JPH0235078A - 赤血球の凍結乾燥法及び凍結乾燥用媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物化学及び医療科学の一般分野、特に赤血球
の保存、貯蔵及び再生の方法に関する。

〔従来の技術〕

血液は人体の主要な組織であり、その主だった役割は肺
から周辺組織に酸素を運搬することである。この役割は
赤血球（ＲＢＣと略す）によってなされる。酸素は肺に
おいてヘモグロビンと呼ばれる赤色で鉄を含む蛋白質に
よる交換拡散系により周辺細胞へ供給される。ヘモグロ
ビンが酸素と結合するとオキシヘモグロビンが形成され
、組織に酸素を渡すことによりオキシヘモグロビンはデ
オキシヘモグロビンに還元される。

赤色の細胞膜は２つの主要な構造単位、二重膜及び細胞
骨格により構成される。脂質二重層と複合膜蛋白質が二
重膜を構成するが、構造的強度はほとんどなく小胞の発
生によりたやすく壊れる。

もう一方の主要な構成単位である膜の骨格は二重膜を安
定させ、かつ細胞の変形に対し抵抗性を与える。この細
胞骨格は赤血球の細胞膜において二重層と結びついてお
り、これは脂質−蛋白質並びに蛋白質相互の会合により
可能になっている。このヘモグロビン、及び他の赤血球
の構成要素も赤色の細胞、膜に含まれている。

成熟すると骨髄は活発に新しい赤血球を造る。

造られた赤血球はすぐに血液中に出ていき、平均１２０
日の寿命を有する。通常人の場合、食細胞作用、溶血又
は機械的な損傷により毎日約０．８３％の赤血球が失わ
れ、失われた赤血球は骨髄によって補われる。

各種の負傷及び医療処置において全血又は各血液成分の
輸血が求められる。全ての患者が血液の全成分を必要と
するわけではなく、事実血液成分全てを輸血することは
医療上問題がある。分離された血液画分、は輸血時にそ
の生物学的活性を確保するために最も適した特別の条件
下で貯蔵することができる。例えば、提供された血液が
調製センターに受は入れられると、赤血球が分離され種
々の方法で貯蔵される。この赤血球は一般に２００−３
００７ｎｌの容量を有し、かつ７０−９０のへマドクリ
ット値（赤血球の容積％で表現される）を有するパック
された赤血球の１単位として、クエン酸−燐酸−デキス
トロースの存在下４°Ｃで５週間まで貯蔵することがで
きる。

赤血球は、−３０°Ｃ〜−１９６°Ｃで凍結すればグリ
セロール溶液中で７年まで貯蔵することかできるが、輸
血に十分なだけの赤血球の生存を図るため極く低い温度
で凍結を維持しなければならない。これらの方法では所
望の赤血球の生物学的活性を失わせないため貯蔵温度を
注意深く維持することが求められ、かつ輸血された赤血
球の少なくとも７０％が２４時間生存することか求めら
れる。

これは米国血液銀行協会基準による輸血を実施する場合
の許容基準と考えられているものである。

したがって、特別な貯蔵温度又は他の貯蔵条件の維持を
必要としない赤血球の貯蔵方法を得ることが切実に望ま
れている。このような方法は医療目的で赤血球を利用す
ることを容易にする。

この望まれる方法のひとつは赤血球の凍結乾燥（フリー
ズドライ）であり、それは凍結乾燥された赤血球は室温
で長期間貯蔵でき、かつ哺乳類に使用する場合に容易に
水を加えて再生することかできるからである。しかし、
我々の発明以前は、凍結乾燥した赤血球の再生により、
細胞骨格が損なわれておらずヘモグロビンが生物学的活
性を有するような赤血球、つまり生活力のある赤血球を
形成するように赤血球を凍結乾燥することは不可能であ
った。赤血球が従来の方法により凍結乾燥された場合、
例えば水又は食塩燐酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いると、再
生された赤血球は新陳代謝ができなくなる程の損傷を受
け、赤血球のヘモグロビンは酸素を運ぶことが出来なく
なる。凍結乾燥され、かつ再生されたグルタルアルデヒ
ドで固定された赤血球は、主に凝集定量法に用いること
が知られている。

〔発明の内容〕

本発明に係る方法によると赤血球の構造及びヘモグロビ
ンの生物学的活性を維持した状態で赤血球の凍結乾燥を
行うことができ、かつ、治療レベルで使用することがで
きる凍結乾燥赤血球を再生することができる。手短に言
うならば、本発明に係る方法は多数の赤血球を炭水化物
及びポリマーを含む生理的緩衝水溶液に浸漬し、溶液を
凍結した後、溶液を乾燥し、水溶液による再生時に十分
な割合の損傷がなく及び活性のある赤血球を得る凍結乾
燥赤血球を造ることからなる。

