BRPI0908612A2 - composição, vacina, método para produzir uma composição, método para reduzir o risco de lesão iatrogênica e método para diagnosticar uma condição do nervo - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO, VACINA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA REDUZIR O RISCO DE LESÃO IATROGÊNICA E MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA CONDIÇÃO DO NERVO. A presente invenção trata de composições e métodos para a formação de imagem das células de nervo. A composição compreende um corante fluorescente; e um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico. Embora o corante fluorescente por si mesmo não possa penetrar nas células do nervo, o corante fluorescente é ligado ao componente viral para forma um complexo de componente viral/corante que seja capaz de penetrar nas células do nervo.

Description

é “COMPOSIÇÃO, VACINA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO,
MÉTODO PARA REDUZIR O RISCO DE LESÃO IATROGÊNICA E MÉTODO E — m— — -º — FPARADIAGNOSTICARUMACONDIÇÃODONERVO?||ÚÀÚ|À|À
REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO Este pedido reivindica o benefício de prioridade sob 35 USC. $ 119(e) para o pedido de patente provisório US 61/127.659, depositado em 14 de maio de 2008 e o pedido de patente provisório US 61/082.981, depositado em 23 de julho de 2008, sendo que as revelações dos mesmos estão incorporadas no presente pedido a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO Os métodos e composições aqui descritos se referem ao campo de formação de imagens médicas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A lesão iatrogênica do nervo pode resultar em uma perda debilitante de função nos seres humanos. As causas comuns de lesão iatrogênica do nervo incluem falha cirúrgica, lesões por pressão ou tração, hematoma ou posicionamento inadequado do paciente (Fercan Komurcu, MD et al., 2005, Annals of Plastic Surgery, 54(2):135 a 139). Por exemplo, os nervos são geralmente exibidos por imagem durante os procedimentos de prostatectomia. A título de antecedentes, o câncer de próstata é o tipo de câncer mais comum nos homens americanos. Uma opção de tratamento comum é a remoção do tecido de próstata canceroso (isto é, prostatectomia) antes de o câncer se espalhar localmente e antes da metástase. As complicações de prostatectomia radicais incluem incontinência e impotência. Uma porcentagem significante de homens que sofrem procedimentos de prostatectomia radicais se torna impotente devido às lesões nos nervos cavernosos durante a cirurgia. O risco de lesão iatrogênica do nervo pode ser reduzido através
Í da prevenção da lesão aos feixes de nervos que correm ao longo da superfície da glândula da próstata e que são necessários para uma ereção. A cirurgia conservadora do nervo satisfatória, entretanto, é geralmente difícil de ser alcançada devido à dificuldade na distinção entre o tecido da próstata e o tecidodo nervo de inervação.
Existe uma necessidade em relação a métodos de formação de imagens e composições para a formação de imagens do nervo.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO As composições e métodos para a formação de imagens de nervo estão aqui descritos. Os nervos podem estar localizados em áreas diferentes de um indivíduo.
Também é demonstrada na presente invenção uma revelação que liga um corante fluorescente a um componente viral (por exemplo, vírus, proteínas virais, capsídeos) capazes de penetrar nos axônios do nervo que podem formar um complexo de componente de corante/viral que pode penetrar nos axônios do nervo, assim permitindo uma formação de imagens da célula do nervo aperfeiçoada. Uma modalidade fornece uma composição que compreende: - um corante fluorescente; e - um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, em que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de penetrar nas células do nervo.
Nesta e em outras modalidades reveladas na presente invenção, o vírus de replicação defeituosa e neurotrópico pode ser, por exemplo, componentes virais atenuados ou inativados que sejam capazes de penetrar as células do nervo. Em outra modalidade, a composição pode ser uma vacina que compreende o corante fluorescente e um componente viral selecionado a partir de um vírus neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico. Em conformidade, outra modalidade fornece uma vacina, que compreende: - um corante fluorescente; e - um componente viral selecionado a partir de um vírus neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, em que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de penetrar nas células do nervo.
Outra modalidade fornece um método para produzir uma composição, que compreende: - combinar um corante fluorescente com um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteina viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, " permitir que o corante fluorescente seja ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de —penetrarnas células do nervo.
Outra modalidade fornece métodos para a formação de imagens de nervos e/ou diagnóstico de condições e/ou anormalidades do nervo. Os métodos incluem as etapas de (a) administrar uma composição, conforme descrita na presente invenção, ao indivíduo, (b) permitir que o complexo de componente viral/corante penetre nas células do nervo, (c) aplicar uma quantidade suficiente de energia radiante no indivíduo tal como o corante fluorescente, (d) obter intraoperativamente uma imagem fluorescente de um indivíduo. O método pode incluir a etapa de observação da imagem
É fluorescente para visualizar um ou mais nervos no indivíduo ou observar a imagem fluorescente para determinar se um ou mais é transeccionado.
Em conformidade, outra modalidade fornece um método para reduzir o risco de uma lesão iatrogênica em um indivíduo durante um procedimento cirúrgico, que compreende: (a) administrar uma composição ao indivíduo, sendo que a composição compreende: - um corante fluorescente; e - um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, sendo que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral /corante; (b) permitir que o complexo de componente viral/corante penetre nas células do nervo; (c) aplicar uma quantidade suficiente de energia radiante no indivíduo tal que o corante exiba fluorescência; (d) obter intraoperativamente uma imagem fluorescente do indivíduo; e (e) observara imagem fluorescente para visualizar um ou mais nervos no indivíduo.
Outra modalidade fornece um método para diagnosticar uma condição do nervo, que compreende: (a) administrar uma composição ao indivíduo, sendo que a composição compreende: - um corante fluorescente; e - um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteína viral de um vírus
É neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, sendo que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante; (b) permitir que o complexo de componente viral/corante 5 penetrenas células do nervo; (c) aplicar uma quantidade suficiente de energia radiante no indivíduo tal que o corante exiba fluorescência; (d) obter intraoperativamente uma imagem fluorescente do indivíduo; e (e) observaraimagem fluorescente para determinar se o nervo é transeccionado. Outras modalidades fornecem um Kkit contendo as composições reveladas na presente invenção junto com as instruções para o uso da Ê composição de acordo com um ou mais dos métodos descritos na presente invenção Em outras modalidades, o Kit inclui um ou mais ingredientes, reagentes, corantes, vírus, precursores ou outras ferramentas que podem ser usadas para produzir as composições reveladas na presente invenção, junto com as instruções para o uso da composição de acordo com um ou mais dos métodos descritos na presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 descreve esquematicamente um sistema para a formação de imagens médicas; A figura 2 é um fluxograma que descreve algoritmos para a formação de imagens médicas que podem ser realizadas através de um software instalado em um processador de computador; A figura 3A mostra uma imagem fluorescente da parte posterior do camundongo do exemplo 3; A figura 3B é uma imagem de luz visível (branca) da mesma parte
: posterior do camundongo da figura 3A, mas sem a formação de imagem fluorescente;
A figura 3C é uma imagem fluorescente com alguma iluminação de luz visível da medula espinhal exposta do camundongo do exemplo 3;
A figura 3D é uma imagem fluorescente da mesma medula espinhal mais próxima à cabeça do camundongo com os nervos se encontrando com a medula espinhal não marcada com o ICG/PBS/HSV-2 ARR;
A figura 4A mostra o ICG/PBS/HSV-2 ARR (um complexo viral de componente/corante) fluorescente em uma vista ventral de todo o camundongo
(apoiado sobre sua parte posterior) do exemplo 4;
A figura 4B é uma imagem que mostra a parte posterior (vista dorsal) do camundongo do exemplo 4 dissecada, para mostrar a espinha e o nervo fluorescente da pata esquerda, com o uso de uma formação de imagem de luz branca e fluorescente;
A figura 4C é uma imagem fluorescente do mesmo camundongo da figura 4B;
A figura 4D são imagens fluorescentes do (i) gânglio da raiz dorsal fluorescente dissecado do lado esquerdo da espinha do camundongo do exemplo 4 em luz branca apenas, com um segmento curto de seus axônios no lado direito do gânglio, e (ii) o gânglio correspondente do lado direito da espinha, cujos axônios do coxim plantar direito não foram injetados;
A figura 4E são imagens fluorescentes do (i) gânglio da figura 4D (i) e (ii) do gânglio da figura 4D(ii);
A figura 4F é uma imagem fluorescente ampliada do gânglio da figura4E());
A figura SA mostra um desenho anatômico de um membro esquerdo de um coelho para comparação com a imagem fluorescente;
Afigura 5B é uma imagem fluorescente que mostra que O
. complexo ICG/HSV-2ARR percorreu do sítio de injeção do coxim do dedo da pata até o nervo plantar superior; A figura 5C mostra um desenho anatômico de um membro direito de um coelho para comparação com a imagem fluorescente; A figura 5D é uma imagem de um segmento isolado do nervo safeno, em luz branca visível; A figura 5E é uma imagem fluorescente que mostra um segmento isolado do nervo safeno com o complexo ICG/HSV-2ARR fluorescente; As figuras 5F e 5H são imagens fluorescentes que mostram, respectivamente, um segmento excisado do nervo safeno dos dois quadros anteriores (figura 5F) e o nervo in situ (figura 5H); As figuras 5G e 51 são imagens fluorescentes que mostram o segmento excisado do nervo safeno da figura 5F, mas corado para o gene LacZ do vírus ICG/PBS/HSV-2ARR inativado por UV; A figura 5J é um desenho anatômico do membro esquerdo de um coelho para comparação com a imagem fluorescente; e A figura 5K é uma imagem fluorescente do aspecto dorsal da perna do coelho do exemplo 5.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Uma modalidade fornece composições para a formação de imagens do nervo.
