JP5806342B2 - ウイルス成分に結合させた蛍光染料を含む神経画像化用の画像化方法および組成物 - Google Patents

Description

本明細書では、医用画像化分野に関係する組成物および方法を開示する。

（関連出願）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、２００８年５月１４日に出願した米国特許仮出願第６１／１２７，６５９号明細書および２００８年７月２３日に出願した米国特許仮出願第６１／０８２，９８１号明細書に対する優先権の恩典を主張するものである。

医原性の神経損傷は、人間の機能の低下につながることがある。医原性神経損傷の一般的な原因には、手術の失敗、牽引性もしくは圧迫性の病変、血腫、または患者の不適切な姿勢などがある（非特許文献１参照）。

例えば、神経はしばしば、前立腺切除術中に画像化される。背景として、前立腺癌は、米国人男性において最も一般的なタイプの癌である。一般的な１つの治療選択肢は、癌が局所的に広がる前および転移する前に、前立腺の癌組織を除去する方法（すなわち前立腺切除術）である。根治的前立腺切除術の合併症には失禁およびインポテンス（ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ）が含まれる。手術中の海綿体神経の損傷によって、根治的前立腺切除術を受けた男性のうちかなりの割合がインポテンスになる。

前立腺の表面に沿って走る、勃起に必要な神経束に対する損傷を防ぐことによって、医原性神経損傷の危険を低減させることができる。しかしながら、前立腺組織と支配神経組織とを区別することが難しいため、神経温存手術を成功させることはしばしば困難である。

米国特許第６，０１３，２６５号明細書 米国特許第６，０５４，１３１号明細書 米国特許第６，２０７，１６８号明細書 米国特許第６，９１５，１５４号明細書

Fercan Komurcu, MD et al., 2005, Annals of Plastic Surgery, 54(2): 135-139 http://www.americanairandwater.com/uv-facts/uv-dosage.htm Peng et al., 1996, Virology, 216:184-196; LacZ-specific staining facilitates detection of cells that are infected with the mutant virus Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York Gerhardt et al. eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C. http://medical.nema.org/ Laing, J. et al., Intranasal administration of the growth compromised HSV-2 vector ΔRR prevents kainate induced seizures and neuronal loss in rats and mice, Mol. Ther. 2006 May; 13(5): 870-881 Peng et al., Virology 216:184 1996

神経画像化用の改良された画像化方法および組成物が求められている。

本明細書では、神経を画像化するための組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）および方法を開示する。神経は、対象のさまざまな領域に位置する。

本明細書ではさらに、蛍光染料を、神経軸索に入り込む能力を有するウイルス成分（例えばウイルス、ウイルスタンパク質、カプシド）に結合させると、神経軸索に入り込むことができ、したがって神経細胞画像化を改良することができる染料／ウイルス成分複合体を形成することができるという発見を開示する。一実施形態は、
蛍光染料と、
神経向性複製欠陥性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分と
を含み、
蛍光染料がウイルス成分に結合して、神経細胞に入り込む能力を有する染料／ウイルス成分複合体を形成した
組成物を提供する。

この実施形態および本明細書に開示する他の実施形態では、神経向性複製欠陥性ウイルスを例えば、神経細胞に入り込む能力を有する弱毒化または不活化ウイルス成分とすることができる。他の実施形態では、この組成物を、蛍光染料と、神経向性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分とを含むワクチンとすることができる。したがって、他の実施形態は、
蛍光染料と、
神経向性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分と
を含み、
蛍光染料がウイルス成分に結合して、神経細胞に入り込む能力を有する染料／ウイルス成分複合体を形成した
ワクチンを提供する。

他の実施形態は、組成物を調製する方法であって、
蛍光染料を、神経向性複製欠陥性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分と混合すること、
蛍光染料をウイルス成分に結合させて、神経細胞に入り込む能力を有する染料／ウイルス成分複合体を形成すること
を含む方法を提供する。

他の実施形態は、神経を画像化し、かつ／あるいは神経の異常および／または状態を診断する方法を提供する。この方法は、（ａ）本明細書に開示した組成物を対象に投与するステップと、（ｂ）染料／ウイルス成分複合体を神経細胞に入り込ませるステップと、（ｃ）染料が蛍光を発するような十分な量の放射エネルギーを対象に当てるステップと、（ｄ）手術中に対象の蛍光画像を得るステップとを含む。この方法は、蛍光画像を観察して、対象の体内の１つまたは複数の神経を見るステップ、あるいは、蛍光画像を観察して、１つまたは複数の神経が横切されているかどうかを判定するステップを含むことができる。

したがって、他の実施形態は、手術中における対象に対する医原性損傷の危険を低減させる方法であって、
（ａ）
蛍光染料と、
神経向性複製欠陥性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分と
を含み、
蛍光染料がウイルス成分に結合して、染料／ウイルス成分複合体を形成した
組成物を対象に投与すること、
（ｂ）染料／ウイルス成分複合体を神経細胞に入り込ませること、
（ｃ）染料が蛍光を発するような十分な量の放射エネルギーを対象に当てること、
（ｄ）手術中に対象の蛍光画像を得ること、および
（ｅ）蛍光画像を観察して、対象の体内の１つまたは複数の神経を見ること
を含む方法を提供する。

他の実施形態は、神経の状態を診断する方法であって、
（ａ）
蛍光染料と、
神経向性複製欠陥性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分と
を含み、
蛍光染料がウイルス成分に結合して、染料／ウイルス成分複合体を形成した
組成物を対象に投与すること、
（ｂ）染料／ウイルス成分複合体を神経細胞に入り込ませること、
（ｃ）染料が蛍光を発するような十分な量の放射エネルギーを対象に当てること、
（ｄ）手術中に対象の蛍光画像を得ること、および
（ｅ）蛍光画像を観察して、神経が横切されているかどうかを判定すること
を含む方法を提供する。

他の実施形態は、本明細書に開示した組成物と、本明細書に記載した１つまたは複数の方法に従ってこの組成物を使用するための説明書とを含むキット（ｋｉｔ）を提供する。他の実施形態では、このキットが、本明細書に開示した組成物を調製する目的に使用することができる１種または数種の材料成分、試薬、染料、ウイルス、前駆物質または他のツールと、本明細書に記載した１つまたは複数の方法に従ってこの組成物を使用するための説明書とを含む。

