화 완충제 2 부피로 희석한다.
혈장 분획의 특성: 4.7-4.8 g/L 로 희석을 통해 조정된 항원 피브리노겐.
완충액
크로마토그래피 방법의 다양한 단계 동안 사용된 완충액의 조성이 아래 표 1 에 요약되어 있다.
표 1: 친화도 크로마토그래피를 위한 완충액.
Figure pct00001
친화도 크로마토그래피 겔
크로마토그래피를 위해, 항-피브리노겐 라마 항체의 단편으로 구성되는 친화도 리간드를 갖는 친화도 겔 CaptureSelect 피브리노겐 (Life Technologies 레퍼런스 191291050, 로트 171013-01 및 171013-05) 을 사용한다.
칼럼
직경 50 mm, 겔-패킹된 부피 67 ml; 칼럼 높이 3.4 cm 의 칼럼 (레퍼런스 XK 50/30 GE Healthcare) 을 사용했다.
친화도에 의한 정제
약 5 g/L 로 조정된 피브리노겐의 용액을 밸런싱된 친화도 칼럼 CaptureSelect 피브리노겐 상에 임의의 기타 조정 없이 주입한다. 약 10 g/L 의 로드 (load) 를 적용했다.
크로마토그래피 용출액을 그 후 한외여과하고, 컷 오프 역치 막 100 kDa (레퍼런스 Pall Omega OS100C10) 상에서 예비제형화했다.
방법의 마지막에, 수득된 산물은 응고성 피브리노겐 농도 15.2 g/L 및 항원 피브리노겐 농도 15.2 mg/ml 를 갖는다.
실시예 2: 액체 피브리노겐의 조성물의 안정성
피브리노겐의 조성물
실시예 1 에 기재된 방법에 따라 수득된 피브리노겐 조성물을 pH 7.0 에서 적어도 아르기닌 100 mM 및 시트레이트 8.5 mM 와 함께 제형화한다.
피브리노겐 조성물의 안정성
조성물을 안정하게, 공기 하에 (외기에), 교반 없이, +5℃ 의 냉장실에 둔다.
안정성 시험 전에 (T0) 및 안정성 시험의 시작 후 상이한 시점: 2 개월 (T2M) 및 3 개월 (T3M) 에 샘플을 취한다.
5℃ 에서 안정성 시험의 결과
이러한 안정성 시험의 결과가 아래 표에 제시되어 있다.
Figure pct00002
안정성 시험의 시작 후 2 개월 및 3 개월에 수득된 결과는 하기를 보여준다:
- 환원 조건에서의 SDS PAGE 의 결과는 시간의 흐름에 따라 안정적으로 유지되는 알파, 베타 및 감마 사슬의 프로파일의 적은 변화를 보여주며, 이는 액체 피브리노겐의 전부의 유지를 확인시켜 준다;
- 응고성 피브리노겐/항원 피브리노겐 비는 1 에서 유지되고 안정적이며, 이는 액체 피브리노겐의 기능성의 전부의 유지를 확인시켜 준다.
이 시험의 결과는 피브리노겐 조성물이 3 개월 동안 5℃ 에서 액체 형태에서 안정적이라는 것을 분명히 보여준다.
실시예 3: 본 발명에 따라 사용되는 항-피브리노겐 앱타머의 동정
1. 장비 및 방법
올리고뉴클레오티드 뱅크 (bank)
SELEX 방법을 수행하는데 사용된 ssDNA 뱅크는 18 개 염기의 불변 프라이머 영역 2 개가 측면에 있는 40 개 염기의 무작위 영역으로 구성된다.
피브리노겐
표적 단백질은 인간 피브리노겐이다. 인간 피브리노겐의 다양한 공급원을 SELEX 방법 동안 사용했다:
인간 피브리노겐: 인간 피브리노겐의 2 개의 제제를 사용했고, 각각 95% 및 99.9% 의 순도를 갖는 인간 혈장을 사용하여 정제된 조성물의 형태로 제조했다.
트랜스제닉 피브리노겐: 트랜스제닉 피브리노겐을 순도 97% 이하의 트랜스제닉 우유를 사용하여 정제했다.
