CN104800863A - 用于神经成像的包括与病毒组分结合的荧光染料的成像法和组合物 - Google Patents

用于神经成像的包括与病毒组分结合的荧光染料的成像法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于神经成像的包括与病毒组分结合的荧光染料的成像法和组合物。本文公开的是用于使神经细胞成像的组合物和方法。该组合物包括荧光染料；和选自向神经的复制缺陷型病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳的病毒组分。尽管荧光染料自身无法穿透神经细胞，但荧光染料与病毒组分结合，以形成能够穿透神经细胞的染料/病毒组分复合物。

Description

用于神经成像的包括与病毒组分结合的荧光染料的成像法和组合物
本申请是国际申请日为2009年5月14日的国际申请PCT/US2009/043975进入中国、申请号为200980117131.5的题为“用于神经成像的包括与病毒组分结合的荧光染料的成像法和组合物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2008年5月14日提交的美国临时申请号61/127,659、和于2008年7月23日提交的美国临时申请号6I/082,981的优先权利益，所述美国临时申请的公开内容引入本文作为参考。
技术领域
本文公开的是涉及医学成像领域的组合物和方法。
背景技术
医源性神经损伤可以导致在人中的致虚弱的功能丧失。医源性神经损伤的常见原因包括患者的外科手术失败、牵引或压迫性损害、血肿或不适定位(inadequate positioning)(Fercan Komurcu，MD等人，2005，Annals ofPlastic Surgery，54(2)：135-139)。
例如，神经通常在前列腺切除术手术过程中进行成像。作为背景资料，前列腺癌是美国男性中最常见类型的癌症。一种常见治疗选项是在癌症局部扩散前和转移前除去癌性前列腺组织(即，前列腺切除术)。根治性前列腺切除术(radical prostatectomy)并发症包括失禁和阳萎。由于在外科手术过程中对海绵体神经的损伤，经历根治性前列腺切除术手术的相当大百分比的男性变得阳萎。
通过避免对沿着前列腺表面伸展且是勃起所需的神经束的损伤，可以减少医源性神经损伤的危险。然而，由于区分前列腺组织和神经支配神经组织中的困难，通常难以实现成功的保留神经外科手术(nervesparing surgery)。
存在对用于神经成像的改良成像法和组合物的需要。
发明内容
本文公开的是用于使神经成像的组合物和方法。神经可以位于受试者的不同区域中。
本文还公开的是下述发现：使荧光染料与能够穿透神经轴突的病毒组分(例如，病毒、病毒蛋白质、衣壳)结合可以形成染料/病毒组分复合物，其可以穿透神经轴突，从而允许改良的神经细胞成像。一个实施方案提供了包括下述的组合物：
荧光染料；和
选自向神经的复制缺陷型病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳的病毒组分，
其中荧光染料与病毒组分结合，以形成能够穿透神经细胞的染料/病毒组分复合物。
在本文公开的这个和其他实施方案中，向神经的复制缺陷型病毒可以是例如减毒或灭活的病毒组分，其能够穿透神经细胞。在另一个实施方案中，组合物可以是包括荧光染料和病毒组分的疫苗，所述病毒组分选自向神经病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳。因此，另一个实施方案提供了疫苗，其包括：
荧光染料；和
选自向神经病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳的病毒组分，
其中荧光染料与病毒组分结合，以形成能够穿透神经细胞的染料/病毒组分复合物。
另一个实施方案提供了制备组合物的方法，其包括：
使荧光染料与病毒组分组合，所述病毒组分选自向神经的复制缺陷型病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳，
允许荧光染料与病毒组分结合，以形成能够穿透神经细胞的染料/病毒组分复合物。
另一个实施方案提供了用于使神经成像和/或诊断神经异常和/或状况的方法。该方法包括步骤(a)给受试者施用如本文公开的组合物，(b)允许染料/病毒组分复合物穿透神经细胞，(c)给受试者应用足够量的辐射能，从而使得染料发荧光，(d)手术中(intra-operatively)获得受试者的荧光图像。该方法可以包括观察荧光图像以观看受试者中的一条或多条神经，或观察荧光图像以确定是否横切了一条或多条神经的步骤。
因此，另一个实施方案提供了用于减少在外科手术程序过程中对受试者的医源性损伤的危险的方法，其包括：
(a)给受试者施用组合物，所述组合物包括：
荧光染料；和
选自向神经的复制缺陷型病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳的病毒组分，
其中荧光染料与病毒组分结合，以形成染料/病毒组分复合物；
(b)允许染料/病毒组分复合物穿透神经细胞；
(c)给受试者应用足够量的辐射能，从而使得染料发荧光；
(d)手术中获得受试者的荧光图像；和
(e)观察荧光图像以观看受试者中的一条或多条神经。
另一个实施方案提供了用于诊断神经状况的方法，其包括：
(a)给受试者施用组合物，所述组合物包括：
荧光染料；和
选自向神经的复制缺陷型病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳的病毒组分，
其中荧光染料与病毒组分结合，以形成染料/病毒组分复合物；
(b)允许染料/病毒组分复合物穿透神经细胞；
(c)给受试者应用足够量的辐射能，从而使得染料发荧光；
(d)手术中获得受试者的荧光图像；和
(e)观察荧光图像以确定是否横切了神经。
其他实施方案提供了试剂盒，其包含本文公开的组合物，连同根据本文描述的一种或多种方法使用组合物的说明书。在其他实施方案中，试剂盒包括一种或多种成分、试剂、染料、病毒、前体或可以用于制备本文公开的组合物的其他工具，连同根据本文描述的一种或多种方法使用组合物的说明书。
附图说明
图1示意性描述用于医学成像的系统；
图2是描述用于医学成像的算法的流程图，所述算法可以通过安装在计算机处理器上的软件执行；
图3A显示实施例3小鼠背部的荧光图像；
图3B是图3A相同小鼠背部的可见(白色)光图像，但没有荧光成像；
图3C是具有一些可见光照明的实施例3小鼠的暴露的脊髓的荧光图像；
图3D是接近于小鼠头部的相同脊髓的荧光图像，其中与脊髓会合的神经未用ICG/PBS/HSV-2ΔRR标记；
图4A显示在实施例4整只小鼠(仰卧)的腹面观中的ICG/PBS/HSV-2ΔRR(染料/病毒组分复合物)荧光；
图4B是使用荧光和白光成像显示实施例4小鼠背部(背面观)的图像，所述小鼠进行解剖以显示脊柱和来自左爪的荧光神经；
图4C是图4B的相同小鼠的荧光图像；
图4D是下述的荧光图像：(i)仅以白光的从实施例4小鼠脊柱左侧解剖的荧光背根神经节，其中它的轴突的短区段在神经节的右侧上，和(ii)来自脊柱右侧的相应神经节，其右爪垫轴突未进行注射；
图4E是(i)图4D(i)的神经节和(ii)图4D(ii)的神经节的荧光图像；
图4F是来自图4E(i)的神经节的放大荧光图像；
图5A显示用于与荧光图像比较的兔左肢的解剖绘图；
图5B是显示ICG/HSV-2ΔRR复合物从趾垫注射部位向上行进到上足底外侧神经内的荧光图像；
图5C显示用于与荧光图像比较的兔右肢的解剖绘图；
图5D是以可见白光的，隐神经分离的区段的图像；
图5E是显示具有ICG/HSV-2ΔRR复合物荧光的隐神经分离的区段的荧光图像；
图5F和5H是分别显示前2个框(图5F)和原位神经(图5H)的隐神经切断的区段的荧光图像；
图5G和5I是显示图5F的隐神经切断的区段的荧光图像，但就UV灭活的ICG/PBS/HSV-2ΔRR病毒的LacZ基因染色；
