KR102068776B1 - 자가형광이 존재하는 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미징 - Google Patents

자가형광이 존재하는 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미징 Download PDF

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에두아르도 히로유키 모리야마
천 호 스제
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노바다크 테크놀러지즈 유엘씨
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Abstract

생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하기 위한 방법 및 시스템이 개시되며, 상기 방법 및 시스템은 생물학적 물질의 자가형광 및 형광체의 형광 모두를 유도하고, 상기 생물학적 물질의 자가형광 및 형광체의 형광 모두로부터 발생하는 이미지, 및 상기 자가형광에서만 발생하는 이미지를 획득하고, 상기 형광체만을 나타내는 이미지를 생성하기 위해 상기 2개의 이미지를 빼는 것을 포함하며, 상기 자가형광 및 형광을 유도하기 위해 사용된 여기 광의 상대적 강도는 이미지를 획득하기 전에 조절된다.

Description

자가형광이 존재하는 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미징{IMAGING A TARGET FLUOROPHORE IN A BIOLOGICAL MATERIAL IN THE PRESENCE OF AUTOFLUORESCENCE}
본 출원은 2014년 9월 29일 출원된 미국 가출원 제62/056,830호와 관련되며, 그 문헌의 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 형광 이미징에 관한 것으로, 특히 자가형광이 존재하는 생물학적 물질에서 타겟 형광체를 이미징하는 것에 관한 것이다.
생명 과학 분야에서, 형광은 일반적으로 생물학적 물질을 식별하고 분석하는 비침습적 방법으로서 사용된다. 예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 세포 및 세포 성분, 줄기 세포 또는 작은 분자와 같은 생물학적 물질에서의 특정 타겟은 외인성 또는 외인성 형광체로 라벨될 수 있고, 이에 따라 이후 이미지화될 수 있다. 또한 생물학적 물질은 자연적으로 형광을 발하는데, 이는 외적으로 투여된 형광체(즉, 형광물질)의 부재시에 발생하기 때문에 내인성 형광 또는 "자가형광"으로 알려져 있다. 자가형광은 예를 들어 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 엘라스틴, 콜라겐, 플라빈, 아미노산 및 포르피린을 비롯한 생물학적 물질의 다양한 내인성 형광체에서 유래한 것으로 믿어진다.
적절한 여기 파장을 가진 광이 생물학적 물질을 비추는(즉, 조명하는) 경우 자가형광 및 형광 방출이 생성되어 이미지로 기록될 수 있다. 그러나, 형광체의 조합의 결과이고 스펙트럼에 걸쳐 광범위한 방출 스펙트럼이 특징인 자가형광은 형광체의 방출 스펙트럼과 자가형광이 오버랩될 때 특정 형광체의 방출을 검출하는 능력을 방해할 수 있다. 그러한 경우에, 관심 대상의 형광체의 형광을 마스킹함으로써 신호 검출 감도를 감소시키는 것 외에도, 자가형광은 또한 잘못된 양성 결과를 제공함으로써 검출의 특이성을 감소시킬 수있다.
이러한 문제를 해결하기 위한 하나의 접근법은 생물학적 물질의 자가형광에 의해 기여되는 검출된 방출 신호를 감소시키거나 최소화하는 수단을 이용하는 것이다. 선행 기술은 이미지 획득 전에 생물학적 물질의 다양한 전처리를 채용함으로써 자가형광을 감소시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나, 그러한 기술은 또한 생물학적 물질 자체의 품질을 저하시킬 수도 있으며, 일반적으로 생체 내 적용에 적합하지 않다. 대안으로, 자가형광 방출 자체가 완화될 수 없다면, 소정의 획득된 형광 이미지의 디지털 조작에 의해 자가형광으로부터 이미지 데이터로의 신호 기여를 최소화하는 것이 가능하다. 예컨대, 관심 대상의 형광체 및 자가형광 모두로부터 결합된 신호를 포함하는 이미지에서, 이들 방법 중 일부는 "순수한" 자가형광 신호의 추정치를 얻고 가중치 차감에 의해 자가형광을 제거하기 위해 그와 같은 추정치의 사용에 의존한다. 다른 방법들은 부가의 자가형광 신호를 보정하기 위해 통계적 상관 기법을 사용한다. 이러한 이미지 데이터 조작 기술들은 선행 기술 참조문헌으로 기술되어 있으며, 일반적으로 열악한 정확도, 작은(즉, 낮은 해상도) 데이터 세트에 대한 필요성, 또는 중요한 후-처리에 대한 필요성에 의해 제한된다.
결과적으로, 생물학적 물질에서 관심 대상의 형광체에 의해 방출된 형광을 그러한 동일한 생물학적 물질에서의 자가형광 방출과 신속하면서 정확하게 구별하기 위한 고해상도 이미지 처리 기술을 구축하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 형태에 따르면, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 방법이 제공되며, 여기서 타겟 형광체 방출을 위한 파장대역은 생물학적 물질에서 자가형광 방출을 위한 파장대역과 오버랩된다. 상기 방법은 생물학적 물질의 자가형광 및 타겟 형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 생물학적 물질의 자가형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하는 단계; 상기 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 상기 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하는 단계; 및 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 상기 제1 및 제2형광 이미지를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도는 상기 제1 및 제2형광 이미지를 획득하기 전에 조절된다. 상기 처리하는 단계는 예컨대 제1형광 이미지로부터 제2형광 이미지를 빼는 단계를 포함할 수 있다.
실시예에 따르면, 상기 상대적 강도의 조절은 제1 및 제2형광 방출에서, 형광체로부터 발생하는 방출이 제1형광 방출에 존재하고 제2형광 방출에 존재하지 않는 영역인 파장 영역을 식별하고; 상기 파장 영역 밖의 파장대역을 선택하고; 상기 선택된 파장대역에서 제1 및 제2형광 방출의 상대적 강도 비율을 산출하며; 적절한 산출 비율이 달성될 때까지 대응하는 제1형광 방출, 제2형광 방출 또는 그 모두를 조정하기 위해 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조정하는 것을 포함한다. 실시예에 따르면, 상기 제1 및 제2형광 방출의 상대적 강도 비율은 제1형광 방출에 대응하는 곡선 아래 면적 값을 제2형광 방출에 대응하는 곡선 아래 면적 값으로 나눔으로써 산출될 수 있다.
