JPH10507770A - 血小板の貯蔵期間の延長法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトの血小板の低温での貯蔵期間を延長する方法を提供する。該方法では、血小板が保存中その円盤形状を維持し、かつその機能的完全性を保持することを可能にする阻害剤系を使用する。これは、保存中通常の血小板の機能を阻害して、血小板が活性化せず、かつ変形しないようにしておくことにより達成される。血小板を輸血に使用する前に、阻害剤系を血小板から洗い流すことにより、血小板の機能はその通常の機能レベルに戻る。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板の貯蔵期間の延長法技術分野 本発明は、ヒトの血小板の貯蔵寿命を延長する方法に関する。本発明は特に、 可逆的阻害剤系、及び、冷蔵温度（４℃）又は冷凍機温度（−８０℃）で保存す る間血小板が生物的に活性化するのを阻害する一方、阻害剤系が一旦除去される と通常の活性が回復する能力を血小板に残しておくような方法に関する。本発明 の組成物及び方法により、従来得られなかったレベルで機能の回復を維持しつつ 血小板を凍結温度で保存することが可能となる。背景技術 患者を治療するために血小板輸血が用いられることが多い。血小板輸血は、出 血多量に苦しむ負傷による被害者のみならず、化学療法を受けている患者にも適 用される。化学治療は患者の血小板数を減少させ、また機能的に欠陥のある状態 で存在する血小板をもたらす。例えば、血小板減少症を患っている場合、骨髄抑 制により患者の血小板の数が減少するのに対し、出血性心筋炎の患者の場合、化 学治療により血小板の機能に欠陥が生じている。血小板輸血は、血小板の数を増 加させて血小板減少症のような症状を治療するため、及び出血性心筋炎を治療す る際に機能的に欠陥のある血小板を置換するために用いられる。 血小板は、代謝機能及び夾雑物の成長を抑制することが可能な低温で保存すべ きである。現在のところ、血小板は、２２℃で５日間まで保存される。この保存 期間は、無酸素代謝作用に関連するラクテートの増加に起因するｐＨの低下によ り制限される。２２℃での保存はまた、バクテリアの成長の可能性によっても制 限される。冷蔵は、２２℃での保存に対して、代謝機能、夾雑物及びｐＨの安定 性の点で利点がある。しかしながら、冷蔵保存は複数の固有の問題をもたらす。 第１に、約２４時間冷蔵保存すると、血小板は円盤状から球状構造への変形を受 ける。第２に、約２４〜４８時間冷蔵保存すると、自発的な凝集が増加する。第 ３に、４℃で保存された血小板は、保存期間の経過後に機能的活性を回復するこ とができない。最後に、４℃での保存で損傷した血小板は、輸血後、脾臓により 循環から除去されてしまう。 冷蔵血小板保存のゴールは、多数の血小板を維持し、血小板を維持することの できる時間を延長し、血小板の機能の完全性を保持し、かつ血小板のインビボで の循環寿命を通常の限界に近づけることを確実にすることにある。これは、本発 明の阻害剤系を使用することにより達成されるものと考えられる。その理由は、 該系が活性化に必須の経路を遮断し、それにより血小板が４℃で誘起される損傷 を受けないこととなるからである。 新鮮な血小板の貯蔵寿命は２２℃（室温）でわずか３〜５日間であるため、血 小板の貯蔵寿命を延長する方法は有益であると考えられる。残念ながら、数多く の血小板保存の最適化の試みがなされてきたにもかかわらず、細胞形状の著しい 変化（生物学的不活性化につながる）及び凝集力による永久変形のため、血小板 の保存は制限されたままである。更に、保存に伴って血小板の損傷は広がり、そ れにより、該血小板は輸血に続く第１回目の間に脾臓によって予め循環から除去 されてしまう。ちなみに、人体中での正常な血小板の典型的な寿命は約８日間で ある。血小板を長期間保存する先行技術の試みによると、損傷変形した血小板を 作り出すことになる。先行技術により保存した血小板の約８０％〜９０％が、数 字上では保存後に再生可能であるが、脾臓を通過する第１回目の循環後になお活 性であるものはわずか２０％〜３５％である。これは、脾臓が損傷変形した血小 板を濾過により除去するためである。本発明の組成物及び方法によると、数字上 では８０％〜９０％が再生される点は先行技術と同様であるが、損傷変形した血 小板が作り出されることがないため、再活性化された血小板の６５〜８０％が、 人体中で通常の時間生物学的に機能するはずである。 保存温度の低下、凍結保存技術、添加剤及び人工的な保存媒体等のいくつかの 試みによれば、保存後に多数の血小板が得られる。しかしながら、これらの方法 により再生された血小板の機能的な許容量及び循環における耐久性は、限定的な ものである。保存後に多数の血小板が得られるのみならず、保存する間血小板が 凝集するのを防ぎ、かつ一旦患者に輸血されると、循環中に維持され除去されな いという血小板の能力を含む通常の反応能力を維持し続けることを可能にするよ うな血小板保存システムが、血液銀行及び病院により非常に必要とされている。 血液銀行及び病院は、保存後に多数の血小板が得られる血小板保存システムを 、非常に必要としている。これは、保存する間血小板が凝集するのを防ぎ、保存 状態から取り出した後に血小板が通常の反応をする能力を取り戻すことを可能に し、かつ血小板が循環中に維持され脾臓により除去されないことを可能にするよ うな血小板保存システムにより達成される可能性がある。 血小板活性阻害剤を使用する従来の試みは、非常に限定的にしか成功していな い。その理由は主に、先行技術による教示が、血小板の機能を保持する試みにお ける単一の阻害剤の使用に限定されていることにある。