DE68906458T2

DE68906458T2 - Lyophilisation von erythrozyten und dafuer brauchbare mittel.

Info

Publication number: DE68906458T2
Application number: DE8989304846T
Authority: DE
Inventors: Raymond Paul Goodrich; Christine Marie Williams
Original assignee: Cryopharm Corp
Current assignee: Terumo BCT Inc
Priority date: 1988-05-18
Filing date: 1989-05-12
Publication date: 1993-09-09
Anticipated expiration: 2009-05-13
Also published as: ZA893732B; IL90188A0; US5340592A; ES2055048T3; EP0342879B1; EP0342879A2; JPH0235078A; EP0342879A3; DE68906458D1; ATE89167T1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Biochemie und Medizin und insbesondere Verfahren zur Konservierung, Lagerung und Regenerierung von roten Blutzellen.
Blut ist eines der wichtigsten Gewebe des menschlichen Körpers und spielt eine überragende Rolle beim Sauerstofftransport aus den Lungen in die peripheren Gewebe. Träger dieser Rolle sind die Erythrozyten, d.h. die roten Blutzellen (RBZ). Der Sauerstoff wird den peripheren Zellen durch ein Austausch-Diffusionssystem zugeführt, das in den Lungen in einem roten eisenhaltigen Protein, das als Hämoglobin bezeichnet wird, bewerkstelltigt wird. verbindet sich Hämoglobin mit Sauerstoff, entsteht Oxyhämoglobin und nach der Abgabe des Sauerstoffs an die Gewebe wird dieses wieder zu Desoxyhämoglobin reduziert.
Die Membran der roten Blutzellen besteht aus zwei Hauptstrukturkomponenten, und zwar der Membrandoppelschicht und dem Zellskelett. Die Membrandoppelschicht, die geringe innere Festigkeit aufweist und unter Bläschenbildung rasch zerfällt, wird gebildet aus einer Lipiddoppelschicht und integralen Membranproteinen. Die andere Hauptkomponente, das Membranskelett, stabilisiert die Membrandoppelschicht und gewährleistet entsprechende Formbeständigkeit. Das Skelett ist mit der Doppelschicht in der Erythrozytenmembran möglicherweise durch Lipidprotein- sowie Protein-Protein-Assoziationen verbunden. Das Hämoglobin und die übrigen RBZ-Komponenten sind in der Erythrozytenmembran enthalten.
Bei Erwachsenen ist das Knochenmark aktiv an der Bildung neuer Erythrozyten beteiligt. Nach Eintritt der Erythrozyten in das Blut haben sie eine durchschnittliche Lebensdauer von ca. 120 Tagen. Beim Durchschnittsindividuum werden täglich ca. 0,83 % der Erythrozyten durch Phagazytose, Hämolyse oder mechanische Schädigung im Körper abgebaut und die erschöpften Zellen durch das Knochenmark erneuert.
Die Transfusion von Vollblut bzw. einer Vielzahl von Blutbestandteilen erfordert eine große Zahl verschiedenster Verletzungen und medizinischer Prozeduren. Nicht jeder Patient benötigt Vollblut und die Anwesenheit sämtlicher Blutbestandteile kann sogar zu medizinischen Problemen führen. Die einzelnen Blutfraktionen können unter speziellen Bedingungen gelagert werden, welche ihre biologische Aktivität zum Zeitpunkt der Transfusion am besten gewährleisten. Geht z.B. bei einem entsprechenden Verarbeitungszentrum Spenderblut ein, können von diesem Erythrozyten abgetrennt und nach verschiedenen Verfahren gelagert werden. Erythrozyten können in Citrat-Phosphat-Dextrose bei 4ºC bis zu fünf Wochen gelagert werden, und zwar als Einheitspackung mit einem Volumen von 200 bis 300 ml und einem Hämatokritwert (ausgedrückt als Volumenprozentanteil der geformten Teilchen) von 70 bis 90.