본 발명의 다른 형태에 따르면, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템이 제공되며, 여기서 타겟 형광체 방출을 위한 파장대역은 생물학적 물질에서 자가형광 방출을 위한 파장대역과 오버랩된다. 상기 시스템은 생물학적 물질의 자가형광 및 타겟 형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 생물학적 물질의 자가형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하기 위한 수단; 상기 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 상기 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하기 위한 수단; 상기 제1 및 제2형광 이미지의 획득 전에 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조절하기 위한 수단; 및 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 상기 제1 및 제2형광 이미지를 처리하기 위한 수단을 포함한다. 실시예에 따르면, 조명하기 위한 수단은 조명 모듈을 포함하고, 획득하기 위한 수단은 형광 방출 획득 모듈을 포함하며, 처리하기 위한 수단은 프로세서 모듈을 포함한다.
타겟 형광체가 포르피린인 실시예에 있어서, 예컨대 제1여기 광은 약 405 nm의 파장을 갖고, 제2여기 광은 약 450 nm의 파장을 갖고, 선택된 파장대역은 약 600 nm이며, 그 산출 비율은 약 1이다.
본 발명에 따르면, 생물학적 물질에서 관심 대상의 형광체에 의해 방출된 형광을 그러한 동일한 생물학적 물질에서의 자가형광 방출과 신속하면서 정확하게 구별하기 위한 고해상도 이미지 처리 기술을 구축할 수 있다.
수반되는 도면에서 본 발명의 실시예들이 기술된다.
도 1은 실시예에 따른 예시의 방법을 개략적으로 나타내고;
도 2는 소변에서 자가형광 및 포르피린으로부터 발생하는 형광 스펙트럼(도 2의 A), 소변에서 자가형광으로부터 발생하는 형광 스펙트럼(도 2의 B), 및 다양한 실시예들에 따라 얻어진 포르피린 단독에 대응하는 차이를 나타낸 스펙트럼(도 2의 C)을 나타내고;
도 3은 실시예에 따른 405 nm 및 450 nm에서 새롭게 얻어진 소변(도 3의 A) 및 퇴색된 소변(도 3의 B)의 형광 스펙트럼을 나타내고;
도 4는 도 3의 형광 스펙트럼에 대응하는 이미지들을 나타내며, 여기서 좌측 열(A, C, E)은 새롭게 수집된 소변과 관련되고, 우측 열(B, D, F)은 광퇴색된 소변과 관련되고, 상부 행(A, B)은 약 405 nm에서의 여기로부터의 형광 이미지와 관련되고, 중간 행(C, D)은 약 450 nm에서의 여기로부터의 형광 이미지와 관련되며, 하부 행(E, F)은 실시예에 따라 얻어진 타겟 형광체(포르피린)에 대응하는 차이가 나타나는 이미지를 나타내며;
도 5의 A는 팔뚝으로부터의 자가형광 및 포르피린 형광을 표시하는, 405 nm 광으로 여기될 때 대상(즉, 대상자)의 팔뚝의 생체 내 형광 이미지의 예를 나타내고; 도 5의 B는 450 nm 여기에서 포르피린 형광이 존재하지 않는 도 5 A의 자가형광 레벨과 유사한 레벨로 자가형광의 감소를 나타내는 450 nm 광 여기에 따른 도 5의 A에서와 같은 팔뚝의 동일한 영역의 형광 이미지를 나타내며; 도 5의 C는 실시예에 따라 제거된 자가형광이 있는 포르피린의 형광 이미지를 나타내고;
도 6의 A는 여기 강도가 600 nm에서 조정된 후 405 nm 및 450 nm에서 배경 강도 값들을 나타내고, 배경 값들간 약 2% 미만의 차이가 여기들간 관찰되며, 도 6의 B는 실시예에 따라 405nm에서 여기된 형광 이미지로부터의 신호-대-잡음비(S/N비)와 배경이 제거된 후의 신호-대-잡음비의 비교를 나타내고;
도 7은 실시예에 따른 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하기 위한 시스템을 나타내고;
도 8은 실시예에 따른 조명 모듈을 나타내며;
도 9는 실시예에 따른 형광 방출 획득 모듈을 나타낸다.
이제, 본 발명의 다양한 형태 및 변형의 구현예 및 실시예가 상세히 참조되며, 그 예는 수반된 도면에 나타나 있다.
본 발명의 일 형태에 따르면, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하기 위한 방법이 제공되며, 여기서 타겟 형광체 방출을 위한 파장대역은 상기 생물학적 물질에서 자가형광 방출을 위한 파장대역과 오버랩된다. 도 1은 실시예에 따른 본 발명의 방법을 개략적으로 나타낸다. 도 1에 따르면, 상기 방법은 생물학적 물질의 자가형광 및 타겟 형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 생물학적 물질의 자가형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하는 단계; 상기 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 상기 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하는 단계; 및 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 상기 제1 및 제2형광 이미지를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도는 상기 제1 및 제2형광 이미지를 획득하기 전에 조절된다.
다양한 실시예들에서, 상기 생물학적 물질은 생물학적 대상(예컨대, 포유류)으로부터 유래되거나, 그 생물학적 대상으로부터 얻어지거나, 또는 그 생물학적 대상에 위치된 물질을 포함하고, 생체 외, 원 위치 또는 생체 내의 물질을 추가로 포함한다. 그러한 생물학적 물질의 예는 인간을 포함한 포유류로부터 유래되거나 포유류에 위치된 생물학적 조직 또는 유체 또는 그 일부, 기관, 세포, 세포주, 세포 성분을 포함한다. 상기 생물학적 물질은 대상의 성장시 언제든지 상피, 결합 조직, 혈관, 근육, 신경 조직, 뼈와 같은 대상의 조직으로부터 얻어지거나, 유래되거나 또는 그 대상의 조직에 있는 세포의 집합체를 포함한다.
다양한 실시예들에서, 상기 생물학적 물질은 타겟 형광체(예컨대, 포르피린)를 포함하는 건강한, 병든, 또는 악성 조직(예컨대, 암 또는 종양)을 포함한다. 상기 생물학적 물질의 예는 대상(인간, 동물)에 존재하는 박테리아를 더 포함한다. 유체인 생물학적 물질의 예는 소변, 혈청, 혈장, 또는 혈액을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 상기 생물학적 물질은 조직 화학, 면역 조직 화학, 세포 화학, 면역 형광법, 면역 블로팅법(immunoblotting) 또는 다른 형광-관련 이미징 애플리케이션들에 사용된 조직 섹션이 될 수 있다.