Em uma modalidade, a composição inclui um corante, como um corante fluorescente usado para a formação de imagens médicas. Muitos corantes, entretanto, não são adequados para formar imagens de determinadas porções do corpo, como nervos, visto que os corantes são tipicamente incapazes de penetrar nas células de nervo. Divulgado na presente invenção está a revelação de que um componente viral neurotrópico, isto é, um componente viral capaz de penetrar nas células do nervo, pode ser usado para
À transportar axonalmente um corante através de partes ou por toda uma rede de nervos. Isso pode ser alcançado através da formação de um complexo de um corante ligado ao componente viral.
CORANTES Conforme usado na presente invenção, o termo "corante fluorescente" ou "corante" significa uma proteína ou molécula pequena ou outro polímero ou macromolécula que exiba fluorescência através da emissão de luz no comprimento de onda de infravermelho próximo ou visível mediante a excitação por energia de luz radiante de um comprimento de onda apropriado.
Os corantes fluorescentes adequados incluem qualquer corante não tóxico que exiba fluorescência quando exposto à energia radiante, por exemplo, luz. Em determinadas modalidades, o corante é um corante fluorescente que emite luz no espectro de infravermelho próximo. Em algumas modalidades, o corante pode não ser lipossolúvel, enquanto em outras modalidades, pode ser lipossolúvel. Em certas modalidades, o corante é um corante tricarbocianina como indocianina verde (ICG), vendido junto à Akorn, Inc. (Buffalo Grove, IL, EUA). O corante ICG é aprovado pela FDA para o uso em seres humanos. Em outras modalidades, o corante é infracianina verde. Em outras modalidades, o corante é selecionado a partir de um isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído, fluorescamina, Rosa Bengala, azul de tripano, Fluoro-gold, 3-indocianina- verde-acil-1, 3-tiazolidina-tiona, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente amarela, proteína fluorescente azule outras proteínas fluorescentes. Os corantes podem ser misturados ou combinados. Em algumas modalidades, corantes análogos podem ser usados. Um "corante análogo" é um corante que é modificado quimicamente, mas ainda mantém sua capacidade de exibir fluorescência quando exposto à energia radiante de um comprimento de onda apropriado.
Em uma modalidade, o corante é uma proteína fluorescente como proteína fluorescente verde ligada de maneira covalente a uma proteina em um capsídeo viral, construída através da substituição do gene da proteína viral pelo mesmo gene da proteína viral, mas fundido ao gene da proteína fluorescente verde. Em uma modalidade, a proteína fluorescente verde é ligada de maneira covalente a uma proteína de vírus neurotrópico que penetra nas células do nervo.
COMPONENTES VIRAIS Em uma modalidade, o componente viral é selecionado a partir de um vírus, proteínas virais e capsídeos. Em uma modalidade, a proteína viral é o capsídeo ou a proteína do capsídeo. Em uma modalidade, a proteína viral é um análogo da proteína viral. Em uma modalidade, as proteínas virais e análogos são capazes de penetrar em uma célula do nervo por conta própria, sem que sejam parte de um capsídeo viral ou de todo o vírus. Em outra modalidade, as proteínas —viraise análogos podem ser parte de um capsídeo viral ou de todo o vírus que por si próprio penetra em uma célula do nervo. Os análogos têm uma estrutura de ácido nucleico que resultam em alterações conservadoras de aminoácidos que, embora alterem a sequência primária da proteína ou do peptídeo, normalmente não alteram sua função. As substituições conservadoras de aminoácidos incluem tipicamente as substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; fenilalanina, tirosina.
Em uma modalidade, a proteína viral e análogos da mesma podem ser isolados antes de o corante ser ligado a esses.
+ Porque é usado em aplicações médicas, esse componente é não virulento ou de "replicação defeituosa." Conforme usado na presente invenção, o termo "replicação defeituosa" significa o fracasso na formação de partículas de vírus (progenia de vírus) na célula alvo (uma célula do nervo). Em uma modalidade, "replicação defeituosa" se refere à incapacidade de reprodução.
Um vírus de "replicação defeituosa" também pode se referir a um vírus atenuado.
Em uma modalidade, os vírus atenuados são vírus vivos que são de baixa virulência.
Em uma modalidade, os vírus atenuados não se replicam.
Em outra modalidade, eles podem expressar antígenos virais em células infectadas sem replicação.
Em outra modalidade, os vírus atenuados se replicam lentamente e produzem uma progenia de vírus atenuada.
Em uma modalidade, o componente viral não é neurovirulento.
Em uma modalidade, um vírus é produzido por replicação defeituosa via mutação ou inativação por calor, luz (por exemplo, luz UV) ou tratamento químico.
A dosagem e comprimentos de onda de luz ultravioleta ("UV") exigidos para exterminar determinados vírus são bem conhecidos.
Por exemplo, http:/Wwww.americanairandwater.com/uv-facts/uv-dosage.htm lista a dosagem de luz UV que inibirá a formação de colônia de determinados vírus, reproduzidos na tabela 1 abaixo: TABELA 1 necessária para um fator de extermínio —— SR TA redução de 1 log redução de 1 lo: Fo so e Em uma modalidade, a mutação pode ser realizada através da remoção ou inativação do material genético viral (como RNA para vírus RNA,
+ i ou DNA para vírus DNA) ou de proteínas exigidas para a replicação viral, efeitos citopáticos ou lise da célula. Em uma modalidade, o vírus é um mutante do vírus rábico, por exemplo, Imovax (Sanofi Pasteur SA). Em outra modalidade, um vírus de replicação defeituosa é uma vacina. "Vacina" conforme usada na presente invenção se refere a uma composição não virulenta (compreende um ou mais componentes virais) que melhora a imunidade para uma doença. Em outra modalidade, uma vacina pode ser usada como o componente do vírus, como a vacina ZostavaxO (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EUA). Em conformidade, outra modalidade fornece uma vacina, que compreende: um corante fluorescente; e um componente viral selecionado a partir de um vírus neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, sendo que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de penetrar nas células do nervo.
O componente viral é neurotrópico na medida em que penetra nas células do sistema nervoso (por exemplo, nervos motores e/ou nervos sensoriais), Em algumas modalidades, o vírus é aquele que é transportado axonalmente através do sistema nervoso. Isto deve ser seguro para o uso em seres humanos. Assim, em determinadas modalidades, qualquer componente viral que seja capaz de penetrar em uma célula do nervo e se ligar ao corante poderá ser usado contanto que não seja lítico e, de preferência, contanto que —não cause efeito citopático.
