JP2019524704A - 安定な液体フィブリノーゲン - Google Patents

Abstract

本発明は、液体形態の安定なフィブリノーゲンを含む組成物に関する。

Description

本発明は、治療において有用な液体形態の安定なフィブリノーゲンを含む組成物に関する。

フィブリノーゲンは、血液凝固の必須タンパク質であるが、それは、凝固を支配する反応のカスケードの最後に形成される不溶性のフィブリンへのその重合が、出血の原因となる血管の割れ目を封鎖する血餅の形成をもたらすからである。

よって、血餅の代わりとなる状況は、出血を停止することを確実にするために必須である。加えて、創傷上に形成されたフィブリンは、組織修復、したがって瘢痕化を確実にする線維ネットワークを形成する。

現在、多くの病状が、フィブリノーゲンを含有する組成物を使用することにより、静脈内で処置される。例えば、突発性又は外傷後出血を有する患者における体質的な低フィブリノーゲン血症、異常フィブリノーゲン血症又は無フィブリノーゲン血症については、後天性低フィブリノーゲン血症等のフレームワークにおける制御されない重い出血をケアすることにおける追加的処置が言及されうる。

ある特定の病状の処置のためには、貯蔵中に安定で、すぐに使用できるフィブリノーゲンを含有する組成物を使用することが特に有利でありうる。この投与形態は、実際に、医師にとって投与における更なる柔軟性及び迅速性を提供し、出血している患者の緊急のケアを改善する。この目的のために、貯蔵中に安定で、迅速な構成に好適な凍結乾燥フィブリノーゲンが開発された。しかしながら、そのような凍結乾燥組成物の再構成には数分かかる。加えて、凍結乾燥物の完全な溶解を可能とし、製品の濃度を保証し、組成物を投与が困難又は不可能なものとしうる泡、濁り又は沈積を形成せずにこれをするために、再構成は穏やかに実行されなければならない。

したがって、そのような凍結乾燥製品を使用することは、出血を処置するために1分1分がものを言う、院内又は入院前の救急医療の状況において最適ではない。

これまで、フィブリノーゲンを含む組成物は、再構成される凍結乾燥形態で販売され、特に液体安定性に関して完全に満足のいくものではない。

特に、Chabbatら(Thrombosis Research、76巻、6号、525〜533頁、1994年)は、NaCl、アミノカプロン酸、グリシン、アルギニン及びアプロチニンを含む、フィブリノーゲン組成物を記載している。しかしながら、セリンプロテアーゼの自然の競合阻害剤であるアプロチニンは、一方では、アナフィラキシーショックの無視できないリスクを有する、その動物起源(ウシ肺からの調製)の観点から、他方では、処置される患者の凝固障害を更に悪化させうるその抗凝固活性に関して、静脈内投与中の患者には好ましくない。

出願WO0021568は、フィブリンシーラントとしてのその使用のための、フィブリノーゲン、カルシウムイオン、免疫刺激剤及び抗-線維素溶解剤を含む組成物を記載している。しかしながら、そのような組成物は患者に静脈内投与されることが不可能である。

出願人の出願EP1648496は、アルギニン、クエン酸三ナトリウム、ロイシン/イソロイシン並びにグリシン及び/又はリシンを添加することにより安定化され、凍結乾燥物の安定化及び可溶化を可能とする、フィブリノーゲンを含む組成物を記載している。しかしながら、そのような組成物はフィブリノーゲンの液体製剤に完全に適したものではない。

WO0021568 EP1648496 EP1739093 WO2015/136217 WO00/17234 WO00/17239 WO2010/019847 WO2012090183

Chabbatら(Thrombosis Research、76巻、6号、525〜533頁、1994年) Liら、J Am Chem Soc、2008年、130(38):12636〜12638頁 Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica、17、237〜246頁 Rohloffら、Molecular Therapy-Nucleic acids、2014年、3、e201 http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleodite.html Allersonら、RNA、2003年、9:364〜374頁

これに関連して、使用が容易なフィブリノーゲンを含む液体組成物に対する必要性が存続している。

出願人は、液体状態で安定な、フィブリノーゲン、好ましくはヒトフィブリノーゲンを含む新しい組成物を開発した。

したがって、本発明は、安定なフィブリノーゲンを含む、液体形態の組成物に関する。

驚くべきことにかつ有利には、出願人は、限定された数かつ最小限量の賦形剤を使用する、液体形態で経時的に特に安定な、フィブリノーゲンを含む組成物を得ることが可能であることを明らかにした。

配列番号1のアプタマーの予測される二次構造を示す。ベース配列(配列番号66)に属するヌクレオチドが灰色で強調されている。 配列番号58のアプタマーの予測される二次構造を示す。ベース配列(配列番号67)に属するヌクレオチドが灰色で強調されている。枠をつけたループは、式(III)のコンセンサス基を含むアプタマーの領域に対応する。 配列番号67〜74のベース配列のアラインメントを示す。配列の枠をつけた部分は、式(III)のコンセンサス基を含む。 図3A〜図3Dは、本発明の方法により得られたヒトフィブリノーゲンに対するある特定のアプタマーの結合特性を示す。 図3Aは、チップ上に固定化された配列番号66(配列番号1のベース配列)上に125nMから1000nMの濃度で存在するヒト血漿フィブリノーゲンのSPR(表面プラズモン共鳴)結合曲線を示す。ヒト血漿フィブリノーゲンの各溶液は、フィブリノーゲンの濃度に依存するシグナルの増加により示されるように用量依存的に複合体が形成されたような方法で、pH6.3で注入された。0.5MのNaClを含むpH6.3の緩衝溶液の注入は、ヒト血漿フィブリノーゲンの溶出を顕著に誘導しなかった。次いで、pH7.40の溶出緩衝液により、フィブリノーゲンが複合体から放出された。次いで、50mMのNaOH溶液の注入により、固相担体が再生された。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位のSPR応答。 チップ上に固定された配列番号66(配列番号1のベース配列)上に125nMから1000nMの濃度で存在するトランスジェニックフィブリノーゲンのSPR結合曲線を示す。トランスジェニックフィブリノーゲンの各溶液は、フィブリノーゲンの濃度に依存するシグナルの増加により示されるように用量依存的に複合体が形成されたような方法で、pH6.3で注入された。0.5MのNaClを含むpH6.3の緩衝溶液の注入は、トランスジェニックフィブリノーゲンの溶出を顕著に誘導しなかった。次いで、pH7.40の溶出緩衝液により、フィブリノーゲンが複合体から放出された。次いで、50mMのNaOH溶液の注入により、固相担体が再生された。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位のSPR応答。 チップ上に固定化された配列番号67(配列番号58のベース配列)上に125nMから1000nMの濃度で存在するヒト血漿フィブリノーゲンのSPR結合曲線を示す。ヒト血漿フィブリノーゲンの各溶液は、フィブリノーゲンの濃度に依存するシグナルの増加により示されるように用量依存的に複合体が形成されたような方法で、pH6.3で注入された。1MのNaClを含むpH6.3の緩衝溶液の注入は、ヒト血漿フィブリノーゲンの溶出を顕著に誘導しなかった。次いで、2MのMgCl₂を含有するpH7.40の溶出緩衝液により、フィブリノーゲンが複合体から放出された。次いで、50mMのNaOH溶液の注入により、固相担体が再生された。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位のSPR応答。 チップ上に固定化された配列番号67(配列番号58のベース配列)上に125nMから1000nMの濃度で存在するトランスジェニックフィブリノーゲンのSPR結合曲線を示す。トランスジェニックフィブリノーゲンの各溶液は、フィブリノーゲンの濃度に依存するシグナルの増加により示されるように用量依存的に複合体が形成されたような方法で、pH6.3で注入された。1MのNaClを含むpH6.3の緩衝溶液の注入は、ヒト血漿フィブリノーゲンの溶出を大幅に誘導することはなかった。次いで、2MのMgCl₂を含有するpH7.40の溶出緩衝液により、フィブリノーゲンが複合体から放出された。次いで、50mMのNaOH溶液の注入により、固相担体が再生された。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位のSPR応答。 図4A〜図4Cは、本発明の方法により得られたヒトフィブリノーゲンに対するある特定のアプタマーの結合特性を示す。 図4Aは、フィブリノーゲンと配列番号66(配列番号1のベース配列)の固定化されたアプタマーとの結合のpHに関する依存性を示す、SPRセンサーグラムを示す。血漿フィブリノーゲンが異なるpHで注入され、各試験において試料注入後、pH6.30の移動緩衝液がフローセルに送り込まれる。最高の結合レベルが6.30のpHで得られる。pHが増加すると結合レベルが減少する。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位のSPR応答。 配列番号67(配列番号58のベース配列)のアプタマーとヒト血漿フィブリノーゲンとの結合親和性のpHに関する依存性を示す、SPRセンサーグラムを示す。6.8より高いpHについては結合が観察されなかった。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位のSPR応答。 チップ上に固定化された(本発明のアプタマーの第2亜群に属する)配列番号60及び配列番号65のアプタマーへのヒト血漿フィブリノーゲンの、SPR技術により得られた結合曲線を示す(センサーグラム)。精製されたヒト血漿フィブリノーゲン(250nM)が、シグナルの増加により示されるように複合体が形成されたような方法で、pH6.3で注入された。0.5MのNaClを含むpH 6.3の緩衝溶液の注入は、ヒト血漿フィブリノーゲンの溶出を顕著に誘導しなかった。次いで、50mMのNaOH溶液の注入により、固相担体が再生された。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位のSPR応答。 配列番号66のアプタマーをgraftしたアフィニティー担体上の血漿に由来するフィブリノーゲンの精製のクロマトグラフィーのプロフィールを示す。Y軸:280nmにおける吸収。X軸:mLで表す。 非還元条件におけるクマシーブルーによる着色後の電気泳動ゲルの写真を示す。左から右に向かって;1:血漿;2:固定相に保持されなかった血漿由来の画分;3:血漿のクロマトグラフィーにより得られたフィブリノーゲンを含有する溶出画分;4:固定担体(stationary support)の再生後に得られた画分;5:分子量マーカー。フィブリノーゲンの溶出画分の純度は、画分中に含有されるタンパク質の総量に対して95%超であった。クロマトグラフィーにおいて使用されたアフィニティー担体に、配列番号66のアプタマーをgraftした。 配列番号67のアプタマーがgraftされたアフィニティー担体上の血漿に由来するフィブリノーゲンの精製のクロマトグラフィーのプロフィールを示す。Y軸:280nmにおける吸収。X軸:mLで表す。 非還元条件におけるクマシーブルーによる着色後の電気泳動ゲルの写真を示す。左から右に向かって;1:血漿;2:固定相に保持されなかった血漿由来の画分;3:固定担体の洗浄後に得られた画分;4:血漿のクロマトグラフィーにより得られたフィブリノーゲンを含有する溶出画分;5:分子量マーカー。フィブリノーゲンの溶出画分の純度は、画分中に含有されるタンパク質の総量に対して少なくとも95%であった。クロマトグラフィーにおいて使用されたアフィニティー担体に、配列番号67のアプタマーをgraftした。 配列番号66のアプタマーがgraftされた固定担体上の半精製フィブリノーゲンの精製に関して得られたクロマトグラフィーのプロフィールを示す。Y軸:280nmにおける吸収。X軸:mLで表す。 配列番号67のアプタマーがgraftされた固定担体上の半精製フィブリノーゲンの精製に関して得られたクロマトグラフィーのプロフィールを示す。Y軸:280nmにおける吸収。X軸:mLで表す。 アフィニティー担体上のフィブリノーゲン中間体の精製により得られた溶出画分の、還元及び非還元条件におけるAgNO₃による着色を伴うSDS-PAGEによる画分の分析を示す。トラック1:分子量標準品、トラック2:フィブリノーゲン中間体(出発材料);トラック3:アフィニティー担体No.1(配列番号66のアプタマー)により得られた溶出画分;トラック4:アフィニティー担体No.1(配列番号67のアプタマー)により得られた溶出画分。 アフィニティー担体上のフィブリノーゲン中間体の精製により得られた溶出画分の、還元及び非還元条件におけるクマシーブリリアントブルーによる着色を伴うSDS-PAGEによる画分の分析を示す。トラック1:分子量標準品、トラック2及び3:フィブリノーゲン中間体(出発材料);トラック4及び5:アフィニティー担体No.1(配列番号66のアプタマー)により得られた溶出画分;トラック6及び7:アフィニティー担体No.1(配列番号67のアプタマー)により得られた溶出画分。 ヒトフィブリノーゲンに対するアプタマーを同定するために使用されたSELEXプロトコールを示す。 アプタマーの変異体の存在下で注入されたフィブリノーゲンとともに固定化された、配列番号66のアプタマーの競合的結合を示す。ここで、(配列番号66に関しては)フィブリノーゲンに対する変異体の親和性が高いほど、変異体/フィブリノーゲン混合物の注入の間の応答は低い。以下の欠失の組合せ(i)1/2、(ii)19/20/21、(iii)18/19/20/21、(iv)15/16/19/20及び(v)14/15/16/20/21/22のうちの1つを含む配列番号66の変異体は、フィブリノーゲンに対して強力な親和性を有する。 センサーチップ上に固定化されたBase Pair Biotechnologies社由来のアプタマー(参照番号6F01オリゴ♯370)への、ヒトトランスジェニック及び血漿フィブリノーゲンの、SPR技術により得られた結合曲線を示す(センサーグラム)。Base Pair Biotechnologies社により推奨された緩衝液を使用して、ヒトトランスジェニック及び血漿フィブリノーゲン(1000nM)がpH7.40で注入された。ヒトトランスジェニック及び血漿フィブリノーゲンに関して、非常に低い結合レベルが観察された。次いで、50mMのNaOH溶液の注入により、固相担体が再生された。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位の応答。 センサーチップ上に固定化された、Liら(J Am Chem Soc、2008年、130(38):12636〜12638頁)の追加のデータに記載された3つのアプタマー(アプタマー85A、121A及び121B)への、ヒト血漿フィブリノーゲンのSPR技術により得られた結合曲線を示す(センサーグラム)。ヒト血漿フィブリノーゲン(1000nM)が、Liらにより推奨されたとおりに、pH7.40で注入された。ヒトトランスジェニック及び血漿フィブリノーゲンに関して、非常に低い結合レベルが観察された。次いで、50mMのNaOH溶液の注入により、固相担体が再生された。X軸:秒で表した時間。Y軸:任意の単位の応答。注: 緩衝液MBSは、50mMのMOPS/150mMのNaClを示す。 緩衝液NaCl 1M MBSは、50mMのMOPS/1MのNaClを示す。 緩衝液M5 MBSは、50mMのMOPS pH6.30/150mMのNaCl/5mMのMgCl₂を示す。 緩衝液0.5M M5 MBSは、50mMのMOPS pH6.30/0.5MのNaCl/5mMのMgCl₂を示す。

フィブリノーゲンは、アルファ、ベータ及びガンマと名付けられた3つのポリペプチド鎖のダイマーから構成されるタンパク質である。したがって、フィブリノーゲンは、ダイマーであり、各モノマーは3つの鎖(アルファ、ベータ、ガンマ)からなる。フィブリノーゲンの主な形態は、340kDaの分子量(MW)を有する。フィブリノーゲンは、ジスルフィド架橋により連結された2つの同一のサブユニットから形成され、分子を3つの小球体:1つの中心(ドメインE)及び2つの遠位(ドメインD)を含む繊維の形態とする。分子全体は、2,964アミノ酸:アルファ鎖(α)のための610アミノ酸、ベータ鎖(β)のための461アミノ酸、及びガンマ鎖(γ)のための411アミノ酸を含有する。フィブリノーゲンは、凝固だけでなく、一次止血にも介入する。これは、体質的な又は重症の無フィブリノーゲン血症に関連した合併症及び低フィブリノーゲン血症に関連した出血性症候群又は出血のリスクを処置するために最も頻繁に処方される。

用語「安定な」は、フィブリノーゲンを含む組成物の物理的及び/又は化学的安定性に相当する。用語「物理的安定性」は、分子の任意の構造的変性の低減又は不存在だけでなく、フィブリノーゲンのダイマー、オリゴマー又はポリマー形態の不溶性又は可溶性の凝集体の形成の低減又は不存在、及び沈殿の形成の低減又は不存在もさす。