単一阻害剤系によれば、 阻害剤が全くない場合よりも向上した結果が得られるが、本発明の組成物及び方 法を用いることにより達成される予期せぬ結果に到達するものではない。単一阻 害剤系の使用に関する従来の方法については、バレリ、ファインゴールド及びマ ーチオンニ、「ジメチルスルホキシドを用いたヒト血小板の簡単な冷凍方法及び −８０℃での保存」、『血液』、第４３巻、第１号（1974年１月）、及びボーデ 、ホルメ、ヒートン及びスワンソン、「血小板活性阻害剤プロスタグランジンＥ 及びテオフィリンを用いた人工媒体中での血小板の長期保存」、“Vox Sang”、 第６０巻、105〜112頁（1991年）に説明されている。発明の開示 本発明は、従来の方法に比べて、有利な効果及び技術的知識の点で大いなる飛 躍となるものである。本発明の組成物及び方法を用いて処理した血小板の保存、 再活性化、及び長期の機能的有効性は、従来は不可能であると考えられてきたも のである。 本発明は、ヒトの血小板の貯蔵期間を延長する方法を提供する。該方法では、 血小板が、長期保存中その円盤形状を維持し、かつその機能的完全性を保持する ことを可能にする阻害剤系を使用する。これは、通常の血小板の機能を阻害して 、保存期間中血小板が生物学的に活性化しないようにしておくことにより達成さ れる。 本発明の方法は、第二メッセンジャーエフェクターからなる阻害剤系を広く含 む。この第二メッセンジャーエフェクター阻害剤系は、次の経路を通して機能す る：環状アデノシン一リン酸（環状ＡＭＰ）、ナトリウムチャネル、環状グアノ シン一リン酸（環状ＧＭＰ）、シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ホス ホリパーゼ、カルシウムカスケード、プロテアーゼ及びプロテイナーゼ、及び膜 改質剤。更に具体的には、各々の経路について、特定の薬剤又は薬剤の組合わせ を使用してよい。例えば、アデノシン、イロプロスト、プロスタサイクリン及び ＰＧＥ₂は、環状ＡＭＰ経路の刺激を通して活性化を阻害するよう作用する。ア ミロライド及びアミロライド類縁体は、ナトリウムチャネルの阻害を通して活性 化を阻害するよう作用する。ニトロプルシッドナトリウム及びＬ−アルギニンは 、ＧＭＰ経路の刺激を通して活性化を阻害するよう作用する。アスピリン、ジピ リダモール、フルビプロフェン及びチクロピジンは、シクロオキシゲナーゼ経路 の阻害を通して活性化を阻害するよう作用する。アスピリン及びチクロピジンは 、リポキシゲナーゼ経路の阻害を通して活性化を阻害するよう作用する。キナク リンは、ホスホリパーゼ経路の阻害を通して活性化を阻害するよう作用する。カ ルシウムは、カルシウムカスケード経路を通して血小板の活性化を促進するよう 作用する。プロテアーゼ及び／又はプロテイナーゼは、表面受容体の変化の阻害 を通して血小板の凝集を阻害するよう作用する。アマンタジン、アジョエン、ヘ パリン、チクロピジン、及び／又はペントキシフィリンは、膜改質剤として作用 する。 前記阻害剤系は、低温、即ち２〜８℃で保存している間作用する。零下の保存 温度（−２０〜−135℃）を使用する場合には、凍結製剤化する前に、血小板に 凍結保護剤を導入するのが有効である。例としては、ジメチルスルホキシド、マ ルトデキストリン類、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン及びグルコース があるが、他の凍結保護剤を使用してもよい。凍結保護剤は個別に使用しても組 み合わせて使用してもよい。 ヒトの血小板の貯蔵に好ましい方法は、静脈穿剌を通してヒトから抗凝固剤の 入った排気試験管に全血を吸引する工程により始まる。該血液を遠心分離して、 血液から血小板に富む血漿を単離する。血小板に富む血漿を遠心分離して、血小 板に乏しい血漿を血小板ペレットから分離するが、該ペレットは血漿を遠心分離 しデカントした後に残る濃縮された血小板である。次に、血小板に乏しい血漿に 、阻害剤系を添加する。この阻害剤系は、血小板に乏しい血漿に添加され、次の 濃度となるような、以下の物質を含む：０.１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは約１ ｍＭのアミロライドのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液、約２.５ｕＭ〜約250 ｕＭ、好ましくは約２５ｕＭのニトロプルシッドナトリウム（NaNP）のリン酸緩 衝生理食塩水溶液、約１０ｕＭ〜約１ｍＭ、好ましくは約０.１ｍＭのアデノシ ンのリン酸緩衝生理食塩水溶液、約１０ｎＭ〜約１ｕＭ、好ましくは約０.１ｕ Ｍのキナクリンのリン酸緩衝生理食塩水溶液、約２ｕＭ〜約200ｕＭ、好ましく は２０ｕＭのジピリダモールのDMS0溶液、約.５ｍＭ〜約５ｍＭ、好ましくは１. ５ｍＭのチクロピジンのDMSO溶液、及び約５単位／ml〜約200単位／ml、好まし くは２０単位／mlのヘパリンのリン酸緩衝生理食塩水溶液。血小板に乏しい血漿 ／阻害剤系混合物中に、血小板ペレットを静かに再懸濁する。混合物を次いで血 小板保存容器中に置き、振盪せずに２℃〜８℃で保存する。阻害剤を添加する他 の方法には、DMSOを添加せずに上記阻害剤の懸濁液を作製する方法がある。該懸 濁液を次いで凍結乾燥する。添加時に、阻害剤の凍結乾燥粉末を血小板に乏しい 血漿で再水和し、次いで血小板ペレットに添加する。該方法の他の点及び阻害剤 の濃度範囲は、上記の通りである。 ２つの例外を除き、４℃での保存で使用するのと同様の工程を、−２０〜−13 5℃での血小板の保存に使用することができる。