SELEX 프로토콜
피브리노겐 (시험 1 내지 3 에서 97% 의 순수한 트랜스제닉 피브리노겐 및 시험 4 및 5 에서 95% 의 순수한 혈장 피브리노겐 및 시험 6 내지 8 에서 99.9% 의 순수한 혈장 피브리노겐) 을 친화도 수지 상에 부동화시켰고, 한편 수지 상에 부동화된 표적의 양은 시험 1 에서 시험 8 로 연속적으로 감소했다 (참고, 도 8).
부동화된 표적을 감소하는 인큐베이션 시간 동안 선별 완충제 (MOPS 50 mM, pH 6.30, NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM) 를 사용하여 감소하는 농도의 ssDNA 의 뱅크/푸울과 함께 인큐베이션했다 (참고, 도 8 의 표).
피브리노겐/ssDNA 을 함유하는 수지를 회수하고, 시험 1 및 2 동안 선별 완충제 및 시험 3 내지 8 동안 MOPS 50 mM, pH 6.30, NaCl 500 mM, MgCl2 5 mM 을 함유하는 세정 완충제로 세정했다 (참고, 상기 표). 세정 후에, 결합된 ssDNA 를 용출 완충제 (Tris-HCl 50 mM, pH 7.40, EDTA 200 mM) 를 사용하여 용출시켰다. 각각의 시험 (제 1 시험은 제외) 전에, 항-지지체 앱타머의 농축을 방지하도록 모든 ssDNA 와 친화도 수지의 인큐베이션에 의해 역선별 단계를 수행했다. SELEX 프로토콜의 파라미터가 도 8 에 기재되어 있다.
SPR 에 의한 앱타머의 결합 친화도의 확인
선택된 앱타머를 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 트리에틸렌 글리콜의 스페이서 및 비오틴으로 합성했다. 앱타머의 1 μM 용액을 SELEX 선별 완충제를 사용하여 제조했다. 앱타머 용액을 5 분 동안 90 ℃ 로 가열하고, 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션하고, 10 분 동안 주위 온도에서 밸런싱했다. 제제를 Biocore T200 기구 (GE Healthcare) 로부터의 스트렙타비딘 SA 로 코팅된 센서 칩 내에 10 μl/ml 의 유속으로 7 분 동안 주입했다. 그 후, 다양한 농도의 표적을 부동화된 앱타머 상에 30 μl/분 의 속도로 1 분 동안 주입했다. 1-2 분 동안 해리 후에, 세정 단계를 30 μl/분 의 속도로 1 분 동안 적합한 세정 완충제의 주입을 통해 수행했다. 용출을 위해, 적합한 용출 완충제를 30 μl/분 의 속도로 1-2 분 동안 주입했다. 마지막으로, 센서 칩을 30 μl/분 의 속도로 30 초 동안 NaOH 50 mM 의 주입을 통해 재생시켰다. 실험 동안, 응답 신호를 센소그램에 기록했다.
2. 결과
SELEX 방법은 67 개 항-피브리노겐 앱타머 후보, 특히 인간 혈장 및 트랜스제닉 피브리노겐에 대해 둘 모두 강한 친화도를 갖는 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60 및 65 의 앱타머를 동정하는 것을 가능하게 했다.
이들 앱타머는 인간 피브리노겐에 pH-의존적 방식으로 결합한다. SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 58 의 앱타머의 기본 서열 (즉 피브리노겐에 결합하는 최소 서열) 을 확인했다. SEQ ID NO 66 의 앱타머는 SEQ ID NO 1 의 앱타머의 기본 서열에 해당한다. SEQ ID NO 67 의 앱타머는 SEQ ID NO 58 의 앱타머의 기본 서열에 해당한다. 도 3A-3D 는 SPR 에 의한 SEQ ID NO 1 및 NO: 58 의 앱타머의 기본 서열에 관해 수득된 결합 프로파일을 보여준다. SEQ ID NO 66 및 67 의 앱타머는, 피브리노겐의 농도가 증가할 때의 신호 증가에 의해 보여지는 바와 같은, 투여량-의존적 방식으로 pH 6.3 에서 트랜스제닉 피브리노겐 및 혈장 피브리노겐에 특이적으로 결합할 수 있다. 앱타머와 피브리노겐 사이의 복합체는 NaCl 의 농도 증가에 의해 유의하게 해리되지 않았다. 다른 한편으로는, pH 7.4 의 완충제의 주입은 앱타머와 피브리노겐 사이의 복합체를 해리시켜, 피브리노겐이 용출되는 것을 가능하게 했다 (도 3A-3D).