本発明に使用する炭水化物は、赤血球と生物学的に調和
できるもの、つまり、赤血球を破壊することなく、赤血
球の細胞膜を透過し又は透過できるものである。この炭
水化物は単糖類からなる群から選ばれるが、これは三糖
類が細胞膜を透過しないからである。単糖類であるペン
トース及びヘキソースは約０．５−約４．０モル濃度、
好ましくは約２モル濃度であることが適当である。キシ
ロース、グルコース、リボース、マンノース及ヒフラク
トースが特に有益で本発明で用いられる。

炭水化物を含まない水溶液における細胞膜の溶解及び破
壊に反して、このような炭水化物溶液中にある赤血球の
凍結乾燥は、凍結乾燥後、少なくとも５０％は損傷のな
い赤血球に回復を向上させる。

このような再生赤血球は凝集室１又は生化学的探査の製
造において使用する細胞の内容を失った幽霊細胞、つま
り標準的な細胞膜システムとして有用である。

本発明を他の面から検討すると、この炭水化物に加えて
水溶性で生物学的に協調的（コンパティプル）なポリマ
ーを含む溶液は、細胞中に残っておりかつ、凍結乾燥し
た赤血球の再生後に回復した生物学的活性を有するヘモ
グロビンの割合を十分に増加させる。このポリマーは溶
液中に０，１ミリモル濃度から飽和までの濃度で加える
ことができる。好ましくは、このポリマーは分子量が少
なくとも約１０に１最も好ましくは約２０に−５０にで
あり、その濃度は約５％からポリマーが溶液に飽和する
までである。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）　、ポリ
ビニルピロリドン誘導体及びデキストラン、デキストラ
ン誘導体からなる群より選ばれたポリマーが十分に有益
である。アミノ酸を基礎とするポリマー（例えば、蛋白
質）又はヒドロキシエチル澱粉も採用することができる
。赤血球の凍結乾燥における炭水化物−ポリマーの使用
は、損傷のない赤血球の再生が出来るようにし、生物学
的活性を有するヘモグロビンの含有量を十分な割合にす
る。

後述するデータに示されるように、上記溶液は赤血球を
凍結、昇華、再生ストレスにさらし、かつ凍結乾燥した
赤血球を哺乳類において通常の機能を発揮することがで
きる赤血球を造りだすよう再生する媒体（ｍｅｄｉｕｍ
）を提供する。術語又は文脈により他の内容を指示され
ない限り、文中に記述されたすべてのパーセントは重量
パーセントを意味する。

上述したように、本発明に係る方法は赤血球に損傷を与
えず生物学的活性を失わせない凍結乾燥及びその再生を
行なえる媒体を提供する。本発明に係る媒体は新規であ
るが、同時にそこで用いられる装置及び関連技術は種々
の物質の凍結乾燥に関する技術として当業者に知られて
いるものであり、実施例で採用された、特に細胞、単な
る特定の温度条件及び装置は文中に記載されたものであ
る。この記述から、当該技術分野における通常の技術に
より損傷のない生活力のある赤血球の凍結乾燥と再生を
行う方法において、本発明に係る媒体を採用することが
可能になる。

寒薔五ユ 各血液型のパックされた赤血球は病院の血液供給センタ
ー又は抗凝血剤にヘパリンを用いて健康なボランティア
から採取して得られた。

これらの血球の試料を生理食塩燐酸緩衝溶液（第−及び
第二塩基性燐酸ナトリウム１０ｍＭ、塩化ナトリウム１
５０ｍＭ、デキストロース５ｍＭ及びアデノシン１０ｍ
Ｍ、　ＰＨ７，２）をもちいて３回洗ったのち、１４．
００Ｏｒｐｍで６−１０秒遠心分離機にかけて赤血球か
ら形質細胞及び／又は他の細胞型の血球を分離した。

パックされた赤血球の試料を、次にＰ　Ｈ７，２のＰＢ
Ｓ溶液でグルコース２モル濃度を含む凍結乾燥緩衝液に
懸濁した。

この懸濁液をフラスコに移し続いて試料が凍結するまで
液体窒素（−１９６°Ｃ）に浸漬した。液体窒素内でフ
ラスコの内壁に溶液が均等に分散して凍結するようフラ
スコを水平に回転させた。