医用画像化システムを概略的に示す図である。 コンピュータプロセッサ上にインストールしたソフトウェアによって実行することができる医用画像化アルゴリズムを示す流れ図である。 実施例３のマウスの背部の蛍光画像を示す図である。 蛍光画像化を使用していない、図３Ａのマウスの同じ背部の可視（白色）光画像である。 ある可視光照明をした、実施例３のマウスの露出した脊髄の蛍光画像である。 マウスの頭部により近い位置の同じ脊髄の蛍光画像であり、ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲで標識されていない脊髄に神経が合流している。 実施例４の（仰向けに横たわった）マウス全体の腹側から見た、ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ（染料／ウイルス成分複合体）の蛍光を示す図である。 脊柱および蛍光を発している左足からの神経を示すために解剖した、蛍光画像化および白色光画像化を使用した実施例４のマウスの背部（背面図）を示す画像である。 図４Ｂと同じマウスの蛍光画像である。 （ｉ）実施例４のマウスの脊柱の左側からの蛍光を発する解剖された脊髄神経節の白色光のみの蛍光画像であり、その軸索の短い部分がこの神経節の右側に見えており、（ｉｉ）脊柱の右側からの対応する神経節の蛍光画像であり、その右フットパッドには注射されていない。 （ｉ）図４Ｄ（ｉ）の神経節の蛍光画像および（ｉｉ）図４Ｄ（ｉｉ）の神経節の蛍光画像である。 図４Ｅ（ｉ）の神経節の拡大された蛍光画像である。 蛍光画像と比較するためのウサギの左肢の解剖図である。 ＩＣＧ／ＨＳＶ−２ΔＲＲ複合体が、トウパッド注射部位から、上足底神経内まで移動したことを示す蛍光画像である。 蛍光画像と比較するためのウサギの右肢の解剖図である。 伏在神経の分離された部分の、可視白色光下での画像である。 伏在神経の分離された部分を示す、ＩＣＧ／ＨＳＶ−２ΔＲＲ複合体の蛍光を用いた蛍光画像である。 図５Ｄおよび５Ｅの２つのフレームの伏在神経の切除された部分を示す蛍光画像である。 ＵＶ不活化ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲウイルスのＬａｃＺ遺伝子に対して染色した、図５Ｆの伏在神経の切除された部分を示す蛍光画像である。 図５Ｄおよび５Ｅの２つのフレームの伏在神経をｉｎ ｓｉｔｕで示す蛍光画像である。 ＵＶ不活化ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲウイルスのＬａｃＺ遺伝子に対して染色した、図５Ｆの伏在神経の切除された部分を示す蛍光画像である。 蛍光画像と比較するためのウサギの左肢の解剖図である。 実施例５のウサギの左脚の背面の蛍光画像である。

一実施形態は、神経画像化用の組成物を提供する。

一実施形態では、この組成物が、医用画像化に使用する蛍光染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）などの染料を含む。しかしながら、染料は一般に神経細胞に入り込むことができないため、多くの染料は、神経などの体のある部分を画像化する目的には適さない。本明細書では、神経向性ウイルス成分（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、すなわち神経細胞に入り込む能力を有するウイルス成分を使用して、ある神経網の一部または全体にわたって染料を軸索を通して輸送することができるという発見を開示する。この輸送は、染料をウイルス成分に結合させた複合体を形成することによって達成することができる。

（染料）
本明細書で使用するとき、用語「蛍光染料」または「染料」は、適当な波長の放射光エネルギーによって励起されたときに可視または近赤外波長範囲の光を放出することで蛍光を発する小分子あるいはタンパク質または他の重合体もしくは高分子を意味する。

適当な蛍光染料には、放射エネルギー、例えば光にさらされたときに蛍光を発する任意の非毒性染料が含まれる。ある種の実施形態では、この染料が、近赤外スペクトル範囲の光を放出する蛍光染料である。ある実施形態では、この染料が脂溶性でなくてもよく、他の実施形態では、この染料を脂溶性とすることができる。ある種の実施形態では、この染料が、Ａｋｏｒｎ，Ｉｎｃ．社（米イリノイ州Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ）によって販売されているインドシアニングリーン（ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）（ＩＣＧ）などのトリカルボシアニン染料（ｔｒｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ）である。ＩＣＧ染料は、ＦＤＡによって人間への使用が承認されている。他の実施形態では、この染料がインフラシアニングリーン（ｉｎｆｒａｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ）である。他の実施形態では、この染料が、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、フィコシアニン（ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ｏ−フタルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、フルオレサミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ Ｂｅｎｇａｌ）、トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）、フルオロゴールド（ｆｌｕｏｒｏ−ｇｏｌｄ）、３−インドシアニングリーン−アシル−１，３−チアゾリジン−チオン（３−ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ−ｇｒｅｅｎ−ａｃｙｌ−１，３−ｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−ｔｈｉｏｎｅ）、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色（ｒｅｄ）蛍光タンパク質、黄色（ｙｅｌｌｏｗ）蛍光タンパク質、青色（ｂｌｕｅ）蛍光タンパク質および他の蛍光タンパク質の中から選択される。これらの染料を混合する、すなわち一緒にすることができる。ある実施形態では、染料類似体（ｄｙｅ ａｎａｌｏｇ）を使用することができる。「染料類似体」は、化学的に改変されてはいるが、適当な波長の放射エネルギーにさらされたときに蛍光を発する能力を依然として保持している染料である。

一実施形態では、この染料が、ウイルスタンパク質遺伝子を、緑色蛍光タンパク質遺伝子に融合させた同じウイルスタンパク質遺伝子に置き換えることによって構築された、ウイルスカプシド（ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄ）中のタンパク質に共有結合した緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質である。一実施形態では、緑色蛍光タンパク質を、神経細胞に入り込む神経向性ウイルスタンパク質に共有結合させる。

（ウイルス成分）
一実施形態では、ウイルス成分が、ウイルス、ウイルスタンパク質およびカプシドの中から選択される。一実施形態では、このウイルスタンパク質が、カプシドまたはカプシドタンパク質である。一実施形態では、このウイルスタンパク質が、ウイルスタンパク質類似体である。一実施形態では、このウイルスタンパク質およびウイルスタンパク質類似体が、ウイルスカプシドまたはウイルス全体の一部としてではなく、単独で神経細胞に入り込む能力を有する。他の実施形態では、このウイルスタンパク質および類似体を、それ自体が神経細胞に入り込むウイルスカプシドまたはウイルス全体の一部とすることができる。類似体は、タンパク質またはペプチドの１次配列は変化させるが、その機能は通常変化させないアミノ酸の保存的な（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）変更に帰着する異なる核酸構造を有する。保存的アミノ酸置換は一般に、以下のグループ内での置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。

一実施形態では、染料を結合させる前に、ウイルスタンパク質およびその類似体を単離することができる。

医療用途において使用されるため、このウイルス成分は、非ビルレント（ｎｏｎｖｉｒｕｌｅｎｔ）または「複製欠陥性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）」である。本明細書で使用するとき、用語「複製欠陥性」は、標的細胞（神経細胞）内においてウイルス粒子（ウイルス子孫（ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｇｅｎｙ））を形成できないことを意味する。一実施形態では、「複製欠陥性」が繁殖不能であることを指す。「複製欠陥性」ウイルスが弱毒化ウイルスを指すこともある。一実施形態では、弱毒化ウイルスが、低ビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）の生きたウイルスである。一実施形態では、弱毒化ウイルスが複製しない。他の実施形態では、弱毒化ウイルスが、感染した細胞内において、複製せずに、ウイルス抗原を発現することができる。他の実施形態では、弱毒化ウイルスがゆっくりと複製し、弱毒化ウイルス子孫を産出する。

一実施形態では、このウイルス成分がニューロビルレント（ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｔ）ではない。

一実施形態では、熱、光（例えばＵＶ光）または化学処理による突然変異または不活化によって、ウイルスが複製欠陥性にされる。ある種のウイルスを殺すのに必要な紫外（「ＵＶ」）光の量および波長はよく知られている。例えば、非特許文献２は、ある種のウイルスのコロニー形成を抑制するＵＶ光の量を一覧にして示しており、これを下表１に転載する。

一実施形態では、ウイルス遺伝物質（例えばＲＮＡウイルスに対するＲＮＡ、ＤＮＡウイルスに対するＤＮＡ）、またはウイルス複製、細胞変性効果もしくは細胞溶解に必要なタンパク質を除去し、または不活化することによって、突然変異を達成することができる。一実施形態では、このウイルスが、狂犬病ウイルスの突然変異体、例えばＩｍｏｖａｘ（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ ＳＡ社）である。