图5J是用于与荧光图像比较的兔左肢的解剖绘图；和
图5K是实施例5兔左腿背方位的荧光图像。
具体实施方式
一个实施方案提供了用于神经成像的组合物。
在一个实施方案中，组合物包括用于医学成像的染料例如荧光染料。然而，许多染料不适合于使身体的特定部分例如神经成像，因为染料一般不能穿透神经细胞。本文公开的是下述发现：向神经病毒组分，即能够穿透神经细胞的病毒组分，可以用于使染料轴突运输穿过神经网络的部分或全部。这可以通过形成与病毒组分结合的染料复合物来实现。
      染料
如本文使用的，术语“荧光染料”或“染料”意指小分子或蛋白质或其他聚合物或大分子，在经由合适波长的辐射光能激发后，其通过发射在可见或近红外波长范围中的光而发荧光。
合适的荧光染料包括当暴露于辐射能例如光时发荧光的任何无毒染料。在特定实施方案中，染料是发射在近红外光谱中的光的荧光染料。在一些实施方案中，染料可能不是脂溶性的，而在其他实施方案中，它可以是脂溶性的。在特定实施方案中，染料是三碳菁(tricarbocyanine)染料，例如由Akorn，Inc.(Buffalo Grove，IL)销售的靛青绿(ICG)。ICG染料是FDA批准用于人使用的。在其他实施方案中，染料是infracyanine green。在其他实施方案中，染料选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、玫瑰红(Rose Bengal)、锥虫蓝、荧光金(fluoro-gold)、3-靛青绿-酰基-1，3-四氢噻唑-硫酮、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和其他荧光蛋白质。染料可以进行混合或组合。在一些实施方案中，可以使用染料类似物。“染料类似物”是已进行化学修饰但仍保留其在暴露于合适波长的辐射能时发荧光的能力的染料。
在一个实施方案中，染料是通过用相同但与绿色荧光蛋白基因融合的病毒蛋白质基因置换病毒蛋白质基因构建的、与病毒衣壳中的蛋白质共价结合的荧光蛋白质，例如绿色荧光蛋白。在一个实施方案中，绿色荧光蛋白与穿透神经细胞的向神经病毒蛋白质共价结合。
      病毒组分
在一个实施方案中，病毒组分选自病毒、病毒蛋白质和衣壳。在一个实施方案中，病毒蛋白质是衣壳或衣壳蛋白质。在一个实施方案中，病毒蛋白质是病毒蛋白质类似物。在一个实施方案中，病毒蛋白质和类似物独自能够穿透神经细胞，而不是病毒衣壳或完整病毒的部分。在另一个实施方案中，病毒蛋白质和类似物可以是自身穿透神经细胞的病毒衣壳或完整病毒的部分。类似物具有导致保守氨基酸改变的不同核酸结构，所述保守氨基酸改变尽管改变蛋白质或肽的一级序列，但它们通常不改变其功能。保守氨基酸取代一般包括在下述组内的取代：
甘氨酸、丙氨酸；
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
天冬氨酸、谷氨酸；
天冬酰胺、谷氨酰胺；
丝氨酸、苏氨酸；
赖氨酸、精氨酸；
苯丙氨酸、酪氨酸。
在一个实施方案中，病毒蛋白质及其类似物可以在染料与之结合前进行分离。
因为它在医学应用中使用，所以这种组分是无毒力或“复制缺陷型的”。如本文使用的，术语“复制缺陷型的”意指在靶细胞(神经细胞)中未能形成病毒颗粒(病毒后代)。在一个实施方案中，“复制缺陷型的”指不能复制。“复制缺陷型”病毒也可以指减毒病毒。在一个实施方案中，减毒病毒是具有低毒力的活病毒。在一个实施方案中，减毒病毒不复制。在另一个实施方案中，它们可以在受感染细胞中表达病毒抗原而不复制。在另一个实施方案中，减毒病毒缓慢复制且产生减毒病毒后代。
在一个实施方案中，病毒组分不是神经毒性的。
在一个实施方案中，病毒经由突变或通过热、光(例如，紫外线)或化学处理灭活而变成复制缺陷型的。杀死特定病毒所需的紫外(“UV”)线的剂量和波长是众所周知的。例如，http：//www.americanairandwater.com/uv-facts/uv-dosage.htm列出了在下表1中再现的，将抑制特定病毒的集落形成的紫外线剂量：
表1
      
在一个实施方案中，突变可以通过去除或灭活病毒复制、致细胞病变效应或细胞裂解所需的病毒遗传物质(例如关于RNA病毒的RNA，或关于DNA病毒的DNA)或蛋白质来实现。在一个实施方案中，病毒是狂犬病病毒突变体，例如Imovax(Sanofi Pasteur SA)。
在另一个实施方案中，复制缺陷型病毒是疫苗。如本文使用的，“疫苗”指改善针对疾病的免疫的无毒力组合物(包括一种或多种病毒组分)。在另一个实施方案中，疫苗可以用作病毒组分，例如疫苗(Merck&Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ)。因此，另一个实施方案提供了疫苗，其包括：
荧光染料；和
选自向神经病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳的病毒组分，
其中荧光染料与病毒组分结合，以形成能够穿透神经细胞的染料/病毒组分复合物。
病毒组分是向神经的，因为它穿透神经系统(例如，运动神经和/或感觉神经)的细胞。在一些实施方案中，病毒是轴突运输穿过神经系统的病毒。它应该是在人中使用安全的。因此，在特定实施方案中，能够穿透神经细胞且与染料结合的任何病毒组分都可以使用，只要它不是裂解的且优选不引起致细胞病变效应。
通过允许荧光染料与组分结合，从而形成也是向神经的染料/病毒组分复合物，即能够穿透神经系统的细胞，利用病毒组分的向神经性质用于成像。染料和病毒或病毒蛋白质之间的结合可以通过范德瓦尔斯(van der Waal)相互作用、偶极-偶极相互作用、阳离子-π相互作用相互作用、氢键合、离子键合、共价键合、或对于染料与病毒或病毒颗粒一起进入神经细胞足够的任何其他结合类型。在一些实施方案中，染料和病毒或病毒蛋白质可以直接结合，意指它们不通过染料及其结合的病毒或病毒颗粒之间的中间插入接头键合或结合。
在一个实施方案中，可以使用具有结合的荧光染料的向神经病毒的衣壳。
在一些实施方案中，病毒是疱疹病毒，并且可以是单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或其突变体。HSV-2感染神经系统的细胞。HSV-2基因ICP10编码由2个亚单位组成的核糖核苷酸还原酶(RR)，所述2个亚单位被称为大和小亚单位，分别由UL39和UL40基因编码。HSV-2ICP10基因(GeneBank编号M12700)在美国专利号6,013,265、6,054,131和6,207,168中描述。
在HSV-2突变体的一个例子中，核糖核苷酸还原酶(RR)结构域从ICP10中缺失。这个结构域的消除是有用的，因为其使所得到的突变体为复制缺陷的。
在一个实施方案中，病毒是突变形式的HSV-2，命名为ICP10ΔRR，其中ICP10的核糖核苷酸还原酶结构域由编码LacZ的基因置换。ICP10ΔRR病毒是本领域已知的(Peng等人，1996，Virology，216：184-196；LacZ-specific staining facilitates detection of cells that areinfected with the mutant virus)。ICP10ΔRR还可以具有RR基因的缺失，而不添加LacZ基因。人们可以用任何目的基因置换LacZ基因。其中RR结构域缺失或灭活的任何HSV-2突变体都可以是有用的。HSV-2ICP10ΔRR突变体在本文中将被称为HSV-2ΔRR。
在另一个实施方案中，病毒可以是疱疹水痘(herpes varicellae)(带状疱疹病毒)。
本领域已知的标准分子生物学程序可以用于制备合适病毒。示例性程序公开于Sambrook等人(1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)，Ausubel等人(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)，和Gerhardt等人(编辑，1994，Methods for General and MolecularBacteriology，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)中。