凍結した試料をベンチトップ凍結乾燥機（ラブコノ　モ
デル４．５）に入れ真空度　（ｍｅｒｃｕｒＹｖａｃｕ
ｕｍ　　）　１００ミクロン以下で、器内の温度−５６
℃で操作した。結晶の外観を呈し堅く脆い状態になるま
で試料を十分に乾燥（６−２４時間）させ、フラスコを
室温に戻した。

そしてその試料を３７°Ｃにおいてスクロース１Ｍを含
む食塩燐酸緩衝溶液で再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔ　）し
た。再水和に用いた溶液は乾燥前の試料の最初の容量と
同量加えた。

実験後その赤血球を光学顕微鏡で観察すると、約５０％
の赤血球が完全な細胞膜を宵していることが判った。し
かし、ヘモグロビンは細胞との会合が無いことが観察さ
れた。それにもかかわらず、溶液中のヘモグロビンは活
性があり、赤血球中に存在すれば酸素キャリヤーとして
有効であろう。

約０．５〜４モル濃度のフラクトース及びリボース溶液
によって同様の手順を繰り返すことによりほぼ同じ結果
が得られ、さらに約０．　５〜４モル濃度のキシロース
及びマンノースの緩衝溶液でも同様である。

とりわけ、実施例中に記載されたように各種の単糖類を
用いて赤血球の凍結乾燥が行われ、再生溶液のヘモグロ
ビンの分類が記録した。オキシヘモグロビンは哺乳類の
組織に酸素を移転することができる。メトヘモグロビン
は酸素と結合することができないが、低濃度においてＮ
ＡＤＨメトヘモグロビン還元酵素によりオキシヘモグロ
ビンに転換されることができる。ヘモクロムは不可逆性
で性質の劣化したヘモグロビンである。第１表において
、リボース、マンノース、フラクトース、キシロース及
びグルコースの溶液で凍結乾燥した細胞から９０％以上
のオキシヘモグロビンの回復が見られる。またこれらの
単糖類の濃度を約０．５〜４．０モル濃度とした場合に
再生された赤血球に重大な変化はみられず、オキシヘモ
グロビンが今までどうり回復した。

実Ｊ１１旦 実施例１と同様に入手され洗浄された赤血球の多くの試
料をＰＨ７，２の燐酸緩衝溶液であって、２モル濃度の
グルコース及び（ａ）　３０　ｍＭの１０ｋ又は（ｂ）
　６　ｍＭの４０にポリビニルピロリドンの一方を含ん
でいる凍結乾燥緩衝溶液に懸濁した。

次に懸濁液をフラスコに移し続いて試料が凍結するまで
液体窒素（−１９６°Ｃ）に浸漬した。液体窒素中で、
フラスコの内壁に溶液が均等に分散して凍結するようフ
ラスコを水平に回転させた。

凍結した試料をベンチトップ凍結乾燥機（ラブコノ　モ
デル４．５）に入れ、真空度１００ミクロン、器内の温
度−５６℃で操作した。結晶の外観を呈し、堅く脆い状
態になるまで試料を十分に乾燥（６−２４時間）させ、
フラスコを室温に戻した。

そしてその試料を３７°ＣにおいてスクロースＩＭを含
む食塩燐酸緩衝溶液で再水和した。再水和溶液は乾燥前
の試料の最初の容量と同量加えた。

試料をエッペンドルフ　マイクロ遠心機により１４００
　Ｏｒｐｍで遠心し、懸濁液の再水和赤血球をペレット
とした。グルコースとアデノシンを含んだ食塩燐酸緩衝
溶液であって、ポリビニルピロリドン（平均分子量１０
にのものを３０重量％含む）の量を順次減少させた溶液
でこのペレット化した赤血球を懸濁し、順次洗浄した。

例えば、この赤血球を１０にのポリビニルピロリドンを
３０ｍＭ、　　１５ｍＭ及び５ｍＭ含んだ溶液に懸濁し
洗浄した。赤血球は食塩燐酸緩衝溶液に懸濁された。

凍結乾燥用緩衝溶液に前記炭水化物をポリマーとともに
加えた結果、損傷のない細胞の回復率が５２．９±７．
９％となるのみならず、更に赤血球によるヘモグロビン
の保持が１０にのＰＶＰを用いると２７．４−４２．２
％まで、４０にのＰＶＰを用いると５７．３−６５．５
％までとなるという驚くべき結果が生じた。さらに試験
を進めグルコース２Ｍ、２４Ｋ　　ＰＶＰ８ｍＭ及びグ
ルコース−１燐酸３０ｍＭを溶かした溶液を使用するこ
とにより赤血球及びヘモグロビンの回復にさらに良い結
果が示された。