凍結貯蔵剤、即ちジメチルスル ホキシドが、−２０〜−135℃での保存に用いる阻害剤系の一部をなし、かつ血 小板保存容器は−２０〜−135℃での保存に適するものでなければならない。 保存の間の活性化は望ましくない。しかしながら、血小板を保存状態から取り 出したときに、血小板が活性化する能力を維持し、輸血の目的に関して通常通り 機能することが必要とされる。血小板を保存状態から取り出した場合には、本発 明の阻害剤系を血小板から洗い流してもよく、これにより血小板の活性レベルは その通常レベルの非常に近くまで戻る。この洗浄工程は、インビトロでの機械的 洗浄により行ってもよく、あるいは直接輸血での希釈化効果により行ってもよい 。 保存後に血小板がその機能的能力を保持しているか否かを決定するために測定 すべき３種類の血小板活性パラメータがある。これらのパラメータは、新鮮な血 小板についての同様なパラメータと比較する場合に有用である。更に、異なる阻 害剤混合物を用いて保存した血小板についての血小板活性パラメータを比較して 、いずれの阻害剤の組合わせにより保存後により機能的な血小板が得られるかを 決定することもできる。本発明により貯蔵された血小板の活性パラメータを測定 するのに使用する試験は：血小板の数、低張応答、コラーゲン誘導凝集及びアデ ノシン二リン酸（ＡＤＰ）誘導凝集である。更に、グラニュール放出の測定から 、保存中の血小板の完全性についての重要な情報が得られる。 低張応答は、血小板が代謝活性を維持しているか否かを決定するのに用いる検 定である。この検定は、低張溶液の添加に対抗する血小板の能力の測光測定であ る。この活性は、細胞の機能（即ち、機能的な膜水ポンプ）を反映しており、保 存後の血小板の回復の指標である。低張応答は、輸血後に血小板が循環中に留ま る能力の重要な指標であることが明らかにされている。従って、低張応答は、保 存後の血小板の生化学を評価する重要なパラメータを表す。 凝集能力は、血小板が保存中にその機能の完全性を維持し得るか否かを示す他 の特徴である。この能力は、ＡＤＰ及びコラーゲンを使用することにより凝集を 誘導して測定される。作用薬は受容体に結合し、特定の反応を開始させる薬剤で ある。作用薬により誘導される凝集において、凝集(aggregation又はclumping) がその反応である。作用薬、即ちＡＤＰ及びコラーゲンは、凝集を誘導し、血小 板がその凝集能力を維持しているか否かを決定するのに使用される。更に、凝集 反応が起きる場合には、作用薬を添加することなく血小板が相互に癒着しあう自 発的凝集の存在を検出することができる。自発的凝集の発生は、血小板の循環か らの除去につながり、従って血小板の寿命は短い。発明を実施するための最良の形態 Ａ．阻害剤系 本発明の阻害剤系は、特定の第二メッセンジャーエフェクターであって、血小 板と相互作用し、４℃及び−８０℃での保存の間の活性及び機能的活性の損失に 対抗できるよう細胞を安定化させるものの適用をベースとする。 ７成分混合物 好ましい７成分阻害剤系を形成する特定の改質剤は、アミロライド、アデノシ ン、ニトロプルシッドナトリウム、キナクリン、ジピリダモール、チクロピジン 及びヘパリンである。これらの改質剤を血小板ペレットに添加し、次いで（100 倍〜の濃度に）自己由来の血小板に乏しい血漿で希釈する。これらの改質剤のそ れぞれは、異なる特定の第二メッセンジャー経路に作用する。アミロライドはカ リウム保存利尿剤であり、医薬としては高血圧の治療に使用される。本発明にお いては、アミロライドは、血小板のＮａ⁺−Ｈ⁺交換体の阻害剤として作用する。 アデノシンは、医薬としては患者の正常な洞調律を回復させるのに使用される。 本発明においては、アデノシンは、環状ＡＭＰの生成を刺激する。ニトロプルシ ッドナトリウムは平滑筋を弛緩させ、従って医薬としては血管拡張剤として投与 される。本発明においては、ニトロプルシッドナトリウムは、環状ＧＭＰの生成 を刺激する。ジピリダモールは、医薬としては血小板癒着阻害剤として使用され る。本発明においては、ジピリダモールは、アラキドン酸カスケードのシクロオ キシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼ酵素の阻害剤として作用する。キナクリンは 、腸条虫を根絶する治療に使用される。本発明においては、キナクリンは、ホス ホリパーゼＡ₂阻害剤として作用する。チクロピジンは、医薬としては血小板凝 集阻害剤として血栓性卒中の危険性を低下させるのに使用される。本発明におい ては、チクロピジンは、アラキドン酸カスケードの阻害剤として使用される。ヘ パリンは、医薬としては血液中の抗凝固剤として使用される。本発明においては 、ヘパリンは、フィブリン結合を遮断するのに使用される。 これら全ての第二メッセンジャーエフェクターは、単独であるいは相互に組み 合わせて、作用薬により誘導された凝集を阻害することが明らかにされた。更に 重要なことには、該阻害剤は、血小板を洗浄することによりエフェクターを除去 した後は可逆的である。該第二メッセンジャーエフェクターを、単独であるいは 相互に組み合わせて添加すると、２〜８℃又は−２０〜−135℃での保存の間、 血小板は保存による損傷を受けにくくなる。これらの細胞はまた、エフェクター を除去すると通常の生理学的凝集を示し、自発的凝集を示さず、高い低張応答を 維持した。 血小板損傷阻害剤としての有用性が示されている化学物質について記載する場 合に、実際に言及されている化学物質及び機能的に等価な物質はともに、本発明 の範囲内のものであるとされることに留意すべきである。阻害剤としての有用性 が知られ又は明らかにされているものについて、特に本願明細書に記載している 。