A propriedade neurotrópica do componente viral é explorada pela formação de imagens permitindo que o corante fluorescente seja ligado ao componente, por meio disso formando um complexo de componente
+ viral/corante que também é neurotrópico, isto é, capaz de penetrar nas células do sistema nervoso.
A ligação entre o corante e o vírus ou proteínas virais pode ocorrer através das interações das forças de van der Waals, interações dipolo- dipolo, interações cátion-pi, ligação de hidrogênio, ligação iônica, ligação —covalente ou qualquer outro tipo de ligação suficiente para que o corante entre nas células do nervo com vírus ou partículas virais.
Em algumas modalidades, o corante e o vírus ou as proteínas virais podem se ligar diretamente, significando que não são ligados ou associados por um ligante interposto e intermediário entre o corante e seu vírus ou partículas virais associadas.
Em uma modalidade, o capsídeo de um vírus neurotrópico, com um corante fluorescente ligado ao mesmo, pode ser usado.
Em algumas modalidades, o vírus é o vírus do herpes, e pode ser Herpes Simples Vírus Tipo 2 (HSV-2) ou um mutante do mesmo.
HSV-2 infecta as células do sistema nervoso.
O gene ICP10 de HSV-2 encodifica uma enzima ribonucleotídeo redutase (RR) compreendida por duas sub-unidades, referidas * como as sub-unidades pequena e grande, encodificadas pelos genes UL39 e UL40, respectivamente.
O gene ICP10 de HSV-2 (GeneBank Nº M 12700) é descrito nas patentes US 6.013.265, US 6.054.131 e US 6.207.168. Em um exemplo de um mutante de HSV-2, o domínio —ribonucleotideo redutase (RR) é excluído do ICP10. A eliminação desse domínio é útil na medida em que o mutante resultante é produzido por replicação defeituosa.
Em uma modalidade, o vírus é a forma mutante de HSV-2, denominado como ICP10ARR, no qual o domínio ribonucleotídeo redutase de ICP1O0 é substituído pelo gene que encodifica LacZ.
O vírus ICP1I0ARR é conhecido no estado da técnica (Peng et al., 1996, Virology, 216:184 a 196; coloração de LacZ específico facílita a detecção de células que são infectadas com o vírus mutante). ICP10ARR também pode ter uma deleção do gene RR,
sem a adição do gene LacZ. Um indivíduo poderia substituir o gene LacZ por qualquer gene de interesse. Qualquer mutante de HSV-2 no qual o domínio RR seja excluído ou inativado pode ser usado. O mutante ICP10ARR de HSV-2 será referenciado na presente invenção como HSV-2 ARR.
Em outra modalidade, o vírus pode ser Herpes varicellae (vírus herpes zoster).
Os procedimentos de biologia molecular padrão conhecidos no estado da técnica podem ser usados para produzir vírus adequados. Os procedimentos exemplificativos são revelados em Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, EUA), em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, EUA), e em Gerhardt et al. (eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C, EUA).
COMPOSIÇÕES Conforme descrito acima, em algumas modalidades, a composição inclui um corante ligado a um componente viral de replicação defeituosa. Em determinadas modalidades, a composição inclui um corante ligado a uma proteína viral ou um vírus inativado, conforme descrito adicionalmente na presente invenção. As composições podem ser administradas a um indivíduo pela formação de imagens do nervo.
Em conformidade, outra modalidade fornece um método para produzir uma composição, que compreende: combinar um corante fluorescente com um componente viral — selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma Ê proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, permitir que o corante fluorescente seja ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de
Í penetrar nas células do nervo.
Em algumas modalidades, a composição compreende pouco ou nenhum corante que não esteja ligado ao vírus ou à proteína viral. Por exemplo, a quantidade de corante usada para produzir a composição pode ser titulada em relação à quantidade de vírus ou proteina viral usada. Similarmente, o corante externo (não ligado) pode ser removido da composição através de diálise ou uso de um gradiente de sacarose.
Também revelada na presente invenção, está a preparação e uso das composições aqui descritas. Essa composição pode consistir no ingrediente ativo sozinho, em uma forma adequada para a administração a um indivíduo ou a composição pode compreender o ingrediente ativo e um ou mais veículoes farmaceuticamente aceitáveis, um ou mais ingredientes adicionais ou algumas combinações dos mesmos. O ingrediente ativo pode estar presente na composição na forma de um sal ou éster fisiologicamente aceitável, como na combinação com um ânion ou cátion fisiologicamente aceitável, como é bem conhecido no estado da técnica.
f Conforme usado na presente invenção, o termo "ingrediente ativo” significa um componente viral tal como um vírus neurotrópico, capsídeo viral ou proteína viral no qual um corante fluorescente é ligado.
Conforme usado na presente invenção, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa uma composição química na qual o ingrediente ativo pode ser combinado e na qual, a seguinte combinação, pode ser usada para administrar o ingrediente ativo a um indivíduo.
Conforme usado na presente invenção, o termo sal ou éster "fisiologicamente aceitável" significa uma forma de éster ou sal do ingrediente ativo, que é compatível com quaisquer outros ingredientes da composição e que não é deletério ao indivíduo ao qual a composição é administrada.
As formulações das composições aqui descritas podem ser preparadas através de qualquer método conhecido ou mais adiante na presente invenção, desenvolvidas no estado da técnica da Farmacologia. Em geral, esses métodos preparatórios incluem a etapa de trazer o ingrediente ativo em associação com um veículo ou um ou mais outros ingredientes acessórios e, então, se for necessário ou desejável, conformar ou embalar o produto em uma unidade de multidose ou de única dose desejável. Apesar de as descrições das composições aqui fornecidas serem principalmente direcionadas a composições que são adequadas para a administração em seres humanos, será compreendido por um técnico no assunto que tais composições são geralmente adequadas para a administração a animais de todas as espécies. A modificação de composições adequadas para a administração em seres humanos com a finalidade de produzir as composições adequadas para a administração a vários animais é bem compreendida e o farmacologista veterinário geralmente versado pode elaborar e executar essa modificação com uma experimentação meramente comum se for esse o caso. Os indivíduos aos quais a administração das composições é contemplada incluem, mas não se limitam a, seres humanos e primatas não humanos e outros mamíferos.
As composições podem ser preparadas, embaladas ou vendidas em formulações adequadas para uma via parenteral, intravenosa, oftálmica, intratecal ou qualquer outra via de administração.
As composições podem ser preparadas, embaladas ou vendidas a granel, como uma dose de unidade única ou como uma pluralidade de doses de unidade única. Conforme usado na presente invenção, uma "dose de unidade" é qualquer quantidade distinta da composição que compreende uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que poderia ser
' administrada a um indivíduo ou a uma fração conveniente de tal dosagem como, por exemplo, uma metade ou um terço de tal dosagem.
Conforme usado na presente invenção, "administração parenteral" de uma composição inclui qualquer via de administração caracterizada através de uma ruptura física de um tecido de um indivíduo e a administração da composição através dessa abertura no tecido.
A administração parenteral dessa forma inclui, mas não se limita a, administração de uma composição por injeção, pela aplicação de uma composição através de uma incisão cirúrgica, pela aplicação da composição através de um ferimento não cirúrgico que penetra no tecido, e similares.
Em particular, a administração parenteral é contemplada por incluir, mas não se limita a, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, injeção intraesternal e técnicas de infusão dialítica dos rins.
As formulações de uma composição adequada para a administração parenteral compreendem o ingrediente ativo combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, como água estéril ou salina isotônica estéril.
Tais formulações podem ser preparadas, embaladas ou vendidas em uma forma adequada para a administração em bolus ou para a administração contínua.
As formulações injetáveis podem ser preparadas, embaladas ou vendidas na forma de dosagem única, como em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses contendo um conservante.
As formulações para a administração parenteral incluem, mas não se limitam a, suspensões, soluções, emulsões em veículos aquosos ou oleosos, pastas e formulações biodegradáveis ou de liberação prolongada implantáveis.
Tais formulações podem compreender adicionalmente um ou mais ingredientes adicionais, mas não se limitam a, agentes de suspensão, estabilização ou de dispersão.