実施例３ 凍結乾燥緩衝溶液のグルコースを種々の炭水化物に換え
また、２種の分子量のポリビニルピロリドンを用いて実
施例２の手順を繰り返した。その結果を第２表に示す。

実力Ｕ引土 前記の実施例の凍結乾燥緩衝溶液に使用した分子量と濃
度の異なるポリビニルピロリドンを置キ換えて実施例２
記載の手順（炭水化物として２モル濃度のグルコースを
用いる）を繰り返した。他の条件は実施例２と全く同じ
とした。その結果を第３表に示す。なお、第３表の最上
段のＭＣＨＣは再生した赤血球の平均細胞ヘモグロビン
含有量を表す。通常赤血球のＭＣＨＣは３４±２である
。

第３表は、ＰＶＰは分子量が１０に−４０にのものを３
−３０ｍＭの濃度で用いられることを明らかにしている
。４０ｋＴのＰＶＰは約２６−３５ポアズの粘度を有し
、４０にのＰＶＰは約２８−３２ポアズの粘度を有する
。

ＰＣＰ　　ＭＷ　　モル濃度 １０に ２４に ４０に ０ＫＴ ３６０Ｋ　　Ｏ，１，３ｍＭ Ｏ，１４ｍＭ 第３表 濃度（％） ％Ｈｂの回復率 １３．６ ３０、１±４．１　（ｎ−３） ５２．９ ５２．７±６．３　（ｎ　＝４） ５λ２±６．９　（ｎ””２） １７．７ ３１．０ ６１．４±４．１　（ｎ−３） ５−〇±１．７　（ｎ＝２） １７．７ ３１．８ ５６．８±０．４（ｎ冨２） ５０．０ ９．４ １乙２ ＭＣＨＣ ２０，９±　３．１　（ｎ＝３） １７．３ ２０．９ ２７．４±　４．３　（ｎ＝４） ２２．５ ２５．７±　９．２　（ｎ＝３） ３７．４ ２５．０ ３６．３±　２．８　（ｎ＝２） ２９．４ 衷ＩｆＮ生１ 凍結乾燥緩衝溶液にポリビニルピロリドンと異なるポリ
マーを使用して実施例２と同じ実験を行った。結果を第
４表にまとめて示す。

第４表 リン酸デキストラン 硫酸デキストラン ４０に ５００に アルブミン 実施例６ パックされた赤血球の試料を実施例１と同様にして得て
、洗浄した。これらの細胞を食塩燐酸緩衝液に２０％の
２４　Ｋ−ＰＶＰ　（８ｍＭ）及び２Ｍグルコースを含
む凍結乾燥緩衝液に懸濁した。この試料を実施例２と同
様に凍結乾燥し再生したが、赤血球の再生には種々の溶
液を使用した。水が単独で再生液として用いられた場合
、赤血球は再生後３０分以内に溶解した。ＰＢＳ又はＰ
ＢＳＧＡ（ＰＢＳに５ｍｍｏｌのグルコース及び１０ｍ
ｍｏｌのアデノシンを加えたもの）のような浸透圧の等
しい再生溶液では、ナトリウム塩よりもカリウム塩を採
用した置換ＰＢＳの使用と同様に改善を示す。

十分な改善は再生溶液に１０ｋ又は２４にのいずれかの
ＰＶＰを２０％まで用いることにより示された。

少なくとも２５０　ｍＭ、好ましくは０．０５Ｍ。

最も好ましくは少なくとも０．２５Ｍの最小限濃度で炭
水化物を使用すると再生後優れた細胞形態が得られる。

グルコース、マンノース、トレハロース及びスクロース
が好ましく、特にスクロースが最も好ましい炭水化物で
あるか単糖類及び三糖類がこの目的の為に用いることか
できる。これらのデータを第５表に示すが、すべての炭
水化物及びポリマーはＰＢＳ中に入れられる。