      组合物
如上所述，在一些实施方案中，组合物包括与复制缺陷型病毒组分结合的染料。在特定实施方案中，组合物包括与病毒蛋白质或灭活病毒结合的染料，如本文进一步描述的。组合物可以施用于受试者用于神经成像。
因此，另一个实施方案提供了制备组合物的方法，其包括
使荧光染料与病毒组分组合，所述病毒组分选自向神经的复制缺陷型病毒、向神经病毒的病毒蛋白质和向神经病毒的衣壳，
允许荧光染料与病毒组分结合，以形成能够穿透神经细胞的染料/病毒组分复合物。
在一些实施方案中，组合物包括未与病毒或病毒蛋白质结合的很少染料，或不包括未与病毒或病毒蛋白质结合的染料。例如，用于制备组合物的染料量可以滴定至所使用的病毒或病毒蛋白质的量。类似地，外来的(未结合的)染料可以通过透析或蔗糖梯度的使用从组合物中去除。
本文还公开的是本文描述的组合物的制备和使用。此种组合物可以由适合于施用于受试者的形式的单独活性成分组成，或组合物可以包括活性成分和一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种另外成分、或这些的一些组合。活性成分可以以生理学上可接受的酯或盐的形式存在于组合物中，例如与生理学上可接受的阳离子或阴离子组合，如本领域众所周知的。
如本文使用的，术语“活性成分”意指荧光染料与之结合的病毒组分，例如向神经病毒、病毒衣壳或病毒蛋白质。
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”意指活性成分可以与之组合，并且在组合后可以用于给受试者施用活性成分的化学组合物。
如本文使用的，术语“生理学上可接受的”酯或盐意指活性成分的酯或盐形式，其与组合物的任何其他成分相容，并且对于组合物施用于其的受试者无害。
本文描述的组合物的制剂可以通过药学领域中已知或其后开发的任何方法进行制备。一般而言，此种制备方法包括使活性成分与载体或一种或多种其他助剂(accessory ingredient)接触，并且随后若需要或希望，则使产物成形或包装成希望的单剂或多剂单位的步骤。
尽管本文提供的组合物的描述主要涉及适合于人施用的组合物，但本领域技术人员应当理解此种组合物一般适合于施用于所有类别的动物。修饰适合于人施用的组合物以便使得组合物适合于施用于各种动物是充分了解的，并且普通技术的兽医药理学家可以利用仅仅通常的实验法(即使利用的话)设计且执行此种修饰。预期组合物施用于其的受试者包括但不限于人和非人灵长类动物，和其他哺乳动物。
组合物可以以适合于肠胃外、静脉内、眼、鞘内或任何其他施用途径的制剂进行制备、包装或销售。
组合物可以散装、作为单次单位剂量或作为多个单次单位剂量进行制备、包装或销售。如本文使用的，“单位剂量”是包括预定量活性成分的组合物的任何不连续量。活性成分的量一般等于将施用于受试者的活性成分的剂量，或此种剂量的方便部分，例如此种剂量的一半或三分之一。
如本文使用的，组合物的“肠胃外施用”包括特征在于受试者组织的物理突破和通过组织中的破口施用组合物的任何施用途径。肠胃外施用因此包括但不限于，通过注射施用组合物、通过经由外科手术切口应用组合物，通过经由组织穿透性非外科手术伤口应用组合物等。具体地，预期肠胃外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
适合于肠胃外施用的组合物制剂包括与药学上可接受的载体例如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。此种制剂可以以适合于弹丸施用或连续施用的形式进行制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型进行制备、包装或销售，例如在包含防腐剂的安瓿或多剂容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油或水媒介物中的乳剂、糊剂、和可植入的持续释放或生物可降解的制剂。此种制剂可以进一步包括一种或多种另外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥形式(即，粉末、颗粒或冻干的)提供，以用于在重构的组合物的肠胃外施用前用合适媒介物(例如，无菌无致热原水)重构。
可以施用于动物例如人的剂量范围是约102-约108、或约102-约104、或约103-约108病毒噬斑形成单位/克体重。在另一个实施方案中，剂量范围是例如约10-4mg-约2x 10-3mg染料/g体重)。例如，在下文实验部分中描述的动物实验用ICG染料和下述病毒量执行：(a)4.2x104pfu病毒/克体重用于小鼠，和(b)972.8pfu/克体重用于兔。
      成像法
一个实施方案提供了用于使受试者的至少一条神经成像的方法。图像可以手术中获得。因此，可以通过外科手术暴露其中待执行外科手术的区域或附近区域。该方法包括：(a)施用本文描述的组合物以形成染料/病毒组分复合物，(b)允许染料/病毒组分复合物穿透神经细胞；(c)将足够量的辐射能应用于区域，从而使得染料发荧光，(d)手术中获得荧光图像，和(e)观察荧光图像以确定荧光图像中至少一条神经的存在或不存在。
在一个实施方案中，除观察图像的其他方法外，“观察荧光图像”可以指检查静止图像(印刷的或在屏幕上的)或在视频监视器上实时检查。在一个实施方案中，通过使荧光染料与病毒组分(例如，病毒载体)结合而变得可能的神经的个别图像(即神经图)可以用于诊断目的和用于证明神经位置。在一个实施方案中，关于神经作图的一个用途是手术中的。预计这种技术可以用于染料标记神经以用于在荧光镜透视检查中使用，医生通常用于获得患者内部结构的实时移动图像的成像技术。例如，可以这样发生通过可获得的无论什么方便方法的外科手术视野的手术中显像，从而使得神经特别是其小分支的位置和/或识别不足以确保保留神经外科手术。在此种情况下，目前的技术革新的手术中荧光镜透视检查使用对于成功结果将是关键的。
基于下文报告的实验，估计染料荧光可以以穿过神经的逆行方式，以约2cm/小时或更快的速率移动。染料流动的这种快速可以允许组合物紧在进行成像前数小时(或更长时间)施用。组合物包括染料可以在成像前足够时间施用，从而使得染料行进到待成像的区域，并且在成像时存在于此种区域中。所需时间量可以依赖于神经成像应用和施用部位。作为例子，组合物可以在特定程序中成像前最高达或小于1、2、3、4、5、6、7或8小时施用，例如基于染料行进至成像部位需要的距离。在一个实施方案中，组合物在成像前不超过1、2或3小时施用。
通过观察荧光图像，外科手术团队可以确定图像中神经的不存在或存在。通常使用由可见光的常规外科手术视野照明，通过其大小、形状和肉眼能看到的位置鉴定神经。然而，通常神经特别是其小分支和其下组织之间的对比如此之弱，以致于如果没有通过促使神经发荧光提供的显著对比，那么它们根本不能观察到。通过观察荧光图像，外科手术团队可以进一步确定一条或更多条特定神经的位置。外科手术团队因此可以使用关于一条或更多条神经的存在/不存在或位置的信息，以确定他们将如何执行外科手术程序。例如，基于通过使用该方法获得的信息，外科手术团队可以基于认识到神经在那个区域中不存在而决定在受试者上其中他们较不可能疏忽地切割或通过外科手术接触特定神经的点上作出切口。
其他实施方案预期获得多个图像。多个图像可以彼此比较，以确定神经未受到损害例如被疏忽地切割。
得自所获得图像的信息可以帮助嫁接被横切的神经末梢。在横切的情况下，神经嫁接可以直接应用于末梢，以促进再生神经纤维的萌发。在这种情况下，由横切的神经末梢的荧光可见的光提供了引导通过神经嫁接的神经吻合术的靶。
      诊断法
另一个实施方案提供了例如在外科手术程序过程中诊断神经状况的方法，例如神经是否已经受损或横切，或被成功切除。在一个实施方案中，诊断法包括步骤(a)给受试者施用本文公开的组合物，(b)允许染料/病毒组分复合物穿透神经细胞；(c)给受试者应用足够量的辐射能，从而使得染料发荧光，(d)手术中获得受试者的荧光图像，和(e)观察荧光图像以观看受试者中的一条或多条神经和/或确定是否横切了一条或多条神经。