しかしながら、本願明細書の範囲は、機能的に有効な他の化学物質であって、 既に存在している化学物質又は未だ見いだされていない化学物質にまで及ぶもの である。 ナトリウムチャネルを通して作用する阻害剤について機能的に等価な物質であ ると考えられる特定の化学物質は、アミロライド、アミロライド類縁体、ベプリ ジル、フレカイナイド、サキシトキシン、ベンズアミル及びプラジュナリウムか らなる群から選ばれるものである。ＧＭＰ経路を通して作用する阻害剤と機能的 に等価であると考えられる物質は、ニトロプルシッドナトリウム、Ｌ−アルギニ ン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房ナトリウム排出因子、バソプ レッシン、オキシトシン及び三窒化グリセリルからなる群から選ばれる。シクロ オキシゲナーゼ経路を通して作用する阻害剤について機能的に等価な物質は、ア スピリン、ジピリダモール、フルビプロフェン、チクロピジン、ケトプロフェン 、イブプロフェン、インドメタシン、スルフィンピラゾン、グアナベンツ、ウル ソール酸及びベンゾヒドロキノンからなる群から選ばれる。リポキシゲナーゼ経 路を通して作用する阻害剤成分について機能的に等価な物質は、アスピリン、チ クロピジン、ウルソール酸、ウンベリフェロン、５，８，11，14−エイコサテト ラエン酸及びエスクレチンからなる群から選ばれる。最後に、カルシウムカスケ ード経路を通して作用する阻害剤と機能的に等価な物質は、プロテインキナーゼ Ｃエフェクター、カルシウムチャネル遮断剤、カルシウム濃度改良剤、カルモジ ュリンエフェクター、カルシウムイオノファ及びＡＴＰアーゼ刺激剤からなる群 から選ばれる。 Ｂ．４℃での血小板の保存 本発明の阻害剤系を使用して、４℃で細胞を保存することにより、血小板の貯 蔵寿命を延長することが可能であると考えられる。４℃で１０日間保存した血小 板を、保存後の活性について分析した場合、新鮮な血小板の活性に比べて、細胞 の活性の割合は以下の通りであった：ＡＤＰ誘導凝集７０％、コラーゲン誘導凝 集８５％、低張応答６５％及び細胞数の再生＞９５％。これらの結果は、新鮮な 血小板に比べてＡＤＰ誘導凝集５５％、コラーゲン誘導凝集８０％、低張応答５ ５％となる従来の２２℃で５日間の保存後の血小板の保存と比較して良好である 。 ４℃での実験を行う場合、米国血液銀行協会の手続及びプロトコルに規定され ている通り、かつ血液調達機関が行う通り、静脈穿刺を通して抗凝固剤酸−クエ ン酸デキストロースの入った血液バッグに全血を吸引する。小スケールの実験を 行う場合には、全血を６mlの排気試験管に吸引し、血液バッグの場合と同様のプ ロトコルにより加工することも可能である。血液バッグを2000×ｇで３分間遠心 分離して、赤血球を血小板及び血漿から分離する。接続した血小板保存バッグに 圧搾して血小板に富む血漿を単離し、次いで5000×ｇで５分間２回目の遠心分離 をして血小板をペレット化する。血小板に乏しい血漿を血漿保存バッグに圧搾す る一方、約５０〜６０mlの血漿を伴う得られた血小板ペレットを、血液銀行手続 に規定されている通り２２℃に１時間放置した。温置後、血小板製剤を緩やかに 振盪することにより残存血漿中に再懸濁する。６mlの試験管を用いた小スケール の実験の場合、等容積の血漿を血小板ペレット上に残し、血小板試料を再懸濁す る。 阻害剤系溶液は、以下のように調製する：100ｍＭのアミロライド、150ｍＭの チクロピジン及び２ｍＭのジピリダモールを含むDMSOによる薬剤の溶液を調製す る。２.５ｍＭのニトロプルシッドナトリウム、１０ｍＭのアデノシン、１０ｕ Ｍのキナクリン及び2000単位／mlのヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水による 薬剤の溶液を調製する。これらの混合物中の阻害剤系薬剤の濃度は、４℃での有 効な保存を達成するために血小板中に必要とされる最終濃度の100倍とする。阻 害剤溶液を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容積で、無菌ポートを通 した直接注入により添加する。DMSO溶液及びリン酸緩衝生理食塩水溶液の添加の 順序は、本発明の実施に本質的なものではないと思われる。血小板製剤中の阻害 剤薬剤の最終濃度は、以下の通りである：アミロライド１ｍＭ、アデノシン０. １ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム２５ｕＭ、ジピリダモール２０ｕＭ、キ ナクリン０.１ｕＭ、チクロピジン１.５ｍＭ、及びヘパリン２０単位／ml。標準 血小板保存バッグに入れた血小板製剤を、攪拌せずに４℃に静置する。阻害剤系 を伴う血小板濃縮物は、保存後に直接輸血することが可能である。 あるいは、組合わせた阻害剤を、DMSOを使用せずに血小板ペレットに添加する ことも可能である。これは、２種類の方法により行うことができる。組合わせた 阻害剤を音波処理により懸濁液に加工することが可能である。この音波処理した 懸濁液を、次いで上記のように直接使用することができる。あるいは、音波処理 した懸濁液を凍結乾燥し、凍結乾燥粉末として保存することもできる。使用に際 して、該粉末を、適切な体積の血小板に乏しい血漿を用いて再水和化し、上記の ように血小板ペレットに添加する。いずれの方法を用いる場合でも、（DMSOを使 用しないことを除き）添加剤の最終濃度は上記と同様である。 Ｃ．凍結貯蔵による−２０〜−135℃での血小板の保存 本発明の第２の使用は、血小板を−２０〜−135℃で保存することを含む。本 発明の阻害剤溶液系を血小板ペレットに添加することにより、血小板を有効に安 定化させ、よって細胞を凍結貯蔵し、−２０〜−135℃で保存することが可能と なる。 