用語「化学的安定性」は、液体状態における加速条件下での貯蔵中のフィブリノーゲンを含む組成物の任意の化学修飾の低減又は不存在をさす。

安定性試験は、温度、湿度及び光の異なる条件において実行されうる。好ましくは、本発明のフレームワークにおいて、安定性試験は、少なくとも1週間、好ましくは少なくとも1カ月、好ましくは少なくとも2カ月、好ましくは少なくとも3カ月、好ましくは少なくとも4カ月、好ましくは少なくとも5カ月、より好ましくは少なくとも6カ月持続しうる。典型的に、以下に定義されるような安定性パラメータの測定は、上記安定性試験が、少なくとも1週間、好ましくは少なくとも1カ月、好ましくは少なくとも2カ月、好ましくは少なくとも3カ月、好ましくは少なくとも4カ月、好ましくは少なくとも5カ月、より好ましくは少なくとも6カ月持続しうるという了解の下で、
- フィブリノーゲンを含む組成物の安定性試験の前と;その場合、これは初速度と呼ばれ;
- 上記安定性試験の間又は後と
に行われる。

フィブリノーゲンを含む組成物の安定性は、特に、ヨーロッパ薬局方検査機(オパール色、粒子の形成)を使用する目視検査により、400nmにおける吸収又は光学密度を測定する分光光度計を使用して濁度を測定し、溶液中の約1nmから1μmの間のサイズの粒子を測定することを可能とすることにより評価可能である。

ある実施形態では、フィブリノーゲンを含む組成物の安定性は、サイズ排除高圧クロマトグラフィー(High Pressure Size Exclusion Chromatography)(HPSEC)又は動的光散乱(DLS)法を使用する安定性試験の間に保持されるモノマーの割合の測定により定義される。これらの方法は、当業者に周知である。

フィブリノーゲン組成物は、安定性試験の間に保持されるフィブリノーゲンモノマーの量が、フィブリノーゲンモノマーの初期割合の50%よりも高い、好ましくは60%よりも高い、好ましくは70%よりも高い、好ましくは80%よりも高い、好ましくは90%よりも高い、好ましくは95%よりも高い場合に、安定であると有利に考えられる。

より好ましくは、安定性試験の間に保持されるフィブリノーゲンモノマーの量は、フィブリノーゲンモノマーの初期割合の70%よりも高い。

用語「フィブリノーゲンモノマーの初期割合」は、安定性試験の前に観察されたモノマーの割合を意味する。典型的に、フィブリノーゲンモノマーの量は、上記安定性試験の前及びその間又は後に測定される。

或いは、フィブリノーゲン組成物は、安定性試験の間のフィブリノーゲンモノマーの量の変動が、20%未満、好ましくは10%未満、好ましくは5%未満、好ましくは1%未満である場合に、安定であると考えられる。

別の実施形態では、フィブリノーゲンを含む組成物の安定性は、HPSECを使用することによる安定性試験の間に形成されるフィブリノーゲンポリマーの割合の測定により定義される。フィブリノーゲンポリマーは、フィブリノーゲンの少なくとも2つのアルファポリペプチド鎖、2つのベータポリペプチド鎖及び2つのガンマポリペプチド鎖を含むポリマーである。この用語はフィブリノーゲン三量体も含む。

フィブリノーゲン組成物は、安定性試験の間に形成されるフィブリノーゲンポリマーの量が、フィブリノーゲンポリマーの初期割合に対して50%未満、好ましくは40%未満、好ましくは30%未満、好ましくは20%未満、好ましくは10%未満である場合に安定であると有利に考えられる。典型的に、フィブリノーゲンポリマーの初期割合は、安定性試験の前のフィブリノーゲンのすべてのポリマー形態(三量体以上)に相当する。

より好ましくは、安定性試験の間に形成されるフィブリノーゲンポリマーの量は、30%未満である。典型的に、フィブリノーゲンポリマーの量は、安定性試験の前及び上記安定性試験の間又は後に測定される。

或いは、フィブリノーゲン組成物は、安定性試験の間のフィブリノーゲンポリマーの量における変動が、20%未満、好ましくは10%未満、好ましくは5%未満、好ましくは1%未満である場合に、安定であると考えられる。

別の実施形態では、フィブリノーゲンを含む組成物の安定性は、フィブリノーゲンの抗原測定についてフィブリノーゲンの凝固活性を測定することにより(比活性とも呼ばれる)、評価される。特に有利には、安定なフィブリノーゲン組成物は、0.5よりも高い;好ましくは0.6よりも高い;0.7よりも高い;0.8よりも高い;0.9よりも高い;更により好ましくは約1.0に等しい凝固性フィブリノーゲン/フィブリノーゲン抗原比を有する。更により有利には、フィブリノーゲン組成物は、試験の最後においてその抗原活性に対するその凝固性活性の割合が、この割合の初期値(安定性試験の前のその値)の少なくとも60%よりも高い、好ましくは少なくとも70%、80%、90%、95%、98%又は99%よりも高い場合に、安定であると考えられる。

用語「凝固性フィブリノーゲン」は、von Claussの方法に従って決定された、凝固技術による機能的フィブリノーゲンの測定値を意味する。凝固活性は、フィブリノーゲン溶液のg/Lで表される。この技術は、Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica、17、237〜246頁を参照することのできる当業者に公知である。

用語「抗原フィブリノーゲン」は、活性であるか否かにかかわらず、比濁分析法により測定されたフィブリノーゲンの量を意味する。抗原フィブリノーゲンの量は、g/Lで表される。

フィブリノーゲンを含む組成物の安定性は、好ましくは本発明のフレームワークにおいて定義された安定性試験の前及び後のフィブリノーゲンのアルファ、ベータ及びガンマ鎖の保持のSDS PAGEにおける測定によっても評価される。よって、フィブリノーゲン組成物は:
- すべてのアルファ鎖が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%保持され;より好ましくは約100%保持され、及び/又は
- すべてのベータ鎖が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%保持され;より好ましくは約100%保持され、及び/又は
- すべてのガンマ鎖が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%保持され;より好ましくは約100%保持される場合に、
安定であると有利に考えられる。

特に、フィブリノーゲン組成物は、安定性試験の最後にアルファ及びガンマ鎖のプロフィールが保持されている場合に、安定であると考えられる。用語、アルファ及びガンマ鎖のプロフィールの保持は、アルファ及びガンマ鎖の様々な形態の分布の保持を意味する。

よって、アルファ鎖のプロフィールは、アルファ鎖のAα1、Aα2及びAα3形態の分布が安定性試験の前に取得された初期測定値と安定性試験の最後に取得されたものとの間で保持されている場合に、安定性試験の間に保持されていると考えられる。フィブリノーゲン組成物は、安定性試験の後の(アルファ鎖のすべての形態のパーセンテージとして表される)Aα1形態の範囲が、安定性試験の前の(アルファ鎖のすべての形態のパーセンテージとして表される)Aα1形態の範囲の少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、70%、80%又は90%に相当する場合に、安定であると考えられうる。

よって、ガンマ鎖のプロフィールは、ガンマ鎖のγ'及びγ形態の分布が、安定性試験の前に取得された初期測定値と安定性試験の期間の最後に取得されたものの間で保持されている場合に、安定性試験の間に保持されていると考えられる。

フィブリノーゲンを含む組成物の安定性は、400nmにおけるUV分光光度測定を使用する濁度の測定によっても定義される。実際に、濁度は、溶液を濁らせている物質の量を反映する。フィブリノーゲン組成物は、本発明において定義される安定性試験の後に測定された濁度が、安定性試験の前に測定された濁度に匹敵する場合に、安定であると有利に考えられる。

有利には、安定性試験の後に測定された濁度は、安定性試験の前に測定された濁度の130%よりも低く、120%よりも低く、110%よりも低く;有利には、100%に相当する。

本発明の有利な実施形態では、フィブリノーゲンを含む組成物は、4℃において少なくとも1カ月、少なくとも2カ月、少なくとも3カ月、少なくとも4カ月、少なくとも5カ月、少なくとも6カ月間安定である。

用語「本発明による組成物」は、フィブリノーゲンを含む組成物を示すことを意図し、上記組成物は液体形態で安定である。好ましくは、上記組成物は、フィブリノーゲン、アルギニン及びシトレートで構成される。

用語「液体形態のフィブリノーゲン組成物」は、液体中にフィブリノーゲンを含む組成物、好ましくは凍結乾燥、乾燥、脱水又は除湿に供されておらず、したがって、使用前に再構成される必要のないものを意味する。

したがって、本発明の目的は、凍結乾燥後に再構成されない、液体形態において安定なフィブリノーゲンを含む医薬組成物である。

本発明の別の目的は、液体形態において安定な、フィブリノーゲン及び1つ又は複数の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物である。

用語「薬学的に許容できる賦形剤」は、ヒトタンパク質と、特に塩、アミノ酸、糖、界面活性剤又は任意の他の賦形剤から選択される物質との製剤のために有利に使用されうる任意の賦形剤に相当する。

本発明の薬学的に許容できる賦形剤は、特にイソロイシン、グリシン及びNaClを除外する。

有利には、本発明による薬学的に許容できる賦形剤としては、アルギニン及び/又はシトレートが挙げられる。出願人は、液体形態において経時的に特に安定な、フィブリノーゲン、アルギニン及びシトレートを含む組成物を得ることが可能であったことを明らかにした。そのような組成物は最適であり、なぜなら、それが賦形剤の数を制限し、したがって製剤の成分による副作用のリスクを制限する一方、すぐに使用できる組成物の液体形態での保存をなお可能とするからである。

よって、好ましい実施形態では、本発明は、フィブリノーゲン、アルギニン及びシトレートを含む、好ましくはそれからなり、液体形態において安定な組成物に関する。

好ましくは、上記フィブリノーゲンは、ヒトフィブリノーゲンである。

本発明によれば、フィブリノーゲンを含有する原材料の数種の供給源が使用可能である。よって、フィブリノーゲン組成物は、血漿画分とも呼ばれる血漿、細胞培養の上清に、又はトランスジェニック動物の乳に由来することができる。

好ましい実施形態では、本発明の組成物は、凍結乾燥、乾燥、脱水又は除湿のいずれの先の工程にも供されていない。

好ましい実施形態では、本発明の組成物は、凍結乾燥物を再構成するいずれの先の工程にも供されていない。

具体的な実施形態では、本発明による組成物は、血漿画分、より好ましくは予備精製された血漿から得られた血漿画分である。

用語「予備精製された血漿から得られた血漿画分」は、1つ又は数個の精製工程に供されたヒト血漿の任意の部分又は小部分を意味する。よって、上記血漿分画としては、血漿のクリオ上清(cryosupernatant)プレシピテート、(再懸濁された)血漿のクリオプレシピテート(cryoprecipitate)、(Cohn法又はKistler & Nitschmann法による)エタノール分画法により得られた画分I、マルチカラムクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーカラムのクロマトグラフィー溶出液及び未吸着画分、並びにろ液が挙げられる。

本発明の好ましい実施形態では、本発明による組成物は、クロマトグラフィー溶出液に又はマルチカラムクロマトグラフィーを含む未吸着のクロマトグラフィーカラム画分に由来する。

本発明の更により好ましい実施形態では、本発明による組成物は、クロマトグラフィー溶出液に又はマルチカラムクロマトグラフィー以外の未吸着のクロマトグラフィーカラム画分に由来する。

よって、本発明の好ましい実施形態では、本発明による組成物は、クリオ上清から又は再懸濁されたクリオプレシピテートから得られた血漿画分に由来する。

本発明によれば、「血漿クリオ上清プレシピテート」又は「クリオ上清」は、凍結された血漿の解凍(cryoprecipitation)後に得られた液体相に相当する。特に、クリオ上清は、-10℃から-40℃の間の温度で血漿を解凍し、次いで0℃から+6℃の間の温度、好ましくは0℃から+1℃の間の温度でゆっくりと解凍し、その後クリオプレシピテートとクリオ上清を分離するために、解凍された血漿の遠心分離が続くことにより得られうる。クリオプレシピテートは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンウイルブランド因子、及び第VIII因子濃縮物であるが、クリオ上清は、補体因子、プロテインC、プロテインS、プロテインZ、第II因子、第VII因子、第IX因子及び第X因子のようなビタミンK依存性因子、フィブリノーゲン、イムノグロブリン並びにアルブミンを含有する。

本発明の有利な実施形態では、本発明による組成物は、出願EP1739093又は出願WO2015/136217に記載の方法により得られうる。

本発明の別の具体的な実施形態では、本発明による組成物は、トランスジェニック動物の乳に由来し、例えば、WO00/17234又はWO00/17239に記載の方法により得られる。

ある実施形態では、本発明による組成物は、イムノグロブリン又はアルブミンのようなタンパク質を予め枯渇させられていない血漿に由来する。

ある実施形態では、本発明の組成物は、以下の工程:
- アフィニティークロマトグラフィーによる精製の工程と;
- 少なくとも1つの生物学的安全性の工程と;
- 液体形態での製剤の工程と
を含む方法により得られうる。

本発明の具体的な実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーによる精製の工程は、抗体、抗体断片、抗体の誘導体又はペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、ナノフィチン若しくはアプタマーのようなオリゴヌクレオチドリガンドのような化学的リガンドから選択されるアフィニティーリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより実行される。

本発明の具体的な実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーによる精製の工程は、アプタマーであるアフィニティーリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより実行される。

出願人は、彼自身の研究を行い、フィブリノーゲンに対する新しいアプタマーのファミリーを同定した。このアプタマーの新しいファミリーは、出願人により設計されたSELEX法により内部的に同定された。これらのアプタマーは、タンパク質のグリコシル化の状態に非依存的に、ヒトトランスジェニック及び血漿フィブリノーゲンの両方と特異的に結合することが示されている。出願人により同定されたアプタマーは、結合に関して独特の性質を有する。特に、本発明により使用されるアプタマーは、pH依存性の方法でフィブリノーゲンに結合する。それらが、7.4のような7.0よりも高いpHに比べて、約6.3のpHのようなわずかに酸性のpHにおいて、フィブリノーゲンに対する増大した結合活性を有することは注目されたい。これらの性質は、アフィニティークロマトグラフィーにおける使用に特に好適であり、なぜなら、精製されるタンパク質、すなわちフィブリノーゲンとアプタマーの間の複合体の形成、及び後の複合体からのタンパク質の放出が、溶出緩衝液のpHを変更することによって制御されうるからである。特に、複合体からのタンパク質の放出は、タンパク質の性質を変更することのできない弱い溶出の条件において実行可能である。

・本発明により使用されるアプタマー
アプタマーは、フィブリノーゲンの例えば、クロマトグラフィーによる精製におけるアフィニティーリガンドとして本発明により使用される。したがって、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに対するものであり、すなわち、フィブリノーゲンと特異的に結合することができる。本発明により使用されるアプタマーは、pH依存性の方法でフィブリノーゲンに結合する。

好ましくは、本発明により使用されるアプタマーは、7.0よりも高いpHにおいてはフィブリノーゲンに結合せず、酸性のpH、例えば、pH6.3±0.1のような6.0から6.6までから選択されるpH値においてフィブリノーゲンに結合する。

本明細書において意味されるとおり、(核アプタマーとも呼ばれる)「アプタマー」は、典型的に20から150のヌクレオチドの長さを有し、大きな親和性により標的分子に結合することのできる合成の一本鎖ポリペプチドを示す。アプタマーは、その標的分子との相互作用のレベルにおいて主要な役割を演じることのできる、1つ又は複数の3次元コンフォメーションを特徴とする。結果として、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンと複合体を形成することができる。アプタマーとその標的分子との相互作用は、静電的相互作用、水素結合、及び芳香族性スタック(aromatic stack)の形態における相補性を包含しうる。

「その標的分子に特異的に結合するアプタマー」は、アプタマーが標的分子に対して大きな親和性を有することを意味する。その標的分子に対するアプタマーの解離定数(Kd)は、典型的に10^-6から10^-12Mである。用語「特異的に結合する」は、本明細書において、アプタマーがその標的分子を特異的に認識し、結合する能力を有するが、試料中に存在しうるその他の分子との比較的低い検出可能な反応性をなお有することを意味する。好ましくは、アプタマーは、その親和性が、その標的分子に構造的に近い分子を含む他の分子に対するよりも、標的分子に対して顕著に高い場合、その標的分子に対して特異的に結合する。

例えば、アプタマーはヒトタンパク質に特異的に結合することができるが、上記ヒトタンパク質の等価物への低い親和性をなお有する。

本明細書において意味されるとおり、「その標的分子に対するよりも低い親和性を所与の分子に対して有するアプタマー」又は「所与の分子と比較してその標的分子に特異的なアプタマー」は、上記所与の分子に対するアプタマーのKdが、標的分子に対する上記アプタマーのKdよりも少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10、20、30、40、50、100、200、500又は1000倍高いことを意味する。

アプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)でありうる。アプタマーは、1つ又は数個の化学修飾されたヌクレオチドを含むことができる。化学修飾されたヌクレオチドは、それに限定されることなく、2'-アミノ又は2'-フルオロ-ヌクレオチド、2'-リボプリン、ホスホラミダイト、ロックド核酸(LNA)、ボロン酸により修飾されたヌクレオチド、5-ヨード-又は5-ブロモ-ウラシル、並びにベンジル-dU、イソブチル-dU及びナフチル-dUのような5-修飾されたデオキシウリジンを包含する。5-修飾されたデオキシウリジンについては、その記載が参考文献として本明細書に組み込まれる、Rohloffら、Molecular Therapy-Nucleic acids、2014年、3、e201(図1、4頁を参照されたい)が言及されうる。ある特定の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、ボロン酸により修飾されたいかなる核酸も、特にWO2010/019847に教示されたものも含まない。ある特定の他の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、いかなる5-修飾されたデオキシウリジンも含まない。ある特定の実施形態では、アプタマーは、その3'末端及び/又はその5'末端のレベルのみにおいて修飾されたヌクレオチドを含みうる(すなわち、アプタマーの最初のヌクレオチド及び/又は最後のヌクレオチドが、唯一の化学修飾されたヌクレオチドである)。好ましくは、上記修飾されたヌクレオチドは、固相担体へのアプタマーのgraft、又は上記アプタマーの(例えば、検出又は固定化に有用な)目的のいずれかの基へのカップリングを可能とする。

アプタマーの配列が同定された場合、アプタマーは、当業者に公知の任意の日常的方法により、すなわち、例えば、固相における化学的オリゴヌクレオチド合成により準備されうる。

本明細書において意味されるとおり、「フィブリノーゲンに適したアプタマー」、「フィブリノーゲンに対するアプタマー」又は「抗フィブリノーゲンアプタマー」は、フィブリノーゲンに特異的に結合する合成の一本鎖ポリヌクレオチドを示す。

本明細書において意味されるとおり、用語「フィブリノーゲン」は、グリコシル化の状態とは無関係に、野生型フィブリノーゲンのアミノ酸配列を有する任意のタンパク質又はその変異体を示す。用語「フィブリノーゲン」は、フィブリノーゲンの任意のアイソフォーム及び遺伝子変異体、並びにフィブリノーゲンの任意のグリコシル化形態、任意の非グリコシル化形態又は任意の翻訳後の形態を包含する。

本明細書において意味されるとおり、野生型フィブリノーゲンの変異体は、上記野生型フィブリノーゲンと、少なくとも80%の配列同一性、より好ましくは少なくとも85%、90%、又は95%の配列同一性を有し、上記野生型フィブリノーゲンの生物活性と同様の生物活性を有するタンパク質を示す。例えば、フィブリノーゲンの凝固活性は、van Clauss凝固法により測定可能である。フィブリノーゲンの変異体は、対応する野生型フィブリノーゲンに比較して増加した又は低減された生物活性を有することができる。

ある特定の実施形態では、フィブリノーゲンは、野生型ヒトフィブリノーゲンのアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を示す。上記フィブリノーゲンは、ヒト血漿フィブリノーゲン、ヒト組換え若しくはトランスジェニックフィブリノーゲンでありうる。ある特定の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、そのグリコシル化とは無関係にヒトフィブリノーゲンに結合することができる。例えば、本発明のアプタマーは、ヒト血漿フィブリノーゲンに及び組換えヒトフィブリノーゲン、例えば、多細胞トランスジェニック生物から得られた組換えフィブリノーゲン又は組換え宿主細胞から得られた組換えフィブリノーゲンに特異的に結合することができる。

本発明により使用されるアプタマーは、わずかに酸性のpH、例えば、pH6.3においてフィブリノーゲンに特異的に結合することができる。

好ましくは、本発明により使用されるアプタマーは、ヒト血漿フィブリノーゲンに対する又はヒトトランスジェニックフィブリノーゲンに対して最大10^-6Mの解離定数(Kd)を有する。典型的に、本発明により使用されるアプタマーのヒトフィブリノーゲンに対するKdは、約6.3のpHにおいて、1.10^-12Mから1.10^-6Mでありうる。Kdは、目的のpHにおいて、様々な濃度で、kon及びkoff、そしてしたがってKdの測定値をもたらす流動条件でアプタマーがバイオセンサーチップ上に固定化され、フィブリノーゲンが固定化アプタマーを介して送られる、表面プラズモン共鳴(SPR)試験により決定されることがより好ましい。実施例3において提供されるプロトコールが言及されうる。

ある特定の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、非ヒトフィブリノーゲンに比べてヒトフィブリノーゲンに特異的である。

ある特定の他の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、凝固因子のような血漿中に存在する他のタンパク質に比べてヒトフィブリノーゲンに特異的である。好ましくは、本発明により使用されるアプタマーは、第FII因子、第FXI因子又は第XIII因子に比べてフィブリノーゲンに特異的に結合する。追加の又は代わりの実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブロネクチンに比べてフィブリノーゲンに特異的に結合する。追加の又は代わりの実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、プラスミノーゲンに比べてフィブリノーゲンに特異的に結合する。

好ましくは、本発明により使用されるアプタマーは、7.0又はそれ超のpHにおいてフィブリノーゲンに結合しない。本発明により使用されるアプタマーが7.0又はそれ超のpHにおいてフィブリノーゲンに結合できないことは、典型的に、実施例3に記載されたようなSPRにより決定されうる。実施例3のプロトコールにおいて、結合の不存在は、目的のpHにおいて緩衝化された緩衝液中のフィブリノーゲンを注入後、SPRシグナルがベースラインのレベルに留まることにより表される。

本発明のある特定の態様では、アプタマーは、そのコンフォメーション中の特定の基の存在を特徴としうる。例えば、本発明により使用されるアプタマーは、図1A又は図2Aにおいて示されるような基を含むことができる。いかなる理論にとらわれることも意図しないが、出願人は、上記2次元のコンフォメーションの存在が、フィブリノーゲンとの特異的な相互作用に関与しうると考える。

上記特異的なコンフォメーションの基の存在は、アプタマー配列内の特定のポリヌクレオチド(「ベースポリヌクレオチド」又は「ベース配列」と呼ばれる)の存在に由来しうる。本明細書中で意味されるとおり、所与のアプタマーの「ベース配列」は、典型的に、フィブリノーゲンに結合することのできる上記アプタマー由来の最小配列を含むか又は示す。

自身の研究により同定されたアプタマーを試験することにより、出願人は、数種の目的のベース配列、その中でも配列番号66及び配列番号67のポリヌクレオチドを同定した。

出願人は、配列番号58〜65中のコンセンサス配列の基を更に決定した。図2Bに示されるとおり、配列番号58〜65のアプタマーは、その配列中に2つのコンセンサス基、すなわち、GGTGTAT(配列番号78)の上流のGTTGGTAGGGG (配列番号77)を含む。これらのコンセンサス基は、配列番号58のアプタマーについて図2Aに示されるループを形成するアプタマーの領域中に位置する。いかなる理論にとらわれることも意図するものではないが、出願人は、このコンフォメーションの基が上記アプタマーのフィブリノーゲンへの結合に役割を演じうると考える。

ある特定の態様では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合することができ、以下の特徴:
- 上記アプタマーは、配列番号66のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、又は95%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、又は
- 上記アプタマーは、ヌクレオチド基GTTGGTAGGG(配列番号77)及びGGTGTAT(配列番号78)を含み、配列番号77の基は、配列番号78の上流であることがより好ましい
のうちの1つを有する。

ある特定の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合することができ、以下の特徴:
- 上記アプタマーは、配列番号66のヌクレオチド配列と、少なくとも70%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、又は
- 上記アプタマーは、式(III):
5'-[配列番号79]-[X1]-[配列番号77]-[X2]-[配列番号78]-3' (III)
{式中、
- [X2]及び[X1]は、独立して、ヌクレオチド又は2から5ヌクレオチド長、より好ましくは2又は3ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを示し、
- [配列番号77]は、配列番号77のオリゴヌクレオチド(すなわち、GTTGGTAGGG)であり、
- [配列番号78]は、配列番号78のオリゴヌクレオチド(すなわち、GGTGTAT)であり、
- [配列番号79]は、配列番号79のオリゴヌクレオチド(すなわち、TGT)である}
のヌクレオチド基を含む、
のうちの1つを有する。

具体的な実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、
- 配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74及び配列番号95を含む群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列と、少なくとも70%の配列同一性を有し、かつ
- 本明細書中上記で定義されたような式(III)のヌクレオチド群を含む、
ポリヌクレオチドを含む。

例えば、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号67と少なくとも70%の配列同一性を有し、式(III)のヌクレオチド基を含む、ポリヌクレオチドを含むことができる。

別の態様では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合することができ、配列番号66又は配列番号67と少なくとも70%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

本明細書において意味されるとおり、少なくとも70%の配列同一性は、少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、又は98%の配列同一性を包含する。ヌクレオチド(A)及び(B)の2つの配列間の「同一性パーセンテージ」は、比較ウィンドウにより最適の方法で整列化された2つの配列を比較することにより決定されうる。上記配列の整列化は、周知の方法、例えば、Needleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して実行されうる。アラインメントが得られたら、整列化された同一のアミノ酸残基の総数を配列(A)及び(B)の間で最長の配列中に含有される残基の総数で割ることにより得られうる。配列同一性は、典型的に配列分析ソフトウエアを使用して決定される。2つの核酸配列を比較するために、例えば、デフォルト設定:(i)Matrix:完全DNA、(ii)スペースオープニング:10、(iii)スペースレベル:0.5、アウトプットフォーマット:even、(v)ターミナルスペースペナルティ:false、(vi)スペースオープニングターミナル:10、(vii)スペースレベルターミナル:0.5を使用して、http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleodite.htmlにおいて利用可能な、EMBL-EBIを提供するための対による配列の整列化の「Emboss needle」ツールを使用することが可能である。

本発明により使用されるアプタマーは、典型的に、20から150ヌクレオチドの長さ、より好ましくは30から100ヌクレオチドの長さ、例えば、25から90ヌクレオチドの長さ、30から80ヌクレオチドの長さ、又は30から60ヌクレオチドの長さを有する。結果として、本発明により使用されるアプタマーは、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89又は90ヌクレオチドの長さを有しうる。

具体的な実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号66の基及び配列番号67の基から選択されるポリヌクレオチドとは、1〜15ヌクレオチドの修飾の割合、より好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10ヌクレオチドの修飾のような1〜10ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含む。

本明細書において意味されるとおり、「ヌクレオチドの修飾」は、参照配列に比べたヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入又は別のヌクレオチドによるヌクレオチドの置換を示す。

本発明により使用されるアプタマーは、その3'及び5'末端に、PCRによるその増幅に有用なプライマーを含むこともできる。ある特定の実施形態では、これらのプライマー配列は、ベース配列に組み込まれるか又は部分的に組み込まれることができ、したがって、フィブリノーゲンとの結合相互作用に参加することができる。ある特定の他の実施形態では、これらのプライマー配列は、ベース配列の外側にあり、フィブリノーゲンとのアプタマーの相互作用にいかなる役割も演じないかもしれない。ある特定の他の実施形態では、アプタマーはプライマー配列を欠いている。

ある特定の代わりの又は追加の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、ベース配列の5'末端及び/又は3'末端に結合された2から40ヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチドを含みうる。

ある特定の態様では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合し、式(I)
5'-[NUC1]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3' (I)
{式中、
n及びmは、独立して、0及び1から選択される整数であり、
- [NUC1]は、2から40ヌクレオチド、より好ましくは15から25ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、
- [NUC2]は、2から40ヌクレオチド、より好ましくは15から25ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、かつ
- [CENTRAL]は、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号94及び配列番号95を含む群から選択されるヌクレオチドの配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリヌクレオチドである}
に反応する。

n=m=0である場合[NUC1]及び[NUC2]が不存在であり、アプタマーは、配列[CENTRAL]からなる。n=0かつm=1である場合、[NUC2]は不存在であり、[NUC1]は存在し、したがって、アプタマーは、式(Ia)
5'-[NUC1]-[CENTRAL]-3'
に反応し、n=1かつm=0である場合、[NUC1]は不存在であり、[NUC2]は存在し、したがって、アプタマーは、式(Ib)
5'-[CENTRAL]-[NUC2]-3'
に反応する。

ある特定の実施形態では、[NUC1]は、配列番号75のポリヌクレオチド又は配列番号75のポリヌクレオチドとは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含むか、又はそれからなる。ある特定の他の追加の実施形態では、[NUC2]は、配列番号76のポリヌクレオチド又は配列番号76のポリヌクレオチドとは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含むか、又はそれからなる。

別の態様では、本発明は、フィブリノーゲンに対するアプタマーであって、配列番号1〜配列番号67を含む群から選択されるヌクレオチドの配列と、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%又は98%のような、少なくとも70%の配列同一性を有するアプタマーに関する。例えば、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号1、配列番号2、配列番号58、配列番号60、配列番号65、配列番号66及び配列番号67から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも70%の配列同一性を有することができる。

出願人は、本明細書中上記で定義されたアプタマーの配列及び可能性のあるコンフォメーションの徹底的な分析を実行した。この分析は、各亜群が特定の機能的及び構造的性質を特徴とする、アプタマーの2つの亜群の同定に導いた。

- 本発明により使用されるアプタマーの第1の亜群
アプタマーの第1の亜群は、配列番号66のベース配列との高い配列同一性を有するベース配列を含む、フィブリノーゲンに対するアプタマーを包含する。配列番号1〜57のアプタマーのこの第1の亜群及び配列番号66のベース配列から成るアプタマー。

結果として、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合し、配列番号66と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%又は98%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。好ましくは、上記アプタマーは、20から110ヌクレオチドの長さ、特に、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99ヌクレオチドの長さのような25から100の長さを有する。特に、アプタマーは、35から65ヌクレオチドの長さを有することができる。

ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号66のポリヌクレオチド又は配列番号66とは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15ヌクレオチドの修飾のような、1〜16ヌクレオチドの修飾の割合で異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書中上記で述べたように、ヌクレオチドの修飾(単数)又は修飾(複数)は、任意のタイプでありうる。ヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入又は別のヌクレオチドによるヌクレオチドの置換/交換でありうる。

配列番号66のベース配列と配列番号1〜57のアプタマーとの整列化は、ある特定のヌクレオチドが、第1の亜群に属するアプタマーの間で保持されていないことを示している。上記位置は、19、20、21、24、27、32、33、35、42、45、46、47、50、54、55及び57位を包含し、番号付けは、配列番号66中のヌクレオチドの番号付けを示している。

他の修飾、特に、1つ又は数個の欠失は、配列番号66の1及び2位に導入されうるが、図1Aに示されるとおり、配列番号66のベース配列の第3のロッドにも導入されうる。特に、出願人は、配列番号66のアプタマーの第3のロッド、特に、14〜22位に、配列番号66の親ベース配列に比べて、フィブリノーゲンに対する親和性のいかなる顕著な損失もなく、1〜6個の欠失を導入した。

結果として、配列番号66に関するヌクレオチドの修飾(単数)又は修飾(複数)は、これらのヌクレオチド位置のうちの1つ又は数個において存在しうる。ある特定の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号66とは、1、2,11〜25、32〜35、42、45〜47、50及び54〜58から選択されるヌクレオチド位置、より好ましくは1、2、14〜22、24、27、32、33、35、42、45、46、47、50,54、55及び57から選択されるポリヌクレオチド位置において、1から20、より好ましくは1から14、特に1、2、3、4、5又は6ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含み、番号付けは、配列番号66中のヌクレオチドの番号付けを示している。好ましくは、修飾(単数)又は修飾(複数)は、1つ又は複数のヌクレオチドの交換又は欠失である。

ある特定の具体的な実施形態では、上記ヌクレオチドの修飾(単数)又は修飾(複数)は、20、35、42及び55から選択されるヌクレオチド位置において現れる。ある特定の具体的な実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号66とは、より好ましくは20、35、42及び55から選択される位置において現れる、最大で4ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含むことができ、番号付けは、配列番号66中のヌクレオチドの番号付けを示している。

例えば、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号66のポリヌクレオチド、又は配列番号66のポリヌクレオチドとは1、2若しくは3ヌクレオチドの修飾(単数)若しくは修飾(複数)の割合で、より好ましくは1、2若しくは3ヌクレオチドの修飾(単数)若しくは修飾(複数)の割合で異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができ、上記ヌクレオチドの修飾(単数)若しくは修飾(複数)は、19、20、21、24、27、32、33、35、42、45、46、47、50、54、55及び57を含む群において選択される1つ又は複数のヌクレオチド位置にあり、番号付けは、配列番号66中のヌクレオチドの番号付けを示している。