Em uma modalidade de uma formulação para administração parenteral, o ingrediente ativo é fornecido em uma forma seca (isto é, em pó, granular ou liofiizada) para a reconstituição com um veículo adequado (por exemplo, água
E livre de pirogênio estéril) antes da administração parenteral da composição reconstituída. As doses que podem ser administradas a um animal, por exemplo, um ser humano, se situam na faixa de cerca de 10? a cerca de 10º, —oudecercade 10º a cerca de 10º ou de cerca de 10º a cerca de 10º unidades formadoras de placa de vírus por grama de peso corporal. Em outra modalidade, as doses se situam na faixa de, por exemplo, cerca de 10º mga cerca de 2 x 10º mg de corante/g de peso corporal). Por exemplo, os experimentos com animais descritos na seção experimental abaixo foram realizados com corante ICG e a seguinte quantidade de vírus: (a) 4,2 x10º pfu de vírus por grama de peso corporal para camundongos, e (b) 972,8 pfu por grama de peso corporal para o coelho.
MÉTODOS DE FORMAÇÃO DE IMAGEM Uma modalidade fornece um método para a formação de imagens de pelo menos um nervo de um indivíduo. A imagem pode ser obtida intraoperativamente. Assim, a área em que a cirurgia deve ser executada ou as regiões próximas podem ser cirurgicamente expostas. O método compreende: (a) administrar a composição aqui descrita para formar um complexo viral de componente/corante, (b) permitir que o complexo de componente viral/corante penetre nas células do nervo; (c) aplicar uma quantidade suficiente de energia radiante à área de modo que o corante exiba fluorescência, (d) obter intraoperativamente uma imagem fluorescente, e (e) observar a imagem fluorescente para determinar a presença ou ausência de pelo menos um nervo na imagem fluorescente.
Em uma modalidade, "observação da imagem fluorescente" pode se referir à revisão de uma imagem imóvel (se impressa ou na tela), ou em tempo real em um monitor de vídeo, em adição a outros métodos de observação de imagens. Em uma modalidade, as imagens individuais de
Fo nervos (isto é, mapas do nervo) são possíveis através da ligação de um corante fluorescente a um componente de vírus (por exemplo, um vetor viral) e podem ser usadas para propósitos de diagnóstico para a documentação da localização do nervo. Em uma modalidade, um uso para o mapeamento do nervoéointra-operativo. É previsto que essa tecnologia possa ser usada para os nervos de etiquetação por corante para o uso em fluoroscopia, uma técnica de formação de imagem comumente usada por médicos para obter imagens de movimento em tempo real das estruturas internas de um paciente. Por exemplo, a visualização intraoperativa do campo de vista cirúrgico, através de qualquer meio convencional disponível, pod e ocorrer de modo que a localização e/ou reconhecimento de nervos — especialmente pequenos ramos dos mesmos — seja inadequada para garantir uma cirurgia de conservação do nervo. Nessas situações, o uso fluoroscópico intra-operativo da presente inovação tecnológica será crítico para resultados satisfatórios.
Com base nos experimentos relatados abaixo, estimou-se que o corante fluorescente possa se mover na taxa de cerca de 2 cm/h, ou mais rápido, em uma maneira retrógrada através dos nervos. Essa velocidade rápida do fluxo do corante permite que as composições sejam administradas apenas horas (ou mais) antes de a formação de imagens ser executada. A composição, incluindo o corante, pode ser administrada por um tempo suficiente antes da formação de imagens tal que o corante percorra até a área a ser exibida por imagem e esteja presente nessa área no momento da formação de imagem. A quantidade de tempo exigida pode depender da aplicação da formação de imagem no nervo e do sítio de administração. Como um exemplo, a composição pode ser administrada por até ou menos do que 1, 2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8 horas antes da formação de imagem em determinados procedimentos, por exemplo, com base na distância que o corante necessita para percorrer até o sítio de formação de imagem. Em uma modalidade, a
2? $ composição is administrada por não mais do que 1, 2 ou 3 horas antes da formação de imagem.
Ao observar a imagem fluorescente, a equipe cirúrgica pode determinar a ausência ou presença de um nervo na imagem. Geralmente, os nervos podem ser identificados por seu tamanho, formato e localização bruta usando a iluminação do campo cirúrgico convencional com luz visível. Frequentemente, entretanto, o contraste entre os nervos — especialmente os pequenos ramos dos mesmos — e os tecidos subjacentes é tão insatisfatório que sem o contraste significante proporcionado que leva os nervos a exibirem fluorescência, eles não podem ser observados de nenhuma maneira. A equipe cirúrgica pode determinar adicionalmente a localização de um ou mais nervo(s) específico(s) através da observação da imagem fluorescente. A equipe cirúrgica pode, então, usar a informação sobre a presença /ausência ou localização de um ou mais nervos para determinar como realizará o procedimento cirúrgico. Por exemplo, com base na informação obtida através do uso dos métodos, a equipe cirúrgica pode decidir realizar uma incisão em um ponto no indivíduo em que está menos propensa a cortar inadvertidamente ou contatar cirurgicamente um nervo em particular com base na ausência percebida de um nervo daquela área.
Outras modalidades contemplam a obtenção de uma pluralidade de imagens. A pluralidade de imagens pode ser comparada entre si para determinar se o nervo não foi lesionado, por exemplo, cortado inadvertidamente.
A informação obtida da imagem obtida pode auxiliar no enxerto das extremidades dos nervos, caso sejam transeccionados. No evento de transecção, os enxertos de nervo podem ser aplicados diretamente nas extremidades para facilitar o brotamento axonal de fibras neurais regenerativas.
. | Nesse caso, a luz visível da fluorescência das extremidades de nervos transeccionados fornece um alvo para guiar a anastomose dos nervos através do enxerto do nervo.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Outra modalidade for nece um método de diagnóstico de uma condição do nervo, por exemplo, se um nervo foi lesionado ou transeccionado, ou ressecado de forma sucedida, como durante um procedimento cirúrgico. Em uma modalidade, o método de diagnóstico inclui as etapas de (a) administrar a composição aqui revelada ao indivíduo, (b) permitir que o complexo de componente viral/corante penetre nas células do nervo; (c) aplicar uma quantidade suficiente de energia radiante ao indivíduo de modo que o corante exiba uma fluorescência, (d) obter intraoperativamente uma imagem fluorescente do indivíduo, e (e) observar a imagem fluorescente para visualizar um ou mais nervos no indivíduo e/ou determinar se um ou mais nervos foram transeccionados.
Assim, através da visualização de uma imagem de um nervo, o usuário pode determinar se um nervo particular foi transeccionado. Em algumas modalidades, a imagem é usada para determinar se um nervo transeccionado foi corrigido (isto é, ressecado).
As imagens obtidas por esses métodos podem ser usadas para auxiliar a guiar o enxerto neural quando ocorrem transecções não intencionadas ou quando estas não podem de outra maneira ser evitadas. Em algumas modalidades, uma imagem será observada após o enxerto neural ser executado para confirmar que o nervo tenha sido ressecado satisfatoriamente.
O profissional versado da área será capaz de determinar se um À nervo em particular foi transeccionado através da visualização das imagens obtidas de acordo com os métodos revelados. Por exemplo, linhas irregulares podem indicar a transecção. De modo similar, se um nervo se mostra mais comprido ou largo em uma primeira imagem do que na última imagem, isso também pode indicar que o nervo foi transeccionado. Por outro lado, se um nervo se mostra mais comprido ou largo em uma última imagem do que em uma imagem anterior, isso pode indicar que ele foi ressecado. Assim, em algumas modalidades, o método contempla a obtenção de múltiplas imagens.
DISPOSITIVOS PARA A FORMAÇÃO DE IMAGENS Uma vez administrado, o corante fluorescente na composição é estimulado a apresentar fluorescência, e sua luz emitida é capturada por uma câmera. Um dispositivo adequado é o sistema SPY (Novadaq Technologies Inc, Mississauga, Canadá), ou conforme descrito na patente de número us
6.915.154.