因此，通过观看神经的图像，用户可以确定具体神经是否已经被横切。在一些实施方案中，图像用于确定横切的神经是否已经校正(即切除)。
当非故意处理发生时或当它们无法以其他方式避免时，通过这些方法获得的图像可以用于帮助引导神经嫁接。在一些实施方案中，将在进行神经嫁接后观察图像，以证实神经已经成功切除。
通过观看根据所公开方法获得的图像，技术人员将能够确定具体神经是否被横切。例如，锯齿状线可以指示横切。类似地，如果神经在第一个图像中看起来比较后图像中更长或更宽，那么这也可以指示神经已经被横切。相反，如果神经在较后图像中看起来比较早图像中更长或更宽，那么这可以指示它已经被切除。因此，在一些实施方案中，该方法预期获得多个图像。
      用于成像的设备
一旦施用，组合物中的荧光染料就受激发而发荧光，并且它发射的光通过照相机捕获。合适设备是SPY系统(Novadaq TechnologiesInc.，Mississauga，加拿大)，或如美国专利号6,915,154中描述的。
一般地，合适设备具有能够激发荧光染料的光源和能够捕获所发射的染料荧光的照相机。
图1举例说明适合于激发荧光染料且使荧光染料成像的系统的例子。在特定实施方案中，电源110给热电冷却器和控制器120、光能源130和控制器/定时电路140提供能量。控制器120控制光能源130的温度。例如，二极管激光器的温度影响其操作波长(例如，0.3nm改变/摄氏度)。在一些实施方案中，如本文描述的，光能源130可以不是二极管激光器，并且因此控制器120可能不是必需的。控制器/定时电路140通过计算机150使光能源130与检测器/照相机100合拍。它还包括在计算机150可读介质上的图像加工软件。计算机150与照相机100和显示器160电子通信。显示器160接受来自计算机150的图像数据并且显示所述图像数据。如上所述，在一些实施方案中，光能源130是激光器。它具有通过其传送光能的纤维170。纤维170将光传导给照明透镜180，当机械快门190打开时，光经过所述照明透镜180朝向靶视野。屏障滤波器(barrier filter)210可以用于过滤在荧光染料在其下激发的波长上或下的波长范围中从视野发出的光。在其他实施方案中，光能源130可以是LED。它将直接照明视野中的目的组织(即，可能不需要纤维170)。照相机100捕获在染料激发后由其发射的辐射，并且将检测出的图像数据传送给计算机150。透镜180、纤维170和照相机100是成像头230的部分。头230可以是铰接头(articulating head)。在一些实施方案中，头230进一步包括距离传感器/聚焦指示器220。该系统的组分在下文进一步描述。
在特定实施方案中，以足以促使荧光染料发荧光从而允许目标组织成像的量，将辐射能应用于目标组织。在一些实施方案中，光能的来源是激光器。激光器可以由驱动器和二极管组成。优选地，激光器是大功率激光二极管(HPLDs)。HPLDs的例子包括本领域众所周知的AlInGaAsP激光器和GaAs激光器。此种来源可以是单个二极管(单个发射器)，或由边缘发射半导体芯片制成的二极管-激光器条(diode-laser bars)。激光器可以任选包括滤波器例如带通滤波器，以确保所发射的辐射具有基本上一致的波长。激光器可以包括用于发散激光光束的光学器件。光学器件可以是可调节的，从而允许照明视野中的变动。可调节的光学器件也可以用于提供在给定区域(例如视野)上的均匀照明。
在一些实施方案中，来源输出是连续或准连续(quasi continuous)的。在其他实施方案中，激光输出是脉冲的。脉冲输出可以通过使用脉冲发生器与图像采集同步。在一些实施方案中，激光脉冲可以持续至少3飞秒。在一些实施方案中，激光输出持续约30秒。在其他实施方案中，激光输出持续约0.5秒-约60秒。关于脉冲激光器的合适重复频率可以在下述任何一种的范围中：约1Hz-约80MHz、约10Hz-约100Hz、约100Hz-约1kHz、约1kHz-约100kHz、约100kHz-约80MHz。在一些实施方案中，激光器可以在约1.8、约2.2或约2.5瓦的功率输出下操作。在其他实施方案中，激光器可以在约1-约4瓦范围中的功率输出下操作。在另外其他的实施方案中，平均功率小于5瓦。
在一些实施方案中，能源是具有合适滤波器的白炽光，以便提供合适波长的光，以诱导荧光染料发荧光。在另外其他的实施方案中，光源是发光二极管(LED)。
在一些实施方案中，辐射能可以具有在150nm-1500nm范围中的波长。能量可以由红外光组成。在一些实施方案中，激发光具有约805nm的波长。在特定实施方案中，激发光具有在约805nm-850nm范围中的波长。在一个实施方案中，激发光能量在比发射波长短的波长即检测波长下施用。激发光能量可以扩散地施用，以便不损害受照射组织。在一些实施方案中，激发光在约7.5cm x 7.5cm的面积上施用。在其他实施方案中，光在约1cm x 1cm-约20cm x 20cm范围中的面积上施用。在一个实施方案中，面积是约25-100cm2。如上所述，在一些实施方案中，可以使用多种染料。在这些实施方案中，可以使用多个光源，例如第一个激光器以激发第一种染料和第二个激光器以激发第二种染料。技术人员将理解光源将被选择或配置为激发特定染料。在其他实施方案中，单个光源可以被配置为激发多种染料，例如通过交替在其下发射能量的波长。
成像头230可以包含光传感器例如照相机100。图像采集可以使用能够检测荧光信号的任何传感器来达到。例子包括基于硅的传感器、复合金属氧化物半氧化物(semi oxide)(CMOS)传感器和照相软片。在一个实施方案中，传感器包括照相机，例如电荷耦合设备(CCD)。CCD的例子包括Hitachi KP-M2；KP-M3(Hitachi，Tokyo，日本)。
照相机可以包含用于使图像聚焦的装置。特定实施方案包括用于使图像聚焦的手动装置。其他实施方案包括使图像聚焦的自动装置。照相机可以进一步包含允许放大图像视野(image field)的透镜系统。
在一些实施方案中，照相机和激光器的相对定位是固定的，以便增强清晰度且使本底噪声降到最低。在这些实施方案中，激光器位于就激光器和照相机的轴而言小于约85°的角度上。在其他实施方案中，激光器位于就激光器和照相机的轴而言约20°-约70°的角度上。在一些实施方案中，激光器位于就激光器和照相机的轴而言大于约85°的角度上。此种角度可以是例如90°。
在特定实施方案中，照相机将捕获的图像转发给模拟-数字转换器，并且随后通过在计算机上运行的图像捕获和加工软件。图像可以贮存于任何合适介质中，例如硬盘驱动器、光盘、磁带中。照相机还可以将图像导向电视/VCR系统，从而使得图像可以实时显示、记录且在稍后时候回放。因此，成像可以实时或延迟执行。
在特定实施方案中，计算机150是包括至少512兆字节随机存取存储器(RAM)和至少10千兆字节存储器的个人计算机。在一些实施方案中，计算机150可以包含Pentium IV处理器(Intel，Santa Clara，CA)。在一些实施方案中，计算机150还可以具有CD和DVD驱动器。驱动器可以具有读和写功能性。该系统还提供图像处理软件。
在特定实施方案中，内窥镜可以用于激发组合物中的荧光染料并且检测其荧光，例如用于介入应用。它包括传感器和辐射能来源。内窥镜可以包含光学纤维。在特定其他实施方案中，可以使用包括传感器和辐射源的显微镜，例如外科手术显微镜。在一些实施方案中，传感器包括摄像机。在特定实施方案中，传感器可以以至少10/秒、至少15/秒、至少20/秒、至少30/秒、或至少50/秒的速率捕获图像。因此，特定实施方案预期多个图像。在其他实施方案中，本发明预期一个图像。
图2举例说明成像法的一个实施方案。这种方法可以通过在计算机可读介质、硬件或固件上存储的程序指令执行。(技术人员将理解此种软件包括在计算机可读介质上存储的指令)。当执行时，如下所述软件程序给计算机处理器提供指令。技术人员将进一步理解如本文所述计算机与激光器、传感器和显示器通信。