ある特定の他の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号66のポリヌクレオチド、又は配列番号66のポリヌクレオチドとは1〜14ヌクレオチドの欠失(単数)若しくは欠失(複数)、より好ましくは1、2、3、4、5、6若しくは7ヌクレオチドの欠失(単数)若しくは欠失(複数)の割合で配列番号66とは異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができ、上記ヌクレオチドの欠失(単数)若しくは欠失(複数)は、1、2、14、15、16、17、18、19、20、21及び22を含む群において選択される1つ又は複数のヌクレオチド位置にあり、番号付けは、配列番号66中のヌクレオチドの番号付けを示している。

ある特定の追加の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、配列番号66のポリヌクレオチド、又は配列番号66のポリヌクレオチドとは以下のヌクレオチド欠失の組合せ:
- 19、20及び21位におけるヌクレオチドの欠失、
- 18、19、20及び21位におけるヌクレオチドの欠失、
- 15、16、19及び20位におけるヌクレオチドの欠失、
- 14、15、16、20及び21位におけるヌクレオチドの欠失、並びに
- 14、15、16、20、21及び22位におけるヌクレオチドの欠失
のうちの1つの割合で異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができ、番号付けは、配列番号66中のヌクレオチドの番号付けを示している。

その代わりに又はそれに加えて、ヌクレオチドの欠失は、1及び2位に存在することができ、番号付けは、配列番号66中のヌクレオチドの番号付けを示している。

実施例7に示されるとおり、出願人は、同時にフィブリノーゲンに結合することのできる配列番号66の変異体を同定した。

ある特定の追加の又は代わりの実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに選択的に結合し、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92及び配列番号93からなる群から選択されるか又は配列番号80〜93からなる群から選択される配列に比べて1、2、3、4若しくは5ヌクレオチドの修飾の割合で異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、アプタマーである。

配列番号66の好ましい変異体は、配列番号80〜87のアプタマーを包含する。

本発明により使用されるアプタマーの第1の亜群は、フィブリノーゲンに対するアプタマーであって、配列番号1と少なくとも80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%又は98%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むものを包含する。

特に、アプタマーは、配列番号1のものでありうるか又は配列番号1とは1〜20、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10ヌクレオチドの修飾の割合で異なるヌクレオチド配列を有しうる。上記ヌクレオチドの修飾(単数)若しくは修飾(複数)は、配列番号66について上記した位置(単数)又は位置(複数)に存在することがより好ましい。

「本発明により使用されるアプタマーを得るための方法」と題された以下のセクションにおいて説明されるとおり、本発明により使用されるある特定のアプタマーは、多数の一本鎖DNA(ssDNA)から構成される候補の混合物から同定され、各ssDNAは、PCRによる増幅のためのプライマーの役割を演じる約15から40ヌクレオチドの特定の配列に隣接した約20から100ヌクレオチドのランダムな中心配列を含む。

ある特定の代わりの又は追加の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、式(I):
5'-[NUC1]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3' (I)
{式中、
- [CENTRAL]は、配列番号94と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドであり、
- n及びmは、独立して、0及び1から選択される整数であり、
- [NUC1]は、2から40ヌクレオチド、より好ましくは15から25ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、
- [NUC2]は、2から40ヌクレオチド、より好ましくは15から25ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである}
に反応する。

好ましい実施形態では、m=1であり、[NUC1]は、配列番号75のポリヌクレオチド又は配列番号75とは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含むか又はそれからなる。

式(I)のアプタマーの例は、配列番号66のアプタマーである。

結果として、本発明により使用されるアプタマーは、以下の式:
5'-[NUC1]-[CENTRAL]-[NUC2]n-3'
{式中、
nは、0又は1である}
に反応する。

ある特定の他の実施形態では、[NUC2]は、配列番号76のポリヌクレオチド又は配列番号76とは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含むか又はそれからなる。

特定の態様では、本発明により使用されるアプタマーは、式(I):
5'-[NUC1]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3' (I)
{式中、
mは1であり、
nは0又は1であり、
[NUC1]は、配列番号75のポリヌクレオチド又は配列番号75とは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾、より好ましくはヌクレオチド欠失の割合で異なるポリヌクレオチドであり、
[NUC2]は、2から40ヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチドであり、かつ
[CENTRAL]は、配列番号94のポリヌクレオチドであるか、又は配列番号94とは1、2、3、4、5若しくは6ヌクレオチドの修飾、より好ましくはヌクレオチド欠失の割合で異なるヌクレオチド配列を有する}
のアプタマーでありうる。

ある特定の実施形態では、[NUC2]は、配列番号76のポリヌクレオチドであるか、又は配列番号76とは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾の割合で異なる配列を有し、上記ヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチド置換及びヌクレオチド欠失から選択されることがより好ましい。

ある特定の実施形態では、上記第1の亜群のアプタマーは、下線を引いたヌクレオチドにより図1Aに示されるコンフォメーション基を含むことができる。より一般的な態様では、本発明により使用されるアプタマーは、15から19ヌクレオチド、好ましくは17ヌクレオチドを含む中心ループであって、
- 4から6ヌクレオチド、より好ましくは5ヌクレオチドの長さを有する第1のロッド、
- 13から15ヌクレオチド、より好ましくは14ヌクレオチドを含むループに接続された、2から4ヌクレオチド、より好ましくは3ヌクレオチドを有する第2のロッド、及び
- 場合により、2から4ヌクレオチド、より好ましくは3ヌクレオチドを含むループに接続された、2から8ヌクレオチド、より好ましくは7ヌクレオチドを有する第3のロッド
を有する中心ループを含むコンフォメーション基を形成できるヌクレオチドドメインを含むヌクレオチド配列を有しうる。

ある特定の好ましい実施形態では、第1のロッドは、第2にロッドに隣接し、第3のロッドに由来する2つのヌクレオチドにより分離されている。

本発明の第1の亜群に属するアプタマーは、本明細書中、上記で定義されたわずかに酸性のpH、より好ましくは約6.3のpHにおいてフィブリノーゲンに結合可能である。特に、第1の群のアプタマーは、pH依存性の方法でフィブリノーゲンに結合しうる。

ある特定の実施形態では、上記アプタマーは、pH6.3において、pH7.4のようなわずかにアルカリ性のpHに比べてフィブリノーゲンに対する増加した親和性を有する。ある特定の実施形態では、上記アプタマーは、7.0又はそれ超のpHにおいてはフィブリノーゲンに結合しない。

上記亜群のアプタマーは、Mg2+の存在下でフィブリノーゲンに結合することもできる。ある特定の実施形態では、上記アプタマーは、pH及び/又は媒体中のMg2+の存在に依存する、フィブリノーゲンへの結合親和性を有することができる。例えば、フィブリノーゲンへのアプタマーの結合親和性は、mMの範囲内の濃度、例えば、1から10mMのMg2+の存在下で、Mg2+を欠く同じ媒体に比べて増加しうる。別の例として、本発明により使用されるアプタマーは、約6.3のpHにおいてフィブリノーゲンに特異的に結合し、pH7.4のような7.0よりも高いpHにおいてはフィブリノーゲンに結合しない。

これらの性質は、例えば、「実施例」と題された以下のセクションにおいて配列番号66のアプタマーに関して本明細書に示される。

- 本発明により使用されるアプタマーの第2の亜群
アプタマーの第2の亜群は、それに限定されることなく、配列番号58〜65のアプタマー及び配列番号67のベース配列を包含する。

配列番号58〜65及び配列番号67のアプタマーは、その配列中に2つのコンセンサス基、すなわち、図1Cの配列のアラインメントに示されるとおり、GGTGTAT(配列番号78)の上流のGTTGGTAGGG(配列番号77)を含む。いかなる理論にとらわれることも望むものではないが、出願人は、これらのコンセンサス基が配列番号58のアプタマーについて図1Bに示されるループを形成するアプタマーの領域中に位置すると考える。このコンフォメーションの基は、上記アプタマーのフィブリノーゲンへの結合において役割を演じうる。結果として、このアプタマーの第2の亜群は、フィブリノーゲンに特異的に結合し、配列番号77及び配列番号78のヌクレオチド群を含むアプタマーを包含し、上記アプタマーのベース配列中で配列番号77は、配列番号78の上流にある。

好ましくは、上記アプタマーは、式(III):
5'-[配列番号79]-[X1]-[配列番号77]-[X2]-[配列番号78]-3'
{式中、
- [X2]及び[X1]は、独立して、2から5ヌクレオチドの長さ、より好ましくは2又は3ヌクレオチドの長さのヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを示し、
- [配列番号77]は、配列番号77のオリゴヌクレオチド(すなわち、GTTGGTAGGG)であり、
- [配列番号78]は、配列番号78のオリゴヌクレオチド(すなわち、GGTGTAT)であり、
- [配列番号79]は、配列番号79のオリゴヌクレオチド(すなわち、TGT)である}
のヌクレオチド基を含む。

例えば、本発明により使用されるアプタマーは、式(III)、式中、X1は、ヌクレオチド、例えば、G又はTを示し、X2は、3ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、の基を含むことができる。ある特定の実施形態では、アプタマーは、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74及び配列番号95からなる群から選択される配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、又は95%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを更に含むことができる。

結果として、アプタマーの第2の亜群は、フィブリノーゲンに特異的に結合するアプタマーであって、
- 配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74及び配列番号95を含む群から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、又は95%の配列同一性を有し、かつ
- 式(III):
5'-[配列番号79]-[X1]-[配列番号77]-[X2]-[配列番号78]-3'
{式中、
- [X2]及び[X1]は、独立して、2から5ヌクレオチド、より好ましくは2又は3ヌクレオチドの長さのヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを示し、
- [配列番号77]は、配列番号77のオリゴヌクレオチド(すなわち、GTTGGTAGGG)であり、
- [配列番号78]は、配列番号78のオリゴヌクレオチド(すなわち、GGTGTAT)であり、
- [配列番号79]は、配列番号79のオリゴヌクレオチド(すなわち、TGT)である}
のヌクレオチド基を含む、
ポリヌクレオチドを含むアプタマーを包含する。

本発明により使用されるアプタマーは、20から150ヌクレオチド、例えば、特に26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99のような25から100ヌクレオチドの長さを有することがより好ましい。

追加の又は代わりの実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに結合し、配列番号67のベース配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、又は95%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

ある特定の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合し、配列番号67のポリヌクレオチド又は配列番号67とは1、2、3、4、5若しくは6ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含む。
- 具体的な態様では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合し、式(I) 5'-[NUC1]m-[CENTRAL]-[NUC2]n-3'
{式中、
n及びmは、独立して、0及び1から選択される整数であり、
- [NUC1]は、2から40ヌクレオチド、より好ましくは15から25ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、
- [NUC2]は、2から40ヌクレオチド、より好ましくは15から25ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、かつ
- [CENTRAL]は、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号94及び配列番号95を含む群から選択されるヌクレオチドの配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、又は95%の配列同一性を有し、上記で定義された式(III)のヌクレオチド基を含むポリヌクレオチドである}
に反応する。

ある特定の実施形態では、本発明により使用されるアプタマーは、以下の特徴:
- n=m=1、
- [NUC1]は、配列番号75のポリヌクレオチド又は配列番号75のポリヌクレオチドとは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、
- [NUC2]は、配列番号76のポリヌクレオチド又は配列番号76のポリヌクレオチドとは1、2、3若しくは4ヌクレオチドの修飾の割合で異なるポリヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、
- [CNETRAL]は、配列番号95と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%の配列同一性を有し、本明細書中、上記で定義した式(III)のヌクレオチド基を含む
のうちの少なくとも1つ、2つ、3つ又はすべてを含む、式(I)のアプタマーである。

別の代わりの又は具体的な態様では、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンに特異的に結合し、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65及び配列番号67から選択されるポリヌクレオチドと、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%又は95%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

ある特定の実施形態では、上記第2の亜群のアプタマーは、下線を引いたヌクレオチドにより図1B中に示されるとおり、コンフォメーション基を含むことができる。より一般的な態様では、本発明により使用されるアプタマーは、23から27ヌクレオチドのループに結合された2から5ヌクレオチド、例えば、4ヌクレオチドの長さを有するロッドを含む、コンフォメーション基を形成することのできるヌクレオチドドメインを含むヌクレオチド配列を有することができる。好ましくは、ループは、いかなるロッド-ループ基又は追加のロッド基も欠いている。

上記第2の亜群に属するアプタマーは、わずかに酸性のpH、より好ましくは約6.3のpHにおいてフィブリノーゲンに結合することができる。ある特定の実施形態では、上記アプタマーは、pH7.4のような7.0よりも高いpHに比べて、pH6.3においてフィブリノーゲンとの結合が増大している。好ましくは、上記アプタマーは、7.0よりも高いpHにおいてはフィブリノーゲンに結合しない。より一般的には、第2の亜群のアプタマーは、pH依存性の方法でフィブリノーゲンに結合することができる。

アプタマーのこの亜群は、Mg2+の非存在下でフィブリノーゲンに結合することもできる。ある特定の実施形態では、上記アプタマーは、pH及び/又は媒体中のMg2+の存在に依存する、フィブリノーゲンへの結合親和性を有しうる。例えば、フィブリノーゲンへのアプタマーの結合親和性は、Mg2+を欠く同じ媒体に比べて、Mg2+の存在下、例えば、mMの範囲でMg2+を含む媒体中で低減されうる。

- アフィニティーリガンドとしての本発明によるアプタマーの使用
フィブリノーゲンに対するアプタマーを含むアフィニティーリガンドが、本発明により使用されうる。上記アフィニティーリガンドは、フィブリノーゲンの精製のために固相担体に固定化されうる。

典型的には、本発明により使用されるアフィニティーリガンドは、少なくとも1つの(ii)好適な基材への固定化に有用な非アプタマー実体に結合された(i)アプタマー基、すなわち、上記で定義されたような、フィブリノーゲンに対するアプタマー、を含む。好ましくは、非アプタマー実体は、アプタマーの5'又は3'末端に結合されることがより好ましい。

ある特定の実施形態では、アフィニティーリガンドは、直接的に又はスペーサー基によりアプタマー基に結合された固定化手段を含むことができる。結果として、アフィニティーリガンドは、式(IV):
[IMM]-([SPACER])p-[APTAMER]
{式中、
- [APTAMER]は、上記で定義されたようなアプタマーを示し、
- [SPACER]は、スペーサー基であり、
- [IMM]は、担体へのアプタマーの固定化のための基であり、かつ
- pは0又は1である}
の化合物を含むか又はそれからなることができる。

pイコール0は、スペーサーが不存在であり、[IMM]が[APTAMER]に直接結合し、より好ましくは、アプタマーの3'又は5'末端に結合していることを意味する。

pイコール1は、スペーサーが存在し、[IMM]及び[APTAMER]を結合していることを意味する。

スペーサー基は、典型的に、アプタマー基の立体障害を低減するように、かつフィブリノーゲンに特異的に結合するアプタマーの能力をなお保持しつつ、その到達性を改善するように、選択される。スペーサー基は、任意のタイプでありうる。スペーサーは、非特異的な一本鎖ヌクレオチド、すなわち、フィブリノーゲンを含むタンパク質に結合することができないものでありうる。典型的に、スペーサーは、2から20ヌクレオチドの長さを有することができる。好適な核スペーサーの例は、ポリA及びポリTである。ある特定の他の実施形態では、スペーサーは、非核性の化学的実体でありうる。例えば、スペーサーは、ペプチド、ポリペプチド、二糖若しくは多糖、1つ又は数個のヘテロ原子で場合により中断され、ヒドロキシル、ハロゲン若しくはC1〜C 3のアルキルのような1つ又は数個の置換基により場合により中断される炭化水素鎖;連続したホモポリマー、コポリマー及びポリマー、その組合せを含むポリマーからなる群から選択されうる。例えば、スペーサーは、ポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシリコン、及びその組合せのようなポリエーテルを含む群から選択されうる。例えば、スペーサーは、ヘテロ原子、より好ましくは-O-若しくは-S-、-NHC(O)-、-OC(O)-、-NH-、-NH-CO-NH-、-O-CO-NH-、ホスホジエステル又はホスホロチオエートのような任意の好適な基により結合された数個の炭化水素、オリゴマー又はポリマー鎖を含むことができる。これらのスペーサー鎖は、5から50炭素原子のような2から200炭素原子を含むことができる。好ましくは、スペーサーは、非特異的なオリゴヌクレオチド、炭化水素鎖、ポリエーテル、特に、ポリエチレングリコール及びその組合せから選択される。