실제로, 본 발명의 방법에 의해 수득된 앱타머는 피브리노겐에 pH-의존적 방식으로 결합한다. 이러한 결과는 각각 SEQ ID NO 66 및 SEQ ID NO 67 의 앱타머에 관한 도 4A 및 4B 에서 보여진다. pH 가 증가할 때 피브리노겐의 결합 수준은 감소한다. pH 6.3 에서 최고 결합이 관찰되었다. pH 6.8 초과에서 앱타머는 피브리노겐에 결합되지 않는다.
실시예 4: 동정된 앱타머를 위한 친화도 지지체의 제조
1. 장비 및 방법
- 친화도 지지체
2 개의 친화도 지지체를 NHS-활성화된 세파로오스 (GE Healthcare) 상의 앱타머의 그래프팅에 의해 제조했다. 제 1 친화도 지지체 (친화도 지지체 No. 1) 를 그것의 5' 말단에 아미노 말단 기 및 그것의 3' 말단에 역방위 데옥시-티미딘을 갖는 C6 의 스페이서를 포함하는 SEQ ID NO 66 의 앱타머 (앱타머 A5-1.9) 의 그래프팅에 의해 제조했다. 제 2 친화도 지지체 (친화도 지지체 No. 2) 를 그것의 5' 말단에 아미노 말단 기 및 그것의 3' 말단에 역방위 데옥시-티미딘을 갖는 C6 의 스페이서를 포함하는 SEQ ID NO 67 의 앱타머 (앱타머 A5-2.9) 의 그래프팅에 의해 제조했다.
칼럼에 배치된 1 부피의 NHS-활성화된 세파로오스 겔을 적어도 10 부피의 차가운 HCl 0.1 M 의 용액으로 헹구고, 그 후 적어도 8 부피의 차가운 아세테이트 100 mM, pH 4.0 의 용액으로 밸런싱한다.
2000 g 에서 3 분 동안 원심분리 후에, 상청액을 분리하고, 배출된 겔을 아세테이트 100 mM pH 4.0 의 용액 중 2 부피의 앱타머에 재현탁시킨다. 이러한 현탁액을 2 시간 동안 주위 온도에서 교반 하에 인큐베이션한다.
그 후, 1 부피의 보레이트 200 mM pH 9 를 첨가하고, 이러한 현탁액을 주위 온도에서 교반 하에 2 시간 30 분 동안 인큐베이션한다.
2000 g 에서 3 분 동안 원심분리 후에, 상청액을 분리한다. 배출된 겔을 2 부피의 Tris-HCl 0.1 M pH 8.5 의 용액에 재현탁시킨다. 현탁액을 +4 ℃ 에서 교반 하에 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 및 2000 g 에서 3 분 동안 원심분리 후에, 상청액을 분리한다. 겔을 대안적으로 2 부피의 소듐 아세테이트 0.1 M + NaCl 0.5% pH 4.2 및 2 부피의 Tris-HCl 0.1 M pH 8.5 의 용액으로 세정한다. 이러한 세정 주기를 1 회 반복한다.
2000 g 에서 3 분 동안 원심분리 후에, 상청액을 분리한다. 배출된 겔을 2 부피의 밸런싱 완충제에 재현탁시킨다.
Figure pct00003
실시예 5: 실시예 4 의 친화도 지지체 상에서 반-정제된 피브리노겐의 용액을 사용하는 피브리노겐의 정제
1. 물질 및 방법
- 친화도 크로마토그래피 조건
친화도 지지체 no. 1: 인간 혈장을 사용하여 수득된 해동된 반-정제된 피브리노겐 (IP1: 피브리노겐 중간 산물 1) 의 용액을 결합 완충제 중에 10 배 희석하고, pH 를 6.3 으로 조정했다. 희석된 IP1 을 지지체 no. 1 상에서의 크로마토그래피 단계에 적용했다. 한외여과 단계를 위한 충분한 양의 피브리노겐을 수득하기 위해서 이러한 단계를 1 회 반복했다.