다양한 실시예들에서, 그러한 생물학적 물질에서의 타겟 형광체는 광의 특정 파장에 의해 여기될 때 상이한 통상 긴 파장에서 광을 방출하는 형광체이다. 타겟 형광체는 분석적, 예후적, 진단적, 생리학적, 병리학적 대상 또는 이들의 조합인 형광체를 포함한다. 다양한 실시예들에서, 상기 타겟 형광체는 전구체 또는 최종 형태, 또는 그 조합의 생물학적 물질(즉, 외인성 형광체)에 외부적으로 투여된 생물학적 물질(즉, 내인성 형광 물질)에서 자연적으로 발생할 수 있다. 자연 발생 또는 내인성 형광체들의 예로는 포르피린, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 엘라스틴, 콜라겐, 플라빈, 및 아미노산을 포함한다. 포르피린이 타겟 형광체인 실시예들에서, 그러한 포르피린은 관련 생물학적 시스템에 존재하고 헴(heme)의 생합성에서 전구체 중간체로서 형성된 유기 화합물의 클래스를 포함한다. 예컨대, 인간 및 다른 포유류들에서, 8-, 7-, 6-, 5- 및 4-카르복실기를 갖는 포르피린은 일반적으로 헴 합성을 위해 과잉으로 형성되고, 이에 따라 소변으로 배출된다. 다양한 실시예들에서, 상기 용어 "포르피린"은 예컨대 포르피린 유도체, 코프로포르피린, 유로포르피린, 프로토포르피린, 포르피린 접합체, 리포솜, 및 나노소포체를 포함한다.
외인성 형광체의 예로는 생물학적 물질의 성분에 형광 특성을 증가(예컨대, 강화) 또는 제공하기 위해 사용될 수 있는 다양한 형광 프로브 또는 형광 유도제를 포함한다. 예컨대, 형광 프로브는 성분 내의 내인성 형광체의 형광을 강화시키기 위해 생물학적 물질의 성분과 결합되거나 거기에 부착될 수 있다. 외인성 형광 프로브의 예로는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인, 형광 염료, 4', 6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI) 및 에오신을 포함한다. 형광 유도제의 예로는 형광 단백질(예컨대, 녹색 형광 단백질)의 생성을 유도하기 위해 세포 염색체에 삽입될 수 있는 유전자를 포함한다. 그러한 형광 유도제는 타겟 형광체의 형광 반응을 증가시킬 수 있는 보조제일 수 있다. 예컨대, 타겟 형광체가 포르피린인 실시예들에서, 그러한 보조제는 소비되거나 또는 대상에게 투여될 때 포르피린의 형광 반응을 증가시키는 HEME 경로에서 선택된 식품 소스(예컨대, 포르피리노겐(porphyrinogenic) 식품 또는 화학 물질), 아미노레불린산(aminolevulinic acid) 또는 특정 효소의 억제제(예컨대, 페로켈라타제(ferrochelatease) 억제제)일 수 있다.
생물학적 물질은 이러한 생물학적 물질 내에 다양한 내인성 형광체의 존재로 인해 외적으로 투여된 형광체의 부재하에 자연적으로 형광을 발하거나 "자가형광"한다. 자가형광은, 예를 들어 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 엘라스틴, 콜라겐, 플라빈, 아미노산, 리포푸신, 진보된 당화 최종-산물 및 포르피린을 비롯한 생물학적 물질의 다양한 형광체에서 유래한다. 생물학적 물질은 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 실시예에서 사용되기 전에 처리되거나 또는 다르게 처리된 물질을 포함한다. 예컨대, 소정 실시예들에서, 전처리는 추측하건대 자가형광 내인성 형광체의 일부를 불활성화시킴으로써 생물학적 물질의 자가형광을 감소시키기 위해 생물학적 물질의 광퇴색을 포함할 수 있으며, 따라서 타겟 형광체가 광퇴색에 비교적 덜 민감한 경우 타겟 형광체의 이후의 해상도를 더 선명하게 하거나 또는 생물학적 물질의 자가형광 형광체보다 더 느린 속도로 광퇴색되게 한다.
다양한 실시예들에 따르면, 상기 방법은 생물학적 물질의 자가형광 및 타겟 형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 상기 생물학적 물질의 자가형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하는 단계를 포함한다. 다양한 실시예들에서, 상기 제1여기 광의 파장은 그러한 제1여기 광이 생물학적 물질을 조명할 때 자가형광을 일으키는 생물학적 물질의 형광체 및 타겟 형광체 모두가 여기되어 제1형광 방출을 방출하도록 선택된다. 다양한 실시예들에서, 제2여기 광의 파장은 자가형광을 일으키는 생물학적 물질의 형광체만이 여기되어 제2형광 방출을 방출하도록 선택된다. 다양한 실시예들에서, 예컨대 상기 제1여기 광은 약 350 nm 내지 약 450 nm 범위의 파장을 갖고, 상기 제2여기 광은 약 450 nm 내지 약 700 nm 범위의 파장을 가질 수 있다. 제1여기 광 및 제2여기 광에 의한 생물학적 물질의 조명은 간헐적인 조명, 연속적인 조명 또는 그 조합을 포함한다.
타겟 형광체가 포르피린인 실시예에서, 상기 제1여기 광은 약 405 nm의 파장을 갖고, 상기 제2여기 광은 약 450 nm의 파장을 갖는다. 도 2(음영 영역)은 소변에서 포르피린으로부터 얻어진 데이터를 나타낸다. 특히, 도 2의 A는 소변에서 자가형광 및 포르피린 모두로부터 발생하는 제1형광 방출 스펙트럼이고, 도 2의 B는 단지 자가형광으로부터만 발생하는 제2형광 방출 스펙트럼이다. 도 2의 C는 단지 포르피린에만 대응하는 차이를 나타낸 스펙트럼이다. 도 2에 나타낸 예들에 있어서, 소변은 자가형광으로부터 포르피린의 식별을 보다 양호하게 하기 위해 광퇴색에 의해 전처리된다. 특히, 광퇴색 전처리는 약 3분 동안 약 450 nm 파장의 제2여기 광으로 소변을 조명함으로써 행해지며, 이는 결국 처리하지 않은 소변(도 3)과 비교하여 소변의 자가형광으로부터 포르피린의 향상된 식별을 제공한다. 도 3은 새롭게 얻어진 소변으로부터의 형광 스펙트럼(도 3의 A) 및 이후 약 450 nm로 광에 대한 소변의 약 3분 광퇴색 노출에 따라 얻어진 스펙트럼(도 3의 B)을 나타낸다.
다양한 실시예들에 따르면, 상기 방법은 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하는 단계, 및 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 제1 및 제2형광 이미지를 처리하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도는 제1 및 제2형광 이미지를 획득하기 전에 조절된다. 도 4의 A 내지 D는 소변이 새롭게 얻어질 때 그리고 소변이 약 3분 동안 약 450 nm에서 광에 노출될 때 획득된 도 3의 스펙트럼에 대응하는 이미지들이다. 도 4의 E 및 F는 다양한 실시예들과 연관지어 기술한 바와 같은 처리로부터 제공되는 단지 포르피린만에 대응하는 차이가 나타나는 이미지이다.