Erythrozyten können außerdem bei -30 bis -196ºC eingefroren und in diesem Zustand in einer Glycerinlösung bis zu sieben Jahren gelagert werden, jedoch nur bei tiefen Temperaturen, um ihr Überleben für Transfusionszwecke zu gewährleisten.
Beide Verfahren erfordern eine genaue Einhaltung der Lagerungstemperatur, um ein Zerreißen der Erythrozyten und damit den Verlust ihrer erwünschten biologischen Aktivität zu verhindern und eine Überlebensdauer von wenigstens 70 % der übertragenen Zellen von 24 Stunden zu gewährleisten, was als akzeptables Maß für die Verwendung in der Transfusionspraxis entsprechend den Normen der American Association of Blood Bank entspricht.
Es bestand daher der Bedarf an einem Verfahren zur Lagerung von roten Blutzellen, das unabhängig ist von der Einhaltung bestimmter Lagerungstemperaturen sowie anderer Lagerungsbedingungen. Ein solches Verfahren würde die Zugänglichkeit von Erythrozyten für medizinische Zwecke erleichtern.
Ein derartiges Verfahren war die Lyophilisierung (Gefriertrocknung) von roten Blutzellen, da diese über lange Zeit bei Raumtemperatur gelagert und für die Verwendung bei Säugern leicht regeneriert werden können. Bisher war es jedoch nicht möglich, Erythrozyten auf eine Art und Weise zu gefriertrocknen, die eine Regenerierung der Zellen unter Bildung von Erythrozyten mit intaktem Zellskelett und biologisch aktivem Hämglobin, d.h. mit lebensfähigen roten Blutzellen ermöglicht hätte. Wurden RBZ nach den früheren Verfahren lyophilisiert, wie z.B. in einer wässerigen Salzlösung oder einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), waren die regenerierten Zellen soweit geschädigt, daß sie zur Metabolisierung nicht mehr befähigt waren und kein Hämboglobin transportieren konnten. Mit Glutaraldehyd fixierte Erythrozyten, die lyophilisiert und wiederhergestellt worden waren, fanden vorwiegend bei Agglutinationstests Anwendung.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Lyophilisierung von Erythrozyten unter Bedingungen, welche die Struktur der Zellen sowie die biologische Aktivität des Hämoglobins aufrechterhalten, und gestattet die Regenerierung der lyophilisierten RBZ für die nachfolgende Verwendung zu therapeutischen Zwecken. Kurz zusammengefaßt betrifft das Verfahren das Eintauchen einer Vielzahl von Erythrozyten in eine abgepufferte wässerige, ein Kohlehydrat und/oder ein Polymer enthaltende, physiologische Kochsalzlösung, das Einfrieren und Trocknen der Lösung zur Gewinnung von gefriergetrockneten Erythrozyten, die bei ihrer Regenerierung einen erheblichen Prozentanteil an intakten und lebensfähigen RBZ liefern. Im allgemeinen umfaßt die Erfindung die Verwendung a) eines mit Erythrozyten biologisch verträglichen Kohlehydrats, das deren Membran zu durchdringen vermag und/oder b) eines wasserlöslichen Polymers, das mit Erythrozyten biologisch verträglich ist, zur Bildung eines Mediums für die Lyophilisierung von Erythrozyten.