Geralmente, um dispositivo adequado tem uma fonte de luz capaz de estimular o corante fluorescente e uma câmera capaz de capturar a fluorescência do corante emitida.
A figura 1 ilustra um exemplo de um sistema adequado para estimular e formar imagens do corante fluorescente. Em determinadas modalidades, uma fonte de alimentação (110) fornece energia para um controlador e refrigerador termoelétrico (120), uma fonte de energia de luz (130) e um circuito controlador/regulador (140). O controlador (120) controla a temperatura da fonte de energia de luz (130). Por exemplo, a temperatura de um laser de diodo afeta seu comprimento de onda de operação, (por exemplo, um deslocamento de 0,3 nm por grau Celsius). Em algumas modalidades, conforme aqui descritas, a fonte de energia de luz (130) pode não ser um laser de diodo e, por conseguinte, um controlador (120) pode não ser necessário. O circuito controlador/regulador (140) regula a fonte de energia de luz (130) para o detector/câmera (100) através do computador (150). Este também inclui um software de processamento de imagens em um meio legível por computador (150). O computador (150) está em uma comunicação elétrica com a câmera a
(100) e com o visor (160). O visor (160) recebe os dados de imagem do computador (150) e os exibe.
C onforme descrito acima, em algumas modalidades, a fonte de energia de luz (130) é um laser.
Este tem uma fibra (170) através da qual a energia de luz é transmitida.
A fibra (170) conduz a luz paraaslentesde iluminação (180) através das quais a luz passa em direção ao campo alvo de visão quando o obturado mecânico (190) é aberto.
Um filtro de barreira (210) pode ser usado para filtrar a luz que emana do campo de visão nos comprimentos de onda que se situam na faixa acima ou abaixo daquela na qual o corante fluorescente é estimulado.
Em outras modalidades, a fonte de energia de luz (130) pode ser um LED.
Este iluminaria diretamente o tecido de interesse no campo de visão (isto é, nenhuma fibra (170) seria exigida). À câmera (100) captura a radiação emitida pelo corante após este ser estimulado e transmite os dados de imagem detectados para o computador (150). As lentes (180), fibra (170) e a câmera (100) são parte de um cabeçote de formação de imagens (230). O cabeçote (230) pode ser um cabeçote de articulação.
Em algumas modalidades, o cabeçote (230) inclui adicionalmente um indicador de sensor/foco de distância (220). Os componentes dos sistemas são aqui descritos adicionalmente.
Em certas modalidades, a energia radiante é aplicada ao tecido de interesse, em uma quantidade suficiente para fazer com que o corante fluorescente exiba fluorescência, por meio disso permitindo que o tecido de interesse seja exibido por imagem.
Em algumas modalidades, a fonte da energia de luz é um laser.
O laser pode ser composto de um acionador e diodo.
De preferência, o laser é um laser de diodo de alta potência (HPLDs). Os exemplos de HPLDs incluem os lasers AIlInGaAsP e os lasers GaAs que são bem conhecidos no estado da técnica.
Tais fontes podem ser de diodos únicos (emissor único), ou barreiras de laser de diodo, que são feitas de chips semicondutores de emissão de borda.
O laser pode incluir opcionalmente um
. . filtro, por exemplo, um filtro de passa-faixa, para garantir que a radiação emitida seja de um comprimento de onda substancialmente uniforme. O laser pode compreender ópticos para a divergência do feixe de laser. Os ópticos podem ser ajustados permitindo uma variação no campo de iluminação. Os ópticos ajustáveis também podem ser usados para fornecer até mesmo uma iluminação sobre uma área dada (por exemplo, campo de visão).
Em algumas modalidades, a saída da fonte é contínua ou quase contínua. Em outras modalidades, a saída do laser é pulsada. A saída pulsada pode ser sincronizada com a aquisição de imagem através de um gerador de pulsos. Em algumas modalidades, o pulso do laser tem a duração de pelo menos 3 femtossegundos. Em algumas modalidades, a saída do laser tem a duração de cerca de 0,5 segundos a cerca de 60 segundos. Uma taxa de repetição adequada para o laser pulsado pode se situar na faixa de qualquer das seguintes: cerca de 1 Hz a cerca de 80 MHz, cerca de 10 Hz a cerca de 100 Hz, cerca de 100 Hz a cerca de 1 kHz, cerca de 1 kHz a cerca de 100 kHz, E cerca de 100 kHz a cerca de 80 MHz. Em algumas modalidades, o laser pode . ser operado em uma saída de potência de cerca de 1,8, cerca de 2,2 ou cerca de 2,5 watts. Em outras modalidades, o laser pode ser operado em uma saída de potência na faixa de cerca de | a cerca de 4 watts. Em ainda outras modalidades, a potência média é menor do que 5 watts.
Em algumas modalidades, a fonte da energia é uma luz incandescente com um filtro apropriado de modo que forneça um comprimento de onda adequado de luz para induzir O corante fluorescente a exibir fluorescência. Ainda em outras modalidades, a fonte de luz é um diodo emissor deluz(LED).
Em algumas modalidades, a energia radiante pode ter um comprimento de onda na faixa de 150 nm a 1500 nm. A energia pode ser composta de luz infravermelha. Em algumas modalidades, a luz de
» estímulo tem um comprimento de onda de cerca de 805 nm. Em determinadas modalidades, a luz de estímulo tem um comprimento de onda na faixa de cerca de 805 nm a 850 nm. Em uma modalidade, a energia de luz de estímulo é administrada em um comprimento de onda que é mais curto do que o comprimento de onda emitido, isto é, comprimento de onda de detecção. A energia de luz de estímulo pode ser administrada de forma difundida de modo que não lesione o tecido irradiado. Em algumas modalidades, a luz de estímulo é administrada sobre uma área de cerca de 7,5 cm x 7,5 cm. Em outras modalidades, a luz é administrada sobre uma área na faixa de cerca de 1 cm x 1 cm a cerca de 20 cm x 20 cm. Em uma modalidade, a área é de cerca de 25 a 100 ecm?. Conforme descrito acima, múltiplos corantes podem ser usados em algumas modalidades. Nessas modalidades, as fontes de luz múltiplas podem ser usadas, por exemplo, um primeiro laser para estimular um primeiro corante e um segundo laser para estimular o segundo corante. O elemento versado compreenderá que a fonte de luz será escolhida ou E configurada para estimular um corante em particular. Em outras modalidades, uma única fonte de luz pode ser configurada para estimular múltiplos corantes, por exemplo, através da alternância do comprimento de onda na quala energia é emitida.
O cabeçote de formação de imagens (230) pode ser composto de um sensor de luz, por exemplo, uma câmera (100). A aquisição de imagem pode ser atingida com o uso de qualquer sensor capaz de detectar um sinal fluorescente. Os exemplos incluem sensores à base de silício, sensores compósitos semi-óxidos de óxidos- metálicos (CMOS) e filmes fotográficos. Em uma modalidade, o sensor compreende uma câmera, por exemplo, dispositivo de carga acoplada (CCD). Os exemplos de um CCD incluem o Hitachi KP-M2; KP-M3 (Hitachi, Tokyo, Japão).
s .
A câmera pode ser composta de um meio para focalizar a imagem. Determinadas modalidades abrangem um meio manual para focalizar uma imagem. Outras modalidades abrangem um meio mecanizado para focalizar uma imagem. A câmera pode ser composta adicionalmente de um sistema de lentes que permite a ampliação de um campo de imagem.
Em algumas modalidades, o posicionamento relativo da câmera e do laser é fixado de modo a melhorar a claridade e minimizar o ruído de fundo. Nessas modalidades, o laser é localizado em um ângulo menor do que cerca de 85º em relação aos eixos geométricos do laser e da câmera. Em outras modalidades, o laser é localizado em um ângulo de cerca de 20º a cerca de 70º em relação aos eixos geométricos do laser e da câmera. Em algumas modalidades, o laser é localizado em um ângulo maior do que cerca de 85º em relação aos eixos geométricos do laser e da câmera. Esse ângulo pode ser, por exemplo, de 90º.