血小板を−２０〜−135℃で保存するには、凍結保護剤の添加が必要となる。 本発明の方法の一部として、ジメチルスルホキシド（DMSO）を凍結保護剤として 使用できる。DMSOは極性分子であり、細胞膜に浸透し、凍結調剤工程の間細胞活 性を維持するのに役立つ。本発明において、DMSOは、血小板を安定化させ、−２ ０〜−135℃で保存した後に機能的に活性な血小板を得ることを可能にする。本 発明の阻害剤系を用いて凍結貯蔵した血小板を長期間（＞100日）保存した後、 再生した細胞の数及び血小板の機能的活性を、新鮮な血小板の場合と比較した。 ９５％を超える凍結貯蔵細胞が再生し、これらの血小板はＡＤＰ誘導凝集５５％ 、コラーゲン誘導凝集６５％及び低張応答５０％という機能的活性を示した。こ れらの結果は、従来の２２℃で５日間の保存後の血小板の保存と比較して良好で ある。更に、このプロトコルにおいて、他の凍結保護剤をDMSOの代わりに使用し てもよい。このような凍結保護剤にはマルトデキストリン、デキストラン、ヒド ロキシエチルデンプン及びグルコースが含まれ、これらは単独であっても組み合 わ されていてもよい。 本発明の阻害剤保存系に使用することを目的として血小板を加工するため、血 液銀行手続に規定されかつ４℃での保存について（Ｂ）節で詳細に記載したよう に、血小板濃厚物を作製する。阻害剤系溶液は、以下のように調製する：100ｍ Ｍのアミロライド、150ｍＭのチクロピジン及び２ｍＭのジピリダモールを含むD MSOによる薬剤の溶液を調製する。２.５ｍＭのニトロプルシッドナトリウム、１ ０ｍＭのアデノシン、１０ｕＭのキナクリン及び2000単位／mlのヘパリンを含む リン酸緩衝生理食塩水による薬剤の溶液を調製する。これらの混合物中の阻害剤 系薬剤の濃度は、血小板中に必要とされる最終濃度の100倍とする。阻害剤溶液 を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容積で、無菌ポートを通した直接 注入により添加する。DMSO溶液及びリン酸緩衝生理食塩水溶液の添加の順序は重 要ではないと思われる。血小板製剤中の阻害剤薬剤の最終濃度は、以下の通りで ある：アミロライド１ｍＭ、アデノシン０.１ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウ ム２５ｕＭ、ジピリダモール２０ｕＭ、キナクリン０.１ｕＭ、チクロピジン１. ５ｍＭ、及びヘパリン２０単位／ml。更に、DMSOを、無菌ポートを通した注入に より血小板製剤に直接添加して、最終濃度を１％〜６％、好ましくは２％とする 。−２０〜−135℃での保存に使用可能な血小板バッグを、標準冷凍カセット中 に静置し、次いで−２０〜−135℃の冷凍機中に置く。本発明の阻害剤系を用い て血小板を−２０〜−135℃で保存した後、血小板製剤を−２０〜−135℃の冷凍 機から取り出し、全製剤が溶解するまで３７℃のウォーターバス中に直接置く。 阻害剤系を伴う血小板濃縮物は、溶解処理後に直接輸血することが可能である。 あるいは、血小板製剤を遠心分離して血小板をペレット化し、それにより凍結貯 蔵溶液のDMSO成分を除去することもできる。該血小板を次いで自己由来の血漿中 に再懸濁し、直接輸血することが可能である。 本発明の組成物を当業者が製造することが可能となるように、以下に実施例を 示す。これらの実施例は、本発明が認識された範囲を限定することを意図するも のではない。測定条件を特徴付ける数値に関する精度を確かなものとするために 努力を払ったが、実験的エラー及び偏差がいくらか存在する可能がある。実施例 実施例１ 本実施例は、４℃での長期保存を試験する実験に関する。肘前静脈の静脈穿刺 を通して、酸−クエン酸デキストロース抗凝固剤の入った６mlの吸引排気試験管 に、試験管６本の全血を吸引した。全血の入った試験管を250×ｇで１２分間遠 心分離した。血小板に富む血漿を単離した。血小板に富む血漿を950×ｇで２０ 分間遠心分離した。全ての血小板に乏しい血漿をペレットから除去した。溶液を 血小板に乏しい血漿に添加して、以下の最終濃度とした：アミロライド１ｍＭ、 ニトロプルシッドナトリウム（NaNP）２５ｕＭ、アデノシンのリン酸緩衝生理食 塩水溶液０.１ｍＭ、キナクリン０.１ｕＭ、ジピリダモール２０ｕＭ、チクロピ ジン１.５ｍＭ、ヘパリン２０単位／ml及びDMSO１％。該溶液を含有する血小板 に乏しい血漿を血小板ペレットに戻し、元の血小板に富む血漿の体積の１／１０ の体積とした。ペレットを緩やかに再懸濁し、混合物を血小板保存バッグに移し た。混合物を入れた血小板バッグを、攪拌せずに４℃で保存した。４℃で１０日間保存後の上記方法の結果 標準的な血小板保存バッグ中で４℃において１０日間保存した後、血小板を室 温まで温め、自己由来の血漿で希釈して、元の血小板に富む血漿の体積とした。 新鮮な血小板の活性との比較で、血小板の保存後の活性を分析した。活性の特徴 についての結果は、以下の通りであった。 ＡＤＰ誘導凝集 ７０％ コラーゲン誘導凝集 ８５％ 低張応答 ６５％ 細胞数の再生 ９５％実施例２ 本実施例は、−８０℃での保存後の血小板の活性を試験する実験に関する。肘 前静脈の静脈穿刺を通して、酸−クエン酸デキストロース抗凝固剤の入った６ml の吸引排気試験管に、試験管６本の全血を吸引した。全血の入った試験管を250 ×ｇで１２分間遠心分離した。血小板に富む血漿を単離した。血小板に富む血漿 を950×ｇで２０分間遠心分離した。全ての血小板に乏しい血漿をペレットから 除去した。溶液を血小板に乏しい血漿に添加して、以下の最終濃度とした：アミ ロライド１ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム（NaNP）２５ｕＭ、アデノシン０ .