他の実施形態では、複製欠陥性ウイルスがワクチンである。本明細書で使用する「ワクチン」は、病気に対する免疫を向上させる（１種または数種のウイルス成分を含む）非ビルレント組成物を指す。他の実施形態では、Ｚｏｓｔａｖａｘ（登録商標）ワクチン（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．社、米ニュージャージー州Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ）などのワクチンをウイルス成分として使用することができる。したがって、他の実施形態は、
蛍光染料と、
神経向性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分と
を含み、
蛍光染料がウイルス成分に結合して、神経細胞に入り込む能力を有する染料／ウイルス成分複合体を形成した
ワクチンを提供する。

このウイルス成分は、神経系（例えば運動神経および／または感覚神経）の細胞に入り込むという点において神経向性である。ある実施形態では、このウイルスが、軸索を通して神経系中を輸送されるウイルスである。そのウイルスは人間に使用しても安全であるべきである。したがって、ある種の実施形態では、溶解性（ｌｙｔｉｃ）ではなく、好ましくは細胞変性効果を引き起こさない限りにおいて、神経細胞に入り込む能力および染料と結合する能力を有する任意のウイルス成分を使用することができる。

蛍光染料をウイルス成分に結合させ、それにより、やはり神経向性である、すなわち神経系の細胞に入り込む能力を有する染料／ウイルス成分複合体を形成することによって、ウイルス成分の神経向性は画像化に利用される。染料とウイルスまたはウイルスタンパク質との間の結合は、ファンデルワールス相互作用、双極子−双極子相互作用、カチオン−π相互作用、水素結合、イオン結合、共有結合、あるいは染料がウイルスまたはウイルス粒子と一緒に神経細胞に入るのに十分な他のタイプの結合によることができる。ある実施形態では、染料とウイルスまたはウイルスタンパク質とを直接に結合させることができ、このことは、染料とその関連ウイルスまたはウイルス粒子との間に挿入された中間リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によってそれらが結合されていないことを意味する。

一実施形態では、蛍光染料が結合した神経向性ウイルスのカプシドを使用することができる。

ある実施形態では、このウイルスがヘルペスウイルスであり、このウイルスを、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）またはその突然変異体とすることができる。ＨＳＶ−２は神経系の細胞に侵入する。ＨＳＶ−２遺伝子ＩＣＰ１０は、それぞれＵＬ３９およびＵＬ４０遺伝子によってコード化されたラージサブユニット（ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびスモールサブユニット（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）と呼ばれる２つのサブユニットを含むリボヌクレオチドレダクターゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＲＲ）酵素をコード化する。ＨＳＶ−２ ＩＣＰ１０遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｎｏ．Ｍ１２７００）は、特許文献１，２および３に記載されている。

ＨＳＶ−２突然変異体の一例では、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）がＩＣＰ１０から欠失している。このドメインの排除は、その結果生じる突然変異体を複製欠陥性とするのに有用である。

一実施形態では、このウイルスが、ＩＣＰ１０のリボヌクレオチドレダクターゼドメインがＬａｃＺをコード化する遺伝子に置き換えられた、ＩＣＰ１０ΔＲＲで表されるＨＳＶ−２の突然変異体である。ＩＣＰ１０ΔＲＲウイルスは当技術分野で知られている（非特許文献３参照）。ＩＣＰ１０ΔＲＲは、ＬａｃＺ遺伝子の付加のないＲＲ遺伝子の欠失を有することもある。ＬａｃＺ遺伝子を関心の任意の遺伝子に置き換えることもできる。ＲＲドメインが欠失し、または不活化されたＨＳＶ−２突然変異体も有用なことがある。本明細書では、ＨＳＶ−２ ＩＣＰ１０ΔＲＲ突然変異体をＨＳＶ−２ ΔＲＲと呼ぶ。

他の実施形態では、このウイルスをｈｅｒｐｅｓ ｖａｒｉｃｅｌｌａｅ（帯状ヘルペスウイルス）とすることができる。

当技術分野で知られている標準分子生物学手順を使用して、適当なウイルスを調製することができる。例示的な手順が、非特許文献４、５および６に開示されている。

（組成物）
前述のとおり、ある実施形態では、この組成物が、複製欠陥性ウイルス成分に結合した染料を含む。ある種の実施形態では、本明細書においてさらに説明するように、この組成物が、ウイルスタンパク質または不活化されたウイルスに結合した染料を含む。神経画像化のため、組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することができる。

したがって、他の実施形態は、組成物を調製する方法であって、
蛍光染料を、神経向性複製欠陥性ウイルス、神経向性ウイルスのウイルスタンパク質および神経向性ウイルスのカプシドの中から選択されたウイルス成分と混合すること、
蛍光染料をウイルス成分に結合させて、神経細胞に入り込む能力を有する染料／ウイルス成分複合体を形成すること
を含む方法を提供する。

ある実施形態では、この組成物が、ウイルスまたはウイルスタンパク質に結合していない染料をほとんどまたは全く含まない。例えば、組成物を調製するために使用する染料の量を、使用するウイルスまたはウイルスタンパク質の量に用量設定することができる。同様に、透析によって、またはショ糖勾配を使用することによって、異質な（結合していない）染料を組成物から除去することもできる。

本明細書では、本明細書に記載した組成物の調製および使用も開示する。このような組成物は、対象に投与するのに適した形態の活性材料成分（ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）だけからなることができ、あるいは、活性材料成分と、薬物として許容される１種もしくは数種の担体、追加の１種もしくは数種の材料成分またはこれらのある組合せとを含むことができる。この活性材料成分は、当技術分野においてよく知られている生理的に許容されるカチオンまたはアニオンと混在した形態など、生理的に許容されるエステルまたは塩の形態で組成物中に存在することができる。

本明細書で使用するとき、用語「活性材料成分（ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」は、蛍光染料が結合した、神経向性ウイルス、ウイルスカプシド、ウイルスタンパク質などのウイルス成分を意味する。

本明細書で使用するとき、用語「薬物として許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」は、活性材料成分と混合することができ、混合後に、活性材料成分を対象に投与するために使用することができる化学組成物を意味する。

本明細書で使用するとき、用語「生理的に許容される（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」エステルまたは塩は、組成物の他の材料成分に対して適合性を有し、組成物を投与する対象に対して無害なエステルまたは塩の形態の活性材料成分を意味する。

本明細書に記載した組成物の製剤は、薬理学の分野で知られている任意の方法または今後開発される任意の方法によって調製することができる。このような調製方法は一般に、活性材料成分を、担体あるいは他の１種または数種の副材料成分と混合し、次いで、必要な場合または望ましい場合に、その生成物を、望ましい１回または多回用量単位に成形し、包装するステップを含む。

本明細書に示す組成物の説明は主に、人間への投与に適した組成物を対象としているが、このような組成物は一般に、あらゆる種類の動物への投与に適していることを当業者は理解するであろう。人間への投与に適した組成物をさまざまな動物への投与に適した組成物にするための組成物の改変はよく理解されており、獣医学分野の薬理学者は、仮に実験によるにしても単に通常の実験だけを用いて、このような改変を設計し、実行することができる。これらの組成物の投与が企図される対象には、限定はされないが、人間および人間以外の霊長類ならびに他の哺乳類が含まれる。