Em determinadas modalidades, a câmera retransmite a imagem capturada de um conversor analógico-digital e, então, através da captação de imagem e software de processamento em execução em um computador. A imagem pode ser armazenada em qualquer meio adequado, por exemplo, um disco rígido, um disco óptico, fita magnética. A câmera também direciona imagens para um sistema de televisão/VCR de modo que as imagens possam ser exibidas em tempo real, gravadas e reproduzidas em um momento posterior. Assim, a formação de imagens pode ser realizada em tempo real ou com atraso.
Em determinadas modalidades, o computador (150) é um computador pessoal que compreende pelo menos 512 Megabytes de memória de acesso aleatório (RAM) e pelo menos 10 Gigabytes de capacidade de armazenamento. Em algumas modalidades, o computador (150) pode conter um processador Pentium IV (Intel, Santa Clara, CA, EUA).
s 2 Em algumas modalidades, o computador (150) também pode ter uma unidade de drive de CD e DVD. A unidade de drive ter a funcionalidade da escrita e leitura. O sistema também fornece um software de processamento de imagem.
Em determinadas modalidades, um endoscópio pode ser usado para estimular um corante fluorescente em uma composição e para detectar sua fluorescência, por exemplo, para aplicações intervencionistas. Este inclui um sensor e uma fonte de energia radiante. O endoscópio pode ser composto de fibras ópticas. Em determinadas outras modalidades, um microscópio compreende um sensor e uma fonte de radiação pode ser usada, por exemplo, um microscópio cirúrgico. Em algumas modalidades, o sensor compreende uma câmera de vídeo. Em determinadas modalidades, o sensor pode capturar imagens em uma taxa de pelo menos 10 por segundo, pelo menos 15 por segundo, pelo menos 20 por segundo, pelo menos 30 por segundo ou pelo menos 50 por segundo. Assim, determinadas modalidades contemplam uma pluralidade de imagens. Em outras modalidades, a presente invenção contempla uma única imagem.
A figura 2 ilustra uma modalidade de um método para formação de imagens. Esse método pode ser executado através de instruções programadas armazenadas no meio legível por computador, hardware ou firmware. (Um técnico no assunto compreenderá que tais softwares incluem instruções armazenadas no meio legível por computador). Ao ser executado, o programa de software fornece instruções ao processador do computador conforme descrito abaixo. O elemento versado compreenderá adicionalmente —queo computador está em comunicação com o laser, sensor e visor conforme descrito na presente invenção.
No início (etapa (10)), o usuário pode ser apresentado com múltiplas caixas de diálogo ou outros paradigmas de interface de uso
. a comum.
Por exemplo, o usuário pode ser questionado sobre se ele deseja iniciar um novo estudo (etapa (20)). Se o usuário indicar que ele deseja, ele será instruído a inserir ou, de outra maneira, selecionar um paciente para o estudo.
Por exemplo, o usuário pode ser motivado a escolher um nome de uma lista ligada a uma base de dados que é acessível pelo computador.
A Iternativamente, e le pode ser motivado a inserir um identificador do paciente.
O computador pode, então, acessar a base de dados para determinar a existência de informações adicionais associadas ao paciente e, de preferência, para obter tais informações.
Em uma modalidade preferencial, o software exige que o usuário insira ou, de outra maneira, selecione valores para os campos como primeiro nome do paciente, último nome e número da identidade.
Com mais preferência, uma informação suficiente é inserida ou, de outra maneira, carregada de modo que as imagens sejam armazenadas de acordo com o padrão de Formação de Imagens e Comunicações em Medicina (DICOM). O padrão DICOM é um produto do Comitê de Padrões de DICOM e de seus muitos grupos de trabalho internacionais.
Operações diárias são gerenciadas pela National Electrical Manufacturers Association (Rosslyn, VA, EUA). O padrão está geralmente disponível no site de rede http://medical.nema.org/, e é incorporado na presente invenção a título de referência em sua totalidade.
Após serem inseridos os dados do paciente, o monitor ou outro visor exibe as imagens capturadas pela câmera ou outro sensor em comunicação com o computador (etapa (40)). Nesse momento, o usuário pode alterar a posição, orientação, ganho ou outro parâmetro da câmera para obter uma visão desejada do paciente.
Alternativamente, o usuário pode escolher continuar um estudo (etapa (25)) no início (10). Mediante tal indicação, o processo prossegue para a etapa (40).
Uma vez que a imagem é exibida, o usuário é induzido a indicar se ele deseja copiar sequências (etapa (35)) ou adquirir uma sequência (etapa (50)) O termo "sequências" se refere a dados associados às imagens em tempo real capturadas por uma câmera ou outrosensor em comunicação com o computador.
Uma vez que o usuário indica que ele deseja adquirir imagens do sensor na etapa (50), o computador faz com que o laser seja ligado e este armazena a sequência de vídeo obtida do sensor em RAM (etapa (70)). As imagens em tempo real continuam a ser exibidas no visor.
O usuário é, então, questionado se ele deseja desligar o laser (etapa (80)). Se ele indicar que sim, o computador fará com quer o laser seja desligado (etapa (100)). Alternativamente, se o usuário não indicar que ele deseja desligar o laser, o computador determinará se uma quantidade de tempo predeterminada (por exemplo, 34 segundos) decorreu da etapa (60). Uma vez que a quantidade de tempo predeterminada tenha decorrido, o computador faz com que o laser seja desligado.
As sequências de vídeo continuam a ser armazenadas em RAM até que o laser seja desligado.
Uma vez que o laser é desligado, o usuário é questionado sobre se ele deseja salvar a sequência (etapa (105)). Se ele indicar um modo afirmativo, então, as sequências serão armazenadas no disco rígido (etapa (115)) ou outro meio.
Retornando agora à etapa (40) para os propósitos de descrição do software, uma vez que a imagem em tempo real é exibida, o usuário é questionado sobre se ele deseja copiar as sequências (etapa (35)) Se o usuário indicar que sim, as imagens associadas ao estudo serão selecionadas e gravadas em um disco compacto ou outra mídia selecionada (etapa (55)). Alternativamente, o software pode permitir que o usuário selecione imagens específicas para o armazenamento em mídia selecionada.
De preferência, a(s) imagem(ns) são armazenadas em um formato que é compatível com um é arquivamento de figura e sistema de computador, por exemplo em um formato DICOM. Em outra modalidade, a câmera também direciona imagens para um monitor de LCD ou outro tipo de visor (por exemplo, sistema de televisão /VCR, etc.) tal que a(s) imagem(ns) sejam exibidas em tempo real e/ou gravadas e reproduzidas em um momento posterior. Visto que a(s) imagem(ns) podem ser usadas para guiar todo ou parte do procedimento cirúrgico, a(s) imagem(ns) podem ser exibidas através de toda a duração de tempo do procedimento cirúrgico. Em outras modalidades, a(s) imagem(ns) podem ser exibidas por menos do que toda a duração do procedimento cirúrgico. Em outra modalidade, o software permite a manipulação de imagens após a aquisição, como o efeito de aproximação, seleção da região de interesse, alteração de brilho e contraste e exibição de múltiplas imagens simultaneamente.
Em algumas modalidades, o sistema compreende um campo cirúrgico estéril. O campo cirúrgico estéril cobre o braço de articulação para evitar ou minimizar o risco de contaminação do indivíduo. O campo cirúrgico estéril pode ter uma abertura no mesmo. A abertura pode ser coberta com um material que é capaz de transmitir energia radiante, por exemplo, luz infravermelha gerada por um laser.
DEFINIÇÕES Os artigos "um" e "uma" são usados na presente invenção para se referiem a um ou a mais de um (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento —oumaisdo que um elemento. "Pluralidade" significa pelo menos dois.