Das erfindungsgemäße Kohlehydrat ist mit den RBZ biologisch verträglich, d.h. es sprengt diese nicht und vermag die Erythrozytenmembran zu durchdringen. Das Kohlehydrat kann unter Monosacchariden gewählt werden, da Disaccharide die Membran nicht ausreichend durchdringen. Monosaccharidpentosen und -hexosen werden vorzugsweise in Konzentrationen von 0,5 bis 4,0 Mol, insbesonderedoch von ca. zwei Mol verwendet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Xylose, Glucose, Ribose, Mannose und Fructose. Die Lyophilisierung der RBZ in einer derartigen Kohlehydratlösung erhöht den Rückgewinnungsgrad nach der Lyophilisierung auf wenigstens 50 % intakter Zellen im Gegensatz zum Einschmelzen bzw. zum Abbau der Zellmembran in wässerigen Lösungen in Abwesenheit eines Kohlehydrats. Derartige regenerierte Zellen können zur Herstellung von sogenannten Geistzellen ("ghost cells") für Agglutinationstests oder biochemische Untersuchungen, d.h. als Modellmembransysteme verwendet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung bewirkt die Zugabe eines wasserlöslichen biologisch verträglichen polymers zur Kohlehydratlösung eine erhebliche Steigerung des Prozentanteils des biologisch aktiven Hämoglobins, das in den Zellen zurückgehalten und nach der Regenerierung der RBZ nach der Lyophilisierung regeneriert wird. Das Polymer kann in der Lösung in Konzentrationen von 0,1 mM bis zur Sättigung vorliegen. Vorzugsweise hat das Polymer ein Molekulargewicht von wenigstens 10 K, insbesondere von 20 K bis 50 K, und liegt in einer Konzentration von 5 % bis zu seiner Löslichkeitsgrenze in der Lösung vor. Besonders vorteilhaft sind dabei Polymere, ausgewählt aus der Gruppe Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylpyrrolidonderivate sowie Dextran und Dextranderivate. Verwendet werden aber können auch Polymere auf Aminosäurebasis, z.B. Proteine, oder Hydroxyethylstärke. Die Verwendung der Kohlehydrat-Polymer-Lösung zur Lyophilisierung von RBZ ermöglicht die Rückgewinnung intakter Zellen, wobei ein erheblicher Prozentanteil biologisch aktives Hämoglobin enthält.
Wie aus dem Nachfolgenden hervorgeht, stellen die beschriebenen Lösungen Medien bereit, die es ermöglichen, RBZ den Belastungen durch Einfrieren, Sublimation und Regenerierung auszusetzen und gefriergetrocknete RBZ zu liefern, die regeneriert werden können, um Zellen bereitzustellen, die bei Säugetieren ihre normale Funktionsweise zeigen. Wenn nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben Gewichtsprozente.
Wie oben ausgeführt, stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein Medium für die Lyophilisierung und Regenerierung von intakten und biologisch aktiven Erythrozyten bereit. Obwohl die Medien neu sind, versteht es sich von selbst, daß die Vorrichtung und die dementsprechenden Techniken dem Fachmann auf dem Gebiet der Lyophilisierung verschiedenster Stoffe und insbesondere von Zellen bekannt sind und nur die konkreten Temperaturen und die in den Beispielen verwendete Vorrichtung hier beschrieben werden. Aufgrund dieser Beschreibung kann ein Fachmann die erfindungsgemäßen Medien in einem Verfahren zur Gefriertrocknung und Regenerierung intakter lebensfähiger RBZ verwenden.