실시예에 따르면, 이미지 획득 전에 상대적 강도의 조절은 제1 및 제2형광 방출에서, 형광체로부터 발생하는 방출이 제1형광 방출에 존재하고 제2형광 방출에 존재하지 않는 영역인 파장 영역을 식별하고; 상기 파장 영역 밖의 파장대역을 선택하고; 상기 선택된 파장대역에서 제1 및 제2형광 방출의 상대적 강도 비율을 산출하며; 적절한 산출 비율이 달성될 때까지 대응하는 제1형광 방출, 제2형광 방출 또는 그 모두를 조정하기 위해 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조정하는 것을 포함한다. 다양한 실시예들에 따르면, 파장대역은 파장을 포함한다. 예컨대, 도 2의 C 또는 도 3의 B에 나타낸 바와 같은 타겟 형광체가 포르피린인 실시예들에서, 포르피린으로부터 발생하는 방출이 제1형광 방출에 존재하고 제2형광 방출에 존재하지 않는 파장 영역은 예컨대 약 615 nm 내지 약 625 nm 및 약 660 nm 내지 약 700 nm의 범위가 된다. 따라서, 이러한 파장 영역 외의 파장대역으로서 600 nm를 선택하여, 상대적 강도의 조정이 필요한지를 결정하기 위해 405 nm 및 450 nm에서의 상대적 강도의 비율을 산출하는 파장대역으로서 사용하였다. 이러한 예에서, 그러한 상대적 강도는 약 1의 산출 비율이 +/- 2% 내에서 달성될 때까지 조정되었다. 이러한 예에서, 그러한 비율은 제1형광 방출(즉, 약 405 nm에서의 여기로부터 발생하는 방출)에 대응하는 곡선 아래 면적 값을 제2형광 방출(즉, 약 450 nm에서의 여기로부터 발생하는 방출)에 대응하는 곡선 아래 면적 값으로 나눔으로써 600 nm 파장대역에서 산출되었다. 다양한 실시예들에서, 상기 비율은 제1형광 방출의 선택된 파장대역(예컨대, 선택된 파장)에서의 강도를 제2형광 방출의 선택된 파장대역(예컨대, 선택된 파장)으로 나눔으로써 산출될 수 있다. 다양한 실시예들에서, 그러한 비율의 산출을 위한 다른 방법들이 사용될 수 있다. 예컨대, 영역들이 아니라 선택된 파장대역(예컨대, 600 nm)에서 405 nm 및 450 nm에서의 각각의 방출로부터 발생하는 스펙트럼의 하나 또는 그 이상의 강도 지점들이 그러한 산출을 위해 사용될 수 있다.
다양한 실시예들에서, 처리하는 단계는 타겟 형광체의 자가형광 없는 이미지(예컨대, 도 4의 E 및 F)를 생성하기 위해 제1형광 이미지로부터 제2형광 이미지를 빼는 단계를 포함한다.
다양한 실시예들에 따른 상기 방법 및 시스템들이 원 위치 형광을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 도 5 및 도 6의 실험 데이터는 포르피린이 대상의 피부에 국소 적용된 예를 나타낸다. 이러한 예에서, 약 10 mL의 디메틸 슬폭시드(DMSO, Sigma Aldrich)에 약 0.1 mg의 코프로포르피린 에스테르(Sigma-Aldrich)를 용해시켜 포르피린 용액을 준비하였다. 그러한 포르피린 용액은 Q-tip을 이용하여 대상의 팔뚝의 작은 영역에 적용되었다. 데이터를 획득하기 위해 사용된 형광 이미징 시스템은 약 405 nm 및 약 450 nm의 포르피린 흡수 최대치에서 이중-여기 기능의 역할을 한다. 후자는 주요 포르피린 흡수 대역 외의 가장 짧은 파장으로 선택되었고 높은 레벨의 조직 자가형광을 유도하는 특성으로 인해 선택되었다. 반사된 여기 광이 형광 이미지와 간섭하지 않도록 보장하기 위해, 600 nm 대역 통과 필터(600 nm ± 5 nm)를 이미징 시스템의 검출기 앞에 두고, 405 nm 및 450 nm에서 여기 강도는 405 nm에서의 자가형광에 대한 450 nm에서의 자가형광의 비율이 약 1에 도달할 때까지 조절하였다. 도 5의 B는 팔뚝 및 포르피린 형광으로부터 자가형광을 디스플레이하는 405 nm 광으로 여기될 때 대상의 팔뚝의 생체 내 형광 이미지이다. 도 5의 B는 450 nm의 여기에 따라 도 5의 A에서와 같이 팔뚝의 동일한 영역의 형광 이미지이다. 450 nm 여기에 의해 유도된 자가형광이 405 nm 여기에 의해 유도된 자가형광보다 크기 때문에, 450 nm에서의 여기 광은 도 5의 A의 자가형광 레벨과 유사한 레벨로 자가형광을 생성하도록 조절된다. 도 5의 C는 실시예에 따라 자가형광이 제거된 포르피린의 형광 이미지를 나타낸다.
도 5의 A는 405 nm에서 단일 여기의 사용이 포르피린 형광으로부터 발생하는 양호한 국소화된 형광 영역을 생성한다는 것을 나타낸다. 둘레 영역에서 높은 레벨의 배경은 피부에 있는 몇 가지 내인성 형광체(예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 지질)의 존재로부터 발생한다. 동일한 영역이 다른 여기 파장(450 nm)으로 포르피린의 흡수 스펙트럼에서 멀리 여기되었을 때 유사한 자가형광 패턴이 관찰될 수도 있다. 도 5의 C는 상기 방법을 사용하여 자가형광이 성공적으로 감쇠된 본 발명의 방법에 따른 처리 후 결과 이미지를 나타낸다.
도 6의 A는 여기 강도가 600 nm에서 조정 된 후 405 nm 및 450 nm에서 배경 강도 값들을 나타내고, 배경 값들간 약 2% 미만의 차이가 여기들간 관찰되었다. 도 6의 B는 실시예에 따라 405nm에서 여기된 형광 이미지로부터의 신호-대-잡음비(S/N비)와 배경이 제거된 후의 신호-대-잡음비의 비교를 나타낸다. 이러한 방식을 이용하면 405 nm에서 단일의 여기를 이용하는 것과 비교하여 그러한 S/N비의 증가가 달성될 수 있다(각각 약 28.5 및 약 1.9의 S/N비가 나타난 도 6의 B 참조).