１ｍＭ、キナクリン０.１ｕＭ、ジピリダモール２０ｕＭ、チクロピジン１.５ ｍＭ、ヘパリン２０単位／ml及びジメチルスルホキシド６％。該溶液を含有する 血小板に乏しい血漿を血小板ペレットに戻し、元の血小板に富む血漿の体積の１ ／１０の体積とした。ペレットを緩やかに再懸濁し、混合物を血小板保存バッグ に移した。混合物を入れた血小板バッグを、−８０℃において、冷蔵用に設計し た標準赤血球カセット中で保存した。凍結貯蔵後の上記方法の結果 冷凍した血小板試料を３７℃のウォーターバス中に直接置いて溶解させた後、 血小板を自己由来の血漿で希釈して、元の血小板に富む血漿の体積とした。新鮮 な血小板の活性との比較で、血小板の保存後の活性を分析した。活性の特徴につ いての結果は、以下の通りであった。 ＡＤＰ誘導凝集 ５０％ コラーゲン誘導凝集 ７４％ 低張応答 ７８％ 細胞数の再生 ８５％実施例３ 本実施例は、全ユニットの血小板濃厚物を長期間４℃で保存することへの、本 発明の阻害剤系の適用に関する。標準血液銀行手法に従って、湾岸地域血液銀行 の静脈穿刺を通して、無菌市販血液収集システムに全血の全ユニットを吸引した 。標準血液銀行手続に従って、全血の入った血液バッグを遠心分離し、得られた 血小板に富む血漿の分画を標準血小板保存バッグに圧搾した。血小板に富む血漿 を、次いで標準血液銀行プロトコルに従って遠心分離し、得られた血小板に乏し い血漿を標準血漿保存バッグに圧搾した。血小板保存バッグ中の得られた血小板 ペレットには、なお約６０mlの血漿が残存していた。この血小板濃厚物を、攪拌 せずに２２℃で１時間保存して、血小板を再懸濁させた。以下のものを含有する 阻害剤溶液を調製した：100ｍＭのアミロライド、150ｍＭのチクロピジン及び２ ｍＭのジピリダモールを含むDMSOによる薬剤の溶液。２.５ｍＭのニトロプルシ ッ ドナトリウム、１０ｍＭのアデノシン、１０ｕＭのキナクリン及び2000単位／ml のヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水による薬剤の溶液。これらの混合物中の 阻害剤系薬剤の濃度は、血小板製剤中に必要とされる最終濃度の100倍とした。 阻害剤溶液を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容積（約０.６ml）で、 無菌ポートを通した直接注入により添加した。DMSO溶液及びリン酸緩衝生理食塩 水溶液の血小板濃厚物への添加の順序は、重要ではないと思われる。血小板製剤 中の阻害剤薬剤の最終濃度は、以下の通りである：アミロライド１ｍＭ、アデノ シン０.１ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム２５ｕＭ、ジピリダモール２０ｕ Ｍ、キナクリン０.１ｕＭ、チクロピジン１.５ｍＭ、及びヘパリン２０単位／ml 。阻害剤溶液を伴う血小板濃厚物を、次いで攪拌せずに４℃で保存した。同時に 、比較のため、以下のような従来の血液銀行の方法の下で血小板濃厚物ユニット を保存した：血小板濃厚物を１時間温置して再懸濁させた後、標準血液銀行手続 に従って緩やかに攪拌しながら血小板製剤を２２℃で保存した。更に、阻害剤系 を使用することなく、血小板濃厚物製剤を４℃で保存した。保存の様々な時点で 、従来法で保存した製剤、４℃で保存した血小板、及び本発明の阻害剤溶液を使 用して４℃で保存した血小板から、血小板のアリコートを採取した。これらの製 剤からの血小板を、次いで細胞の活性及び機能的活性について分析した。この実 験についての結果を、以下の表に示す。データは、採取した時間での新鮮な血小 板の活性及び機能的活性に対する割合で表されている。 新鮮な血小板に対する％ 活性及び機能的活性についての全ての試験において、本発明の阻害剤溶液を添 加して４℃で保存した血小板濃厚物は、１０日目において、従来法で保存した５ 日目の血小板よりも高い回復を示した。従来の血液銀行の基準の下では、血小板 の最長保存期間は２２℃では５日間である。実施例４ 本実施例は、全ユニットの血小板濃厚物を長期間凍結貯蔵により−８０℃で保 存することへの、本発明の阻害剤系の適用に関する。標準血液銀行手法に従って 、湾岸地域血液銀行の静脈穿刺を通して、無菌市販血液収集システムに全血の全 ユニットを吸引した。標準血液銀行手続に従って、全血の入った血液バッグを遠 心分離し、得られた血小板に富む血漿の分画を標準血小板保存バッグに圧搾した 。血小板に富む血漿を、次いで標準血液銀行プロトコルに従って遠心分離し、得 られた血小板に乏しい血漿を標準血漿保存バッグに圧搾した。血小板保存バッグ 中の得られた血小板ペレットには、なお約６０mlの血漿が残存していた。この血 小板濃厚物を、攪拌せずに２２℃で１時間保存して、血小板を再懸濁させた。以 下のものを含有する阻害剤溶液を調製した：100ｍＭのアミロライド、150ｍＭの チクロピジン及び２ｍＭのジピリダモールを含むDMSOによる薬剤の溶液。２.５ ｍＭのニトロプルシッドナトリウム、１０ｍＭのアデノシン、１０ｕＭのキナク リン及び2000単位／mlのヘパリンを含むリン酸緩衝生理食塩水による薬剤の溶液 。これらの混合物中の阻害剤系薬剤の濃度は、血小板製剤中に必要とされる最終 濃度の100倍とした。阻害剤溶液を、血小板濃厚物に、全血小板製剤の１／100容 積（約０.６ml）で、無菌ポートを通した直接注入により添加した。DMSO溶液及 びリン酸緩衝生理食塩水溶液の血小板濃厚物への添加の順序は、重要ではないと 思われる。血小板製剤中の阻害剤薬剤の最終濃度は、以下の通りである：アミロ ライド１ｍＭ、アデノシン０.