Beispiel 1

Gepackte RBZ von unterschiedlichem Bluttyp wurden vom Blutspendezentrum eines Krankenhauses erhalten bzw. gesunden Blutspendern unter Verwendung von Heparin als Antikoagulans entnommen.
Eine Reihe von Proben dieser Blutzellen wurde mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (10 mM Mono- und Dinatriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 5 mM Dextrose und 10 mM Adenosin bei pH 7,2) dreimal unter Zentrifugieren bei 14.000 U/min während 6 bis 10 Sekunden gewaschen, um das Plasma und/oder die übrigen Zelltypen von den RBZ abzutrennen.
Proben der gepackten RBZ wurden dann in einem 2 M Glucose enthaltenden Lyophilisierungspuffer in einer PBS-Lösung bei einem pH von 7,2 suspendiert.
Danach wurde die Suspension in einen Kolben gefüllt, der anschließend in flüssigen Stickstoff (-196ºC) getaucht wurde, bis die Probe gefroren war. Der Kolben wurde in flüssigem Stickstoff gleichmäßig rotiert, um eine homogene Dispersion der Lösung an den Kolbenwänden zu erzielen.
Die eingefrorenen Proben wurden dann in eine Laborgefriertrocknungsanlage (Modell Labcono 4,5) verbracht, die bei einem Vakuum von unter 100 um Hg bei einer Innenkammertemperatur von -56ºC arbeitete. Man ließ die Proben sorgfältig trocknen (6 bis 24 Stunden), bis sie kristallines Aussehen zeigten und sich spröde anfaßten, wonach man den Kolben sich wieder auf Raumtemperatur erwärmen ließ.
Die Proben wurden dann bei 37ºC unter Verwendung einer 1 M Saccharose enthaltenden Lösung in einer PBS-Lösung rehydratisiert. Die Rehydratisierungslösung wurde in einer Menge zugesetzt, die dem Ausgangsvolumen der Probe vor dem Trocknen entsprach.
Bei der Prüfung der Zellen mit Hilfe eines Lichtmikroskops wurde festgestellt, daß ca. 50 % der RBZ intakte Zellmembranen aufwiesen. Das Hämoglobin war jedoch nicht an die Zellen gebunden. Dennoch war es in der Lösung aktiv und wäre es in den Zellen anwesend, würde es als Sauerstoffüberträger wirksam sein. Die Wiederholung dieses Vorgangs mit Fructose- und Riboselösungen bei einer Konzentration von ca. 0,5 bis 4 Mol führte fast zu denselben Ergebnissen wie bei Verwendung gepufferter Xylose- und Mannoselösungen in einer Konzentration von ca. 0,5 bis 4 Mol.
Zur Lyophilisierung der RBZ wurden, wie in diesem Beispiel beschrieben, verschiedene Monosaccharide verwendet. Festgestellt wurde die Verteilung des Hämoglobins in der regenerierten Lösung. Oxyhämoglobin vermag den Sauerstoff zum Säugergewebe zu transportieren. Methämoglobin ist ein Hämoglobin, das den Sauerstoff nicht zu binden vermag, jedoch in geringeren Konzentrationen vom Enzym NADH-Methämoglobinreduktase wieder in Oxyhämoglobin umgewandelt werden kann. Hämochrom ist irreversibel abgebautes Hämoglobin. Tabelle 1 zeigt die Regenerierung von über 90 % Oxyhämoglobin aus Zellen, die mit Lösungen von Ribose, Mannose, Fructose, Xylose und Glucose lyophilisiert worden waren. Es wurden keine erheblichen Abweichungen in der Zellregenerierung festgestellt und auch das Oxyhämoglobin wurde regeneriert, wenn die Konzentrationen dieser Monosaccharide in einem Bereich zwischen 0,5 und 4,0 M lagen. Tabelle 1 Kohlehydrate Hämochrom Ribose Mannose Fruktose Sorbose Galactose Xylose Glucose

