WO2022239870A1 - 血液由来成長因子含有組成物及びその調製方法 - Google Patents

血液由来成長因子含有組成物及びその調製方法 Download PDF

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WO2022239870A1
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platelet
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growth factor
minutes
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理人 裙本
佑衣 宮林
和夫 大西
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セルソース株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a blood-derived growth factor-containing composition and a preparation method thereof.
  • platelet-rich plasma platelet rich plasma: hereinafter also referred to as "PRP"
  • PRP platelet rich plasma
  • This platelet-rich plasma is rich in many growth factors. Since these growth factors play an effective role in wound healing and tissue regeneration, platelet-rich plasma is a promising material in the field of regenerative medicine (eg, Patent Document 1).
  • the preparation of PRP includes the process of activating platelets and releasing growth factors contained in platelets.
  • Platelet-derived factor release stimulators such as thrombin and calcium chloride have been used for platelet activation.
  • the main object of the present invention is to provide a blood-derived growth factor-containing composition effective for wound healing and tissue regeneration and a method for preparing the blood-derived growth factor-containing composition. Furthermore, another object of the present invention is to provide a blood-derived growth factor-containing composition capable of relieving severe pain upon administration and a method for preparing the blood-derived growth factor-containing composition.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the present inventors have developed a blood-derived growth factor-containing composition capable of relieving severe pain during administration by performing filtration treatment with a filter of a predetermined size. We have found that it is possible to prepare Specifically, it is the following invention.
  • a method for preparing a blood-derived growth factor-containing composition from mammalian blood comprising the steps of: adding to the blood an anticoagulant capable of forming a chelate complex with a metal ion; separating platelet-rich plasma containing buffy coat components from the blood; The blood to which is added is subjected to a first centrifugation treatment at 5 to 2000 G for 1 to 60 minutes to recover an upper layer containing plasma and buffy coat, and in the step of recovering the upper layer , a method in which the volume ratio of the upper layer portion to be recovered is 1:0.1 to 0.5 based on the volume of the total liquid volume; [2] After the step of collecting the upper layer, further subjecting the upper layer to a second centrifugation treatment at 100 to 2500 G for 1 to 30 minutes to pellet platelets and buffy coat components; removing the supernatant and suspending the platelets and the buffy coat component to obtain a platelet-rich plasma; and The method according to [1]
  • the step of activating the platelet-rich plasma by freezing and thawing comprises freezing by treatment at ⁇ 200° C. to ⁇ 20° C. for 10 minutes or more, followed by thawing by treatment at 20° C. to 50° C. for 10 minutes or more.
  • a method for preparing a blood-derived growth factor-containing composition from mammalian blood comprising the steps of: adding to the blood an anticoagulant capable of forming a chelate complex with metal ions; a step of separating platelet-rich plasma containing a buffy coat component from the blood, a step of freezing and thawing the platelet-rich plasma to activate it, and a filter having a pore size of 0.2 to 1 ⁇ m, the activated filtering the platelet-rich plasma; [10] A blood-derived growth factor-containing composition prepared by the method according to any one of [1] to [7] and [9] above; [11
  • a blood-derived growth factor-containing composition effective for wound healing and tissue regeneration and a method for preparing the blood-derived growth factor-containing composition. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a blood-derived growth factor-containing composition capable of alleviating severe pain during administration and a method for preparing the blood-derived growth factor-containing composition.
  • FIG. 1 is a graph showing the amounts of growth factor (VEGF) and anti-inflammatory cytokine (IL-1Ra) in blood-derived growth factor-containing compositions of Examples 6-10.
  • FIG. 2 is a graph showing the amount of growth factor (VEGF) in a blood-derived growth factor-containing composition obtained under predetermined separation conditions.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of anti-inflammatory cytokine (IL-1Ra) in blood-derived growth factor-containing compositions obtained under predetermined separation conditions.
  • a method for preparing the blood-derived growth factor-containing composition according to the present embodiment will be described below, and then the blood-derived growth factor-containing composition according to the present embodiment obtained by the above-described preparation method will be described.
  • a method for preparing a blood-derived growth factor-containing composition is a method for preparing a blood-derived growth factor composition from mammalian blood, wherein an anticoagulant capable of forming a chelate complex with a metal ion is added to the blood. and a step of separating platelet-rich plasma containing a buffy coat component from the blood to which the anticoagulant has been added (hereinafter also referred to as a “separation step”).
  • mammal blood is not particularly limited as long as it contains a growth factor, and is, for example, blood derived from humans, pigs, cows, horses, dogs, cats and monkeys, preferably human is the blood of Also, said "mammalian blood” is preferably autologous.
  • ⁇ Addition process> blood to which an anticoagulant that forms a chelate complex with metal ions has been added is used.
  • the anticoagulant may be added to the collected blood later, but it is desirable to collect the blood in advance in a container such as a blood collection tube or blood collection bag containing the anticoagulant.
  • Anticoagulants that form chelate complexes with metal ions include compounds that form chelate complexes with metal ions (such as calcium ions), such as polycarboxylic acids and salts thereof.
  • polycarboxylic acids include citric acid and EDTA.
  • Polycarboxylates include EDTA salts such as 2Na citrate (citrate), EDTA-2K, and EDTA-2Na.