다양한 기존의 방식들은 모든 형광 종이 조명되는 형광 이미지의 동시 획득을 포함하며, 그것들의 형광 방출은 동시에 수집된다. 이후, 그러한 획득된 이미지들은 스펙트럼 비혼합 또는 배경 차감을 포함하는 하나 또는 그 이상의 자가형광 제거 모델을 이용하여 처리된다. 차이를 드러내기 위해 스펙트럼 비혼합(선형 분해) 및 디지털 배경 차감과 같은 자가형광을 제거하기 위한 다양한 기존 방식들이 제안되었지만, 이러한 방식들은 획득 후 이미지를 조작해야 하고, 자가형광을 위해 미리 특성화된 스펙트럼을 보정해야 하고, 타겟 형광체의 농도에 따라 감도가 변하기 쉽다. 이러한 방법들이 비용이 효율적이고 생체 외 및 생체 내 이미징 모두에 적용할 수 있지만, 이것들은 형광 이미지로부터 자가형광 성분을 완전히 제거할 수 없고, 더욱이 기계적 배경 신호를 추가로 고려할 수도 없다. 이미지 획득 전에 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도의 조절은, 다양한 실시예들과 연관지어 기술한 바와 같이, 예컨대 자가형광을 일으키는 생물학적 물질의 형광체와 타겟 형광체(예컨대, 포르피린)간 광퇴색의 상이한 비율로 인해 시간에 따라 방출의 상대적 변화를 보상한다. 만약 선행 기술에서 기술한 바와 같이 강도의 조절이 이미지 획득 후 디지털적으로 수행되면, 타겟 형광체의 이미지를 이끌어내기 위한 2개 이미지의 처리(예컨대, 차감)의 정확도는, 특히 제1 및 제2형광 신호의 크기가 크게 다를 경우 감소한다. 선행 기술의 스펙트럼 비혼합 방법은 종종 일정하지 않을 수 있는 샘플의 자가형광의 양에 대한 사전 지식을 필요로 한다. 또한, 생물학적 물질의 이미지는 획득 시스템 자체가 기여한 일정량의 잡음이나 배경을 포함할 수도 있다. 따라서, 본 발명과는 대조적으로, 선행 기술에서 교시된 바와 같이, 이미지 획득 후 강도의 정규화는, 자기형광 신호(예컨대, 생물학적 물질의 저농도 성분에서의 형광체 또는 내인성 형광체)에 비해 타겟 형광체가 낮은 레벨 신호를 가질 때 잡음이 더 많고 신호 품질이 제한된다. 더욱이, 선행 기술에서 교시된 바와 같이, 타겟 형광체의 낮은 레벨 신호의 이미지 획득 후 증폭은 또한 신호 품질에 부정적으로 영향을 미치는 기계적 배경 신호를 증폭시킨다. 선행 기술의 방식들과는 달리, 본 발명은 생물학적 물질에서의 형광 변화에 대한 동적 실시간 보정을 용이하게 하고, 따라서 생물학적 물질의 특성의 실시간 표시를 가능하게 한다.
다양한 실시예들에 따라 생성된 데이터는, 다양한 실시예들과 연관지어 기술한 바와 같이 본 발명의 이중-여기 방법이 형광 이미지의 획득 전 선택된 파장에서 자가형광 강도를 조절함으로써 생물학적 조직의 형광 이미징 동안 형광 배경 신호의 감소 또는 완화를 용이하게 한다는 것을 보여준다. 다양한 실시예들에 따르면, 스펙트럼 이미지의 획득은 오직 배경 또는 관심 대상의 형광체로부터의 시간 여기 및 광 수집에 의해 수행된다. 이러한 여기 및 형광 수집의 시간적 분리는 크로스-토크(cross-talk)를 최소화한다. 동일한 여기 소스 하에서 방출 신호를 수집하는 대신, 다양한 실시예들에 따른 본 방법은 제2여기 파장((관심 대상의 타겟 형광체로부터 형광을 유도하지 않는)에 의해 등가의 배경 레벨을 유도한 다음, 이어서 관심 대상의 타겟 형광체로부터의 형광 신호를 감소시키지 않고 차감될 수 있다.
본 발명은 조직 자가형광이 형광 이미징에 영향을 주는 형광 이미징 애플리케이션에 효과적일 수 있다. 다른 여기 소스로부터 등가의 자가형광 신호의 검출은 단일의 형광 여기보다 더 정확한 분자 진단을 용이하게 한다. 또한, 다양한 실시예에 따른 이중 형광 이미징 방식은 디지털적으로 배경을 제거하거나 배경 레벨을 조절함으로써 관심 대상의 형광체의 형광 강도가 영향받지 않기 때문에, 다른 후-처리 분석 기술보다 더 강력하고 정확하다. 실시예에 따라 수집된 실험 데이터에 의해 나타낸 바와 같이, 이러한 방법은 포르피린과 같은 형광체의 선별적 축적을 이용하여 생체 내 악성 조직의 식별에 사용될 수 있다.
본 발명의 형태에 따르면, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하기 위한 시스템이 제공된다. 상기 시스템은 생물학적 물질의 자가형광 및 타겟 형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 생물학적 물질의 자가형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하기 위한 수단; 상기 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 상기 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하기 위한 수단; 상기 제1 및 제2형광 이미지의 획득 전에 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조절하기 위한 수단; 및 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 상기 제1 및 제2형광 이미지를 처리하기 위한 수단을 포함한다.