Beispiel 2

Eine Anzahl von Proben gepackter RBZ, die wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten und gewaschen wurden, wurden in einem 2 M Glucose und entweder a) 30 mM 10 K-Polyvinylpyrrolidon oder b) 6 mM 40 K-Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Lyophilisierungspuffer in PBS bei einem pH von 7,2 suspendiert.
Danach wurde die Suspension in einen Kolben gefüllt, der anschließend in flüssigen Stickstoff (-196ºC) getaucht wurde, bis die Probe gefroren war. Der Kolben wurde in flüssigem Stickstoff gleichmäßig rotiert, um eine homogene Dispersion der Lösung an den Kolbenwänden zu erzielen.
Die eingefrorene Probe wurde dann in eine Laborgefriertrocknungsanlage (Modell Labcono 4,5) verbracht, die bei einem Vakuum von unter 100 um Hg bei einer Innenkammertemperatur von -56ºC arbeitete. Man ließ die Proben sorgfältig trocknen (6 bis 24 Stunden), bis sie kristallines Aussehen zeigten und sich spröde anfaßten, wonach man den Kolben sich wieder auf Raumtemperatur erwärmen ließ.
Die Proben wurden dann bei 37ºC unter Verwendung einer 1 M Saccharose enthaltenden Lösung in einer PBS-Lösung rehydratisiert. Die Rehydratisierungslösung wurde in einer Menge zugesetzt, die dem Ausgangsvolumen der Probe vor dem Trocknen entsprach.
Die Proben wurden bei 14.000 U/min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die rehydratisierten RBZ in der Suspension zu pelletieren. Die pelletierten Zellen wurden danach resuspendiert und nacheinander mit Lösungen gewaschen, die abnehmende Mengen an Polyvinylpyrrolidon (Durchschnittsmolekulargewicht 10 K bei 30 Gew.-%) in PBS mit Glucose und Adenosinlösung enthielten. So z.B. wurden die Zellen resuspendiert und in 30 mM, 15 mM und 5 mM 10 K Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Lösungen gewaschen. Danach wurden die Zellen in PBS resuspendiert.
Die Einarbeitung des oben beschriebenen Kohlehydrats in der gepuf ferten Lyophilisierungslösung in das Polymer führte zu überraschenden Ergebnissen nicht nur in der Hinsicht, daß die Regenerierung der intakten Zellen bei 52,9 ± 7,9 % gehalten werden konnte, sondern auch darin, daß die Lösung, welche eine Hämoglobinretention seitens der Zellen von 27,4 bis zu 42,2 % bei 10 K-PVP und von 57,3 bes zu 65,5% bei 40 K-PVP ermöglichte, wobei mehr als 80 % des Hämoglobins auf Oxyhämoglobin entfielen. Weitere Tests ergaben, daß eine Lösung mit 2 M Glucose für 24 K-PVP bei einer Konzentration von 8 mM und 30 mM Glucose-1-phosphat sogar noch zu besseren Ergebnissen im Hinblick auf die Regenerierung sowohl der Zellen als auch des Hämoglobins führt.

Beispiel 3

Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde mit verschiedenen Kohlehydraten anstelle von Glucose im Lyophilisierungspuffer bei zwei verschiedenen Polyvinylpyrrolidonkonzentration wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Kohlehydrat Zellregenerierung, % Hb-Regenerierung, % Galactose Mannose Xylose Fructose Glucose

Beispiel 4

Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren (unter Verwendung von 2 M Glucose als Kohlehydrat) wurde wiederholt, wobei Polyvinylpyrrolidon mit anderen Molekulargewichten und Konzentrationen als im Lyophilisierungspuffer des oben beschriebenen Beispiels eingesetzt wurde. Alle übrigen Bedingungen entsprachen Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Die mit MCHC bezeichnete Spalte bezeichnet den durchschnittlichen Zell-Hämoglobingehalt der regenerierten Zellen. Der MCHC-Wert normaler RBZ beträgt 34 ± 2. Tabelle 3 belegt, daß PVP bei einem Molekulargewicht von 10 bis 40 K in Konzentrationen von 3 bis 30 mM verwendet werden kann. PVP mit einem Molekulargewicht von 40 KT hat eine Viskosität von ca. 2,6 bis 3,5 kgm.&supmin;¹s&supmin;¹ (26 bis 35 Poise) und 40 K-PVP hat eine Viskosität von ca. 2,8 bis 3,2 kgm.&supmin;¹s&supmin;¹ (28 bis 32 poise). Tabelle 3 Molarität % Konzentration Hb-Regenerierung, %

Beispiel 5

Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch andere Polymere als Polyvinylpyrrolidon im Lyophilisierungspuffer verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4 Polymer % Konzentration Hb-Regenerierung Dextran Dextranphosphat Dextransulfat Ficoll Fischgelatine Dextrin Albumin