これらの組成物は、非経口、静脈内、眼、髄腔内または他の任意の投与経路に適した製剤として調製し、包装し、販売することができる。

これらの組成物は、バルク（ｂｕｌｋ）で、または単一単位用量（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ）として、あるいは複数の単一単位用量として、調製し、包装し、販売することができる。本明細書で使用するとき、「単位用量」は、所定量の活性材料成分を含む分離された組成物の量である。この所定の活性材料成分の量は一般に、対象に投与される活性材料成分の用量、あるいは、例えばこのような用量の１／２または１／３など、このような用量の都合のよい部分に等しい。

本明細書で使用するとき、組成物の「非経口投与」は、対象の組織に物理的に裂け目（ｂｒｅａｃｈ）を形成し、組織のその裂け目を通して組成物を投与することを特徴とする任意の投与経路を含む。非経口投与はしたがって、限定はされないが、注射による組成物の投与、外科的切開を通した組成物の投与、組織に貫入した非外科的創傷を通した組成物の投与などを含む。具体的には、非経口投与は、限定はされないが、皮下、腹腔内、筋肉内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射、ならびに腎臓透析注入法を含むことが企図される。

非経口投与に適した組成物の製剤は、無菌水、無菌等張食塩水などの薬物として許容される担体と混合した活性材料成分を含む。このような製剤は、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）投与に適した形態または連続投与に適した形態として調製し、包装し、または販売することができる。注射可能製剤は、アンプル剤（ａｍｐｕｌｅ）などの単位用量の形態として、または防腐剤を含む多用量容器に入れて、調製し、包装し、または販売することができる。非経口投与用製剤は、限定はされないが、懸濁剤、液剤、油性または水性賦形剤に乳濁させた乳剤、パスタ剤、および埋入可能な持効性または生分解性製剤を含む。このような製剤はさらに、限定はされないが、懸濁化剤、安定化剤または分散剤を含む、１種または数種の追加の材料成分を含むことができる。非経口投与用製剤の一実施形態では、適当な賦形剤（例えば発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）を含まない無菌水）を用いて再形成し、その後に再形成組成物を非経口投与するため、活性材料成分が、乾燥形態（すなわち粉末、顆粒または凍結乾燥形態）で提供される。

動物、例えば人間に投与することができる用量は、体重１グラムあたり、ウイルスとして、約１０^２から約１０^８、または約１０^２から約１０^４、あるいは約１０^３から約１０^８プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）である。他の実施形態では、この用量が、体重１ｇあたり、染料として、例えば約１０^−４ｍｇから約２×１０^−３ｍｇである。例えば、下記の実験セクションに記載した動物実験は、ＩＣＧ染料および以下の量のウイルスを用いて実行した：（ａ）マウスに対しては、体重１グラムあたりウイルス４．２×１０^４ｐｆｕ、（ｂ）ウサギに対しては、体重１グラムあたり９７２．８ｐｆｕ。

（画像化方法）
一実施形態は、対象の少なくとも１つの神経を画像化する方法を提供する。この画像は手術中に得ることができる。したがって、手術を実行する領域またはその近くの領域を外科的に露出させることができる。この方法は、（ａ）本明細書に記載した組成物を投与して、染料／ウイルス成分複合体を形成すること、（ｂ）染料／ウイルス成分複合体を神経細胞に入り込ませること、（ｃ）染料が蛍光を発するような十分な量の放射エネルギーを前記領域に当てること、（ｄ）手術中に蛍光画像を得ること、および（ｅ）蛍光画像を観察して、蛍光画像内に少なくとも１つの神経が存在するのか、または存在しないのかを判定することを含む。

一実施形態では、「蛍光画像を観察すること」が、（印刷された、または画面上の）静止画像またはビデオモニタ上のリアルタイム画像を調べること、および画像を観察する他の方法を指すことがある。一実施形態では、蛍光染料をウイルス成分（例えばウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ））に結合させることによって可能となる神経の個々の画像（すなわち神経マップ）を、診断目的および神経位置のドキュメンテーション（ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）目的に使用することができる。一実施形態では、神経マッピングのための１つの使用が手術中の使用である。患者の内部構造のリアルタイム動画を得るために医師が一般的に使用する画像化技法である蛍光透視法（ｆｌｕｏｒｏｓｃｏｐｙ）において使用するため、この技術を使用して、神経に染料タグを付けることができると予想される。例えば、使用可能な従来の何らかの手段による手術中の手術視野の可視化が、神経温存手術を確実なものにするのには、神経、特に神経の小さな枝の位置決定および／または認知が不十分であるような形で達成されることがある。このような状況では、本技術革新を手術中の蛍光透視法で使用することが、良好な結果を得るために決定的に重要である。

後に報告する実験に基づくと、蛍光染料は、約２ｃｍ／時以上の速度で神経を逆方向に移動することができると推定された。この高速の染料の流れは、画像化を実行するほんの数時間（または数時間以上）前に、組成物を投与することを可能にすることがある。画像化する領域に染料が移動し、画像化の時点で染料が画像化する領域に存在するような画像化前の十分な時刻に、染料を含む組成物を投与することができる。必要な時間は、神経画像化の用途および投与部位によって異なることがある。一例として、ある種の手技では、例えば画像化部位までに染料が移動する必要がある距離に基づいて、画像化の１、２、３、４、５、６、７または８時間前までに、あるいは画像化の１、２、３、４、５、６、７または８時間前よりも前に、組成物を投与することができる。一実施形態では、画像化の１、２または３時間前までに組成物が投与される。

蛍光画像を観察することによって、手術チームは、画像内に神経が存在するのかまたは存在しないのかを判定することができる。可視光を用いた従来の手術フィールド照明を使用することにより、しばしば、神経を、それらのサイズ、形状および大まかな位置によって識別することができる。しかしながら、神経、特に神経の小さな枝とその下の組織との間のコントラストが十分ではなく、そのため、神経が蛍光を発するようにすることによって得られるかなり大きなコントラストなしでは、神経を全く観察できないことがよくある。手術チームはさらに、蛍光画像を観察することによって、１つまたは複数の特定の神経の位置を決定することができる。手術チームはしたがって、１つまたは複数の神経の存在の有無または位置に関する情報を使用して、手術をどのように実行するのかを決定することができる。例えば、これらの方法を使用することによって得た情報に基づいて、手術チームは、その領域に神経が存在しないことを感知したことに基づいて、特定の神経を不注意によって切断したり、または手術中に触れたりする可能性がより低い対象上の点で切開を実施することを決めることができる。

他の実施形態は、複数の画像を得ることを企図する。それらの複数の画像を互いに比較して、神経が損傷を受けていないと判定すること、例えば不注意によって神経が切断されていないと判定することができる。

得られた画像から得られる情報は、神経が横切されている（ｔｒａｎｓｅｃｔｅｄ）場合に、それらの神経の端部に移植を実施する助けとなることがある。横切の場合には、神経移植片を神経の端部に直接にあてがって、再生神経線維の新芽形成を促進することができる。この場合、横切された神経の端部の蛍光による目に見える光は、神経移植による神経の吻合術を誘導する標的を提供する。