상기 시스템과 관련된 선택된 형태들은 본 발명의 방법의 다양한 실시예들과 관련하여 상기 기술되었다. 도 7에 따르면, 생물학적 물질(14)에서 타겟 형광체(15)의 이미지를 추출하기 위한 시스템(10)의 예시의 실시예를 나타낸다. 상기 시스템(10)은 이중 형광 여기 광으로 상기 생물학적 물질(14)의 조명을 위한 조명 수단(12; 예컨대, 생물학적 물질을 조명하도록 구성된 광원), 자가형광 및 타겟 형광체 모두로부터 그리고 자가형광 단독으로부터 발생하는 형광 이미지를 획득하기 위한 수단(16; 예컨대, 형광 이미지를 획득하도록 구성된 이미지 획득 어셈블리), 및 타겟 형광체만을 나타내는 이미지를 추출하도록 상기 획득된 형광 이미지를 처리하기 위하 수단(18; 예컨대, 획득된 이미지를 처리하도록 구성된 프로세서 어셈블리)을 포함한다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 조명하기 위한 수단(12)은 예컨대 도 8에 나타낸 조명 모듈(20)을 포함한다. 그러한 조명 모듈(20)은 자가형광을 일으키는 형광체 및 타겟 형광체를 여기시키기 위한 적절한 강도 및 적절한 파장을 갖는 형광 여기를 제공하도록 동작가능하게 구성된 형광 여기 소스(22)를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 형광 여기 소스(22)는 타겟 형광체의 형광 및 자가형광 모두로부터 발생하는 방출을 유도하기 위한 제1여기 광, 및 자가형광으로부터만 발생하는 방출을 유도하기 위한 제2여기 광을 제공하는 이중 여기 성능을 갖는 단일의 여기 소스일 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 형광 여기 소스(22)는 2개의 여기 소스(나타내지 않음)를 포함하며, 그 중 하나는 제1여기 광을 제공하기 위한 것이고, 다른 하나는 제2여기 광을 제공하기 위한 것이다. 다양한 실시예들에 있어서, 상기 형광 여기 소스(22)는 예컨대 레이저 다이오드(예컨대, 하나 또는 그 이상의 섬유-결합 다이오드 레이저를 포함하는), 하나 또는 그 이상의 LED, 아크 램프, 또는 제1 및 제2여기 광을 제공하기 위한 충분한 강도 및 적절한 파장의 다른 조명 기술들을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 상기 형광 여기 소스(22)로부터의 제1 및 제2여기 광은 생물학적 샘플을 조명하기 위해 사용되는 출력을 성형 및 안내하기 위해 광학 요소(즉, 하나 또는 그 이상의 광학 요소)를 통해 투사된다. 그러한 성형 광학 요소는 예컨대 하나 또는 그 이상의 렌즈, 광 가이드 및 확산기들로 이루어질 수 있다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 형광 여기 소스(22)로부터의 출력(24)은 하나 또는 그 이상의 포커싱 렌즈(26)를 통과한 다음, 예컨대 미국의 뉴포트 코포레이션(Newport Corporation)으로부터 통상 입수가능한 광 파이프와 같은 균질화 광 파이프(28)를 통과한다. 최종적으로, 그러한 광은 예컨대 미국의 뉴포트 코포레이션로부터 또한 입수가능한 그라운드 글래스 확산기와 같은 광 확산기(30; 즉, 하나 또는 그 이상의 광학 확산기 또는 회절 요소)를 통과한다. 형광 여기 소스(22) 자체에 대한 전력은, 예컨대 미국 루미나 파워 인크(Lumina Power Inc.)로부터 입수가능한 것들과 같은 고전류 레이저 드라이버에 의해 제공된다. 형광 여기 소스(22)가 레이저인 실시예에서, 레이저는 이미지 획득 프로세스 동안 펄스 모드로 동작될 수 있다. 이러한 실시예에서, 고체 상태 광다이오드(32)와 같은 광학 센서는 조명 모듈(20)에 통합되어 다양한 광학 요소로부터의 산란 또는 분산된 반사를 통해 조명 모듈(20)에 의해 생성된 조명 강도를 샘플링한다.
다른 대안의 실시예에서, 상기 조명하기 위한 수단(12)은 또한 백색광 조명과 같은 추가의 기능을 제공하도록 구성될 수도 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 생물학적 물질의 백색광 이미지로 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 획득하고 결합하는 것을 더 포함할 수 있다. 이런 방식으로, 타겟 형광체의 위치는 생물학적 물질의 환경 내에서 시각화될 수 있다. 이는 그러한 생물학적 물질을 인간의 눈으로 직접 볼 수 없는 경우에 유용하다.
다양한 실시예들에서, 도 8의 조명 모듈(20)은 상기 형광 여기 소스(22)로부터 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조절하기 위한 수단(나타내지 않음)을 포함함으로써, 강도 조정을 가능하게 한다. 그와 같은 조절을 위한 수단은 광원에 대한 파워의 조절, 셔터, 애퍼처(aperture) 또는 초퍼(chopper)에 의한 광 빔의 기계적 차단, 광학적, 광-기계적 또는 전기-광학적 전환, 광 빔의 필터링 또는 차단 또는 유사한 수단을 포함할 수 있다.
도 7을 다시 참조하면, 획득하기 위한 수단(16)은 예컨대 제1 및 제2형광 이미지를 획득하기 위한 도 9에 나타낸 형광 방출 획득 모듈(30; 예컨대, 카메라 모듈)을 포함한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 생물학적 물질에서 타겟 형광체로부터의 형광 방출(42) 및 자가형광을 일으키는 다른 형광체로부터의 형광 방출 또는 그 모두는 다양한 광학 요소(예컨대, 46a, 46b, 48 및 50)의 배열을 이용하여 이미지 센서(44) 상에 수집 및 포커스된다. 상기 이미지 센서(44)에 의해 변환된 광 신호로부터 기인한 전하는 형광 방출 획득 모듈(30) 내의 적절한 판독 및 증폭 전자 장치에 의해 비디오 신호로 변환된다.
도 7을 다시 참조하면, 다양한 실시예들에서, 처리하기 위한 수단(18; 예컨대 프로세서 어셈블리)은 예컨대 그러한 방출 신호를 분석하고, 산출된 정보를 적절한 디스플레이 및/또는 기록 장치로 출력하기 위해 제1형광 이미지로부터 제2형광 이미지를 빼기 위한 산출을 수행하기 위한 프로세서 모듈(나타내지 않음)을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 상기 프로세서 모듈은 예컨대 태블릿, 랩탑, 데스크탑 또는 네트워크 컴퓨터와 같은 소정의 컴퓨터 또는 컴퓨팅 수단을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 상기 프로세서 모듈은 데이터(예컨대, 이미지 시퀀스)를, 예를 들어 내부 메모리, 하드 디스크, 또는 플래시 메모리와 같은 유형의 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 저장할 수 있는 능력을 가진 데이터 저장 모듈을 구비함으로써, 획득된 데이터의 기록 및/또는 후 처리를 가능하게 한다. 다양한 실시예들에서, 상기 프로세서 모듈은 내부 클럭을 구비함으로써, 다양한 요소들의 제어를 가능하게 하고 조명 및 센서 셔터의 정확한 타이밍을 보장하게 한다. 다양한 다른 실시예들에서, 상기 프로세서 모듈은 또한 사용자 입력 및 출력의 그래픽 디스플레이를 제공할 수 있다. 이미징 시스템은 이미지들이 획득되거나 기록 후 재생됨에 따라 그러한 이미지들을 디스플레이하거나, 또는 상기 방법의 다양한 단계에서 생성된 데이터를 시각화하기 위해 비디오 디스플레이(나타내지 않음)로 선택적으로 구성될 수 있다. 다양한 실시예들에서, 상기 처리하기 위한 수단은 이미징 시스템과 통신하거나 또는 이미징 시스템의 구성 요소이다. 실시예에 따른 이미징 시스템의 예로는 내시경이 있다.