在开始(步骤10)时，可以向用户提供多个对话框或其他常见用户界面范例。例如，用户可能被询问他是否希望开始新研究(步骤20)。如果用户指示他希望如此，那么他可以得到指示输入或以其他方式选择患者用于研究。例如，用户可以得到提示从与数据库连接的列表中选择名字，所述数据库是计算机可访问的。可替代地，他可以得到提示输入患者标识符。计算机随后可以访问数据库以确定与患者有关的另外信息的存在，并且优选获得此种信息。在优选实施方案中，软件要求用户输入或以其他方式选择关于患者名字、姓氏和ID号字段的值。最优选地，输入或以其他方式加载足够信息，从而使得图像可以根据医学数字成像和通信(Digital Imaging and Communications in Medicine)(DICOM)标准进行存储。DICOM标准是DICOM标准委员会及其许多国际工作组的产物。日常运转由美国国家电气制造商协会(NationalElectrical Manufacturers Association)(Rosslyn，VA)管理。该标准可在网站http：//medical.nema.org/上公开获得，并且整体引入本文作为参考。
在输入患者数据后，监视器或其他显示器显示由与计算机通信的照相机或其他传感器捕获的图像(步骤40)。此时，用户可以改变照相机的位置、方向、放大率(gain)或其他参数，以获得所需患者视图。
可替代地，用户可以在开始10时选择继续研究(步骤25)。在此种指示后，过程进行至步骤40。
一旦显示了图像，用户就得到提示以指示他是希望拷贝序列(步骤35)还是获得序列(步骤50)。术语“序列”指与实时图像相关的数据，所述实时图像由与计算机通信的照相机或其他传感器捕获。一旦用户在步骤50中指示他希望获得来自传感器的图像，计算机就促使激光器开启，并且它将得自传感器的视频序列存储于RAM中(步骤70)。实时图像继续在显示器上显示。用户随后被询问他是否希望关闭激光器(步骤80)。如果他指示他希望如此，那么计算机促使激光器切断(步骤100)。可替代地，如果用户未指示他希望切断激光器，那么计算机测定从步骤60开始是否已经过预定时间量(例如，34秒)。一旦已经过预定时间量，计算机就促使激光器切断。视频序列继续存储于RAM中，直至激光器关闭。一旦激光器关闭，用户就被询问他是否希望保存序列(步骤105)。如果他指示肯定，那么序列被存储于硬盘驱动器(步骤115)或其他介质中。
现在回到步骤40用于描述软件的目的，一旦显示了实时图像，用户就被询问他是否希望拷贝序列(步骤35)。如果用户指示他希望如此，那么选择与研究相关的图像且烧制在光盘或其他选择的介质上(步骤55)。可替代地，软件可以允许用户选择特定图像用于存储在选择的介质上。优选地，一个或多个图像以与图片存档和计算机系统相容的格式例如以DICOM格式存储。
在另一个实施方案中，照相机还可以将图像导向LCD监视器或其他显示器(例如，电视/VCR系统等)，从而使得一个或多个图像可以实时显示和/或记录且在稍后时候回放。因为一个或多个图像可以用于引导所有或部分外科手术程序，所以外科手术程序期间自始至终可以显示一个或多个图像。在其他实施方案中，一个或多个图像可以显示小于外科手术程序的整个期间。在另一个实施方案中，软件允许在采集后处理图像，例如缩放、选择目标区、改变亮度和对比，且同时显示多个图像。
在一些实施方案中，该系统包括无菌帘。无菌帘覆盖铰接臂(articulating arm)以预防受试者的污染或使受试者的污染危险降到最低。无菌帘可以在其中具有开口。开口可以由能够传送辐射能的材料覆盖，所述辐射能例如由激光器产生的红外光。
      定义
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用于指冠词的一个或超过一个(即至少一个)语法对象。例如，“一个元件”意指一个元件或超过一个元件。“多个”意指至少2个。
如本文使用的，“受试者”指任何动物。动物可以是哺乳动物。合适哺乳动物的例子包括但不限于，人和非人灵长类动物、犬、猫、羊、牛、猪、马、小鼠、大鼠、兔和豚鼠。
“ICG”是靛青绿，批准用于人使用的生物相容性近红外荧光染料。
“PBS”是磷酸缓冲盐水。
“HSV-2”是单纯疱疹2型病毒。
“HSV-2ICP10ΔRR”是其中野生型HSV-2病毒中的RR结构域缺失或灭活的突变病毒。
术语“pfu”是噬斑形成单位，在适合于这种测试的细胞或细菌培养系统中形成一个噬斑(一个受感染区域)所需的最低限度病毒数目。
“S.C.”是脊髓。
提供下述实施例仅用于举例说明的目的，并且不意欲是限制性的，除非另有说明。因此，本发明决不应解释为受限于下述实施例，而是应解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变动。
      实施例
      实施例1：病毒突变体的制备
HSV-2ΔRR突变体可以如Laing，J.等人，Intranasal administrationof the growth compromised HSV-2vectorΔRR prevents kainate inducedseizures and neuronal loss in rats and mice，Mol.Ther.2006年5月；13(5)：870-881，和Peng等人，Virology 216：1841996中所述进行制备。
      实施例2：组合物的制备
制备2种母液：
(1)ICG母液：溶于0.8ml H2O中的25mg ICG
(2)HSV-2ΔRR病毒母液：溶于20μl磷酸缓冲盐水(PBS)中的107pfu。
使20μL病毒母液与20μL ICG母液组合，并且在4℃保持1小时(ICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物)。
      实施例3：动物研究
实施例3是用单独的荧光染料与和病毒结合的荧光染料比较的成像比较。除非另有说明，所有图像都是得自CCD照相机的数字图像。
通过卤烷吸入使小鼠(60g)暂时麻醉。用10μL ICG、磷酸缓冲盐水(PBS)和病毒突变体HSV-2ΔRR(“ICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物”)注射小鼠的右爪垫。用作为对照的10μl ICG/PBS混合物注射小鼠的左爪垫。相同浓度的ICG存在于2种混合物中。
爪垫注射后2小时，使小鼠麻醉且随后用戊巴比妥钠的腹膜间(interperitoneal)注射实施安死术。首先获得完整小鼠的ICG荧光图像，并且随后获得在解剖的各个阶段时的ICG荧光图像。
结果
图3A是暴露了脊柱和背部肌肉的实施例3小鼠背部的荧光图像。具有单独注射的ICG的左爪荧光局限于左爪自身。用ICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物注射的右爪自身是荧光的，但荧光向上延伸至爪神经的背根神经节(即，神经元细胞体)位于其中的脊柱。ICG-PBS-HSV-2ΔRR复合物已沿轴突向上从爪行进到在脊柱上的轴突细胞体。ICG-PBS-HSV-2ΔRR的爪垫注射已一直跟踪爪垫神经到脊柱。图3B描绘与图3A相同的视图，但作为可见(白色)光图像，而没有荧光成像。
图3C是实施例3小鼠的暴露的脊髓的荧光图像(连同一些可见白光照明)。接近它在其中与脊髓会合的荧光神经(起因于注射到爪垫内)的部分由3个箭标指示。图3D是接近于小鼠头部的相同脊髓的荧光图像，其中与脊髓会合的神经未用ICG/PBS/HSV-2ΔRR标记。图3D显示如由箭标所示的，仅其轴突吸收且转运荧光病毒的爪垫神经而不是其他无关神经是标记的。在图3C和图3D中，标记310指示将神经从在312处指示的脊髓拉开的镊子的位置。脊髓在位置314处切割(仅图3C)。小鼠头部一般处于朝向图3C的右手侧，而小鼠尾部一般指向该图的左手侧。
      实施例4：动物研究
实施例4是与病毒结合的荧光染料与无注射比较的比较，以显示荧光局限于与脊柱左侧连接的来自左爪的神经。