（診断方法）
他の実施形態は、神経の状態、例えば、手術中などに、神経が損傷を受けたりまたは横切されたりしていないかかどうか、あるいは神経がうまく切除されたかどうかを診断する方法を提供する。一実施形態では、この診断方法が、（ａ）本明細書に開示した組成物を対象に投与するステップと、（ｂ）染料／ウイルス成分複合体を神経細胞に入り込ませるステップと、（ｃ）染料が蛍光を発するような十分な量の放射エネルギーを対象に当てるステップと、（ｄ）手術中に対象の蛍光画像を得るステップと、（ｅ）蛍光画像を観察して、対象の体内の１つまたは複数の神経を見、かつ／あるいは１つまたは複数の神経が横切されているかどうかを判定するステップとを含む。

したがって、神経の画像を見ることによって、ユーザは、特定の神経が横切されているかどうかを判定することができる。ある実施形態では、この画像が、横切された神経が矯正されたか（すなわち切除されたか）どうかを判定するために使用される。

意図しない切断が生じたとき、または切断を防ぐことができないときに、これらの方法によって得られた画像を使用して、神経移植術の誘導に役立てることができる。ある実施形態では、神経移植術が実行された後に、神経がうまく切除されたことを確認するために、画像が観察される。

熟練した医師は、開示した方法に従って得た画像を見ることによって、特定の神経が横切されているかどうかを判定することができる。例えば鋸歯状の線は、横切を示していることがある。同様に、第１の画像の方が後の画像よりも神経がより長くまたはより幅が広く見える場合も、神経が横切されたことを示していることがある。反対に、後の画像の方がより初期の画像よりも神経がより長くまたはより幅広く見える場合には、神経が切除されたことを示していることがある。したがって、ある実施形態では、この方法が、複数の画像を得ることを企図する。

（画像化装置）
組成物を投与した後、組成物中の蛍光染料を励起して蛍光を放出するようにし、その放出光をカメラによって捕捉する。適当な装置は、ＳＰＹシステム（Ｎｏｖａｄａｑ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社、カナダＭｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）、または特許文献４に記載されている装置である。

適当な装置は一般に、蛍光染料を励起する能力を有する光源と、放出された染料蛍光を捕捉する能力を有するカメラとを有する。

図１は、蛍光染料を励起し、画像化するのに適したシステムの一例を示す。ある種の実施形態では、電源１１０が、熱電冷却器およびコントローラ１２０、光エネルギー源１３０およびコントローラ／タイミング回路１４０に電力を供給する。コントローラ１２０は、光エネルギー源１３０の温度を制御する。例えば、ダイオードレーザの温度はその動作波長に影響を及ぼす（例えば１℃につき０．３ｎｍシフトする）。ある実施形態では、本明細書に記載されているとおり、光エネルギー源１３０がダイオードレーザでなくともよく、したがってコントローラ１２０が必要ない場合がある。コントローラ／タイミング回路１４０は、コンピュータ１５０を介して、光エネルギー源１３０と検出器／カメラ１００のタイミングを合わせる。コンピュータ１５０はさらに、コンピュータ１５０の可読媒体上に画像処理ソフトウェアを含む。コンピュータ１５０は、カメラ１００および表示装置１６０と電気的に連絡している。表示装置１６０は、コンピュータ１５０から画像データを受け取り、そのデータを表示する。前述のとおり、ある実施形態では、光エネルギー源１３０がレーザである。光エネルギー源１３０は、光エネルギーを伝送するファイバ１７０を有する。ファイバ１７０は照射レンズ１８０まで光を導き、機械式シャッタ１９０が開いているとき、光は照射レンズ１８０を通過して標的視野へと向かう。バリアフィルタ（ｂａｒｒｉｅｒ ｆｉｌｔｅｒ）２１０を使用して、標的視野を発した光のうち、蛍光染料が励起する波長よりも長い波長範囲または短い波長範囲の光を除去することができる。他の実施形態では、光エネルギー源１３０をＬＥＤとすることができる。それは、標的視野内の関心の組織を直接に照明するであろう（すなわちファイバ１７０が必要ないことがある）。カメラ１００は、励起された後に染料が放出する放射を捕捉し、検出された画像データをコンピュータ１５０に送信する。レンズ１８０、ファイバ１７０およびカメラ１００は画像化ヘッド２３０の部分である。ヘッド２３０は関節式ヘッドとすることができる。ある実施形態では、ヘッド２３０がさらに距離センサ／フォーカスインジケータ（ｆｏｃｕｓ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）２２０を含む。システムのこれらの構成要素については本明細書においてさらに説明する。

ある種の実施形態では、蛍光染料が蛍光を発する十分な量の放射エネルギーを関心の組織に当て、それによって関心の組織を画像化することを可能にする。ある実施形態では、光エネルギー源がレーザである。このレーザは、ドライバ（ｄｒｉｖｅｒ）およびダイオードを含むことができる。このレーザは、高出力レーザダイオード（ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｌａｓｅｒ ｄｉｏｄｅ）（ＨＰＬＤ）であることが好ましい。ＨＰＬＤの例には、当技術分野でよく知られているＡｌＩｎＧａＡｓＰレーザおよびＧａＡｓレーザが含まれる。このような光エネルギー源は、単一ダイオード（単一発光体）、または端面発光型半導体チップから作られたダイオードレーザバー（ｄｉｏｄｅ−ｌａｓｅｒ ｂａｒ）とすることができる。放出された放射が実質的に均一な波長を有することを保証するため、レーザは、任意選択で、フィルタ、例えば帯域フィルタを含むことができる。レーザは、レーザビームを発散させる光学部品を備えることができる。この光学部品を、照明フィールドの変更を可能にする調整可能な光学部品とすることができる。この調整可能な光学部品を使用して、所与の領域（例えば視野）全体にわたって均一な照明を提供することもできる。

ある実施形態では、光エネルギー源の出力が連続または準連続である。他の実施形態では、レーザ出力がパルスである。パルス発生器を使用することによって、このパルス出力を画像取得と同期させることができる。ある実施形態では、レーザパルスが少なくとも３フェムト秒間続く。ある実施形態では、レーザ出力が約３０秒間続く。他の実施形態では、レーザ出力が約０．５秒〜約６０秒間続く。パルスレーザに対する適当な繰返し数は、以下のうちの任意の範囲とすることができる：約１Ｈｚ〜約８０ＭＨｚ、約１０Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、約１００Ｈｚ〜約１ｋＨｚ、約１ｋＨｚ〜約１００ｋＨｚ、約１００ｋＨｚ〜約８０ＭＨｚ。ある実施形態では、このレーザを、約１．８、約２．２または約２．５ワットの出力で動作させることができる。他の実施形態では、このレーザを、約１〜約４ワットの出力で動作させることができる。他の実施形態では平均出力が５ワット未満である。

ある実施形態では、このエネルギー源が、蛍光染料が蛍光を発する適当な波長の光を供給する適当なフィルタを有する白熱灯である。他の実施形態では、この光源が発光ダイオード（ＬＥＤ）である。

ある実施形態では、放射エネルギーが、１５０ｎｍ〜１５００ｎｍの範囲の波長を有することができる。このエネルギーは赤外光を含むことができる。ある実施形態では、励起光の波長が約８０５ｎｍである。ある種の実施形態では、励起光の波長が約８０５ｎｍ〜８５０ｎｍである。一実施形態では、励起光エネルギーが、放出波長すなわち検出波長よりも短い波長で与えられる。被照射組織を傷つけないように、励起光エネルギーを拡散的に与えることができる。ある実施形態では、励起光が、約７．５ｃｍ×７．５ｃｍの面積に与えられる。他の実施形態では、励起光が、約１ｃｍ×１ｃｍないし約２０ｃｍ×２０ｃｍの面積に与えられる。一実施形態では、この面積が約２５から１００ｃｍ^２である。前述のとおり、ある実施形態では、複数の染料を使用することができる。これらの実施形態では、複数の光源、例えば第１の染料を励起する第１のレーザおよび第２の染料を励起する第２のレーザを使用することができる。この光源は、特定の染料を励起するように選択され、または特定の染料を励起するように構成されることを当業者は理解するであろう。他の実施形態では、例えばエネルギーを放出する波長を交番させることによって、単一の光源を、複数の染料を励起するように構成することができる。