例えば、スペーサーは、2から20個のモノマーを含む、少なくとも1つのポリエチレングリコール基を含む。例えば、スペーサーは、好適な結合セグメントにより一緒に結合された1から4個のトリエチレングリコールブロックを含むことができる。例えば、スペーサーは、C12の親水性エチルアミントリエチレングリコールの誘導体でありうる。或いは、スペーサーは、C2〜C20の炭化水素鎖、特に、C12のメチレン鎖のようなC2〜C20のアルキル鎖でありうる。

スペーサーは、より好ましくはアプタマー基の3'末端又は5'末端に結合される。

[IMM]は、アフィニティーリガンドを基材、より好ましくは固相担体上に固定化することを可能とする任意の好適な基を示す。[IMM]は、アフィニティーリガンドを基材上に固定化しようとする相互作用のタイプに依存する。

例えば、アフィニティーリガンドは、水素結合、静電力又はファンデルワールス力を含む、特定の非共有結合のおかげで固定化されうる。例えば、担体上へのアフィニティーリガンドの固定化は、リガンド/アンチリガンド対(例えば、ビオチン/ビオチン抗体及びジゴキシゲニン/ジゴキシゲニン抗体のような抗原/抗体、又はリガンド/受容体)及び結合タンパク質標識に依存しうる。多数のタンパク質標識が当業者に周知であり、例えば、(ストレプトアビジン又はアビジン誘導体との結合のための)ビオチン、(タンパク質又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合された他の物質との結合のための)グルタチオン、(タンパク質又はマルトースへの結合タンパク質に結合された他の物質との結合のための)マルトース、(糖基への結合のための)レクチン、c-myc標識、ヘマグルチニン抗原標識(HA)、チオレドキシン標識、FLAG標識、ポリArg標識、ポリHis標識、Strep標識、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン等を包含する。ある特定の実施形態では、[IMM]はビオチンを示す。結果として、本発明により使用されるアフィニティーリガンドは、アビジン又はストレプトアビジンがgraftされる担体への固定化のために好適である。

或いは、アフィニティーリガンドは、固相担体への共有結合によるgraftに好適でありうる。したがって、[IMM]は化学反応性基を含む化学的実体を示す。化学的実体は、典型的に、1000g.mol^-1よりも低い、好ましくは700、600、500又は400gmol^-1よりも低いような、800g.mol^-1よりも低い分子量を有する。反応性基は、任意のタイプでありえ、一次アミン、マレイミド基、スルフヒドリル基等を包含する。

例えば、化学的実体は、SIAB化合物、SMCC化合物又はその誘導体に由来しうる。オリゴヌクレオチドを固定化するためのスルホ-SIABの使用が、例えば、Allersonら、RNA、2003年、9:364〜374頁に記載されている。

ある特定の実施形態では、[IMM]は、一次アミノ基を含む。例えば、[IMM]は、-NH2又はC1〜C30のアミノアルキル、より好ましくはC1〜C6のアミノアルキルでありうる。[IMM]が、活性化されたカルボン酸基を有する担体への固定化のために好適な第1級基を含む、アフィニティーリガンド。活性化されたカルボン酸基は、それに限定されることなく、酸塩化物、混合エステル及び無水基を包含する。好ましい活性カルボン酸基は、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである。

本明細書中、上記で述べたとおり、[IMM]-([SPACER])pは、より好ましくはアプタマーの3'末端又は5'末端に結合される。[IMM]-([SPACER])pに結合されていないアプタマー基の末端は、2'-o-メチル-若しくは2'-フルオロピリミジン、2'-リボプリン、ホスホラミダイト、逆位ヌクレオチドのような化学修飾されたヌクレオチド又はPEG若しくはコレステロールのような化学基を含むことができる。これらの修飾は、リガンドの分解、特に酵素分解を防止しうる。他の実施形態では、アプタマーの上記遊離端(すなわち、[IMM]又は[SPACER]に結合されていない末端)は、本明細書中、上記されたような検出手段に連結されうる。

選択的にフィブリノーゲンに結合することのできるアフィニティー担体も、本発明によって使用可能であり、この担体上に本明細書中、上記したような複数のアフィニティーリガンドを含む。

アフィニティーリガンドは、非共有結合による相互作用により、又は1つ若しくは複数の共有結合により固相担体に固定化されうる。

ある特定の実施形態では、アフィニティーリガンドは、上記担体上に共有結合によりgraftされる。典型的に、graftは、リガンドの[IMM]基中に存在する化学反応性基と固相担体の表面上に存在する化学反応性基との反応により実行される。

好ましくは、リガンドの化学反応性基は一級アミン基であり、固相担体上に存在するものは、NHSにより活性化されたカルボン酸基(すなわち、N-ヒドロキシスクシニミジルエステル)である。この場合、graft反応は、実施例4において示され、その記載が参照することにより本明細書に組み込まれるWO2012090183に記載のとおり、6よりも低いpH、例えば、3.5から4.5のpHにおいて実行されうる。

アフィニティー担体の固相担体は、任意のタイプでありえ、考えられる用途に従って選択される。

例えば、固相担体は、プラスチック、金属及びガラス、ニッケル/ニッケル酸化物、チタン、ジルコニウム酸化物、シリコン、加圧シリコン、多結晶シリコン、二酸化シリコン又はセラミックのような無機物から選択されうる。上記担体は、マイクロ電子デバイス、マイクロ流体デバイスのようなデバイス、センサー、バイオセンサー又はチップ、例えば、SPRとの使用に好適なものに含有されうる。或いは、担体は、ポリマー、金属又は磁性ビーズのようなビーズの形態でありうる。これらの担体は、検出及び診断ニーズのために好適でありうる。

他の実施形態では、固相担体は、ポリマーゲル、フィルター又はメンブレンでありうる。特に、固相担体は、寒天、架橋寒天、セルロース又はポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリアミド、ポリスルホンのような合成ポリマー及びその誘導体からなることができる。これらの担体は、フィブリノーゲンの精製のために好適でありうる。例えば、固相担体は、クロマトグラフィーのための担体でありえ、特に、液体アフィニティークロマトグラフィーのための担体でありうる。例えば、本発明により使用されるアフィニティー担体は、工業規模でのアフィニティークロマトグラフィーを実行するために好適でありうる。したがって、本発明により使用されるアフィニティー担体は、クロマトグラフィー法、例えば、カラムクロマトグラフィー法又は不連続クロマトグラフィー法における固定相として使用されうる。

フィブリノーゲンの精製における本発明によるアプタマー及びアフィニティーリガンドの使用
本発明により使用されるフィブリノーゲンを捕捉するための方法は、以下の工程:
- 本発明により使用されるアプタマー又はアフィニティーリガンドがその上に固定化される固相担体を供給する工程と、
- フィブリノーゲンと固相担体上に固定化された上記アプタマー又は上記アフィニティーリガンドの間の複合体の形成により、フィブリノーゲンが捕捉されるように、フィブリノーゲンを含有する溶液と上記固相担体を接触させる工程と
を含む。

ある特定の実施形態では、方法は、
- 上記複合体からフィブリノーゲンを放出させる工程、
- 上記複合体からフィブリノーゲンを回収する工程、
- フィブリノーゲンと上記アプタマー又はアフィニティーリガンドの間の複合体の形成を検出する工程、
- フィブリノーゲンを定量化する工程
のような、1つ又は数個の追加の工程を含むことができる。

複合体の検出及びフィブリノーゲン(又は複合体)の定量化は、当業者に公知の任意の方法により実行されうる。例えば、検出及び定量化は、実施例に示されるとおり、SPRにより実行されうる。

或いは、標識された抗フィブリノーゲン抗体がフィブリノーゲンと本発明によるアフィニティーリガンドの間に形成された複合体の検出又は定量化のために使用される、ELISAタイプの試験を使用することが可能である。抗フィブリノーゲン抗体は、フルオロフォアで標識されうるか又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような検出のために好適な酵素にカップリングされうる。

以下の実施例5及び6に詳細に示されるとおり、本発明により使用されるアプタマーは、フィブリノーゲンの精製における使用に特に好適である。

出発組成物を使用する、本発明により使用されるフィブリノーゲンの精製の方法は、以下の工程:
a.上記出発組成物を、本明細書中、上記で定義されたようなアフィニティー担体と、(i)上記担体上に固定化されたアプタマー又はアフィニティーリガンドと(ii)フィブリノーゲンの間の複合体の形成のために好適な条件において接触させる工程と、
b.上記複合体からフィブリノーゲンを放出させる工程と、
c.精製された形態でフィブリノーゲンを回収する工程と
を含む。

フィブリノーゲンを含有する出発組成物を使用する、精製されたフィブリノーゲン組成物のための本発明により使用される調製の方法は、以下の工程:
a.上記出発組成物を、本明細書中、上記で定義されたようなアフィニティー担体と、(i)上記担体上に固定化されたアプタマー又はアフィニティーリガンドと(ii)フィブリノーゲンの間の複合体の形成のために好適な条件において接触させる工程と、
b.上記複合体からフィブリノーゲンを放出させる工程と、
c.精製されたフィブリノーゲン組成物を回収する工程と
を含む。

本明細書において意味されるとおり、出発組成物は、潜在的にフィブリノーゲンを含む任意の組成物でありうる。出発組成物は、フィブリノーゲンがそれから分離されなければならない混入物を含有しうる。

混入物は、任意のタイプでありえ、出発組成物の性質に依存することができる。混入物は、タンパク質、塩、ホルモン、ビタミン、栄養素、脂質、細胞膜の断片のような細胞片等を包含する。ある特定の実施形態では、混入物は、凝固因子、フィブロネクチン、アルブミン、イムノグロブリン、プラスミノーゲン、アルファ-2-マクログロブリン等のような血液タンパク質を含みうる。

ある特定の他の実施形態では、混入物は、非ヒトタンパク質、特に組換え細胞、細菌若しくは酵母、又はトランスジェニック動物のような組換え宿主により内因的に発現された非ヒトタンパク質を含みうる。

典型的に、出発組成物は、細胞培養であるか、又は細胞培養に由来するか、発酵ブロスに由来するか、細胞ライセートに由来するか、組織に由来するか、器官に由来するか、若しくは体液に由来することができる。本明細書において意味されるとおり、「出発組成物」は、乳、血液又は細胞培養のような目的の実体に由来し、これは、出発組成物が、上記実体を1つ又は数個の処理工程に従わせることにより上記実体から得られることを意味する。例えば、目的の実体は、細胞ライセート、塩の沈降、cryo-precipitation若しくは凝結のような沈降の工程、加圧ろ過若しくは限外ろ過のようなろ過の工程、遠心分離、清澄化、クロマトグラフィー、液液若しくは固液抽出のような抽出の工程、ウイルス不活化、低温殺菌、凍結/融解の工程等のような1つ又は数個の処置に従わせることができる。例えば、血液由来の出発組成物は、それに限定されることなく、血漿、血漿画分及びクリオプレシピテートを包含する。

ある特定の実施形態では、出発溶液は、血液、より好ましくはヒト血液に由来する。出発組成物は、血漿、血漿画分、例えば、コーンのエタノール分画法により得られた画分I及び血液クリオプレシピテートから選択されうる。ある特定の実施形態では、出発組成物は、イムノグロブリンが枯渇した血漿画分及び/又はアルブミンが枯渇した血漿画分及び/又はビタミンK依存性凝固タンパク質が枯渇した血液若しくは血漿画分である。

ある特定の他の実施形態では、出発組成物は組換え宿主から得られる。好ましくは、組換え宿主は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物のようなトランスジェニック動物である。非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、ヒトフィブリノーゲンを発現するように遺伝子改変された任意の動物でありうる。好ましくは、ヒトフィブリノーゲンは、上記トランスジェニック動物の体液中で発現される。

したがって、出発溶液はトランスジェニック動物の体液であるか又はそれに由来しうる。体液は、それに限定されることなく、血液、乳及び尿を包含する。

具体的な実施形態では、出発組成物は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物からの乳であるか又はそれに由来する。乳中に目的のタンパク質を分泌することのできるトランスジェニック動物の作成方法は技術において周知である。典型的に、これらの方法は、(カゼインプロモーター又はWHAPプロモーターのような)非ヒト哺乳動物の胚において乳中に自然に分泌されるタンパク質からのプロモーターに任意選択により結合された目的のタンパク質のためのコード遺伝子を含む、遺伝子アセンブリ生成物の導入を包含する。次いで、胚は同じ動物種に属し、妊娠のためにホルモンの観点から準備された雌の子宮に移される。

ある特定の好ましい実施形態では、出発組成物は、ヒト血液、トランスジェニックミルク及びその派生物から選択されうる。

本発明の方法において使用されるアフィニティー担体は、本明細書中、上記の任意のアフィニティー担体でありうる。好ましくは、アフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィーを実行するためのアフィニティー担体である。実際に、フィブリノーゲンの精製又は精製されたフィブリノーゲンの組成物を調製するための方法は、より好ましくは、クロマトグラフィー技術、例えば、不連続モード又はカラムに基づき、アフィニティー担体は、固定相の役割を演じる。工程a)において、フィブリノーゲンを含有する好適な体積の出発組成物が、フィブリノーゲンの分子と上記アプタマー基の間に複合体が形成されるような方法で、アフィニティー担体の表面上に存在する抗フィブリノーゲンアプタマー基とフィブリノーゲンの特異的相互作用に都合のよい条件でアフィニティー担体と接触させられる。したがって、工程a)では、フィブリノーゲンがアフィニティー担体上に保持される。アプタマー基とフィブリノーゲンの分子の間の結合は、工程a)をわずかに酸性のpHにおいて実行することにより強化されうる。ある特定の実施形態では、工程a)は、7.0よりも低いpH、好ましくは6.9、6.8又は6.7よりも低いpHにおいて実行される。特に、工程a)は、6.0から6.8のpH、より好ましくは6.0、6.1、6.2、6.3、6.4又は6.5のような6.0から6.5のpHにおいて実行されうる。例えば、工程a)は、6.3のpHのような6.1から6.5のpHにおいて実行されうる。より一般的な態様では、工程a)のpH条件は、アフィニティー担体上のフィブリノーゲンの結合に好都合であるが、なおアフィニティー担体上の他の分子の結合を最小化するような方法で選択されうる。典型的に、工程a)は、(以下、「結合緩衝液」と呼ばれる)緩衝溶液の存在下で実行される。結合緩衝液は、工程a)の前に出発組成物と混合されるか又は工程a)の間に添加されうる。典型的に、結合緩衝液は、緩衝剤を含有する水溶液である。緩衝剤は、フィブリノーゲン及びアフィニティー担体と適合性であるように、かつ工程a)のための所望のpHを与えるように選択されうる。例えば、約6.3のpHを得るために、緩衝剤は、それに限定されることなく、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(M
ES)、HEPES、Bis-TRIS、シトレート及びアセテートから選択されうる。緩衝剤は、約5mMから1mM、例えば、10mMから500mM、例えば、約50mMのような、10mMから200mMの濃度で存在しうる。

いかなる理論にとらわれることも意図するものではないが、塩の存在は、フィブリノーゲンと固相担体のアプタマー基の間の複合体の形成に好都合でありえ、及び/又は出発組成物中に存在する他の分子の結合を防止することができる。典型的に、工程a)は、例えば、10mMから500mM、より好ましくは50mMから350mMの範囲の濃度、又は約150mMのような100mMから200mMの範囲の濃度の塩化ナトリウムの存在下で実行されうる。

二価カチオンの存在は、フィブリノーゲンのアプタマー基への結合を調節することができる。ある特定の実施形態では、工程a)は、少なくとも1mM、例えば、約1mMから50mM、例えば、約5mMの濃度のような1mMから20mMの濃度の、Mg2+のような二価カチオンの存在下で実行される。

ある特定の他の実施形態では、工程a)は、Mg2+の非存在下で;より一般的には、二価カチオンの非存在下で実行される。

結果として、工程a)において使用される結合緩衝液は、100mMから500mMの濃度のNaCl及び約1mMから50mMの濃度の塩化マグネシウム(MgCl2)のようなマグネシウム塩を含むことができ、5.0又は6.9のpHを有することができる。この緩衝液は、固相担体上に存在するアプタマー基が本明細書中、上記で定義された本発明の第1の亜群において選択される場合に、好適でありうる。

特にアプタマー基が上記で定義された第1の亜群に属する場合、工程a)を実行するために好適な結合緩衝液は、50mMのMOPS、5mMのMgCl2及び150mMのNaClを含む、pH6.3の緩衝液でありうる。