"Indivíduo" conforme aqui usado, se refere a qualquer animal. O animal pode ser um mamífero. Os exemplos de mamíferos adequados incluem, mas não se limitam a, seres humanos e primatas não humanos, cães, gatos,
. carneiros, vacas, porcos, cavalos, camundongos, ratos, coelhos e porcos da índia. "CG" é indocianina verde, um corante fluorescente de infravermelho próximo biocompatível aprovado para o uso em seres humanos. "PBS" é salina tamponada com fosfato "HSV-2" é herpes simples vírus tipo 2 "HSV-2 ICP10ARR" é um vírus mutante em que o domínio RR é excluído ou inativado no vírus HSV-2 de tipo selvagem. O termo "pfu" é unidade de formação de placa, o número mínimo devírus exigido para formar uma placa (uma área infectada) em uma célula ou sistema de cultura de bactéria adequados para esse teste. "S.C." é medula espinhal. Os seguintes exemplos são fornecidos para propósitos de ilustração apenas, e não têm a intenção de serem limitadores exceto quando especificado em contrário. Assim, a presente invenção não deve ser construída em nenhuma forma como sendo limitadora aos seguintes exemplos, mas, de preferência, deve ser construída para abranger quaisquer e todas as variações que se tornarem evidentes como um resultado dos ensinamentos fornecidos na presente invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE MUTANTES DE VÍRUS O mutante HSV-2 ARR pode ser preparado conforme descrito em Laing, J. et al., Intranasal administration of the growth compromised HSV-2 vector ARR prevents kainate induced seizures and neuronal loss in rats and —mice, Mol. Ther. 2006 May; 13(5): 870 a 881, e em Peng et al., Virology 216:184 1996. EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES Duas soluções estoque foram preparadas:
; ' Ss « fp (1) solução estoque de ICG: 25 mg de ICG em 0,8 ml! de HO (2) solução estoque do vírus HSV-2ARR: 107 pfu em 20 ul de salina tamponada com fosfato (PBS). 20 ul da solução estoque de vírus foram combinados com 20 ul de solução estoque de ICG e mantidos durante 1 hora a 4ºC (mistura de ICG/PBS/HSV-2 ARR). EXEMPLO 3: ESTUDO ANIMAL O exemplo 3 é uma comparação da formação de imagens com um corante fluorescente sozinho versus um corante fluorescente ligado ao vírus. Exceto quando especificado em contrário, todas as imagens são imagens digitais obtidas de uma câmera CCD. Um camundongo (60 g) foi brevemente anestesiado através de inalação de halotano. O coxim da pata direita do camundongo foi injetado com 10 uL de ICG, salina tamponada com fosfato (PBS) e um mutante de vírus, HSV-2ARR ("mistura de ICG/PBS/HSV-2ARR"). O coxim da pata esquerda foi injetado com 10 ul de mistura de ICG/PBS como um controle. A mesma concentração de ICG esteve presente em ambas as misturas. Duas (2) horas após as injeções no coxim das patas, Oo camundongo foi anestesiado e, então, foi submetido à eutanásia com uma injeção interperitoneal de sódio pentobarbital. As imagens fluorescentes de ICG foram adquiridas primeiramente do camundongo intacto e, então, de vários estágios de dissecação.
RESULTADOS A figura 3A é uma imagem fluorescente da parte posterior do camundongo do exemplo 3 com os músculos posteriores e da espinha expostos. A fluorescência da pata esquerda, com apenas ICG injetado, é limitada pela própria para esquerda. A pata direita, injetada com a mistura de ICG/PBS/HSV-2ARR, é fluorescente por si própria, mas a fluorescência se z NENE, dl + estende até a espinha em que os gânglios da raiz dorsal (isto é, os corpos de células de neurônio) dos nervos da pata estão localizados.
O complexo ICG- PBS-HSV-2ARR percorreu dos axônios da pata até os corpos da célula de axônios na espinha.
A injeção no coxim da pata de ICG-PBS-HSV-2ARR seguiu os nervos do coxim da pata por todo o caminho até a espinha.
A figura 3B descreve a mesma vista que a figura 3A, mas como uma imagem de luz visível (branca) sem a formação de imagem fluorescente.
A figura 3C é uma imagem fluorescente (junto com alguma iluminação de luz branca visívell da medula espinhal exposta do camundongo do exemplo 3. A porção do nervo fluorescente (resultante de uma injeção no coxim da pata) próxima de onde a mesma se encontra com a medula espinhal é indicada pelas três setas.
A figura 3D é uma imagem fluorescente da medula espinhal mais próxima da cabeça do camundongo com os nervos se encontrando com a medula espinhal não marcada com ICG/PBS/HSV-2ARR.
A figura 3D mostra que apenas os nervos do coxim da pata dos quais os axônios recolheram e transportaram o vírus fluorescente são marcados, conforme mostrados pelas setas, e não outros nervos não relatados.
Nas figuras 3C e 3D, o marcador 310 indica a posição da pinça puxando o nervo para fora da medula espinhal, indicada em (312). A medula espinhal é cortada na posição (314) (figura 3C apenas). A cabeça do camundongo geralmente repousa em direção ao lado direito da figura 3C enquanto que a cauda do camundongo aponta geralmente para a direção do lado esquerdo da figura.
EXEMPLO 4: ESTUDO ANIMAL O exemplo 4 é uma comparação de um corante fluorescente ligado a um vírus versus nenhuma injeção para mostrar que a fluorescência é confinada nos nervos a partir da pata esquerda que se conecta com o lado esquerdo da espinha.
? *e Um camundongo (50 g) foi brevemente anestesiado através da inalação de halotano. O camundongo foi injetado com 10 ul de mistura de ICG/PBS/HSV-2ARR no coxim da pata esquerda, e nada foi injetado no coxim da pata direita como controle.
Duas (2) horas após a injeção no coxim da pata, o camundongo foi anestesiado com uma injeção intraperitoneal de sódio de pentobarbital. Subsequentemente, o coração foi exposto, uma veia jugular foi cortada e 10 ml! de salina isotônica foram injetados lentamente em uma cavidade aérea do coração para exsanguinotransfudir e matar o camundongo. O propósito da exsanguinotransfusão foi de reduzir a fluorescência do tecido de fundo resultante das moléculas de ICG no bolus injetado no coxim da pata que não foram ligadas ao vírus e que penetraram no sistema linfático. Como com o primeiro camundongo, as imagens fluorescentes de ICG foram adquiridas primeiramente do camundongo intacto e, então, em vários estágios de dissecação.
RESULTADOS A figura 44 mostra uma imagem da fluorescência de ICG/PBS/HSV-2ARR em uma vista ventral de um camundongo inteiro (o camundongo está deitado sobre sua parte posterior). A injeção no coxim da E pata esquerda resulta na florescência em toda a pata esquerda e até a perna esquerda. O coxim da pata direita, a pata e a perna direitas que não foram injetadas não apresentaram fluorescência.
A figura 4B mostra a parte posterior (vista dorsal) do camundongo dissecada para mostrar a espinha e o nervo fluorescente da pata esquerda, usando a formação de imagem de luz branca e fluorescente. O marcador (320) indica a posição do nervo da pata esquerda. A posição da medula espinhal é indicada em (322). A figura 4C mostra apenas a imagem fluorescente do mesmo camundongo. A fluorescência é confinada no lado esquerdo da espinha sem fluorescência no lado direito (o coxim da pata não foi injetado).
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i A figura 4D mostra (i) o gânglio da raiz dorsal fluorescente dissecado (330) do lado esquerdo da espinha do camundongo em apenas uma luz branca, com um segmento curto de seus axônios no lado direito do gânglio, e (ii) o gânglio correspondente (332) do lado direito da espinha; sendo que a pata direita não foi injetada.
A figura 4E mostra (i) a imagem fluorescente do gânglio da figura 4D (i), e (ii) a imagem fluorescente do gânglio da figura 4D(ii). A figura 4F mostra uma imagem de irradiação inferior e ampliada do gânglio da figura 4E(i). As figuras 4D a 4F mostram que a injeção no coxim da pata esquerda marca o nervo da pata esquerda por todo o caminho até seu gânglio daraiz dorsal e que não existe fluorescência no gânglio da raiz dorsal direito correspondente porque o coxim da pata direita não foi injetado.
EXEMPLO 5: VÍRUS INATIVADO POR UV Esse exemplo demonstra a aplicação da formação de imagens de um vírus inativado por irradiação de UV, produzindo ao mesmo uma replicação defeituosa.
Uma solução estoque de ICG foi preparada dissolvendo 25 mg de 1ICG em 0,8 ml! de HO.