通过卤烷吸入使小鼠(50g)暂时麻醉。小鼠用10μlICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物注射到左爪垫内，并且不注射任何东西到右爪垫内作为对照。
爪垫注射后2小时，用戊巴比妥钠的腹膜内注射使小鼠麻醉。随后，使心脏暴露，切割颈静脉，并且将10ml等渗盐水缓慢注射到心脏的气室(aerial chamber)内，以放血(exanguate)且杀死小鼠。放血(exanguation)的目的是减少起因于在爪垫注射的弹丸中的ICG分子的本底组织荧光，所述ICG分子未与病毒结合且进入淋巴系统中。与第一只小鼠一样，首先获得完整小鼠的ICG荧光图像，并且随后获得在解剖的各个阶段时的ICG荧光图像。
结果
图4A显示在整只小鼠(小鼠仰卧)的腹面观中的ICG/PBS/HSV-2ΔRR荧光图像。左爪垫注射导致在整个左爪中且向上进入左腿内的荧光。未注射的右爪垫、右爪和腿是无荧光的。
图4B显示使用荧光和白光成像的小鼠背部(背面观)，所述小鼠进行解剖以显示脊柱和来自左爪的荧光神经。标记320指示来自左爪的神经的位置。脊髓位置在322处指示。图4C显示相同小鼠的单独荧光图像。荧光局限于脊柱的左侧，而在右(未注射的爪垫)侧上无荧光。
图4D显示(i)仅以白光的从小鼠脊柱左侧解剖的荧光背根神经节330，其中它的轴突的短区段在神经节的右侧上，和(ii)来自脊柱右侧的相应神经节332；右爪未进行注射。图4E显示(i)图4D(i)的神经节的荧光图像，和(ii)图4D(ii)的神经节的荧光图像。图4F显示来自图4E(i)的神经节的放大的、较低辐照度图像。图4D-4F显示左爪垫的注射标记左爪神经一直到其背根神经节，并且在相应右背根神经节中无荧光，这是因为右爪垫未进行注射。
      实施例5：UV灭活的病毒
这个实施例证实通过UV照射灭活从而使得其复制缺陷的病毒的成像应用。
通过使25mg ICG溶解于0.8ml H2O中制备ICG母液。用溶于20μl PBS中的107pfuHSV-2ΔRR制备病毒母液。
使50μL病毒母液与50μl ICG母液组合到一个瓶内，并且允许在4℃静置1小时(“ICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物”)。上文的ICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物用在约350nm的UV辐射灭活约15分钟。
通过卤烷吸入使荷兰黑带兔(2.57kg)暂时麻醉。兔用100μLICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物注射到右爪的内侧趾垫内，并且用100μlUV灭活的ICG/PBS/HSV-2ΔRR混合物注射到左爪的内侧趾垫内。执行爪垫注射后4又1/2小时，使兔麻醉且随后用戊巴比妥钠的腹膜内注射实施安死术。解剖首先在右肢上执行，在趾垫ICG/PBS/HSV-2ΔRR注射部位上约5cm开始。
图5A是用于与荧光图像(图5B)比较的兔肢的解剖绘图，并且被呈现以举例说明通过在位置340处的解剖剪升高的右腿足底内侧神经中的ICG荧光的位置。来自附近血管的荧光也是可见的。在趾垫注射部位342处的荧光在图5B的较低部分中可见。
图5C是兔右肢的内侧面的解剖绘图。箭标指示与血管相邻的大神经。对UV灭活的HSV-2-ΔRR病毒已注射到其内的左肢执行相同解剖程序。显示了以可见光(图5D)和具有ICG荧光(图5E)的隐神经分离的区段的图像，其中白色箭标指示神经的位置。
切断分离的神经区段且置于显微镜载玻片上。在用等渗盐水润湿其后，应用盖玻片。区段的ICG荧光可以在图5F中看见，如由SPY系统记录的(由Novadaq Technologies Inc.，Mississauga，加拿大销售)。神经ICG荧光也已在10X放大率下原位记录(图5H)。随后用染色LacZ(置换从HSV-2病毒中切下的基因区段以使其减毒的基因)的酶(C12-FDG)染色神经区段。染色的神经的显微照片在2个放大率下显示(图5G，4X放大率，和图5I，10X放大率)，指示在神经中病毒的存在。
图5K显示实施例5兔左腿背方位的荧光图像，它的解剖绘图显示于图5J中。图5J中的箭标指向上肢中的大神经。图5K证实ICG/PBS/HSV-2ΔRR从趾垫注射部位向上行进到上足底外侧神经(upper plantar nerve)内。ICG UV灭活的病毒移动进入推测是坐骨和胫神经(箭标)的小分支内，这允许甚至这些小神经的成像。箭标在趾垫注射部位上约11cm，指示荧光UV灭活的病毒行进在趾垫上11cm，从而允许使甚至遥远的神经成像。图5K右侧也可能显示血管中的荧光。
如对于本领域技术人员显而易见的，可以进行许多修饰和变动。本文描述的具体实施方案仅提供用于举例，并且不以任何方式意味着是限制性的。说明书和实施例仅意欲被视为示例性的，而本发明的真实范围和精神由下述权利要求指示。

Claims (8)

1.一种组合物，其包括：
荧光染料；和
包含疱疹病毒的向神经的复制缺陷型病毒；
其中所述荧光染料与所述病毒结合，以形成能够穿透神经细胞的染料/病毒组分复合物。
2.权利要求1的组合物，其中所述染料选自靛青绿、infracyaninegreen、绿色荧光染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、玫瑰红、锥虫蓝、荧光金、3-靛青绿-酰基-1，3-四氢噻唑-硫酮、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和其他荧光蛋白质。
3.权利要求2的组合物，其中所述染料是靛青绿。
4.权利要求1的组合物，其中所述病毒包括HSV-2ICP10ΔRR。
5.一种用于减少在外科手术程序过程中对受试者的医源性损伤的危险的方法，其包括：
(a)给所述受试者施用组合物，所述组合物包括：
荧光染料；和
包含疱疹病毒的向神经的复制缺陷型病毒，
其中所述荧光染料与所述病毒结合，以形成染料/病毒组分复合物；
(b)允许所述染料/病毒组分复合物穿透神经细胞；
(c)给所述受试者应用足够量的辐射能，从而使得所述染料发荧光；
(d)手术中获得所述受试者的荧光图像；和
(e)观察所述荧光图像以观看所述受试者中的一条或多条神经。
6.权利要求5的方法，其中所述荧光染料选自靛青绿、infracyaninegreen、绿色荧光染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、玫瑰红、锥虫蓝、荧光金、3-靛青绿-酰基-1，3-四氢噻唑-硫酮、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和其他荧光蛋白质。
7.权利要求6的方法，其中所述荧光染料是靛青绿。
8.权利要求5的方法，其中所述复制缺陷型病毒包括HSV-2ICP10ΔRR。
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Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070122344A1 (en) 2005-09-02 2007-05-31 University Of Rochester Medical Center Office Of Technology Transfer Intraoperative determination of nerve location
US20080161744A1 (en) 2006-09-07 2008-07-03 University Of Rochester Medical Center Pre-And Intra-Operative Localization of Penile Sentinel Nodes