溶液 水 ＰＢＳ ＰＢＳＧＡ リバースＰＢＳ グルコース　ＩＭ マンノース　ＩＭ トレハロースＩＭ スクロース　０．０５Ｍ ０．　ｌ０Ｍ ０．２５Ｍ １Ｍ ５％　ＩＯＫ　ＰＶＰ ２０％　ＩＯＫ　ＰＶＰ 第 ％細胞回復率 ４９３±３０ ５９、２ ５５．５ ６５．７ ４３、８ ４９、５ ４９．６±ｌ０１６ ５５　６±１１ ５％　２４ＫＰＶＰ　　　　　５２．２２０％　２４Ｋ
ＰＶＰ　　　５３．　８＋９．　４５％　ｌ０ＫＰＶＰ
　　　６５．　　Ｏ＋６．　５＋　　１Ｍスクロース ２０％　ｌ０ＫＰＶＰ　　　　　３９．５＋　　１Ｍス
クロース ５％　２４ＫＰＶＰ ＋　　１Ｍスクロース ２０％　２４Ｋ　ＰＶＰ ＋　　１Ｍスクロース ６４、８ ５表 ％Ｈｂの回復率 ３７４±１ ３４、４ ５１．３ ４６．２ ５１．４±５．　１ ５２．３±３．０ ６７．７ ３８．８ ７３、１±８．　１ ５９０±７６ ６１．６ ５９．３±６．９ ７６．４±４．２ ＣＨＣ ２９，９±１．　８ ３１．２ ２５、８ ２４．９ ２４、４ ２４．６ ２５．５±２．１ ２３５±１４ ２８．２±８．７ ２８２±８．７ ３１．５ 先の記述から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確
かめることができ、その精神と範囲から離れることなく
、本発明を各種の使用法と条件に適合させることができ
る。状況に応じた提案による又は便宜上の措置を取るよ
うな形態の変更及び同等の置換は考慮されており、文中
に特殊な用語が用いられているが、これらは説明的な意
味で使用されるもので、何らかの制限を目的とするもの
ではない。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）赤血球の細胞膜を浸透することができる単糖類約
   ０．５−約４モル濃度を含む溶液に赤血球を浸漬したの
   ち、その溶液を凍結し、そしてその水分の昇華により赤
   血球を乾燥させることを特徴とする、細胞膜を有する赤
   血球の凍結乾燥方法。
2. （２）単糖類がペントース及びヘキソースからなる群よ
   り選ばれる請求項（１）記載の方法。
3. （３）単糖類がキシロース、グルコース、リボース、マ
   ンノース及びフラクトースからなる群より選ばれる請求
   項（１）又は（２）記載の方法。
4. （４）単糖類が溶液中に約２モル濃度で存在する請求項
   （３）記載の方法。
5. （５）約０．５−約４モル濃度までの単糖類及び約０．
   １ミリモル濃度から飽和までの濃度の分子量が約１０ｋ
   −約３６０ｋであるポリマーを含む溶液に赤血球を浸漬
   したのち、その溶液を凍結し、そして水分の昇華により
   赤血球を乾燥させることを特徴とする赤血球の凍結乾燥
   方法。
6. （６）単糖類がペントース及びヘキソースからなる群よ
   り選ばれる請求項（５）記載の方法。
7. （７）単糖類がキシロース、グルコース、リボース、マ
   ンノース及びフラクトースからなる群より選ばれる請求
   項（５）記載の方法。
8. （８）ポリマーがポリビニルピロリドン及びデキストラ
   ンからなる群より選ばれる請求項（５）、（６）又は（
   ７）記載の方法。
9. （９）ポリマーがポリビニルピロリドンである請求項（
   ５）、（６）又は（７）記載の方法。
10. （１０）約０．５−約４モル濃度の単糖類及び少なくと
    も０．１ミリモル濃度の分子量が約１０ｋ−約３６０ｋ
    であるポリマーを含む溶液を含有する赤血球の凍結乾燥
    用媒体。
11. （１１）単糖類がペントース及びヘキソースからなる群
    より選ばれる請求項（１０）記載の媒体。
12. （１２）単糖類がキシロース、グルコース、リボース、
    マンノース及びフラクトースからなる群より選ばれる請
    求項（１０）記載の媒体。
13. （１３）ポリマーがポリビニルピロリドン及びデキスト
    ランからなる群より選ばれる請求項（１０）記載の媒体
    。
14. （１４）ポリマーがポリビニルピロリドン及びデキスト
    ランからなる群より選ばれる請求項（１１）記載の媒体
    。
15. （１５）ポリマーがポリビニルピロリドン及びデキスト
    ランからなる群より選ばれる請求項（１２）記載の媒体
    。
16. （１６）ポリマーがポリビニルピロリドンである請求項
    （１０）記載の媒体。
17. （１７）ポリマーがポリビニルピロリドンである請求項
    （１１）記載の媒体。
18. （１８）ポリマーがポリビニルピロリドンである請求項
    （１２）記載の媒体。