画像化ヘッド２３０は、光センサ、例えばカメラ１００を含むことができる。画像取得は、蛍光信号を検出する能力を有する任意のセンサを使用して達成することができる。例には、シリコンベースのセンサ、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサおよび写真フィルムが含まれる。一実施形態では、このセンサが、カメラ、例えば電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を含む。ＣＣＤの例には、Ｈｉｔａｃｈｉ ＫＰ−Ｍ２、ＫＰ−Ｍ３（日立製作所、東京）が含まれる。

このカメラは、画像を集束させる手段を含むことができる。ある種の実施形態は、画像を集束させる手動手段を包含する。他の実施形態は、画像を集束させる自動手段を包含する。このカメラはさらに、画像フィールドの拡大を可能にするレンズ系を含むことができる。

ある実施形態では、明瞭性（ｃｌａｒｉｔｙ）を高め、背景雑音を最小化するために、カメラとレーザの相対位置が固定される。これらの実施形態では、レーザが、レーザおよびカメラの軸に対して約８５℃未満の角度に配置される。他の実施形態では、レーザが、レーザおよびカメラの軸に対して約２０℃から約７０℃の角度に配置される。ある実施形態では、レーザが、レーザおよびカメラの軸に対して約８５℃よりも大きな角度に配置される。このような角度は例えば９０℃とすることができる。

ある種の実施形態では、このカメラが、捕捉された画像をアナログ−ディジタル変換器へ中継し、次いでコンピュータ上で実行されている画像捕捉および画像処理ソフトウェアに通す。この画像を、適当な媒体、例えばハードドライブ、光ディスク、磁気テープに記憶することができる。画像をリアルタイムで表示し、記録し、後に再生することができるように、このカメラはさらに、画像をテレビジョン／ＶＣＲシステムへ送ることができる。したがって、画像化は、リアルタイムで、またはある遅延時間の後に実行することができる。

ある種の実施形態では、コンピュータ１５０が、少なくとも５１２メガバイトのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）と、少なくとも１０ギガバイトの記憶装置とを備えるパーソナルコンピュータである。ある実施形態では、コンピュータ１５０が、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標） ＩＶプロセッサ（Ｉｎｔｅｌ社、米カリフォルニアＳａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を含むことができる。ある実施形態では、コンピュータ１５０がさらにＣＤ／ＤＶＤドライブを有することができる。このドライブは、読取りおよび書込み機能を有することができる。このシステムはさらに画像処理ソフトウェアを提供する。

ある種の実施形態では、例えば介入用途（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に対して、内視鏡を使用して、組成物中の蛍光染料を励起し、その蛍光を検出することができる。この内視鏡は、センサおよび放射エネルギー源を含む。この内視鏡は光ファイバを含むことができる。他のある種の実施形態では、センサおよび放射源を備える顕微鏡、例えば外科用顕微鏡を使用することができる。ある実施形態では、このセンサがビデオカメラを含む。ある種の実施形態では、このセンサが、少なくとも１０画像／秒、少なくとも１５画像／秒、少なくとも２０画像／秒、少なくとも３０画像／秒または少なくとも５０画像／秒の速度で画像を捕捉することができる。したがって、ある種の実施形態は複数の画像を企図する。他の実施形態では、本発明が１つの画像を企図する。

図２は、画像化方法の一実施形態を示す。この方法は、コンピュータ可読媒体、ハードウェアまたはファームウェア上に記憶されたプログラムされた命令によって実施することができる。（当業者は、このようなソフトウェアが、コンピュータ可読媒体上に記憶された命令を含むことを理解するであろう。）実行されたとき、このソフトウェアプログラムは、コンピュータプロセッサに、後述するような命令を与える。当業者はさらに、このコンピュータが、本明細書に記載したレーザ、センサおよび表示装置と連絡していることを理解するであろう。

開始（ステップ１０）で、ユーザに、複数のダイアログボックス（ｄｉａｌｏｇ ｂｏｘ）または他の一般的なユーザインタフェースパラダイム（ｐａｒａｄｉｇｍ）を提示することできる。例えば、新たなスタディ（ｓｔｕｄｙ）を始めたいかどうかについてユーザに問い合わせることができる（ステップ２０）。そうしたいとの意思をユーザが示した場合、そのスタディに対する患者を入力するか、または他の方法で選択するようユーザに指示することができる。例えば、コンピュータにアクセス可能なデータベースにリンクされたリストから名前を選択するようユーザに促すことができる。交互に、患者識別子を入力するようユーザに促すこともできる。コンピュータは次いでデータベースにアクセスして、患者に関連した追加情報の存在の有無を判定し、好ましくはそのような情報を取得することができる。好ましい一実施形態では、患者の名前、姓およびＩＤ番号フィールドに対応する値を入力するか、または他の方法でそれらの値を選択するように、ソフトウェアがユーザに要求する。ＤＩＣＯＭ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）規格に従って画像を記憶することができるように、十分な情報が入力されるか、または他の方法でロードされることが最も好ましい。ＤＩＣＯＭ規格は、ＤＩＣＯＭ規格委員会（ＤＩＣＯＭ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）およびその多くの国際的な作業グループの成果である。日々の運営は、北米電子機器工業会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（米ヴァージニア州Ｒｏｓｓｌｙｎ）が管理している。この規格は、ウェブサイトである非特許文献７において一般に入手可能であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

患者データが入力された後、モニタまたは他の表示装置は、コンピュータと連絡したカメラまたは他のセンサによって捕捉された画像を表示する（ステップ４０）。この時点で、ユーザは、患者の所望の画像を得るため、カメラの位置、方向、利得または他のパラメータを変更することができる。

あるいは、ユーザは、開始１０で、スタディを続けること（ステップ２５）を選択することもできる。このような意思が示されると、このプロセスはステップ４０へ進む。

画像を表示した後、シーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を複写したいのか（ステップ３５）、またはシーケンスを取得したいのか（ステップ５０）についての意思を示すよう、ユーザに促す。用語「シーケンス」は、コンピュータと連絡したカメラまたは他のセンサによって捕捉されたリアルタイム画像に関連したデータを指す。ステップ５０で、センサから画像を取得したいという意思をユーザが示すと、コンピュータは、レーザをオンにし、センサから得たビデオシーケンスをＲＡＭに記憶する（ステップ７０）。リアルタイム画像は表示装置上に表示され続ける。次いで、レーザをオフにしたいのかどうかについてユーザに問い合わせる（ステップ８０）。そうしたいとの意思をユーザが示した場合、コンピュータはレーザをオフにする（ステップ１００）。交互に、レーザをオフにしたいとの意思をユーザが示さない場合、コンピュータは、ステップ６０から所定の時間（例えば３４秒）が経過したかどうかを判定する。この所定の時間が経過すると、コンピュータはレーザをオフにする。レーザがオフになるまで、ビデオシーケンスはＲＡＭに記憶され続ける。レーザをオフにした後、シーケンスを保存したいかどうかをユーザに問い合わせる（ステップ１０５）。そうしたいとの意思をユーザが示した場合には、ハードドライブ（ステップ１１５）または他の媒体にシーケンスを記憶する。