친화도 지지체 no. 2: 인간 혈장을 사용하여 수득된 해동된 반-정제된 피브리노겐 (IP1: 피브리노겐 중간 산물 1) 의 용액을 결합 완충제 중에 10 배 희석하고, pH 를 6.3 으로 조정했다. 희석된 IP1 을 지지체 no. 2 상에서의 크로마토그래피 단계에 적용했다. 한외여과 단계를 위한 충분한 양의 피브리노겐을 수득하기 위해서 이러한 단계를 1 회 반복했다.
친화도 크로마토그래피의 조건이 각각의 친화도 지지체에 관해 요약되어 있다:
Figure pct00004
각각의 친화도 지지체의 경우에, 완충제의 조성의 변화에 의해 적당한 조건에서 피브리노겐을 용출했다. 친화도 지지체 no. 1 및 no. 2 상에서의 2 가지 크로마토그래피의 경우에, 2 개의 용출액 분획이 생성되었고, 한외여과 단계를 위해 함께 그룹화되었다.
- 한외여과의 조건
각각의 친화도 지지체의 경우에, 한 세트의 용출액 분획을 100 kDa 에서의 한외여과에 적용하여 피브리노겐을 농축하고, 그것을 pH 7.4 에서 20 g/L 의 비율에서 소듐 시트레이트 10 mM, 아르기닌 중에 제형화했다.
- 분석 방법
Figure pct00005
2. 결과
결과가 도 7A-7B 및 7C-7D 에 제시되어 있다. 도 7A 및 7B 는 각각 친화도 지지체 no. 1 및 no. 2 상에서 피브리노겐의 반-정제된 용액을 사용하는 피브리노겐의 정제에 관해 수득된 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. pH 를 7.4 로 증가시키고 친화도 지지체 no. 2 의 경우에는 MgCl2 를 첨가하고 친화도 지지체 no. 1 의 경우에는 Mg2+ 를 제거하여 피브리노겐을 용출시켰다. 크로마토그래피에 의해 수득된 분획의 전기영동에 의한 분석 (도 7C 및 7D) 은 로딩된 물질 (IP1) 에 존재하는 오염물이 현저히 제거되어, 사실상 단독으로 피브리노겐이 용출액에서 가시적인 것을 보여줬다. 또한, 환원 조건은 용출액 중의 피브리노겐이 가시적 변성이 없는 천연 형태라는 것을 보여준다 (Aα1 은 밴드 Aα 중에서 가장 큰 밴드이다).
수득된 피브리노겐의 산출량 및 농도가 아래 표에 요약되어 있다:
Figure pct00006
활성 피브리노겐은 응고성 피브리노겐과 항원 피브리노겐 사이의 비가 1 에 가까운 것에 의해 보여진다. 2 가지 친화도 지지체로 제조된 농축되고 제형화된 피브리노겐의 분석이 아래 표에 상세히 기재되어 있다:
Figure pct00007
두 가지 정제된 피브리노겐의 경우에, 응고 및 항원 피브리노겐 사이의 비는 두 가지 앱타머에 관해 약 1.0 이었다. 적당한 크로마토그래피 조건은 유지된 활성을 갖는 정제된 피브리노겐의 제조를 허용한다.
아래 표는 출발 물질 중에서 및 본 발명의 친화도 지지체로 수득된 피브리노겐의 정제된 분획 중에서의 오염물 단백질의 적정을 보여준다:
Figure pct00008
출발 물질의 65% 내지 99% 범위의 제거율로 오염물 단백질의 양호한 제거가 달성된다.
크로마토그래피 조건은 피브리노겐의 안정성의 관점에서 가장 문제가 많은 오염물 중 하나인 초기 플라스미노겐의 99.5% 초과의 제거율을 허용했다.
SELEX 에 의해 동정된 앱타머는 크로마토그래피에 의한 피브리노겐의 정제에서 친화도 리간드로서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 앱타머는 선별적 결합 및 그 후 적당한 비-변성 조건에서 피브리노겐의 용출을 허용한다는 점에 유의해야 한다.
실시예 6: 혈장을 사용하는 크로마토그래피에 의한 피브리노겐의 정제
친화도 지지체 No. 1: 혈장을 해동하고, 0.45 μm 에서 여과하고, 결합 완충제로 10 배 희석하고, 그 후 pH 를 6.3 으로 조정했다. 희석된 용액을 지지체 No. 1 상에서의 크로마토그래피 단계에 적용했다.