Uma solução estoque de vírus foi preparada com 10” pfu de HSV-2ARR em 20 ul de PBS. 50 ul da solução estoque de vírus foi combinada com 50 ul de solução estoque de ICG em um frasco e permitiu-se que assentasse durante 1 hora a 4ºC ("mistura de ICG/PBS/HSV-2ARR"). A mistura de ICG/PBS/HSV- 2ARR acima foi inativada com radiação UV a cerca de 350 nm por cerca de 15 minutos.
Um coelho da raça Dutch-belted (2,57 kg) foi brevemente —anestesiado por inalação de halotano.
O coelho foi injetado com 100 ul de mistura ICG/PBS/HSV-2ARR no coxim do dedo medial da pata direita, e injetado com 100 ul de mistura de ICG/PBS/HSV-2ARR inativada por UV no coxim do dedo medial da para esquerda.
Quatro horas e meia após a execução ê Í das injeções nos coxins das patas, o coelho foi anestesiado e, então, foi submetido à eutanásia com uma injeção intraperitoneal de sódio pentobarbital. A dissecação foi primeiramente executada no membro direito, começando por cerca de 5 cm acima do sítio de injeção de ICG/PBS/HSV-2ARR no coxim do dedo.
A figura 5A é um desenho anatômico de um membro do coelho para comparação com a imagem fluorescente (figura 5B), e é apresentada para ilustrar a posição da fluorescência de ICG no nervo plantar medial da perna direita elevado pelos cortes da dissecação na posição 340. A fluorescência dos vasos sanguíneos próximos também é visível. A fluorescência no sítio de injeção no coxim do dedo 342 é visível na parte inferior da figura 5B.
A figura 5C é um desenho anatômico de uma superfície medial do membro direito de um coelho. A seta indica um nervo grande adjacente aos vasos sanguíneos. O mesmo procedimento de dissecação foi executado no membro esquerdo no qual o vírus HSV-2-ARR inativado por UV foi injetado. As imagens de um segmento isolado do nervo safeno são mostradas em luz visível (figura 5D) e com fluorescência de ICG (figura SE), com a seta branca indicando a posição do nervo.
O segmento do nervo isolado foi estimulado e colocado sobre uma lâmina de microscópio. Após o umedecimento do mesmo com salina isotônica, uma lamínula foi aplicada. A fluorescência de ICG do segmento pode ser vista na figura 5F conforme gravada pelo sistema SPY (vendido junto à Novadaq Technologies Inc., Mississauga, Canadá). A fluorescência ICG do nervo também foi gravada in situ em ampliação de 10X (figura 5H). O segmento do nervo foi, então, manchado com uma enzima (C12-FDG) que “mancha LacZ (o gene que substitui o segmento de gene cortado do vírus HSV- 2 para atenuá-lo). Os micrográficos do nervo manchado são mostrados em duas ampliações (figura 5G, ampliação de 4X e figura 51, ampliação de 10X), indicando a presença do vírus no nervo.
A figura 5K mostra uma imagem fluorescente do aspecto dorsal da perna esquerda do coelho do exemplo 5, um desenho anatômico o qual é mostrado na figura 5J. A seta na figura 5J aponta para um nervo grande no membro superior. A figura 5K demonstra que o ICG/PBS/HSV-2ARR percorreu —dosítiode injeção no coxim do dedo até o nervo plantar superior. O vírus ICG inativado por UV se moveu para o interior de pequenos ramos de que se presume serem os nervos isquiático e tibial (setas), permitindo a formação de imagem até mesmo desses nervos pequenos. As setas são de cerca de 11 cm acima do sítio de injeção no coxim do dedo, indicando que o vírus inativado por UV fluorescente percorreu 11 cm acima do coxim do dedo, permitindo até mesmo que nervos distantes fossem visualizados por imagem. A figura 5K à direita também mostra de maneira parecida a fluorescência nos vasos sanguíneos.
Muitas modificações e variações podem ser feitas conforme forem se tornando aparentes para técnicos no assunto. As modalidades específicas aqui descritas são oferecidas a título de exemplo apenas e não têm a intenção de serem limitadores em qualquer modo. É a intenção de que o relatório : descritivo e os exemplos sejam considerados apenas como exemplificativos, com âmbito e espírito verdadeiros da presente invenção sendo indicados pelas seguintes reivindicações.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende: - um corante fluorescente; e 5 - um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, em que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de penetrar nas células do nervo.
    2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o corante é selecionado a partir de indocianina verde, infracianina verde, corante fluorescente verde, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído, fluorescamina, Rosa Bengala, azul de tripano, Fluoro-gold, 3-indocianina- verde-acil-1,3-tiazolidina-tiona, — proteina — fluorescente — verde, — proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente amarela, proteina fluorescente Se. azul e outras proteínas fluorescentes.
    3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o corante é indocianina verde.
    4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente viral é um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico.
    5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus é herpesvírus ou um mutante ou variante do mesmo.
    6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o herpesvírus é HSV-2.
    7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus é Herpes varicellae.
    8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus compreende HSV-2 ICP10ARR.
    9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que vírus é considerado defeituoso para replicação por meio da inativação por UV, mutação, tratamento químico ou tratamento térmico.
    10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o vírus de replicação defeituosa é selecionado a partir de um vírus atenuado, um vírus mutado e uma vacina.
    11. VACINA, caracterizada pelo fato de que compreende: - um corante fluorescente; e - um componente viral selecionado a partir de um vírus —neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, em que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de penetrar nas células do nervo.
    12. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO, caracterizado pelo fato de que compreende: - combinar um corante fluorescente com um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um a capsídeo de um vírus — neurotrópico, - permitir que o corante fluorescente seja ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante que seja capaz de penetrar nas células do nervo.
    13. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o componente viral é um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico.
    14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fatode que o vírus é produzido por replicação defeituosa por meio de mutação, radiação de UV, tratamento químico ou tratamento térmico.
    15. MÉTODO PARA REDUZIR O RISCO DE UMA LESÃO IATROGÊNICA em um indivíduo durante um procedimento cirúrgico, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar uma composição a um indivíduo, sendo que a composição compreende: - um corante fluorescente; e - um componente viral selecionado a partir de um a vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteina viral de um vírus — neurotrópicoe um capsídeo de um vírus neurotrópico, sendo que o corante fluorescente é ligado ao componente viral para formar um complexo de componente viral/corante; (b) permitir que o complexo de componente viral/corante penetre nas células do nervo; (c) aplicar uma quantidade suficiente de energia radiante a um indivíduo tal que o corante exiba fluorescência; (d) obter intraoperativamente uma imagem fluorescente do indivíduo; e (e) observaraimagem fluorescente para visualizar um ou mais nervos no indivíduo.
    16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o corante fluorescente é selecionado a partir de indocianina verde, infracianina verde, corante fluorescente verde, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído, fluorescamina, Rosa Bengala, azul de tripano, Fluoro-gold, 3-indocianina- verde-acil-1,3-tiazolidina-tiona, — proteina — fluorescente — verde, — proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente amarela, proteína fluorescente — azule outras proteínas fluorescentes.
    17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o corante fluorescente é indocianina verde.
    18. —" MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição compreende herpesvírus defeituoso para replicação.
    19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o herpesvírus é HSV-2.
    20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o vírus de replicação defeituosa compreende HSV-2 ICP1IO0ARR.
    21. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA CONDIÇÃO DO NERVO, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar uma composição ao indivíduo, sendo que a composição compreende: - um corante fluorescente; e - um componente viral selecionado a partir de um vírus de replicação defeituosa e neurotrópico, uma proteína viral de um vírus neurotrópico e um capsídeo de um vírus neurotrópico, sendo que o corante fluorescente é ligado ao componente viral —paraformar um complexo de componente viral/corante; (b) permitir que o complexo de componente viral/corante penetre nas células do nervo; (c) aplicar uma quantidade suficiente de energia radiante no indivíduo tal que o corante exiba fluorescência; (d) obter intraoperativamente uma imagem fluorescente do indivíduo; e (e) observaraimagem fluorescente para determinar se o nervo 5 — étranseccionado.
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