Beispiel 6

Proben von gepackten RBZ wurden erhalten und gewaschen wie in Beispiel 1. Diese Zellen wurden in einem Lyophilisierungspuffer mit 20 * 24 K-PVP (8 mM) und 2 M Glucose in PBS suspendiert. Danach wurden die Proben, wie in Beispiel 2 beschrieben, lyophilisiert und regeneriert, wobei jedoch für die Regenerierung der Zellen unterschiedliche Lösungen verwendet wurden. War Wasser die einzige Regenerierungsflüssigkeit, kam es innerhalb von 30 Minuten nach der Regenerierung zur Zellysis. Eine isotonische Regenerierungslösung, wie z.B. PBS oder PBSGA (PBS mit 5 mM Glucose und 10 mM Adenosin) ergab eine Verbesserung ebenso wie die Verwendung von Reverse-PBS, bei der anstelle von Na-Salzen K-Salze verwendet wurden. Starke Verbesserungen ergaben Konzentrationen von bis zu 20 % 10 K- oder 24 K-PVP in der Regenerierungslösung.
Die Verwendung eines Kohlehydrats in einer minimalen Konzentration von wenigstens 250 mM, vorzugsweise 0,05 M und insbesondere wenigstens 0,25 M, bewirkte eine bessere Zellmorphologie nach der Regenerierung. Für diese Zwecke können sowohl Mono- als auch Disaccharide verwendet werden, obwohl Glucose, Mannose, Trehalose und Saccharose die bevorzugten Kohlehydrate sind, insbesondere jedoch Saccharose. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt, wobei sämtliche Lösungen von Kohlehydrat und Polymer in PBS gebildet wurden. Tabelle 5 Lösungsmittel Zellregenerierung % Hb-Regenerierung Wasser Reverse-PBS Glucose Mannose Trehalose Saccharose Saccharose
Aufgrund der obigen Beschreibung kann ein Fachmann leicht die Hauptmerkmale der Erfindung feststellen und, ohne von Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen, diese an die verschiedensten Verwendungszwecke und Bedingungen anpassen. Obwohl hier bestimmte Bedingungen verwendet wurden, haben diese nur beispielhaften Charakter und schränken sie nicht ein.

Claims

1. Verfahren zur Lyophilisierung von eine Zellmembran aufweisenden Erythrozyten, das folgende Stufen umfaßt:

a) Eintauchen einer Vielzahl von Erythrozyten in eine Lösung, die ein Monosaccharid enthält, das die Erythrozytenmembran zu durchdringen vermag, in einer Konzentration von 0,5 bis 4 M,

b) Einfrieren der Lösung und

c) Trocknung der Erythrozyten durch Sublimierung des Wassers.

2. Verfahren zur Lyophilisierung von Erythrozyten, das folgende Stufen umfaßt:

a) Eintauchen einer Vielzahl von Erythrozyten in eine wässerige Lösung, die folgende Komponenten enthält:

ein Monosaccarid in einer Konzentration von 0,5 bis 4 M und

ein Polymer mit einem Molekulargewicht von 10 K bis 360 K in einer Konzentration von 0,1 pM bis zur Sättigung der Lösung;

b) Einfrieren der Lösung und

c) Trocknung der Erythrozyten durch Sublimierung des Wassers.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polymer Polyvinylpyrrolidon oder Dextran ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Monosaccharid ausgewählt wird unter Pentosen und Hexosen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Monosaccharid ausgewählt wird unter xylose, Glucose, Ribose, Mannose und Fructose.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Monosaccharid in der Lösung in einer Konzentration von ca. 2 M vorliegt.

7. Medium zur Lyophilisierung von Erythrozyten, das eine Lösung darstellt, die folgende Komponenten umfaßt:

ein Monosaccarid in einer Konzentration von 0,5 bis 4 M und

ein Polymer mit einem Molekulargewicht von 10 K bis 360 K in einer Konzentration von wenigstens 0,1 mM.

8. Medium nach Anspruch 7, das außerdem noch durch ein oder mehrere Merkmale nach einem oder mehreren Ansprüchen 3 bis 6 definiert ist.

9. Verwendung

a) eines Kohlehydrats, das biologisch mit Erythrozyten verträglich ist und ihre Membran zu durchdringen vermag und/oder

b) eines wasserlöslichen Polymers, das biologisch mit Erythrozyten verträglich ist,

zur Bildung eines Mediums für die Lyophilisierung von Erythrozyten.

10. Verwendung nach Anspruch 9, worin das Kohlehydrat ausgewählt wird unter Pentosen und Hexosen und/oder das Polymer Polyvinylpyrrolidon ist.