동작에 있어서, 그리고 도 7 내지 9의 실시예들을 계속해서 참조하면, 생물학적 물질은 조명 모듈(20)을 포함하는 시스템(10)의 조명(12)을 위한 수단의 조명 경로에 위치되고, 예컨대 상기 조명 모듈(20)은 생물학적 물질의 거의 전체 영역에 걸쳐 거의 일정한 조명 필드를 생성한다. 형광 여기 소스(22; 예컨대, 레이저 다이오드)가 턴온되어 이미지 센서(예컨대, 형광 방출 획득 모듈(30)의 이미지 센서(44))에 대한 셔터 시퀀스를 시작한다. 생물학적 물질로부터의 형광 방출은 예컨대 선택된 파장대역(예컨대, 포르피린의 경우 선택된 파장이 약 600 nm인)에서 도 9의 옵틱(46a; optic)과 같은 형광 방출 획득 모듈(30)의 전면 이미징 옵틱에 의해 수집되고, 상대적 강도의 비율이 산출된다. 산출된 비율이 적절한 경우(예컨대, 포르피린의 경우, 적절한 산출 비율이 약 0.98 내지 1.02의 범위에 있는), 제1 및 제2형광 이미지가 획득된다. 상기 비율이 적절하지 않은 경우, 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도가 조절되고 적절한 비율이 달성될 때까지 상기 비율이 재산출된다. 이어서, 획득된 제1 및 제2형광 이미지를 차감하여 타겟 형광체만을 나타내는 제3형광 이미지를 추출한다.
본 발명의 다른 형태에 따르면, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 방법을 포함하는 내장된 컴퓨터-실행가능(판독가능) 프로그램 코드 수단을 갖는 유형의 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 제공되며, 여기서 타겟 형광체 방출을 위한 파장대역은 생물학적 물질에서 자기형광 방출을 위한 파장대역과 오버랩되며, 상기 방법은:
생물학적 물질의 자가형광 및 타겟 형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 생물학적 물질의 자가형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하는 단계;
상기 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 상기 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하는 단계; 및
타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 상기 제1 및 제2형광 이미지를 처리하는 단계를 포함하며,
상기 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도는 상기 제1 및 제2형광 이미지를 획득하기 전에 조절된다.
당업자는 다양한 실시예에 따른 프로그램 코드 수단이 임의의 적절한 프로그래밍 언어로 기록될 수 있고, 예컨대 한정하지 않고 비-기록가능 저장 매체(예컨대, ROM 또는 CD-ROM 디스크와 같은 읽기 전용 메모리 장치)에 영구적으로 저장된 정보, 기록가능 저장 매체(예컨대, 하드 드라이브)에 이미 저장된 정보, 근거리 통신망과 같은 통신 매체, 인터넷과 같은 공중망, 또는 전자 명령을 저장하기에 적합한 소정 타입의 매체를 통해 프로세서로 전송된 정보를 포함한 많은 형태로 프로세서로 전달될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 방법의 다양한 실시예들을 실행하는 컴퓨터 판독가능 명령을 수반할 경우, 그러한 컴퓨터 판독가능 매체는 본 발명의 다양한 실시예들의 예를 나타낸다. 다양한 실시예들에서, 유형의 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 모든 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하며, 본 발명의 범위는 매체가 유형 및 비일시적 모두인 컴퓨터 판독가능 매체로 제한된다.
또 다른 형태에 있어서, 다양한 실시예들과 연관지어 기술한 바와 같이 외인성 형광체 및 시스템을 포함하는 키트가 제공된다.
따라서, 본 발명의 다양한 실시예들은 관심 대상의 형광 및 자가형광의 비공지 조합으로부터 관심 대상 형광의 식별을 용이하게 한다. 본 발명은 타겟 형광체에 대한 이미지 품질의 향상을 용이하게 하고, 배경뿐만 아니라 자가형광도 제거하면서 신호 형광을 유지하고 결과의 신호를 자가형광 비율 및 검출의 전체 감도로 증가시킨다. 본 발명은 광범위한 배열의 생물학적 물질에 적용가능하고, 소정의 형광 이미징 애플리케이션에 적용될 수 있다. 본 발명은 생물학적 물질 내의 하나 또는 그 이상의 형광체 타겟의 존재, 부재, 농도 및/또는 공간 분포를 식별하기 위해 생물학적 샘플을 이미지화하고 분석하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 의학적 평가 또는 생물학적 평가(예컨대, 생물학적 현상의 평가), 진단적 평가, 치료적 평가, 생리학적 평가 또는 이들의 조합을 위한 보완적인 도구로서 더 사용될 수 있다.
본 발명은 나타내고 상세히 기술된 다양한 실시예와 관련하여 기술되고 설명되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형 및 구조적 변경이 이루어질 수 있으므로 나타낸 세부 사항으로 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 실시예뿐만 아니라 형태, 구성요소의 배열, 단계, 세부 사항 및 실시예의 동작 순서들은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 행해질 수 있으며, 이러한 설명을 참조함으로써 당업자가 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 수반된 청구범위는 본 발명의 실제 범위 내에 있는 그와 같은 변형 및 실시예들을 포함하는 것으로 고려된다. 용어 "예컨대" 및 "그와 같은" 및 그 문법적 등가물과 관련하여, "그리고 제한하지 않고"라는 문구는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 다음에 따르는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 단수 형태 "하나", "한" 및 "그"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
10 : 시스템,
14 : 생물학적 물질,
15 : 타겟 형광체,
20 : 조명 모듈,
22 : 여기 소스.