친화도 지지체 No. 2: 혈장을 해동하고, 0.45 μm 에서 여과하고, 결합 완충제로 10 배 희석하고, 그 후 pH 를 6.3 으로 조정했다. 희석된 용액을 지지체 No. 2 상에서의 크로마토그래피 단계에 적용했다.
친화도의 조건이 아래 표에서 각각의 친화도 지지체에 관해 요약되어 있다:
Figure pct00009
각각의 친화도 지지체의 경우에, 완충제의 조성의 변화에 의해 적당한 조건에서 피브리노겐을 용출시켰다.
2. 결과
결과가 도 5A-5B 및 6A-6B 에 제시되어 있다. 도 5A 및 6A 는 각각 친화도 지지체 No. 1 및 No. 2 상에서 혈장을 사용하는 피브리노겐의 정제에 관해 수득된 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. 대부분의 오염물 단백질은 정지상에서 유지되지 않았으며, 한편 피브리노겐은 지지체에 결합된다는 점에 주목해야 한다. pH 를 7.4 로 증가시키고 친화도 지지체 No. 2 의 경우에는 MgCl2 2 M 를 첨가하고 친화도 지지체 No. 1 의 경우에는 Mg2+ 를 제거하여 피브리노겐을 용출시켰다. 크로마토그래피에 의해 수득된 분획의 전기영동에 의한 분석 (도 5B 및 도 6B) 은 피브리노겐이 주로 용출 분획에 존재했으며, 한편 오염물 단백질은 비-유지 분획, 세정 분획 또는 재생 분획에 존재했다는 것을 보여줬다. 실제로, 용출 분획은 단일 밴드의 형태로 이동했다. 용출액 피브리노겐의 분획의 상대 순도 (SDS PAGE 에 의해 확인됨) 는 95% 초과였다.
이들 결과는 본 발명에 따라 사용되는 앱타머가 복합 출발 조성물을 사용하는 피브리노겐의 정제에서 친화도 리간드로서 사용하기에 특히 적합하다는 것을 보여준다.
실시예 7: SEQ ID NO: 66 의 기본 서열의 최적화
1. 물질 및 방법
- SEQ ID NO: 66 의 변이체의 제조:
제 1 시험에서, 변이체 당 2 개의 연속적 뉴클레오티드 (1/2, 3/4, 5/6 등) 의 시스템적 제거에 의해 28 가지 변이체를 디자인했다. 하기 시험에서, 친화도의 상실을 초래하지 않은 결실의 조합이 조합되었다.
- 경쟁적 결합 시험
디자인된 변이체의 친화도를 부모 앱타머의 친화도와 비교하기 위해서, 병행 시험을 수행했다. 첫째로, SEQ ID NO 66 의 앱타머의 1 μM 용액을 결합 완충제를 사용하여 제조했다. 앱타머 용액을 5 분 동안 90 ℃ 로 가열하고, 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션하고, 10 분 동안 주위 온도에서 밸런싱했다. 제제를를 Biacore T200 기구 (GE Healthcare) 로부터의 스트렙타비딘 SA 으로 코팅된 센서 칩 내에 10 μl/분 의 비율에서 7 분 동안 주입했다. 그 후, 변이체 (2 μM) 및 인간 혈장 피브리노겐 (0.4 μM) 을 함유하는 혼합물을 부동화된 앱타머 상에 30 μl/분 의 속도에서 1 분 동안 주입했다. 다양한 단편/피브리노겐 혼합물에 관해 수득된 응답을 비교했다.
2. 결과
도 9 에서 보여지는 바와 같이, SEQ ID NO: 80-93 의 서열의 변이체는 결합 신호의 유의한 저해를 갖고, 따라서 그들은 피브리노겐에 대해 상당한 친화도를 갖는다. 각각 위치 01/02 에서, 위치 01/02/19/20/21 에서, 위치 01/02/14/15/16/20/21/22 에서, 위치 01/02/18/19/20/21 에서, 위치 01/02/18/19/20 에서, 위치 01/02/15/16/20/21 에서, 및 위치 01/02/19/20 에서 결실을 함유하는 SEQ ID NO: 80-87 의 변이체에 관해 최고 친화도가 관찰되었다.