US8498695B2 (en) 2006-12-22 2013-07-30 Novadaq Technologies Inc. Imaging system with a single color image sensor for simultaneous fluorescence and color video endoscopy
US8406860B2 (en) 2008-01-25 2013-03-26 Novadaq Technologies Inc. Method for evaluating blush in myocardial tissue
JP5231625B2 (ja) 2008-03-18 2013-07-10 ノヴァダク テクノロジーズ インコーポレイテッド Ｎｉｒ画像およびフルカラー画像を獲得するための画像化システムおよびその作動方法
US10219742B2 (en) 2008-04-14 2019-03-05 Novadaq Technologies ULC Locating and analyzing perforator flaps for plastic and reconstructive surgery
EP2285421B1 (en) 2008-05-02 2018-04-11 Novadaq Technologies ULC Methods for production and use of substance-loaded erythrocytes for observation and treatment of microvascular hemodynamics
US8554579B2 (en) 2008-10-13 2013-10-08 Fht, Inc. Management, reporting and benchmarking of medication preparation
US10492671B2 (en) 2009-05-08 2019-12-03 Novadaq Technologies ULC Near infra red fluorescence imaging for visualization of blood vessels during endoscopic harvest
CA2829306C (en) 2011-03-08 2017-02-14 Novadaq Technologies Inc. Full spectrum led illuminator
EP2804523B1 (en) * 2012-01-18 2016-09-28 University of Utah Research Foundation Devices and systems for fluorescence imaging of tissue
JP6028096B2 (ja) 2012-06-21 2016-11-16 ノバダック テクノロジーズ インコーポレイテッド 血管造影及びかん流の定量化並びに解析手法
JP2015536181A (ja) 2012-10-26 2015-12-21 バクスター・コーポレーション・イングルウッドＢａｘｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ 医学的用量調製システムのためのワーク・ステーションの改善
KR102078768B1 (ko) * 2012-10-26 2020-02-19 백스터 코포레이션 잉글우드 의료 투여분 조제 시스템을 위한 개선된 이미지 취득
US9040019B2 (en) 2012-11-30 2015-05-26 General Electric Company Methods of detecting myelin basic protein
RU2664595C2 (ru) * 2013-05-23 2018-08-21 Конинклейке Филипс Н.В. Устройство для воздействия на кожу с адаптивной обратной связью по движению
US9625386B2 (en) * 2014-09-10 2017-04-18 Iwasaki Electric Co., Ltd. Imaging system
CN107209118B (zh) * 2014-09-29 2021-05-28 史赛克欧洲运营有限公司 在自体荧光存在下生物材料中目标荧光团的成像
US11107574B2 (en) 2014-09-30 2021-08-31 Baxter Corporation Englewood Management of medication preparation with formulary management
KR102012880B1 (ko) 2014-10-09 2019-08-22 노바다크 테크놀러지즈 유엘씨 형광-조정 광전용적맥파 측정기를 사용한 조직 내의 절대적인 혈류의 정량화
AU2015358483A1 (en) 2014-12-05 2017-06-15 Baxter Corporation Englewood Dose preparation data analytics
CA2975295A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-11 Novadaq Technologies Inc. Methods and systems for characterizing tissue of a subject
US10869592B2 (en) 2015-02-23 2020-12-22 Uroviu Corp. Handheld surgical endoscope
CA2978455A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 Baxter Corporation Englewood Pharmacy workflow management with integrated alerts
USD790727S1 (en) 2015-04-24 2017-06-27 Baxter Corporation Englewood Platform for medical dose preparation
AU2016351730B2 (en) 2015-11-13 2019-07-11 Novadaq Technologies Inc. Systems and methods for illumination and imaging of a target
EP4155716A1 (en) 2016-01-26 2023-03-29 Stryker European Operations Limited Image sensor assembly
US10744212B2 (en) * 2016-03-14 2020-08-18 General Electric Company Topical application of nerve labeling dyes for image-guided surgery
USD916294S1 (en) 2016-04-28 2021-04-13 Stryker European Operations Limited Illumination and imaging device
EP3469420A4 (en) 2016-06-14 2020-02-12 Novadaq Technologies ULC ADAPTIVE IMAGING METHODS AND SYSTEMS FOR IMPROVING LOW LIGHT SIGNALS IN MEDICAL VISUALIZATION
WO2018018160A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Novadaq Technologies ULC Methods and systems for characterizing tissue of a subject utilizing machine learning