アフィニティー担体上に存在するアプタマー基が本明細書中、上記で定義されたアプタマーの第2の群において選択される場合、結合緩衝液は、Mg2+を、より一般的には、二価カチオンを欠くことができる。したがって、工程a)を実行するために好適な結合緩衝液は、50mMのMOPS及び150mMのNaClを含む、pH6.3の緩衝液でありうる。

工程a)の最後であって、工程b)の前に、アフィニティー担体は、特異的に結合していないが担体に吸着された物質を排除するような方法で、好適な洗浄緩衝液により洗浄されうる。言うまでもなく、洗浄緩衝液は、フィブリノーゲンとアプタマー基の間の複合体を顕著に変化させないが、アフィニティー担体に特異的に結合していない物質の脱離になお好都合である。

よって、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、工程a)の最後で工程b)の前にアフィニティー担体を洗浄する工程を含む。当業者に周知の任意の慣用の洗浄緩衝液が使用されうる。ある特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、工程a)において使用される結合緩衝液と同じ組成を有する。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、工程a)において使用される結合緩衝液に比べて、同じ構成要素であるが、異なる濃度のものを含みうる。追加の又は代わりの実施形態では、洗浄緩衝液のpHは、結合緩衝液のそれと同じである。

洗浄緩衝液は、7よりも低いpH、例えば、pH5.0から6.9、より好ましくはpH6.3のような6.1から6.5を有することができる。洗浄緩衝液は、NaClを更に含みうる。典型的には、洗浄緩衝液のイオン力は、結合緩衝液のそれよりも高いことが可能である。実際に、出願人は、本発明のある特定のアプタマーに関して、高いイオン力がフィブリノーゲンのアプタマー基への結合を顕著に変更しない可能性があることを示した。言い換えれば、フィブリノーゲンと本発明により使用されるある特定のアプタマーの間の複合体は、高いイオン力の存在下でさえ、安定でありうる。よって、ある特定の実施形態では、洗浄溶液は、工程a)において使用される結合緩衝液のそれよりも高いイオン力を有する。代わりの又は追加の実施形態では、洗浄緩衝液は、少なくとも100mMであって、10M以下のNaCl濃度を含みうる。例えば、NaClの濃度は、約100mMから5mM、より好ましくは150mMから2mMでありうる。場合により、洗浄緩衝液は、約0.1mMから20mM、より好ましくは約5mMの濃度のような1mMから10mMの濃度の二価カチオン、特にMg2+を更に含む。ある特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、Mg2+を欠き、より一般的には二価カチオンを欠く。

ある特定の他の追加の実施形態では、洗浄緩衝液は、少なくとも1つの追加の構成要素、より好ましくはアルキルジオールから選択される、特にエチレングリコール又はプロピレングリコールから選択される少なくとも1つの追加の構成要素を含むことができる。実際に、本発明により使用されるある特定のアプタマーのためには、洗浄溶液中のエチレングリコールのようなアルキルジオールの存在は、フィブリノーゲンとアプタマーの間の複合体を変化させない。したがって、洗浄緩衝液は、1質量%から70質量%、より好ましくは50質量%のような10質量%から60質量%の量のエチレングリコール又はプロピレングリコールのようなアルキルジオールを含みうる。

単に例示の目的のために、洗浄緩衝液は、pH6.3において50mMのMOPS、2MのNaCl及び場合により、50質量%のグリコールを含む。この洗浄緩衝液は、本明細書中、上記のアプタマーの第2の亜群に属するアプタマー基を有するアフィニティー担体の洗浄を実行するために好適でありうる。洗浄緩衝液の別の例は、pH6.3において50mMのMOPS、0.5MのNaCl及び5mMのMgCl2を含む溶液である。

工程b)は、工程a)において形成された複合体からフィブリノーゲンを放出させることが目的である。この放出は、フィブリノーゲンとアプタマー基の間の複合体の不安定化により、すなわち、アプタマーのフィブリノーゲンへの親和性を低減させる条件を使用して得られうる。アプタマー基とフィブリノーゲンの間の複合体が、フィブリノーゲンを変化させることのできない穏やかな条件において不安定化させられうることは注目されるべきである。

本明細書中、上記で説明したとおり、本発明により使用されるアプタマーのフィブリノーゲンに結合する能力は、媒体のpHに依存しうる。7.0を超えるpHの増加は、フィブリノーゲンの放出に好都合であることを可能とする。よって、ある特定の実施形態では、工程b)は、7.0を超えてpHを増加させることにより実行される。好ましくは、工程b)のpHは、7.0から8.0、例えば、7.4のpHのような7.2から7.8である。言い換えれば、7.0よりも高いpHの溶出緩衝液が、フィブリノーゲンの放出に好都合とするために使用されうる。単に例示の目的のために、好適な溶出緩衝液は、pH7.4において50mMのMOPSにより緩衝化され、150mMのNaClを含む溶液でありうる。

本明細書中、上記で説明したとおり、アプタマーのフィブリノーゲンに結合する能力は、Mg2+のような二価カチオンの存在によっても変化しうる。例えば、フィブリノーゲンへのアプタマー基の結合は、Mg2+の存在により好都合とされうる。よって、工程b)における複合体からのタンパク質の放出は、二価カチオンを欠き及び/又はEDTA若しくはEGTAのような二価カチオンをキレート化する作用物質を含む溶出緩衝液を使用することにより好都合とされうる。例えば、二価カチオンをキレート化する作用物質は、工程b)において使用される溶出緩衝液中、少なくとも1mMであって、最大500mMの濃度で存在しうる。二価カチオンをキレート化するキレート化の利用は、本明細書中、上記した第1の亜群に属するアプタマーを有するアフィニティー担体に好適でありうる。

他の実施形態では、フィブリノーゲンへのアプタマー基の結合は、Mg2+のような二価カチオンの存在下で減少しうる。よって、この実施形態では、溶出緩衝液は、二価カチオン、特にMg2+を、約0.1mM〜20mM、より好ましくは約5mMの濃度のような1mMから10mMの濃度で含むことができる。この溶出は、本明細書中、上記で定義された第2の亜群に属するアプタマー基により形成された複合体からのタンパク質の放出に好適でありうる。

工程b)において使用可能な溶出緩衝液の別の例は、2MのMgCl2を含む、pH7.4の50mMのMOPSの溶液である。

工程c)の最後において、精製されたフィブリノーゲンが、典型的には、精製された液体組成物の形態で得られる。この精製された液体組成物は、1つ又は複数の追加の工程に供されうる。上記液体組成物は、より好ましくは滅菌条件下で、濃縮され及び/又は例えば、滅菌ろ過による若しくは洗剤による不活性化若しくはウイルス除去、ダイアフィルトレーション、1種又は数種の薬学的に許容できる賦形剤による製剤の工程、凍結乾燥、圧縮並びにその組合せに供されうる。

より一般的な態様では、フィブリノーゲンの精製の方法又は精製されたフィブリノーゲン組成物の調製の方法としては、それに限定されることなく、排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーの1つ又は数個の工程、沈降の工程、加圧ろ過、限外ろ過、タンジェンシャル限外ろ過、ナノフィルトレーション及び逆浸透のような1つ又は数個のろ過の工程、清澄化の工程、不活性化における工程又はウイルス除去、滅菌、製剤、凍結乾燥、パッケージングの工程並びにその組合せが挙げられる、1つ又は数個の追加の工程を含みうる。

ある特定の追加の実施形態では、フィブリノーゲンの精製の方法又は精製されたフィブリノーゲン組成物の調製の方法は、以下の特徴の組合せ:
- 組合せ1:(i)アプタマー基は、本明細書中、上記で定義された第1の亜群のアプタマーから選択され、(ii)工程(a)は、pH5.8〜6.5、より好ましくは6.3において、Mg2+の存在下で実行され、及び(iii)工程(b)は、pH7.0〜8.0、より好ましくは7.4において、場合により、二価カチオンをキレート化する作用物質の存在下で実行される、並びに
- 組合せ2:(i)アプタマー基は、本明細書中、上記で定義された第2の亜群のアプタマーから選択され、(ii)工程(a)は、pH5.8〜6.5、より好ましくは6.3において、Mg2+の非存在下で実行され、及び(iii)工程(b)は、pH7.0〜8.0、より好ましくは7.4において、Mg2+の存在下で実行される、
のうちの1つを含む。

追加の態様では、本発明のアプタマー及びアフィニティーリガンドは、血漿の分画の方法において使用されうる。血漿の分画の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの数個の連続した工程を含むことができ、アフィニティークロマトグラフィーの各工程が、フィブリノーゲン、イムノグロブリン、アルブミン及びビタミンK依存性凝固因子のような他の凝固因子等の目的の血漿タンパク質を回収することを可能とする。各工程において使用されるアフィニティーリガンドは、任意のタイプ、特にアプタマーでありうる。これに関して、驚くべきことに出願人は、フィブリノーゲン、アルブミン及びイムノグロブリンのような血漿タンパク質が、アプタマーに基づくアフィニティークロマトグラフィーの連続した工程を実行することにより、血漿を使用して回収され、精製されうることを示した。アプタマーに基づくアフィニティークロマトグラフィーの連続した工程を含む、血漿の分画の方法が、少なくとも96%、更に少なくとも99%のタンパク質純度を有するフィブリノーゲンの濃縮物及びイムノグロブリンの濃縮物を、イムノグロブリンについては血漿1リッターあたり約9〜12g、及びフィブリノーゲンについては血漿1リッターあたり2〜4gのアウトプットで得ることを可能とすることに注目されたい。出願人は、これらの良好なアウトプット及びこれらの良好な純度の割合が、未加工の血漿を使用して達成されうることを更に示した。言い換えれば、アプタマーに基づくアフィニティークロマトグラフィーの工程は、エタノール分画(コーン法)、cryo-precipitation、カプリレート分画又はPEGによる沈降のようないかなる前処理も含まず、未加工の血漿に対して実行されうる。この分画法が、一時的な中間の冷蔵を回避可能とすることに注目されたい。

したがって、本発明の別の目的は、
(a)フィブリノーゲンを回収するためのアフィニティークロマトグラフィーの工程であって、アフィニティーリガンドがフィブリノーゲンに特異的に結合するアプタマーである、工程と、
(b)イムノグロブリン(Ig)を回収するためのアフィニティークロマトグラフィーの工程であって、アフィニティーリガンドが、イムノグロブリンに特異的に結合するアプタマーである、工程と
を含み、アフィニティークロマトグラフィーの工程(a)及び(b)が任意の順番で実行されうる、血漿の分画の方法である。

好ましくは、アイソタイプGのイムノグロブリンが工程(b)において回収される。

フィブリノーゲンを回収するためのアフィニティークロマトグラフィーの工程は、Igを回収するためのアフィニティークロマトグラフィーの前に、及びその逆で実行されうる。結果として、ある特定の実施形態では、血漿の分画の方法は、
- 血漿又はその派生物をアフィニティークロマトグラフィーの工程に供する工程であって、アフィニティーリガンドがフィブリノーゲンに特異的に結合するアプタマーである、工程と、
- 実質的にフィブリノーゲンを欠く、非保持画分を、アフィニティークロマトグラフィーの工程に供する工程であって、アフィニティーリガンドが、イムノグロブリンに特異的に結合するアプタマーである、工程と
を含む。

言うまでもなく、上記の工程は、フィブリノーゲンとアフィニティー担体上に保持されたIgのそれぞれの回収を含みうる。

ある特定の他の実施形態では、血漿の分画の方法は、
- 血漿又はその派生物をアフィニティークロマトグラフィーの工程に供する工程であって、アフィニティーリガンドがIgに特異的に結合するアプタマーである、工程と、
- 実質的にIgを欠く、非保持画分を、アフィニティークロマトグラフィーの工程に供する工程であって、アフィニティーリガンドが、フィブリノーゲンに特異的に結合するアプタマーである、工程と
を含む。

言うまでもなく、上記の工程は、Ig及びアフィニティー担体上に保持されたフィブリノーゲンのそれぞれの回収を含みうる。

本発明の方法では、出発組成物は血漿又はその派生物でありうる。血漿の派生物は、それに限定されることなく、清澄化された血漿、脂質が枯渇した血漿、血漿のクリオプレシピテート、血漿のクリオプレシピテートの上清、血漿画分等を包含する。ある特定の他の実施形態では、出発組成物は未加工の血漿である。

好ましくは、アイソタイプGのイムノグロブリンが回収される。アイソタイプGのイムノグロブリンは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を包含する。ある特定の他の実施形態では、イムノグロブリンに対するアプタマーは、IgGの下位範疇とは無関係にIgGに特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、すべての下位範疇のIgGを回収するために、数種の抗IgGアプタマーが使用される。好ましくは、本発明の分画の方法において回収されたIgGの画分は、出発血漿の下位範疇の分布に類似した下位範疇の分布を有し、すなわち、50%から70%のIgG1、25%から35%のIgG2、2%から8%のIgG3及び1%から8%のIgG4を含む。

ある特定の実施形態では、本発明の血漿の分画の方法は、1つ又は数個の追加の工程、特に(c)アルブミンの精製の工程を含む。

精製されたアルブミンは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー及びろ過が続く、エタノールによる沈降法のような任意の慣用方法により回収されうる。

例えば、工程(c)は、アフィニティーリガンドがアルブミンに特異的に結合するアプタマーである、アフィニティークロマトグラフィーでありうる。

工程(c)が存在する場合、工程(a)、(b)及び(c)は任意の順番で実行可能である。ある特定の実施形態では、工程(c)は、工程(a)から得られた又は工程(b)の非保持画分に対して実行される。

不連続クロマトグラフィー、疑似移動床クロマトグラフィー(SMB)のような任意のタイプのクロマトグラフィー技術が、本発明の方法における工程(a)、(b)及び(c)を実行するために使用されうる。好ましいクロマトグラフィー技術は、疑似移動床クロマトグラフィーSMBのような数個のカラムの使用を含むものである。

血漿の分画の方法は、それに限定することなく、抗A及び/又は抗B抗体を除去するためのクロマトグラフィーの工程、限外ろ過、タンジェンシャル限外ろ過、ナノフィルトレーション、逆浸透、清澄化、ウイルス不活化の工程、ウイルス排除の工程、滅菌、製剤のような研磨工程、又は凍結乾燥、或いはその組合せを含む、1つ又は数個の追加の工程を含むことができる。本発明の方法は、アルカリ性溶液、例えば、水酸化ナトリウム溶液による衛生処理のような、クロマトグラフィーカラムのファウリングを防止及び/又は排除する目的を有する1つ又は数個の追加の工程も含むことができる。

本発明は、本発明による精製されたフィブリノーゲン組成物の調製の方法により又は本発明による血漿の分画の方法により得られうるか又は得られた、精製されたフィブリノーゲン組成物にも関する。

本発明の別の目的は、上記組成物中の存在するタンパク質の総質量に対して少なくとも90質量%、より好ましくは少なくとも91質量%、92質量%、93質量%、94質量%、95質量%、96質量%、97質量%、98質量%、99質量%、99.1質量%、99.2質量%、99.3質量%、99.4質量%、99.5質量%、99.6質量%、99.7質量%、99.8質量%、99.9質量%を構成する、精製されたフィブリノーゲン組成物である。ある特定の実施形態では、精製されたフィブリノーゲン組成物は、ヒト血漿フィブリノーゲン、例えば、ヒト血漿から得られたフィブリノーゲンを含む。この実施形態では、上記組成物は、最大で10質量%、より好ましくは最大で9質量%、8質量%、7質量%、6質量%、5質量%、4質量%、3質量%、2質量%、1質量%、0.9質量%、0.8質量%、0.7質量%、0.6質量%、0.5質量%、0.4質量%,0.3質量%、0.2質量%又は0.1質量%の他の血漿タンパク質、特に、他のヒト凝固因子を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、実質的にヒトフィブリノーゲン以外のヒト凝固因子を欠く。ある特定の追加の又は代わりの実施形態では、上記組成物は第XIII因子を欠く。

ある特定の実施形態では、精製されたフィブリノーゲンの組成物は、ヒト組換えフィブリノーゲン、例えば、組換え細胞又はトランスジェニック動物のような組換え宿主により産生されたヒトフィブリノーゲンを含む。この実施形態では、上記組成物は、最大で10質量%、より好ましくは最大で9質量%、8質量%、7質量%、6質量%、5質量%、4質量%、3質量%、2質量%、1質量%、0.9質量%、0.8質量%、0.7質量%、0.6質量%、0.5質量%、0.4質量%,0.3質量%、0.2質量%又は0.1質量%の他の血漿タンパク質、特に、組換え宿主に由来する他の非ヒトタンパク質を含んでいた。ある特定の実施形態では、組成物は実質的に非ヒトタンパク質を欠く。ある特定の追加の又は代わりの実施形態では、上記組成物は、組換え宿主中に見出されうるフィブリノーゲンのいかなる非ヒト等価物も欠く。