次に、ソフトウェアを説明するためステップ４０に戻る。リアルタイム画像を表示した後、シーケンスを複写したいかどうかについてユーザに問い合わせる（ステップ３５）。そうしたいとの意思をユーザが示した場合には、そのスタディに関連した画像を選択し、その画像を、コンパクトディスクまたは他の選択された媒体に記録する（ステップ５５）。交互に、ソフトウェアは、選択された媒体上に記憶する特定の画像をユーザが選択することを許す。この画像（１つまたは複数）は、あるピクチャアーカイビング（ｐｉｃｔｕｒｅ ａｒｃｈｉｖｉｎｇ）／コンピュータシステムに適合したフォーマット、例えばＤＩＣＯＭフォーマットで記憶されることが好ましい。

他の実施形態では、この画像（１つまたは複数）をリアルタイムで表示し、かつ／または記録し、後に再生することができるように、このカメラがさらに、ＬＣＤモニタまたは他の表示装置（例えばテレビジョン／ＶＣＲシステムなど）に画像を送ることができる。この画像（１つまたは複数）を使用して、手術の全体または一部を誘導することができるため、手術時間の全体にわたってこの画像（１つまたは複数）を表示することができる。他の実施形態では、手術時間全体よりも短い時間の間、この画像（１つまたは複数）を表示することができる。他の実施形態では、ソフトウェアが、ズーミング（ｚｏｏｍｉｎｇ）、関心領域の選択、明るさおよびコントラストの変更、複数画像の同時表示など、取得後の画像の操作を可能にする。

ある実施形態では、このシステムが無菌ドレープ（ｄｒａｐｅ）を備える。この無菌ドレープは関節式アームを覆って、対象が汚染されることを防ぎ、または対象が汚染される危険を最小化する。この無菌ドレープは開口部を有することができる。この開口部を、放射エネルギー、例えばレーザが発生させた赤外光を透過する能力を有する材料で覆うことができる。

（定義）
本明細書では冠詞「ａ」および「ａｎ」が、その冠詞の文法上の対象が１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）あることを示す。一例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。「複数」は少なくとも２つを意味する。

本明細書で使用する「対象」は任意の動物を指す。この動物を哺乳類とすることができる。適当な哺乳類の例には、限定はされないが、人間および人間以外の霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ウサギおよびモルモットが含まれる。

「ＩＣＧ」は、人間に対する使用が承認されている生物適合性の近赤外蛍光染料であるインドシアニングリーンである。

「ＰＢＳ」はリン酸緩衝食塩水である。

「ＨＳＶ−２」は単純ヘルペスウイルス２型である。

「ＨＳＶ−２ ＩＣＰ１０ΔＲＲ」は、野生型ＨＳＶ−２ウイルスのＲＲドメインが欠失し、または不活化された突然変異ウイルスである。

用語「ｐｆｕ」はプラーク形成単位であり、これは、この試験に適した細胞または細菌培養系において１つプラーク（１つの感染領域）を形成するのに必要なウイルスの最小数である。

「Ｓ．Ｃ．」は脊髄（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）である。

特に明記しない限り、以下の実施例は、例示だけを目的に示すものであり、限定することは意図されていない。したがって、本発明が以下の実施例に限定されると解釈すべきではなく、本発明は、本明細書に提供する教示の結果として明らかになる全ての変型実施形態を包含すると解釈すべきである。

（実施例）
（実施例１：ウイルス突然変異体の調製）
ＨＳＶ−２ ΔＲＲ突然変異体は、非特許文献８および非特許文献９に記載されているとおりに調整することができる。

（実施例２：組成物の調製）
以下の２種類の保存溶液を調製した。

（１）ＩＣＧ保存溶液：Ｈ_２Ｏ０．８ｍｌ中にＩＣＧ２５ｍｇを含む
（２）ＨＳＶ−２ ΔＲＲウイルス保存溶液：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２０μｌ中に１０^７ｐｆｕを含む

このウイルス保存溶液２０μＬをＩＣＧ保存溶液２０μＬと混合し、４℃で１時間放置した（ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ混合物）。

（実施例３：動物実験）
実施例３は、蛍光染料だけを用いた画像化とウイルスに結合させた蛍光染料を用いた画像化との比較である。特に明記しない限り、全ての画像はＣＣＤカメラによって得たディジタル画像である。

ハロタン吸入法（ｈａｌｏｔｈａｎｅ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）によってマウス（６０ｇ）に一時的に麻酔をかけた。マウスの右フットパッド（ｆｏｏｔｐａｄ）に、ＩＣＧ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびウイルス突然変異体ＨＳＶ−２ ΔＲＲ（「ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ混合物」）１０μＬを注射した。左フットパッドには、ＩＣＧ／ＰＢＳ混合物１０μＬを対照として注射した。これらの両方の混合物には同じ濃度のＩＣＧが存在する。

フットパッドに注射してから２時間後、マウスに麻酔をかけ、次いでペントバルビタールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）の腹膜間注射によって安楽死させた。最初に無傷のマウスのＩＣＧ蛍光画像を取得し、次いでさまざまな解剖段階におけるＩＣＧ蛍光画像を取得した。

（結果）
図３Ａは、脊柱および背部の筋肉が露出した実施例３のマウスの背部の蛍光画像である。ＩＣＧだけを注射した左足の蛍光は、左足だけに限定されている。ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ混合物を注射した右足は、右足自体が蛍光を発しており、この蛍光は、足の神経の脊髄神経節（すなわちニューロン細胞体）が位置する脊柱まで延びている。ＩＣＧ−ＰＢＳ−ＨＳＶ−２ ΔＲＲ複合体は、右足から、軸索に沿って、脊柱にある軸索の細胞体まで移動した。ＩＣＧ−ＰＢＳ−ＨＳＶ−２ ΔＲＲのフットパッド注射は、脊柱までずっとフットパッド神経をたどった。図３Ｂは、図３Ａと同じ図を、蛍光画像化を使用していない可視（白色）光画像として示している。

図３Ｃは、実施例３のマウスの露出した脊髄の蛍光画像である（ある可視白色光照明も使用されている）。（フットパッドへの注射の結果）蛍光を発している神経が脊髄に合流する位置に近いこの神経の部分が、３本の矢印によって指示されている。図３Ｄは、マウスの頭部により近い位置の同じ脊髄の蛍光画像であり、ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲで標識されていない脊髄に神経が合流している。図３Ｄは、矢印によって示されているように、その軸索が蛍光ウイルスを吸収し、輸送したフットパッド神経だけが標識され、他の無関係な神経は標識されないことを示している。図３Ｃおよび３Ｄでは、符号３１０が、符号３１２で示された脊髄から神経を引き離している鉗子の位置を示している。脊髄は、位置３１４（図３Ｃにだけ示されている）で切断されている。マウスの頭部は概ね図３Ｃの右側の方にあり、マウスの尾は概ね図の左側の方を指している。

（実施例４：動物実験）
実施例４は、蛍光が、脊柱の左側に接続する左足からの神経だけに限定されることを示すため、ウイルスに結合させた蛍光染料を注射したものと、注射しなかったものとを比較したものである。