１ｍＭ、ニトロプルシッドナトリウム２５ｕＭ、 ジピリダモール２０ｕＭ、キナクリン０.１ｕＭ、チクロピジン１.５ｍＭ、及び ヘパリン２０単位／ml。更に、無菌ポートを通した注入により、DMSOを血小板濃 厚物に添加して、最終濃度を６％とした。標準冷凍バッグに入れた血小板製剤を 、冷凍カセットに入れ、−８０℃に置いた。同時に、従来の血液銀行の方法に従 って、血小板濃厚物を凍結貯蔵した。即ち、６％のDMSOを血小板濃厚物に添加し 、次いで血小板製剤を−８０℃で冷凍カセット中に置いた。−８０℃で２０日間 保存した後、血小板製剤を−８０℃の冷凍機から取りだし、３７℃のウォーター バス中に 直接置いた。血小板のアリコートを採取し、遠心分離してDMSOを除去した。血小 板ペレットを自己由来の血漿中に再懸濁し、細胞の活性及び機能的活性を決定し た。この実験についての結果を、以下の表に示す。データは、採取した時間での 新鮮な血小板の活性及び機能的活性に対する割合で表されている。 新鮮な血小板に対する％ 本発明の阻害剤系を使用して、−８０℃で凍結貯蔵することにより保存した血 小板は、良好な活性及び機能的活性の回復を示しており、従って輸血後であって も有効であり得ると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カーリー ローラ エム アメリカ合衆国 テキサス州 77090 ヒ ューストン ハロー トゥリー ＃2053− 100

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血小板保存系用の血漿賦形剤を含む血小板保存用組成物であって、該血漿賦 形剤が、生物活性血小板のインビトロでの貯蔵を可能とするのに機能的に有効な 一定量の２種以上の血小板損傷阻害剤を含有する、前記組成物。 ２．前記２種以上の血小板損傷阻害剤が、環状ＡＭＰ第二メッセンジャー系のエ フェクター、ナトリウムチャネルの阻害剤、環状ＧＭＰ第二メッセンジャー系の エフェクター、シクロオキシゲナーゼ経路の阻害剤、リポキシゲナーゼ経路の阻 害剤、ホスホリパーゼ経路の阻害剤、カルシウムカスケード、プロテアーゼ及び プロテイナーゼの阻害剤、膜改質剤及びこれらの組合わせからなる群から選ばれ る、請求項１記載の血小板保存用組成物。 ３．血小板保存用の血漿賦形剤を含む血小板保存用組成物であって、該血漿賦形 剤が、生物活性血小板のインビトロでの貯蔵を可能とするのに機能的に有効な一 定量の３種以上の血小板損傷阻害剤を含有する、前記組成物。 ４．前記３種以上の血小板損傷阻害剤が、環状ＡＭＰ第二メッセンジャー系のエ フェクター、ナトリウムチャネルの阻害剤、環状ＧＭＰ第二メッセンジャー系の エフェクター、シクロオキシゲナーゼ経路の阻害剤、リポキシゲナーゼ経路の阻 害剤、ホスホリパーゼ経路の阻害剤、カルシウムカスケード、プロテアーゼ及び プロテイナーゼの阻害剤、膜改質剤及びこれらの組合わせからなる群から選ばれ る、請求項３記載の血小板保存用組成物。 ５．前記環状ＡＭＰ第二メッセンジャー系が、アデノシン、イロプロスト、プロ スタサイクリン、ＰＧＥ₂、フォルスコリン、コレラトキシン、イソプレテレノ ール、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチル−ｃＡＭＰ、テオフィリン、イソブチル メチル−キサンチン、チロトロピン及びオーラノフィンからなる群から選ばれる 、請求項２又は４記載の血小板保存用組成物。 ６．前記ナトリウムチャネルを通して作用する阻害剤が、アミロライド、アミロ ライド類縁体、ベプリジル、フレカイナイド、サキシトキシン、ベンズアミル及 びプラジュナリウムからなる群から選ばれる、請求項２又は４記載の血小板保存 用組成物。 ７．前記ＧＭＰ経路を通して作用する阻害剤が、ニトロプルシッドナトリウム、 Ｌ−アルギニン、亜酸化窒素、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１Ａ、心房ナトリウム排出 因子、バソプレッシン、オキシトシン及び三窒化グリセリルからなる群から選ば れる、請求項２又は４記載の血小板保存用組成物。 ８．前記シクロオキシゲナーゼ経路を通して作用する阻害剤が、アスピリン、ジ ピリダモール、フルビプロフェン、チクロピジン、ケトプロフェン、イブプロフ ェン、インドメタシン、スルフィンピラゾン、グアナベンツ、ウルソール酸及び ベンゾヒドロキノンからなる群から選ばれる、請求項２又は４記載の血小板保存 用組成物。 ９．前記リポキシゲナーゼ経路を通して作用する阻害剤が、アスピリン、チクロ ピジン、ウルソール酸、ウンベリフェロン、５，８，11，14−エイコサテトラエ ン酸及びエスクレチンからなる群から選ばれる、請求項２又は４記載の血小板保 存用組成物。 10．前記ホスホリパーゼ経路を通して作用する阻害剤が、キナクリン及びメパク リンからなる群から選ばれる、請求項２又は４記載の血小板保存用組成物。 11．前記カルシウムカスケード経路を通して作用する阻害剤が、プロテインキナ ーゼＣエフェクター、カルシウムチャネル遮断剤、カルシウム濃度改良剤、カル モジュリンエフェクター、カルシウムイオノファ及びＡＴＰアーゼ刺激剤からな る群から選ばれる、請求項２又は４記載の血小板保存用組成物。 12．前記プロテアーゼ又はプロテイナーゼ阻害剤が、ヘパリン及びアポプロチニ ンからなる群から選ばれる、請求項２又は４記載の血小板保存用組成物。 13．前記膜改質剤が、アマンタジン、ヘパリン、チクロピジン、ペントキシフィ リン及びアジョエンからなる群から選ばれる、請求項２又は４記載の血小板保存 用組成物。 14．