Claims (33)

  1. 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법으로서, 타겟 형광체의 방출을 위한 파장대역은 생물학적 물질에서 제2형광체의 방출을 위한 파장대역과 오버랩되며, 상기 방법은:
    상기 타겟 형광체의 형광 및 상기 제2형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 상기 제2형광체의 형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하는 단계;
    상기 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 상기 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하는 단계; 및
    상기 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 상기 제1 및 제2형광 이미지를 처리하는 단계를 포함하며,
    상기 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도는 상기 제1 및 제2형광 이미지를 획득하기 전에 조절되고,
    상대적 강도의 조절은:
    제1 및 제2형광 방출에서, 형광체로부터 발생하는 방출이 제1형광 방출에 존재하고 제2형광 방출에 존재하지 않는 영역인 파장 영역을 식별하고;
    상기 파장 영역 밖의 파장대역을 선택하고;
    상기 선택된 파장대역에서 제1 및 제2형광 방출의 상대적 강도 비율을 산출하며;
    미리 정해진 산출 비율이 달성될 때까지 대응하는 제1형광 방출, 제2형광 방출 또는 그 모두를 조정하기 위해 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조정하는 것을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    파장 영역 밖의 파장대역은 제1 및 제2형광 방출로부터 발생하는 형광 스펙트럼에서 하나 또는 그 이상의 파장을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    제1 및 제2형광 방출의 상대적 강도 비율을 산출하는 것은 제1형광 방출에 대응하는 곡선 아래 면적 값을 제2형광 방출에 대응하는 곡선 아래 면적 값으로 나누는 것을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    타겟 형광체가 포르피린인 경우, 제1여기 광은 405 nm의 파장을 갖고, 제2여기 광은 450 nm의 파장을 갖는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    선택된 파장대역은 600 nm이고, 여기서 산출 비율은 1인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 제1 및 제2형광 이미지를 처리하는 단계는 제1형광 이미지로부터 제2형광 이미지를 빼는 단계를 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    생물학적 물질은 광퇴색에 의해 전처리되는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    타겟 형광체는 내인성, 외인성 또는 그 조합인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    내인성 형광체는 포르피린, 포르피린 전구체, 포르피린 유도체, 포르피린 접합체, 포르피린 리포솜, 포르피린 나노소포체 또는 이들의 조합인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    포르피린은 코프로포르피린, 유로포르피린, 프로토포르피린 또는 이들의 조합을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  11. 청구항 8에 있어서,
    외인성 형광체는 형광 염료, 형광 유도제 또는 이들의 조합인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템의 동작 방법.
  12. 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템으로서, 타겟 형광체의 방출을 위한 파장대역은 생물학적 물질에서 제2형광체의 방출을 위한 파장대역과 오버랩되며, 상기 시스템은:
    상기 타겟 형광체의 형광 및 상기 제2형광체의 형광 모두로부터 발생하는 제1형광 방출을 유도하기 위해 제1여기 광으로 그리고 상기 제2형광체의 형광으로부터 발생하는 제2형광 방출을 유도하기 위해 제2여기 광으로 상기 생물학적 물질을 조명하기 위한 수단;
    상기 제1형광 방출로부터 제1형광 이미지를 그리고 상기 제2형광 방출로부터 제2형광 이미지를 획득하기 위한 수단;
    상기 제1 및 제2형광 이미지의 획득 전에 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조절하기 위한 수단; 및
    상기 타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 상기 제1 및 제2형광 이미지를 처리하기 위한 수단을 포함하며,
    상대적 강도를 조절하기 위한 수단은:
    제1 및 제2형광 방출에서, 형광체로부터 발생하는 방출이 제1형광 방출에 존재하고 제2형광 방출에 존재하지 않는 영역인 파장 영역을 식별하기 위한 수단;
    상기 파장 영역 밖의 파장대역을 선택하기 위한 수단;
    상기 선택된 파장대역에서 제1 및 제2형광 방출의 상대적 강도 비율을 산출하기 위한 수단; 및
    미리 정해진 산출 비율이 달성될 때까지 대응하는 제1형광 방출, 제2형광 방출 또는 그 모두를 조정하기 위해 제1 및 제2여기 광의 상대적 강도를 조정하기 위한 수단을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  13. 청구항 12에 있어서,
    파장 영역 밖의 파장대역은 제1 및 제2형광 방출로부터 발생하는 형광 스펙트럼에서 하나 또는 그 이상의 파장을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  14. 청구항 12에 있어서,
    제1 및 제2형광 방출의 상대적 강도 비율을 산출하기 위한 수단은 제1형광 방출에 대응하는 곡선 아래 면적 값을 제2형광 방출에 대응하는 곡선 아래 면적 값으로 나누기 위한 수단을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  15. 청구항 12에 있어서,
    타겟 형광체가 포르피린인 경우, 제1여기 광은 405 nm의 파장을 갖고, 제2여기 광은 450 nm의 파장을 갖는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  16. 청구항 12에 있어서,
    선택된 파장대역은 600 nm이고, 여기서 산출 비율은 1인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  17. 청구항 12에 있어서,
    타겟 형광체를 나타내는 제3형광 이미지를 추출하기 위해 제1 및 제2형광 이미지를 처리하기 위한 수단은 제1형광 이미지로부터 제2형광 이미지를 빼기 위한 수단을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  18. 청구항 12에 있어서,
    조명하기 위한 수단은 제1 및 제2여기 광을 생성하도록 동작가능하게 구성된 형광 여기 소스를 포함하는 조명 모듈을 구비한, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  19. 청구항 18에 있어서,
    조명 모듈은 상기 조명 모듈을 나가는 제1 및 제2여기 광을 성형 및 안내하도록 동작가능하게 구성된 광학 요소를 더 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  20. 청구항 19에 있어서,
    광학 요소는 렌즈, 광 가이드, 확산기 또는 이들의 조합을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  21. 청구항 12에 있어서,
    획득하기 위한 수단은 이미지 센서를 포함하는 형광 방출 획득 모듈을 구비한, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  22. 청구항 21에 있어서,
    형광 방출 획득 모듈은 이미지 센서 앞에 배치된 광학 요소를 더 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  23. 청구항 12에 있어서,
    처리하기 위한 수단은 프로세서 모듈을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  24. 청구항 23에 있어서,
    프로세서 모듈은 조명하기 위한 수단의 동작, 획득하기 위한 수단의 동작 또는 이들 조합을 제어하도록 동작가능하게 구성된, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  25. 청구항 12에 있어서,
    생물학적 물질은 광퇴색에 의해 전처리되는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  26. 청구항 12에 있어서,
    타겟 형광체는 내인성, 외인성 또는 그 조합인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  27. 청구항 26에 있어서,
    내인성 형광체는 포르피린, 포르피린 전구체, 포르피린 유도체, 포르피린 접합체, 포르피린 리포솜, 포르피린 나노소포체 또는 이들의 조합인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  28. 청구항 27에 있어서,
    포르피린은 코프로포르피린, 유로포르피린, 프로토포르피린 또는 이들의 조합을 포함하는, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  29. 청구항 26에 있어서,
    외인성 형광체는 형광 염료, 형광 유도제 또는 이들의 조합인, 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미지를 추출하는 시스템.
  30. 생물학적 물질이 생물학적 조직, 생물학적 유체 또는 그의 일부를 포함하는, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법.
  31. 생물학적 물질이 포유 동물로부터 획득되고 포유 동물에 위치된 기관, 세포, 세포주, 세포 성분을 포함하는, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법.
  32. 생물학적 물질이 건강한 조직, 병든 조직 또는 악성 조직을 포함하는, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법.
  33. 생물학적 물질이 조직 화학, 면역 조직 화학, 세포 화학, 면역 형광법, 면역 블로팅법(immunoblotting) 또는 형광-관련 이미징 애플리케이션에 사용하기 위한 조직 섹션을 포함하는, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법.
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