本発明は、組換えヒトフィブリノーゲンのようなヒトフィブリノーゲン又は本明細書中上記で定義されたようなヒト血漿フィブリノーゲンの精製された組成物を、1つ又は数種の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物にも関する。上記医薬組成物並びに本発明によるフィブリノーゲンの精製された液体組成物は、凝固障害の処置、特に、後天性又は先天性フィブリノーゲン欠乏症(低フィブリノーゲン血症、異常フィブリノーゲン血症、又は無フィブリノーゲン血症)の処置において使用されうる。本発明の組成物は、急性の外傷後若しくは術後出血の管理又は急性腎不全に起因するフィブリノーゲン欠乏症の管理において使用されうる。

本発明により使用されるアプタマーを得るための方法
出願人は、ヒトフィブリノーゲンに対するアプタマーを同定するために、従来技術に記載の数種のSELEX戦略を実行した。これらの戦略のいずれも成功せず、標準的なSELEXは、混入物に対するアプタマーの同定をもたらし、これは、なぜそれを実行するために精製されたフィブリノーゲンの組成物の1%未満が使用されるかを説明している。

これに関して、出願人は、フィブリノーゲンのような「SELEX抵抗性」タンパク質に対するアプタマーを得る新しい方法を開発するために、徹底的な研究を行った。

出願人は、「SELEX抵抗性」タンパク質への強力な結合親和性を有し、精製の方法においてアフィニティーリガンドとして使用可能なアプタマーを得ることを可能とする、新しいSELEX法を設計した。この新しいSELEX法は、標的タンパク質の表面上における「ポジティブパッチ」の創製に好適なpH条件において実行される選択の工程を特徴とする。言い換えれば、出願人により設計された方法は、タンパク質の表面ドメインにわたる正電荷に都合のよいものとすることによって、潜在的なアプタマーと標的タンパク質の間の局所的相互作用を強化することに基づく。

この方法は、フィブリノーゲンのような1つ又は数個の表在性ヒスチジンを有するタンパク質のために実行されうる。選択の工程(すなわち、標的タンパク質が核酸の候補混合物と接触させられる工程)のpHは、標的タンパク質の少なくとも1つの表在性ヒスチジンのプロトン化に好都合であるような方法で選択されなければならない。フィブリノーゲンの場合、出願人は、選択の工程のためのpHはわずかに酸性のpHである、という種をまいた。

結果として、フィブリノーゲンに特異的に結合する、本発明により使用されるアプタマーを得る方法は、以下の工程:
a)7.0よりも低い、より好ましくは5.8から6.8のpHにおいて、フィブリノーゲンを核酸の候補混合物と接触させる工程と、
b)フィブリノーゲンに結合する核酸を回収する一方、なお未結合の核酸を排除する工程と、
c)フィブリノーゲンに対する増加した親和性を有する核酸の候補混合物を生成するために、工程b)において得られた核酸を増幅する工程と、
d)フィブリノーゲンに対する1つ又は数種のアプタマーが得られるまで、工程(a)、(b)、(c)を反復する工程と
を含む。

工程(a)では、核酸の候補混合物は一般に、化学合成された統計的核酸の混合物である。候補混合物は、108から1018、典型的に約1015個の核酸を含みうる。候補混合物は、DNAの核酸混合物又はRNAの核酸混合物でありうる。ある特定の実施形態では、候補混合物は、多数の一本鎖DNA(ssDNA)からなり、各ssDNAは、PCRによる増幅のためのプライマーの役割を演じる約15から40ヌクレオチドの特定の配列に隣接した約20から100ヌクレオチドの中心的な統計的配列を含む。ある特定の他の実施形態では、候補混合物は、多数のRNAの核酸からなり、各RNAは、RT-PCRによる増幅のための約15から40ヌクレオチドのプライマー配列に隣接した約20から100ヌクレオチドの中心的な統計的配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸の候補混合物は、非修飾ヌクレオチドからなり、これは、核酸が自然に存在するヌクレオチドのみを含むことを意味する。ある特定の他の実施形態では、候補混合物は、化学修飾された核酸を含むことができる。言い換えれば、核酸は、1つ又は数個の化学修飾されたヌクレオチドを含むことができる。好ましい実施形態では、候補混合物は、一本鎖DNAからなる。

工程a)は、上記フィブリノーゲンに対する親和性を有する核酸へのフィブリノーゲンの結合に好都合な条件下で実行される。好ましくは、工程a)のpHは、6.1、6.2、6.3、6.4及び6.5のような6.0から6.6である。工程a)のための好適なpHは、例えば、6.3±0.1である。このpHは、フィブリノーゲンの少なくとも1つの表在性ヒスチジンをプロトン化することを可能とする。工程(a)は、緩衝化された水溶液中で実行されうる。緩衝剤は、所望のpHを得ることを可能とし、標的タンパク質及び核酸の混合物と適合性である任意の緩衝剤から選択されうる。緩衝剤は、それに限定されることなく、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、HEPES、Bis-Tris、シトレート及びアセテートから選択されうる。緩衝剤は、約5mM〜1M、例えば、約50mMのような10mMから500mM、例えば、10mMから200mMの濃度で存在しうる。

具体的な実施形態では、安定でフィブリノーゲンを含む液体組成物が、以下の工程:
- 血漿のクリオ上清画分を得る工程と、
- フィブリノーゲン富化画分を得るように、8%エタノールによる、クリオ上清の沈降の工程と、
- 好ましくは抗体、抗体断片、抗体の誘導体又はペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、ナノフィチンのような化学的リガンド又はアプタマーのようなオリゴヌクレオチドリガンドから選択されるアフィニティーリガンドを使用する、アフィニティーゲルクロマトグラフィーによる分離による再懸濁後の血漿のフィブリノーゲン富化画分の精製の工程と、
- フィブリノーゲンを含む、精製された、吸収された画分の回収の工程と、
- 場合により、薬学的に許容される賦形剤、好ましくはアルギニン及び/又はシトレートを添加する工程
を含む方法により得られる。

具体的な実施形態では、方法は、少なくとも3カ月、4℃における貯蔵の工程を更に含む。

本発明の具体的な実施形態では、使用されるアフィニティークロマトグラフィーは、Fibrinogen CaptureSelectマトリックス(Life Technologies社)のような、ラマ抗体に由来するリガンドタイプの部分を含むアフィニティーマトリックスである。

特に有利には、本発明による組成物は、プロテアーゼ及び/又は線維素溶解の活性化剤を欠く。

「プロテアーゼ及び/又は線維素溶解の活性化剤を欠くフィブリノーゲン組成物」は、フィブリノーゲン組成物が、プロテアーゼ及び/又は線維素溶解の活性化剤の残量が:
- クロマトグラフィーの工程の前に予備精製されたフィブリノーゲン溶液と比べて非常に大きく低減されており、及び/又は
- ゼロ、及び/又は
- 当業者により一般に使用される方法の検出閾値よりも低い
ような方法で、トロンビン、プロトロンビン、プラスミン、プラスミノーゲンのようなプロテアーゼの排除を可能とする1つ又は数個の工程に供されたことを意味すると理解される。

有利には、残留プロトロンビンの割合は、5μUI/mgフィブリノーゲンよりも低く、プラスミノーゲンの割合は、15ng/mgフィブリノーゲンよりも低い。

したがって、本発明の具体的な実施形態では、本発明による組成物は、潜在的に活性化されうる酵素源である、トロンビン及び/又はプラスミン或いはその対応するプロトロンビンプロ酵素(凝固の第II因子)及び/又はプラスミノーゲンのようなプロテアーゼを欠く。

本発明の具体的な実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン組成物は、プロテアーゼの阻害剤及び/又は抗-線維素溶解剤を欠く。

用語「プロテアーゼの阻害剤及び/又は抗-線維素溶解剤」は、抗プロテアーゼ活性を有する任意の分子、特に、セリンプロテアーゼの阻害及び/又は抗-線維素溶解活性を有する任意の分子、特に、トロンビン及び/又は抗プラスミンの阻害活性を有する任意の分子、特に、ヒルジン、ベンズアミジン、アプロチニン、フェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)、ペプスタチン、ロイペプチン、ヘパリンと結合した又はしないアンチトロンビンIII、アルファ2マクログロブリン、アルファ1アンチトリプシン、ヘキサン酸又はイプシロンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、アルファ2アンチプラスミンを意味する。

本発明の具体的な実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン組成物は、ヒルジン及び/又はベンズアミジン及び/又はアプロチニン及び/又はPMSF及び/又はペプスタチン及び/又はロイペプチン及び/又はヘパリンと結合した若しくはしないアンチトロンビンIII及び/又はアルファ2マクログロブリン及び/又はアルファ1アンチトリプシン及び/又はヘキサン酸及び/又はイプシロンアミノカプロン酸及び/又はトラネキサム酸及び/又はアルファ2アンチプラスミンを欠く。

本発明の具体的な実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン組成物は、金属イオンを欠く。

本発明の具体的な実施形態では、本発明による組成物は、有利にカルシウムを欠く。

本発明の具体的な実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン組成物は、イソロイシン、グリシン及び/又はNaClを欠く。

本発明の具体的な実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン組成物は、アルブミンを欠く。

有利には、本発明による組成物は、70%よりも高いか又はそれに等しい、好ましくは75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%よりも高いかそれに等しい純度を有する。

本発明の具体的な実施形態では、本発明による組成物は、他の同時精製されたタンパク質を含有せず、有利には、FXIII及び/又はフィブロネクチンを含有しない。

本発明の別の具体的な実施形態では、本発明によるフィブリノーゲン組成物は、1つ又は数種の付随的タンパク質、場合により、同時精製されたタンパク質も含みうる。本発明の具体的な実施形態では、本発明による組成物は、有利にFXIIIを含む。

本発明による組成物は、精製後、直接的に液体形態の医薬品形態を生産する工程:製剤、滅菌ろ過及び容器(貯蔵/投与のためのボトル又は他のデバイス)への分配に供される。

特に有利には、本発明による組成物は、凍結乾燥、乾燥、脱水又は除湿のいかなる工程にも供されない。

特に有利には、本発明による組成物は、したがって、凍結乾燥物の再構成の工程に供されていない液体形態である。

特に有利には、本発明による組成物は、液体形態であり、したがって、可能性のある薬学的に許容される賦形剤に加えて水を含む。本発明の具体的な実施形態では、液体形態の組成物は、シトレート及び/又はアルギニン、より好ましくは300mM未満のアルギニンを含む。

有利には、本発明による組成物は、静脈内投与に特に適している。

本発明の別の態様は、治療におけるその使用のための本発明による組成物に関する。本明細書中、上記で述べた技術的特徴のすべてがここにあてはまる。

以下の例は、その範囲を制限しない、本発明の実施形態を示す。

安定な液体フィブリノーゲンの組成物
材料及び方法
血漿画分
出発材料は、最初にクリオ沈降反応の工程に供し、次いで8%エタノールによる沈降の工程に供したヒト血漿のプールである。

こうして得た予備精製した血漿フィブリノーゲン溶液を、pH及び伝導率について予め平衡化したクロマトグラフィーカラムへの注入の前に、2容のゲルの均等化緩衝液(equalising buffer)により希釈した。

血漿画分の特徴:4.7〜4.8g/Lへの希釈により、抗原フィブリノーゲンを調整した。

緩衝溶液
クロマトグラフィー法の様々な工程の間に使用した緩衝溶液の組成を以下のTable 1(表1)に要約する。

アフィニティークロマトグラフィーゲル
クロマトグラフィーのために、抗フィブリノーゲンラマ抗体の断片からなるアフィニティーリガンドを有するアフィニティーゲルCaptureSelect Fibrinogen(Life Technologies社、参照番号191291050、ロット171013-01及び171013-05)を使用する。

カラム
直径50mmのカラム(参照番号XK 50/30 GE Healthcare社)、67mlのゲル充填体積;カラムの高さについては3.4cmを使用した。

親和性による精製
約5g/Lに調整したフィブリノーゲンの溶液を、いかなる他の調整もすることなく、平衡化したアフィニティーカラムCaptureSelect Fibrinogenに注入した。約10g/Lの負荷を加えた。

次いで、クロマトグラフィー溶出液を限外ろ過し、カットオフ閾値100kDaの膜(参照番号Pall Omega OS100C10)において予備製剤した。

方法の最後において、得られた生成物は、凝固性フィブリノーゲンとして15.2g/L及び抗原フィブリノーゲンとして15.2mg/mlの濃度を有した。

液体フィブリノーゲンの組成物の安定性
フィブリノーゲンの組成物
実施例1に例示した方法により得たフィブリノーゲン組成物を、少なくとも100mMのアルギニン及び8.5mMのシトレートとともにpH7.0において製剤した。

フィブリノーゲン組成物の安定性
+5℃の冷蔵室中、攪拌せずに大気下(戸外)で、組成物を安定させる。
試料を安定性試験の前(T0)、及び安定性試験の開始に従って様々な時点:2カ月(T2M)及び3カ月(T3M)で採取する。

5℃における安定性試験の結果
この安定性試験の結果を以下のtable(表2)に表す。

安定性試験開始後2カ月及び3カ月で得た結果は:
- 還元条件におけるSDS PAGEの結果は、経時的に安定なままであるアルファ、ベータ及びガンマ鎖のプロフィールにおける低い変動を示し、液体フィブリノーゲンすべての保持を確認していること
- 凝固性フィブリノーゲン/抗原フィブリノーゲンの比は保持され、1で安定しており、すべての液体フィブリノーゲン及び液体フィブリノーゲンのすべての官能性の保持を確認していること
を示している。

この試験の結果は、5℃において3カ月間、フィブリノーゲン組成物が液体形態で安定であることを明らかに示している。

本発明により使用される抗フィブリノーゲンアプタマーの同定
1.機器及び方法
オリゴヌクレオチドバンク
SELEX法を実行するために使用したssDNAバンクは、2つの18塩基の定常プライマー領域に隣接した40塩基のランダム領域からなる。

フィブリノーゲン
標的タンパク質はヒトフィブリノーゲンである。SELEX法の間、様々なヒトフィブリノーゲンの供給源を使用した:
ヒトフィブリノーゲン:ヒトフィブリノーゲンの2つの調製物を使用し、それぞれ95%及び99.9%の純度を有するヒト血漿を使用して、精製された組成物の形態で調製した。
トランスジェニックフィブリノーゲン:97%以下の純度のトランスジェニックなウシ乳を使用して、トランスジェニックフィブリノーゲンを精製した。

SELEXプロトコール
フィブリノーゲン(試験1〜3のための97%の純粋なトランスジェニックフィブリノーゲン並びに試験4及び5のための95%の純粋な血漿フィブリノーゲン並びに試験6〜8のための99.9%の純粋な血漿フィブリノーゲン)を、アフィニティー樹脂に固定化したが、試験1〜8では樹脂に固定化した標的の量は持続的に減少した(図8を参照されたい)。

固定化した標的を、減少濃度のssDNAのバンク/プールとともに、選択緩衝液(50mMのMOPS、pH6.30,150mMのNaCl、5mMのMgCl₂)を使用して、減少インキュベーション時間の間、インキュベートした(図8中の表を参照されたい)。

フィブリノーゲン/ssDNAを含有する樹脂を回収し、選択緩衝液で試験1及び2の間、並びに試験3〜8の50mMのMOPS、pH6.30,500mMのNaCl、5mMのMgCl₂を含有する洗浄緩衝液で洗浄した(表を参照されたい)。洗浄後、溶出緩衝液(50mMのTris-HCl、pH7.40、200mMのEDTA)を使用して、結合したssDNAを溶出させた。(最初の試験を除く)各試験の前に、抗担体アプタマーの濃縮を防止するように、すべてのssDNAをアフィニティー樹脂とともにインキュベートすることにより、対イオンの選択の工程を実行した。SELEXプロトコールのパラメータを図8に記載する。