CN106190841B (zh) * 2016-08-30 2018-12-18 刘长亮 一种神经网络电活动检测系统以及基于此系统的神经精神类药物的筛选方法
US11832797B2 (en) 2016-09-25 2023-12-05 Micronvision Corp. Endoscopic fluorescence imaging
US11350816B2 (en) 2020-09-13 2022-06-07 Micron Vision Corp. Portable and ergonomic endoscope with disposable cannula
WO2018058013A1 (en) * 2016-09-25 2018-03-29 Xiaolong Ouyang Endoscopic fluorescence imaging
US11684248B2 (en) 2017-09-25 2023-06-27 Micronvision Corp. Endoscopy/stereo colposcopy medical instrument
US11330973B2 (en) 2017-09-25 2022-05-17 Micronvision Corp Portable and ergonomic endoscope with disposable cannula
KR101911725B1 (ko) * 2017-01-16 2018-12-28 주식회사 코어파마 적색형광단백질을 발현하는 유전자 및 틴 에틸 에티오푸르푸린을 이용한 광역학 치료용 조성물 및 이를 이용한 광역학 치료방법
KR102306048B1 (ko) * 2017-01-30 2021-09-29 메디비콘 아이엔씨. 확산 반사 보정을 갖는 형광 추적제의 비침습 모니터링 방법
JP6931705B2 (ja) 2017-02-10 2021-09-08 ノバダック テクノロジーズ ユーエルシー オープンフィールドハンドヘルド蛍光イメージングシステムおよび方法
KR101970664B1 (ko) 2017-06-12 2019-04-19 (주)계림건축사사무소 탈부착식 패널 어셈블리
US11980342B2 (en) 2020-11-12 2024-05-14 Micronvision Corp. Minimally invasive endoscope
US11771304B1 (en) 2020-11-12 2023-10-03 Micronvision Corp. Minimally invasive endoscope
CN109628415A (zh) * 2018-12-13 2019-04-16 中国科学院深圳先进技术研究院 三级神经环路操纵组合物及动物三级神经环路操纵方法
WO2021016626A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Uroviu Corp. Disposable endoscopy cannula with integrated grasper

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007028032A2 (en) * 2005-09-02 2007-03-08 University Of Rochester Medical Center Intraoperative determination of nerve location

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1707499A1 (ru) * 1989-06-22 1992-01-23 Институт Физиологии Им.И.П.Павлова Способ окрашивани перехватов Ранвье
JP3896176B2 (ja) * 1996-05-21 2007-03-22 浜松ホトニクス株式会社 近赤外線蛍光トレーサーおよび蛍光イメージング方法
US6013265A (en) * 1996-10-22 2000-01-11 University Of Maryland, Baltimore Vaccine composition for herpes simplex virus and methods of using
US6054131A (en) 1998-01-16 2000-04-25 University Of Maryland Baltimore Vaccine composition for herpes simplex virus and method of using
US6399354B1 (en) * 1998-07-31 2002-06-04 President And Fellows Of Harvard College Replication-competent virus expressing a detectable fusion protein
US6915154B1 (en) 1999-09-24 2005-07-05 National Research Council Of Canada Method and apparatus for performing intra-operative angiography
AU2001247369A1 (en) * 2000-03-10 2001-09-24 Washington University Method for labeling individual cells
AU2002243751A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of herpes simplex virus
WO2003006658A1 (en) * 2001-07-13 2003-01-23 The General Hospital Corporation Mutant herpes simplex virus that expresses yeast cytosine deaminase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007028032A2 (en) * 2005-09-02 2007-03-08 University Of Rochester Medical Center Intraoperative determination of nerve location

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S.PYNER等: "Tracing functionally identified neurons in multisynaptic pathway in the hamster and rat using herpes simplex virus expressing green fluorescent protein"", 《EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY》 *
TOSTEN FALK等: ""A herpes simplex viral vector expressing green fluorescent protein can be used to visualize morphological changes in high-density neuronal culture"", 《ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *

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