실시예 8: 액체 피브리노겐의 조성물의 안정성
피브리노겐의 조성물
피브리노겐 조성물을 앱타머 A5-1.9 (SEQ ID NO 66) 를 구현하는 크로마토그래피 지지체 no. 1 을 사용하여 수득하고, pH 7.0 에서 적어도 아르기닌 100 mM 및 시트레이트 8.5 mM 과 함께 제형화했다.
피브리노겐 조성물의 안정성
조성물을 안정하게, 공기 하에 (외기에), 교반 없이, +5℃ 의 냉장실에 둔다.
안정성 시험 전에 (T0) 및 안정성 시험의 시작 후 1 개월 (T1M) 에 샘플을 취한다.
5℃ 에서 안정성 시험의 결과
이러한 안정성 시험의 결과가 아래 표에 제시되어 있다.
Figure pct00010
안정성 시험 1 개월 후의 결과는 하기를 보여준다:
- 환원 조건에서의 SDS PAGE 의 결과는 시간의 흐름에 따라 안정적으로 유지되는 알파, 베타 및 감마 사슬의 프로파일의 적은 변화를 보여주며, 이는 액체 피브리노겐의 전부의 유지를 확인시켜 준다;
- 응고성 피브리노겐/항원 피브리노겐 비는 1 에서 유지되고 안정적이며, 이는 액체 피브리노겐의 기능성의 전부의 유지를 확인시켜 준다.
이 시험의 결과는 피브리노겐 조성물이 1 개월 동안 5℃ 에서 액체 형태에서 안정적이라는 것을 분명히 보여준다.
서열의 표
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES <120> FIBRINOGENE LIQUIDE STABLE <130> BCT170217 <160> 95 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 1 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 2 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 3 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 3 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcag cagtc 75 <210> 4 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 4 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcgc agtc 74 <210> 5 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 5 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagc 75 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 6 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacgt 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 7 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 7 gggtcaatgc caggtctcag acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 8 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attaaaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 9 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 9 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgtcacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 10 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcggtc 76 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 11 gggtcaatgc caggtctcgg acccggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 12 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cgactcgcaa gcagtc 76 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 13 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcatc 75 <210> 14 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 14 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcgtc 75 <210> 15 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 15 gggtcaatgc caggtctcgg acccggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 16 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 16 gggtcaatgc caggtctcgg accaggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 17 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 17 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctgcaag cagtc 75 <210> 18 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 18 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagagcca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 19 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 19 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcacaa gcagtc 76 <210> 20 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 20 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctccaag cagtc 75 <210> 21 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 21 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcaagc agtc 74 <210> 22 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 22 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcggaa gcagtc 76 <210> 23 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 23 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgaag cagtc 75 <210> 24 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 24 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcag cagtc 75 <210> 25 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 25 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcgc agtc 74 <210> 26 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 26 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 gggctcgcaa gcagtc 76 <210> 27 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 27 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcac agtc 74 <210> 28 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 28 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa cagtc 75 <210> 29 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 29 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cagctcgcaa gcagtc 76 <210> 30 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 30 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggctgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 31 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 31 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggctgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 32 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 32 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttggcat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 33 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 33 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttggcat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 34 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 34 gggtcaatgc caggtctcgg acctgggatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 35 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 35 gggtcaatgc caggtctcgg acctgggatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 