SPRによるアプタマーの結合親和性の測定
選択したアプタマーを、オリゴヌクレオチドの5'末端においてビオチン及びトリエチレングリコールのスペーサーとともに合成した。1μMのアプタマーの溶液をSELEX選択緩衝液を使用して調製した。アプタマー溶液を90℃において5分間加熱し、氷中で5分間インキュベートし、周囲温度で10分間平衡化させた。Biocore T200機器(GE Healthcare社)からストレプトアビジンSAでコーティングしたセンサーチップ中に、7分間、10μl/mlの引き入れ量で調製物を注入した。次いで、30μl/分の速度で1分間、固定化されたアプタマー上へ様々な濃度の標的を注入した。1〜2分間の解離後、30μl/分の速度で1分間の好適な洗浄緩衝液の注入により、洗浄の工程を実行した。溶出のために、30μl/分の速度で1〜2分間、好適な溶出緩衝液を注入した。最後に、30μl/分の速度で30秒間、50mMのNaOHを注入することにより、センサーチップを再生させた。実験の間、応答シグナルをセンサーグラムに記録した。

2.結果
SELEX法は、67個の抗フィブリノーゲンアプタマー候補を同定することを可能とし、その中で配列番号1、配列番号58、配列番号60及び65のアプタマーがヒト血漿及びトランスジェニックフィブリノーゲンの両方に対して強力な親和性を有する。

これらのアプタマーは、pH依存性の方法でヒトフィブリノーゲンに結合する。配列番号1及び配列番号58のアプタマーのベース配列(すなわち、フィブリノーゲンに結合する最小配列)を決定した。配列番号66のアプタマーは、配列番号1のアプタマーのベース配列に相当する。配列番号67のアプタマーは、配列番号58のアプタマーのベース配列に相当する。図3A〜図3Dは、配列番号1及び配列番号58のアプタマーのベース配列についてSPRにより得た結合プロフィールを示す。配列番号66及び67のアプタマーは、フィブリノーゲンの濃度が増加する場合のシグナルの増加により示されるとおり、pH6.3においてトランスジェニックフィブリノーゲン及び血漿フィブリノーゲンに特異的に用量に依存して結合することができる。アプタマーとフィブリノーゲンの間の複合体は、NaCl濃度の増加によっては顕著に解離しなかった。一方、pH7.4の緩衝液の注入は、アプタマーとの間の複合体が解離することを可能とし、したがって、フィブリノーゲンが溶出した(図3A〜図3D)。

実際に、本発明の方法により得られたアプタマーは、pH依存性の方法でフィブリノーゲンに結合する。この結果を、配列番号66及び配列番号67のアプタマーについてそれぞれ、図4A及び図4Bに示す。フィブリノーゲンの結合レベルは、pHが増加すると減少する。最大の結合を、pH6.3において観察した。6.8よりも高いpHでは、アプタマーはフィブリノーゲンに結合しない。

同定したアプタマーのためのアフィニティー担体の準備
1.機器及び方法
- アフィニティー担体
NHS-activated Sepharose (GE Healthcare)上にアプタマーをgraftすることにより、2つのアフィニティー担体を準備した。第1のアフィニティー担体(第1アフィニティー担体)を、その5'末端のアミノ末端基及びその3'末端の逆位デオキシチミジンとともにC6のスペーサーを含む、配列番号66のアプタマー(アプタマーA5-1.9)をgraftすることにより、準備した。第2のアフィニティー担体(第2アフィニティー担体)を、その5'末端のアミノ末端基及びその3'末端の逆位デオキシチミジンとともにC6のスペーサーを含む、配列番号67のアプタマー(アプタマーA5-2.9)をgraftすることにより、準備した。

カラム中に入れた1容のNHS-activated Sepharoseゲルを、少なくとも10容の0.1Mの冷HClの溶液によりすすぎ、次いで、少なくとも8容の100mMの冷アセテートの溶液、pH4.0で平衡化した。

2000gにおける3分間の遠心分離後、上清を分離し、排出したゲルを2容の100mMのアセテート、pH4.0のアプタマーの溶液中に再懸濁する。この懸濁液を攪拌しながら周囲温度で2時間インキュベートする。

次いで、1容の200mMのボロン酸、pH9を添加し、この懸濁液を攪拌しながら、周囲温度で2時間30分、インキュベートする。

2000gにおける3分間の遠心分離後、上清をとっておく。排出したゲルを2容の0.1M のTris-HCl、pH8.5の溶液に再懸濁する。懸濁液を、攪拌しながら+4℃で一夜、インキュベートする。

インキュベーション及び2000gにおける3分間の遠心分離の後、上清をとっておく。ゲルを代わりに2容の0.1Mの酢酸ナトリウム+0.5%のNaCl、pH4.2及び2容の0.1MのTris-HCl、pH8.5の溶液で洗浄する。この洗浄サイクルを1回繰り返す。

2000gにおける3分間の遠心分離後、上清を分離する。排出したゲルを2容の平衡化緩衝液に懸濁する。

実施例4のアフィニティー担体上の半精製フィブリノーゲンの溶液を使用するフィブリノーゲンの精製
1.材料及び方法
- アフィニティークロマトグラフィーの条件
第1アフィニティー担体:解凍した、ヒト血漿を使用して得た半精製フィブリノーゲン(IP1:フィブリノーゲン中間体生成物1)の溶液を、結合緩衝液で10倍希釈し、pHを6.3に調整した。希釈したIP1を、第1担体におけるクロマトグラフィーの工程に供した。限外ろ過の工程のための十分量のフィブリノーゲンを得るために、この工程を1回繰り返した。

第2アフィニティー担体:解凍した、ヒト血漿を使用して得た半精製フィブリノーゲン(IP1:フィブリノーゲン中間体生成物1)の溶液を、結合緩衝液で10倍希釈し、pHを6.3に調整した。希釈したIP1を、第2担体におけるクロマトグラフィーの工程に供した。限外ろ過の工程のための十分量のフィブリノーゲンを得るために、この工程を1回繰り返した。

アフィニティークロマトグラフィーの条件を各アフィニティー担体について要約した。

各アフィニティー担体のために、緩衝液の組成を変更することにより、フィブリノーゲンを穏やかな条件で溶出した。第1及び第2アフィニティー担体における2つのクロマトグラフィーについて、溶出液の2つの画分を生成し、限外ろ過の工程のために一緒にグループ化した。

- 限外ろ過の条件
各アフィニティー担体のために、フィブリノーゲンを濃縮し、それを10mMのクエン酸ナトリウム、20g/Lの割合のアルギニン(argiline)、pH7.4中で製剤するように、1組の溶出液画分を100kDaにおける限外ろ過に供した。

- 分析方法

2.結果
結果を図7A〜図7B及び図7C〜図7Dに示す。図7A及び図7Bは、第1及び第2アフィニティー担体それぞれにおいて、フィブリノーゲンの半精製溶液を使用するフィブリノーゲンの精製について得たクロマトグラフィープロフィールを示す。pHを7.4まで高め、アフィニティー担体2についてはMgCl₂を添加することにより、アフィニティー担体1については、Mg²⁺の排除により、フィブリノーゲンを溶出させた。クロマトグラフィーにより得た、画分の電気泳動による分析(図7C及び図7D)は、負荷材料(IP1)中に存在する混入物が、著しく排除され、実際にフィブリノーゲンのみが溶出液中で目に見えることを示している。加えて、還元条件は、溶出液中のフィブリノーゲンが、目に見えて分解することなく、天然型であることを示している(Aα1は、バンドAαの中で最大のバンドである)。

アウトプット及び得られたフィブリノーゲン中の濃度を以下のtable(表6)に要約する:

凝固性フィブリノーゲンと抗原フィブリノーゲンの間の1に近い比により、活性なフィブリノーゲンが明らかとなる。2つのアフィニティー担体を使用して調製した、濃縮し、製剤したフィブリノーゲンの分析を、以下のtable(表7)に詳述する。

2つの精製フィブリノーゲンについて、凝固性及び抗原フィブリノーゲンの間の比は2つのアプタマーについて約1.0であった。穏やかなクロマトグラフィー条件は、保持された活性を有する精製フィブリノーゲンの調製を可能とする。

以下のtable(表8)は、出発材料中及び本発明のアフィニティー担体により得られたフィブリノーゲンの精製画分中の混入タンパク質の滴定を示している。

出発材料の65%から99%までの範囲の排除により、混入タンパク質の良好な排除を得た。

クロマトグラフィー条件は、フィブリノーゲンの安定性の観点から最も問題となる混入物の1つである初期のプラスミノーゲンの99.5%超の排除を可能とした。

SELEXにより同定したアプタマーは、クロマトグラフィーによるフィブリノーゲンの精製におけるアフィニティーリガンドとしての使用に好適である。本発明の方法により同定されたアプタマーが、選択的な結合、次いで穏やかな非変性条件下でのフィブリノーゲンの溶出を可能とすることは注目すべきである。

血漿を使用するクロマトグラフィーによるフィブリノーゲンの精製
第1アフィニティー担体:血漿を解凍し、0.45μmでろ過し、結合緩衝液で10倍希釈し、次いで、pHを6.3に調整した。希釈溶液を、第1担体におけるクロマトグラフィーの工程に供した。

第2アフィニティー担体:血漿を解凍し、0.45μmでろ過し、結合緩衝液で10倍希釈し、次いで、pHを6.3に調整した。希釈溶液を、第2担体におけるクロマトグラフィーの工程に供した。

親和性の条件を、各アフィニティー担体について以下のtable(表9)に要約する:

各アフィニティー担体について、緩衝液の組成の変更による穏やかな条件でフィブリノーゲンを溶出させた。

2.結果
結果を図5A〜図5B及び図6A〜図6Bに示す。図5A及び図6Aは、それぞれ第1及び第2アフィニティー担体において血漿を使用するフィブリノーゲンの精製について得られたクロマトグラフィープロフィールを示す。ほとんどの混入タンパク質が固定相に保持されなかった一方、フィブリノーゲンは担体に結合されたことは注目すべきである。pHを7.4に高めることにより、及びアフィニティー担体2については2MのMgCl₂を添加することにより、及びアフィニティー担体1についてはMg²⁺の排除により、フィブリノーゲンが溶出した。クロマトグラフィーにより得た画分の電気泳動による分析(図5B及び図6B)は、フィブリノーゲンが主に溶出画分中に存在した一方、混入タンパク質が非保持画分中、洗浄画分中、又は再生画分中に存在したことを示した。実際に、溶出画分は単一のバンドの形態で移動した。(SDS PAGEにより決定した)溶出液のフィブリノーゲンの画分の相対純度は、95%よりも高かった。

これらの結果は、本発明により使用されるアプタマーが、複雑な出発組成物を使用するフィブリノーゲンの精製におけるアフィニティーリガンドとしての使用に特に好適であることを明らかにしている。

配列番号66のベース配列の最適化
1.材料及び方法
- 配列番号66の変異体の調製
最初の試験において、変異体(1/2、3/4、5/6等)あたり、2つの連続したヌクレオチドの系統的な除去により、28個の変異体を設計した。以下の試験において、親和性の損失をもたらさなかった欠失の組合せを併合した。

- 競合結合試験
設計した変異体の親和性を親アプタマーの親和性と比較するために、同時の試験を行った。最初に、配列番号66のアプタマーの1μM溶液を、結合緩衝液を使用して調製した。アプタマー溶液を90℃まで5分間加熱し、氷中で5分間インキュベートし、周囲温度で10分間平衡化した。Biacore T200機器(GE Healthcare社)からストレプトアビジンSAでコーティングしたセンサーチップ中に、7分間、10μl/分の速度で調製物を注入した。次いで、30μl/分の速度で1分間、固定化されたアプタマー上へ、変異体(2μM)及びヒト血漿フィブリノーゲン(0.4μM)を含有する混合物を注入した。様々な断片/フィブリノーゲン混合物について得た反応を比較した。

2.結果
図9に示すとおり、配列番号80〜93の配列の変異体は、顕著な結合シグナルの阻害を有し、結果として、これらはフィブリノーゲンに対するかなりの親和性を有する。最高の親和性は、それぞれ位置01/02において、位置01/02/19/20/21において、位置01/02/14/15/16/20/21/22において、位置01/02/18/19/20/21において、位置01/02/18/19/20において、位置01/02/15/16/20/21において及び位置01/02/19/20において欠失を含有する配列番号80〜87の変異体について観察した。

液体フィブリノーゲンの組成物の安定性
フィブリノーゲンの組成物
アプタマーA5 -1.9(配列番号66)を提供する第1クロマトグラフィー担体を使用してフィブリノーゲン組成物を得て、少なくとも100mMのアルギニンとともに及び8.5mMのシトレート、pH7.0とともに製剤した。

フィブリノーゲン組成物の安定性
+5℃の冷蔵室中、攪拌せずに大気下(戸外)で、組成物を安定させる。
試料を安定性試験の前(T0)、及び安定性試験の開始後1カ月(T1M)で採取する。

5℃における安定性試験の結果
この安定性試験の結果を以下のtable(表10)に表す。

1カ月後の安定性試験の結果は:
- 還元条件におけるSDS PAGEの結果は、経時的に安定したままであるアルファ、ベータ及びガンマ鎖のプロフィールにおける低い変動を示し、液体フィブリノーゲンすべての保持を確認していること
- 凝固性フィブリノーゲン/抗原フィブリノーゲンの比は保持され、1で安定しており、すべての液体フィブリノーゲン及び液体フィブリノーゲンのすべての官能性の保持を確認していること
を示している。

この試験の結果は、フィブリノーゲン組成物が5℃において1カ月間、液体形態において安定であることを明らかに示している。

Claims (22)

1. 液体形態の安定なフィブリノーゲンを含む組成物。
2. 4℃において少なくとも3カ月間安定である、請求項1に記載の組成物。
3. 0.5よりも高い;好ましくは0.6よりも高い;0.7よりも高い;0.8よりも高い;0.9よりも高い;更により好ましくは約1.0に等しい凝固性フィブリノーゲン/フィブリノーゲン抗原比を有する、請求項1又は2に記載の組成物。
4. フィブリノーゲンモノマーの初期割合の50%よりも高い、好ましくは60%よりも高い、好ましくは70%よりも高い、好ましくは80%よりも高い、好ましくは90%よりも高い、好ましくは95%よりも高い、安定性試験の間に保持されるフィブリノーゲンモノマーの量を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
5. フィブリノーゲンポリマーの初期割合の10%未満、好ましくは20%未満、好ましくは30%未満、好ましくは40%未満、好ましくは50%未満である、安定性試験の間に形成されるポリマーの量を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
6. - すべてのアルファ鎖が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%保持され;より好ましくは約100%保持され、及び/又は
   - すべてのベータ鎖が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%保持され;より好ましくは約100%保持され、及び/又は
   - すべてのガンマ鎖が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%保持され;より好ましくは約100%保持される、
   請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
7. 安定性試験の後に測定された濁度が、安定性試験の前に測定された濁度の130%よりも低く、120%よりも低く、110%よりも低く;有利には、100%に相当する、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
8. プロテアーゼ及び/又は線維素溶解の活性化剤を欠く、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
9. プロテアーゼ阻害剤及び/又は抗-線維素溶解剤を欠く、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
10. 薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記薬学的に許容される賦形剤が、アルギニン及びシトレートからなる、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
12. フィブリノーゲン、アルギニン及びシトレートから構成される、液体形態で安定である、組成物。
13. イソロイシン及び/又はグリシンを欠く、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
14. アルブミンを欠く、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
15. 金属イオン、特にカルシウムを欠く、請求項1から14のいずれか一項に記載の組成物。
16. 液体であり安定であり、凍結乾燥、乾燥、脱水又は除湿のいずれの先の工程にも供されていない、フィブリノーゲンを含む組成物。
17. 液体であり安定であり、凍結乾燥物を再構成するいずれの先の工程にも供されていない、フィブリノーゲンを含む組成物。
18. フィブリノーゲンを含む組成物であって、液体であり安定であり、以下の工程:
    - アフィニティークロマトグラフィーによる精製の工程と、
    - 少なくとも1つの生物学的安全性の工程と、
    - 液体形態での製剤の工程と
    を含む方法により得られうる、組成物。
19. アフィニティークロマトグラフィーが、ラマ抗体又はアプタマーに由来するリガンドタイプの部分を使用するクロマトグラフィーからなることを特徴とする、請求項18に記載の組成物。
20. 以下の工程:
    - 血漿又は血漿のクリオ上清画分を得る工程と、
    - 好ましくは抗体誘導体又はアプタマーのタイプのリガンドを使用する、アフィニティーゲルクロマトグラフィーによる分離による、血漿又は血漿のクリオ上清画分の精製の工程と、
    - フィブリノーゲンを含む、精製された、吸収された画分の回収の工程と、
    - 場合により、薬学的に許容される賦形剤、好ましくはアルギニン及び/又はシトレートを添加する工程と
    を含む方法により得られうる安定な液体フィブリノーゲンを含む組成物。
21. 治療における使用のための、請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記組成物が静脈内投与されることを特徴とする、請求項21に記載の使用のための組成物。