ヒトの血小板の貯蔵期間を延長するために使用する阻害剤系であって、該系 が、保存中血小板の活性を阻害することが可能である一方で、該阻害剤系が血小 板から除去された後は血小板の活性が回復することを可能とするものであり、生 物活性血小板の保存時間を延長するのに有効な量のアミロライド、ニトロプルシ ッドナトリウム、アデノシン、ジピリダモール、キナクリン、チクロピジ ン及びヘパリンを含有する血漿相を含む、前記阻害剤系。 15．血小板保存用組成物であって、約０.１ｍＭ〜１０ｍＭのアミロライド、約 ２.５ｕＭ〜250ｕＭのニトロプルシッドナトリウム、約１０ｕＭ〜１ｍＭのアデ ノシン、約１０ｎＭ〜１ｕＭのキナクリン、約２ｕＭ〜200ｕＭのジピリダモー ル、約.５ｍＭ〜５ｍＭのチクロピジン、及び約５単位／mｌ〜約200単位／mlの ヘパリンを含有する血小板保存系用の血漿賦形剤を含む、前記組成物。 16．更に約.５％〜約１０％の凍結貯蔵剤を含む、請求項１、３又は15のいずれ か１項に記載の組成物。 17．前記凍結貯蔵剤が、約.５％〜６％のジメチルスルホキシドである、請求項1 6に記載の組成物。 18．前記凍結貯蔵剤が、濃度約２％のジメチルスルホキシドである、請求項16に 記載の組成物。 19．前記アミロライドの濃度が約１ｍＭである、請求項14に記載の組成物。 20．前記ニトロプルシッドナトリウムの濃度が約２５ｕＭである、請求項14に記 載の組成物。 21．前記アデノシンの濃度が約０.１ｍＭである、請求項14に記載の組成物。 22．前記キナクリンの濃度が約０.１ｕＭである、請求項14に記載の組成物。 23．前記ジピリダモールの濃度が約２０ｕＭである、請求項14に記載の組成物。 24．前記チクロピジンの濃度が約１.５ｍＭである、請求項14に記載の組成物。 25．前記ヘパリンの濃度が約２０単位／mlである、請求項14に記載の組成物。 26．以下の工程： アミロライド、ニトロプルシッドナトリウム、アデノシン、キナクリン、ジピ リダモール、チクロピジン及びヘパリンの１種以上からなる群から選ばれる選択 された薬剤を血漿相に添加して、血漿阻害剤混合物を形成する工程； 該血漿阻害剤混合物を血小板製剤と混合する工程；及び 冷蔵する工程 を含む、血小板の長期間の貯蔵のための方法。 27．前記血漿阻害剤混合物が、約.５％〜約１０％の凍結貯蔵剤を含む、請求項2 6に記載の方法。 28．前記凍結貯蔵剤が、約.５％〜６％のジメチルスルホキシドである、請求項2 6に記載の方法。 29．前記凍結貯蔵剤が、濃度約６％のジメチルスルホキシドである、請求項26に 記載の方法。 30．前記アミロライドが濃度約１ｍＭ以上で添加される、請求項26に記載の方法 。 31．前記ニトロプルシッドナトリウムが濃度約２５ｕＭで添加される、請求項26 に記載の方法。 32．前記アデノシンが濃度約０.１ｍＭで添加される、請求項26に記載の方法。 33．前記キナクリンが濃度約０.１ｕＭで添加される、請求項26に記載の方法。 34．前記ジピリダモールが濃度約２０ｕＭで添加される、請求項26に記載の方法 。 35．前記チクロピジンが濃度約１.５ｍＭで添加される、請求項26に記載の方法 。 36．前記ヘパリンが濃度約２０単位／mlで添加される、請求項26に記載の方法。 37．ヒトの血液を加工する方法であって、以下の工程： (a)ヒトの新鮮血液から血小板を含有する血漿を単離する工程； (b)血漿から血小板の少なくとも一部を分離する工程； (c)分離した血漿に、分離した血漿中の血小板の凝集を阻害し得る可逆的阻害 剤を添加する工程； (d)阻害し、分離した血漿中に、分離した血小板を懸濁する工程；及び (e)懸濁した血小板を含有する得られた血漿を、冷蔵した血漿を選ばれた期間 貯蔵するのに有効な温度で冷蔵する工程 を含む、前記方法。 38．ヒトの血液を加工する方法であって、以下の工程： a．静脈穿刺を通してヒトから全血を吸引する工程； b．吸引した血液を遠心分離して、血液から血小板に富む血漿を単離する工程 ； c．血小板に富む血漿を遠心分離して、血小板に乏しい血漿と血小板ペレット とを形成する工程； d．血小板に乏しい血漿に、 アミロライド； ニトロプルシッドナトリウム； アデノシン； キナクリン； ジピリダモール； チクロピジン； ヘパリン を含む阻害剤系を添加する工程； e．阻害剤系を含有する血小板に乏しい血漿中に、血小板ペレットを静かに再 懸濁する工程；及び f．懸濁したペレットを含有する得られた血漿を、温度約４℃で保存する工程 を含む、前記方法。 39．ヒトの血液を加工する方法であって、以下の工程： a．静脈穿刺を通してヒトから全血を吸引する工程； b．吸引した血液を遠心分離して、血液から血小板に富む血漿を単離する工程 ； c．血小板に富む血漿を遠心分離して、血小板に乏しい血漿と血小板ペレット とを形成する工程； d．血小板に乏しい血漿に、 アミロライド； ニトロプルシッドナトリウム； アデノシン； キナクリン； ジピリダモール； チクロピジン； ヘパリン； ジメチルスルホキシド を含む阻害剤系を添加する工程； e．阻害剤系及び凍結保護剤を含有する血小板に乏しい血漿中に、血小板ペレ ットを静かに再懸濁する工程；及び f．懸濁したペレットを含有する得られた血漿を、温度約−８０℃で保存する 工程 を含む、前記方法。 40．ヒトの新鮮血液から血小板を単離する方法であって、以下の工程： 血小板を含有する新鮮血液から血漿を分離する工程； 分離した血漿から血小板を分離して、実質的に血漿を含まない血小板分画及び 血小板に乏しい血漿分画を形成する工程； 血小板に乏しい血漿に可逆的阻害剤を添加する工程； 可逆的阻害剤を含有する血漿分画中に、血小板分画を懸濁する工程；及び 懸濁した血小板分画を含有する可逆的に阻害した血漿分画を、温度約４℃未満 で冷却する工程 を含む、前記方法。