36 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 36 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cgggtcgcaa gcagtc 76 <210> 37 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 37 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cgggtcgcaa gcagtc 76 <210> 38 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 38 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggtcgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 39 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 39 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc actagaacca gggtcgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 40 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 40 gggtcaatgc caggtctcgg gcctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 41 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 41 gggtcaatgc caggtctcgg gcctggaatc cgccacccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 42 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 42 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccgcccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 43 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 43 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccgcccgc actagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 44 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 44 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgcctcccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 45 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 45 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctggcaa gcagtc 76 <210> 46 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 46 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcaagc agtc 74 <210> 47 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 47 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcacaa gcagtc 76 <210> 48 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 48 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgaag cagtc 75 <210> 49 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 49 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcggaa gcagtc 76 <210> 50 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 50 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa ggagtc 76 <210> 51 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 51 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc caccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 52 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 52 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaaccg gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 53 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 53 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa cagtc 75 <210> 54 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 54 gggtcaatgc caggtctcga acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 55 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 55 gggtcaatgc caggtctcgt acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 56 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 56 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagatcca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 57 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 57 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attaggacca gggttgacat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 58 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 58 gggtcaatgc caggtctcaa ctttcgcgtg tggttggtag ggctaggtgt atacgcatat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 59 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 59 gggtcaatgc caggtctcag gtgagtctta cggatgtggt tggtagggct aggtgtatat 60 cggctcgcaa gcagt 75 <210> 60 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 60 gggtcaatgc caggtctctg cgtacttatc tcgatgtggt tggtagggat aggtgtatat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 61 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 61 gggtcaatgc caggtctcga tctctgtggt tggtagggga gtgtgtatag tgtcgtatcg 60 gctcgcaagc agtc 74 <210> 62 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 62 gggtcaatgc caggtctcgc tgtggttggt agggataggt gtatggcagc tggataggat 60 cggctcgcaa gcagt 75 <210> 63 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 63 gggtcaatgc caggtctcaa taaaagtagc tgatgtgcgt tggtagggaa cggtgtatat 60 cggctcgcaa gcagt 75 <210> 64 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 64 gggtcaatgc caggtctcgg cgtagaagcc ggaatgtggt tggtagggtt aggtgtatat 60 cggctcgcaa gcagt 75 <210> 65 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 65 gggtcaatgc caggtctcga gccggtgttg tgttatgttg gtagggaagg tgtataatat 60 cggctcgcaa gcagtc 76 <210> 66 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Core sequence A.5-1.9 <400> 66 gggtcaatgc caggtctcgg acctggaatc cgccacccgc attagaacca gggttgac 58 <210> 67 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Core sequence A5-2.9 <400> 67 cgcgtgtggt tggtagggct aggtgtatac gcat 34 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central region <400> 68 aggtgagtct tacggatgtg gttggtaggg ctaggtgtat 40 <210> 69 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central region <400> 69 tgcgtactta tctcgatgtg gttggtaggg ataggtgtat 40 <210> 70 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central region <400> 70 gatctctgtg gttggtaggg gagtgtgtat agtgtcgt 38 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central region <400> 71 gctgtggttg gtagggatag