ハロタン吸入法によってマウス（５０ｇ）に一時的に麻酔をかけた。マウスの左フットパッドにＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ混合物１０μＬを注射し、右フットパッドには、対照として何も注射しなかった。

フットパッドに注射してから２時間後、ペントバルビタールナトリウムの腹膜間注射によってマウスに麻酔をかけた。続いて、心臓を露出させ、頸静脈を切開し、心臓のアエリアルチャンバ（ａｅｒｉａｌ ｃｈａｍｂｅｒ）に等張食塩水１０ｍｌをゆっくりと注入して放血し、マウスを死亡させた。放血（ｅｘａｎｇｕａｔｉｏｎ）の目的は、ウイルスに結合せず、リンパ系に入った、ボーラス注射したフットパッド内のＩＣＧ分子に起因する背景組織蛍光を低減させることである。最初のマウスと同様に、最初に無傷のマウスのＩＣＧ蛍光画像を取得し、次いでさまざまな解剖段階におけるＩＣＧ蛍光画像を取得した。

（結果）
図４Ａは、マウス全体の腹側から見たＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ蛍光画像を示す（マウスは仰向けに横たわっている）。左フットパッド注射の結果、左足全体に蛍光が見られ、蛍光は左脚内へ延びている。注射していない右フットパッド、右足および右脚は蛍光を発していない。

図４Ｂは、脊柱および蛍光を発している左足からの神経を示すために解剖した、蛍光画像化および白色光画像化を使用したマウスの背部（背面図）を示す。符号３２０は左足からの神経の位置を示す。脊髄の位置は３２２で示されている。図４Ｃは、同じマウスの蛍光画像だけを示す。蛍光は、脊柱の左側だけに限定されており、右（注射していないフットパッドの）側に蛍光は見られない。

図４Ｄは、（ｉ）マウスの脊柱の左側からの蛍光を発する解剖された脊髄神経節３３０を白色光のみで示し、その軸索の短い部分がこの神経節の右側に見えており、（ｉｉ）脊柱の右側からの対応する神経節３３２を示す。右足には注射されていない。図４Ｅは、（ｉ）図４Ｄ（ｉ）の神経節の蛍光画像および（ｉｉ）図４Ｄ（ｉｉ）の神経節の蛍光画像を示す。図４Ｆは、図４Ｅ（ｉ）の神経節の拡大された低放射照度（ｌｏｗｅｒ ｉｒｒａｄｉａｎｃｅ）画像を示す。図４Ｄ〜４Ｆは、左フットパッドの注射が、その脊髄神経節までずっと左足神経を標識すること、および右フットパッドには注射しなかったため、対応する右の脊髄神経節には蛍光が見られないことを示している。

（実施例５：ＵＶ不活化ウイルス）
この実施例は、ウイルスを複製欠陥性にするＵＶ照射によって不活化されたウイルスの画像化応用を示す。

Ｈ_２Ｏ０．８ｍｌにＩＣＧ２５ｍｇを溶解することによってＩＣＧ保存溶液を調製した。ＰＢＳ２０μｌ中にＨＳＶ−２ ΔＲＲ １０^７ｐｆｕを含むウイルス保存溶液を調製した。

ウイルス保存溶液５０μＬとＩＣＧ保存溶液５０μｌとを１つのフラスコに入れて混合し、４℃で１時間放置した（「ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＡＲＲ混合物」）。上記のＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ混合物を、約３５０ｎｍ、約１５分のＵＶ照射によって不活化した。

ハロタン吸入法によってダッチベルテッドウサギ（Ｄｕｔｃｈ−ｂｅｌｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ）（２．５７ ｋｇ）に一時的に麻酔をかけた。このウサギの右足の内側トウパッド（ｔｏｅ ｐａｄ）に、ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ混合物１００μｌを注射し、左足の内側トウパッドに、ＵＶ不活化ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ混合物１００μｌを注射した。足パッドに注射してから４時間半後、ウサギに麻酔をかけ、次いでペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によって安楽死させた。最初に、トウパッドのＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲ射部位の約５ｃｍ上から出発して、右肢を解剖した。

図５Ａは、蛍光画像（図５Ｂ）と比較するためのウサギの肢の解剖図であり、位置３４０にある解剖鋏によって持ち上げられた右脚内側足底神経内のＩＣＧ蛍光の位置を示すために示したものである。近くの血管からの蛍光も見える。図５Ｂの下部に、トウパッド注射部位３４２の蛍光が見える。

図５Ｃは、ウサギの右肢の内側表面の解剖図である。矢印は、血管に隣接した大きな神経を指示している。ＵＶ不活化ＨＳＶ−２−ΔＲＲウイルスを注射した左肢にも、同じ解剖手技を実施した。伏在神経の分離された部分の可視光画像（図５Ｄ）およびＩＣＧ蛍光画像（図５Ｅ）が示されており、白い矢印は神経の位置を示す。

この分離された神経部分を切除し、顕微鏡スライド上に置いた。等張食塩水で湿らせた後、カバーガラスをかけた。ＳＰＹシステム（Ｎｏｖａｄａｑ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社（カナダＭｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）によって販売されている）によって記録したこの部分のＩＣＧ蛍光を図５Ｆに示す。さらに、この神経ＩＣＧ蛍光をｉｎ ｓｉｔｕで、倍率１０×で記録した（図５Ｈ）。次いでこの神経部分を、ＬａｃＺ（ＨＳＶ−２ウイルスを弱毒化するために、ＨＳＶ−２ウイルスから切り取られた遺伝子部分の代わりに組み込まれた遺伝子）を染色する酵素（Ｃ１２−ＦＤＧ）で染色した。この染色された神経内にウイルスが存在することを指示するこの神経の顕微鏡写真を、２段階の倍率で示す（図５Ｇ（倍率４×）および図５Ｉ（倍率１０×））。

図５Ｋは、実施例５のウサギの左脚の背面の蛍光画像を示し、この部分の解剖図を図５Ｊに示す。図５Ｊの矢印は、上肢の大きな神経を指している。図５Ｋは、ＩＣＧ／ＰＢＳ／ＨＳＶ−２ ΔＲＲが、トウパッド注射部位から、上足底神経内まで移動したことを示している。ＩＣＧ ＵＶ不活化ウイルスは、坐骨神経および脛骨神経であると推定される神経の小さな枝の中へ移動し（矢印）、このことが、これらの小さな神経の画像化さえも可能にした。これらの矢印は、トウパッド注射部位の約１１ｃｍ上にあり、このことは、ＵＶ不活化蛍光ウイルスがトウパッドの１１ｃｍ上まで移動したことを指示しており、このことは、遠隔の神経の画像化さえも可能にする。図５Ｋ右はおそらく、血管内の蛍光をも示している。

当業者には明らかなとおり、多くの修正および変更を加えることができる。本明細書に記載した特定の実施形態は単に例として示したものであり、限定する意図は全くない。以上の明細書および実施例は、単なる例とみなすことが意図されており、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって指示される。

Claims (1)

1. 蛍光染料と、
   神経細胞内では複製不可能な神経向性ｈｅｒｐｅｓ ｖａｒｉｃｅｌｌａｅとを含み、
   前記蛍光染料は前記ウイルスに結合して、神経細胞に入り込む能力を有する複合体を形成し、
   前記染料はインドシアニングリーンである
   ことを特徴とする組成物。

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