gtgtatggca gctggatagg 40 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central region <400> 72 aataaaagta gctgatgtgc gttggtaggg aacggtgtat 40 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central region <400> 73 ggcgtagaag ccggaatgtg gttggtaggg ttaggtgtat 40 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central region <400> 74 gagccggtgt tgtgttatgt tggtagggaa ggtgtataat 40 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 75 gggtcaatgc caggtctc 18 <210> 76 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 76 atcggctcgc aagcagtc 18 <210> 77 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> consensus moiety <400> 77 gttggtaggg 10 <210> 78 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Consensus moiety <400> 78 ggtgtat 7 <210> 79 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> consensus moiety <400> 79 tgt 3 <210> 80 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 80 gtcaatgcca ggtctcggac ctggaatccg ccacccgcat tagaaccagg gttgac 56 <210> 81 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 81 gtcaatgcca ggtctccctg gaatccgcca cccgcattag aaccagggtt gac 53 <210> 82 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 82 gtcaatgcca gtcgctggaa tccgccaccc gcattagaac cagggttgac 50 <210> 83 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 83 gtcaatgcca ggtctcctgg aatccgccac ccgcattaga accagggttg ac 52 <210> 84 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 84 gtcaatgcca ggtcacctgg aatccgccac ccgcattaga accagggttg ac 52 <210> 85 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 85 gtcaatgcca ggtcgacctg gaatccgcca cccgcattag aaccagggtt gac 53 <210> 86 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 86 gtcaatgcca ggtcgcctgg aatccgccac ccgcattaga accagggttg ac 52 <210> 87 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 87 gtcaatgcca ggtctcacct ggaatccgcc acccgcatta gaaccagggt tgac 54 <210> 88 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 88 gtcaatgcca ggtcggacct ggaatccgcc acccgcatta gaaccagggt tgac 54 <210> 89 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 89 gtcaatgcca ggtctcggac ctggaatccg ccacccgcat tagaaccagg gttga 55 <210> 90 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 90 gtcaatgcca ggtctcggac ctggaatccg ccacccgcat agaaccaggg ttgac 55 <210> 91 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 91 gtcaatgcca gtcggacctg gaatccgcca cccgcattag aaccagggtt gac 53 <210> 92 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 92 gtcaatgcca ggtctcggac ctggaatccg ccacccgctt agaaccaggg ttgac 55 <210> 93 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aptamer <400> 93 gtcaatgcca gcggacctgg aatccgccac ccgcattaga accagggttg ac 52 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> central region <400> 94 ggacctggaa tccgccaccc gcattagaac cagggttgac 40 <210> 95 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> central region <400> 95 aactttcgcg tgtggttggt agggctaggt gtatacgcat 40

Claims (22)

  1. 액체 형태의 안정적 피브리노겐을 포함하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 4℃ 에서 적어도 3 개월 동안 안정적인 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 0.5 초과; 바람직하게는 0.6 초과; 0.7 초과; 0.8 초과; 0.9 초과; 더욱더 바람직하게는 약 1.0 의 응고성 피브리노겐 / 피브리노겐 항원 비를 갖는 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐 단량체의 초기 비율의 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과의 안정성 시험 동안 유지된 피브리노겐 단량체의 양을 갖는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐 중합체의 초기 비율의 10% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 바람직하게는 50% 미만의 안정성 시험 동안 형성된 중합체의 양을 갖는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기와 같은 조성물:
    - 알파 사슬의 전부가 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 에서 유지되며; 더욱 바람직하게는 약 100% 에서 유지되고/되거나,
    - 베타 사슬의 전부가 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 에서 유지되며; 더욱 바람직하게는 약 100% 에서 유지되고/되거나,
    - 감마 사슬의 전부가 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 에서 유지되며; 더욱 바람직하게는 약 100% 에서 유지됨.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정성 시험 후에 측정된 혼탁도가 안정성 시험 전에 측정된 혼탁도의 130% 미만, 120% 미만, 110% 미만이며; 유리하게는 100% 에 해당하는 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 및/또는 피브린용해의 활성화제를 포함하지 않는 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 저해제 및/또는 항-피브린용해제를 포함하지 않는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 아르기닌 및 시트레이트로 이루어지는 조성물.
  12. 피브리노겐, 아르기닌 및 시트레이트로 구성되는 조성물로서, 액체 형태에서 안정적인 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 이소류신 및/또는 글라이신을 포함하지 않는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민을 포함하지 않는 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 이온, 특히 칼슘을 포함하지 않는 조성물.
  16. 피브리노겐을 포함하는 조성물로서, 액체 및 안정적이고, 동결-건조, 데시케이션, 탈수 또는 건조의 임의의 사전 단계에 적용된 적이 없는 조성물.
  17. 피브리노겐을 포함하는 조성물로서, 액체 및 안정적이고, 냉동건조물의 재구성의 임의의 사전 단계에 적용된 적이 없는 조성물.
  18. 피브리노겐을 포함하는 조성물로서, 액체 및 안정적이고, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 조성물:
    - 친화도 크로마토그래피에 의한 정제의 단계,
    - 생물 보안의 적어도 하나의 단계, 및
    - 액체 형태의 제형화의 단계.
  19. 제 18 항에 있어서, 친화도 크로마토그래피가 라마 항체 또는 앱타머에서 유래하는 리간드 유형 모이어티를 사용하는 크로마토그래피로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 수득될 수 있는 안정적 액체 피브리노겐을 포함하는 조성물:
    - 혈액 혈장 또는 혈액 혈장의 저온상청액 분획을 수득하는 단계,
    - 바람직하게는 항체 유도체 또는 앱타머 유형의 리간드를 사용하는 친화도 겔 크로마토그래피에 의한 분리에 의해 혈장 또는 혈액 혈장의 저온상청액 분획을 정제하는 단계,
    - 피브리노겐을 포함하는 정제된 흡착된 분획을 회수하는 단계,
    - 가능하게는 약학적으로 허용가능한 부형제, 바람직하게는 아르기닌 및/또는 시트레이트를 첨가하는 단계.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법에서 사용하기 위한 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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