  • the anticoagulant may be added as a solid, or may be added as a solution in which the anticoagulant is dissolved in a solvent such as pure water (preferably a physiologically acceptable one).
  • the final concentration of anticoagulant in whole blood after addition of anticoagulant is preferably 0.5 in the case of disodium citrate. to 1.5% by mass, more preferably 0.8 to 1.0% by mass, and in the case of EDTA-2K, preferably 0.5 to 2.0 mg/mL, more preferably 1.1 to 1 .7 mg/mL, and in the case of EDTA-2Na, preferably 0.5-2.0 mg/mL, more preferably 1.0-1.5 mg/mL.
  • the method of the present embodiment further includes the step of pre-chilling the anticoagulant-added blood before the step of separating platelet-rich plasma from the blood to which the anticoagulant that forms a chelate complex with the metal ion is added.
  • the refrigeration temperature in the step of pre-chilling the blood is, for example, 0-10°C.
  • the process time of the step of pre-chilling the blood is, for example, more than 0 hours and 72 hours or less.
  • the lower limit of the process time may be 30 minutes or more, 1 hour or more, 2 hours or more, 4 hours or more, or 8 hours or more.
  • the upper limit of the process time may be 60 hours or less, 48 hours or less, 36 hours or less, or 24 hours or less.
  • the method of this embodiment includes the step of separating platelet-rich plasma containing buffy coat components from blood to which an anticoagulant has been added.
  • buffy coat refers to a thin white layer containing a large number of leukocytes formed between erythrocytes and plasma fractions when blood is centrifuged.
  • “comprising a buffy coat component” means containing at least part of the buffy coat.
  • the temperature of blood and platelet-rich plasma is preferably controlled between 4 and 25°C during this separation step.
  • the blood is usually subjected to a first centrifugation process at a relatively low speed to separate the red blood cell-containing fraction, the buffy coat, the platelet-rich plasma (PRP), and the platelet-poor plasma.
  • platelet-rich plasma is obtained.
  • the separation step preferably includes a first relatively low speed centrifugation process and a second relatively high speed centrifugation process.
  • the first centrifugation process and the second centrifugation process may each be independently performed multiple times.
  • the platelet-rich plasma and buffy coat may be obtained by a relatively slow first centrifugation process alone.
  • the first centrifugation treatment, the second centrifugation treatment, and the concentration/purification treatment of platelets and buffy coat components are described in detail below.
  • the relatively low-speed first centrifugation treatment is preferably centrifugation at 5 to 2000 G (corresponding to about 200 to 2000 rpm in a normal centrifuge). Rotation conditions may be 100-1000G, 150-750G, and 200-500G.
  • the treatment time may be 1 to 60 minutes, 1 to 30 minutes, 5 to 20 minutes, 10 to 15 minutes.
  • the volume ratio of the upper layer portion to be recovered is preferably 1:0.1 to 0.5, more preferably 1:0.2 to 0.5, based on the volume of the total liquid volume. 5, more preferably 1:0.3-0.5, particularly preferably 1:0.35-0.5, most preferably 1:0.4-0.5.
  • the relatively high-speed second centrifugation process is preferably centrifugation at 100-2500 G (equivalent to about 700-5000 rpm in a normal centrifuge).
  • Rotation conditions may be 1100-2000G, 1200-1500G.
  • the treatment time may be 1-30 minutes, 5-20 minutes, or 10-15 minutes.
  • the platelets and buffy coat components can be purified and concentrated.
  • any volume can be removed in the step of removing the supernatant.
  • the volume ratio is preferably 1: 1 to 10, more preferably 1: 1 to 5, and still more preferably 1: 1 to 3. The supernatant can be retained and the rest can be removed.
  • Addition of drugs is known as a method of activating platelet-rich plasma.
  • Agents that activate platelet-rich plasma generally include calcium ion source compounds such as calcium chloride, calcium phosphate, calcium lactate, and calcium carbonate.
  • activation of platelet-rich plasma can be achieved by freezing and thawing without adding drugs. Therefore, the use of calcium ion source compounds can be minimized and additives can be minimized.
  • Freezing of platelet-rich plasma can be performed by exposing the platelet-rich plasma to a low temperature at which freezing occurs. Specifically, the platelet-rich plasma is placed under temperature conditions of, for example, ⁇ 10° C. or less, ⁇ 20° C. or less, ⁇ 100° C. or less, or ⁇ 200° C. or less, preferably ⁇ 20° C. to ⁇ 200° C. Can be frozen. This may be done by contact with liquid nitrogen or storage in a freezer.
  • the freezing process time may be 1 minute or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 15 minutes or more, 20 minutes or more, 25 minutes or more, or 30 minutes or more. On the other hand, it may be 180 minutes or less, 150 minutes or less, 90 minutes or less, 60 minutes or less, 50 minutes or less, 40 minutes or less, or 30 minutes or less.
  • freezing can be performed, for example, by immersing a container containing platelet-rich plasma in liquid nitrogen for 1 minute or longer.
  • Melting of platelet-rich plasma can be performed by exposing the platelet-rich plasma to a temperature at which melting occurs. Specifically, frozen platelet-rich plasma is treated at a temperature of, for example, 20°C or higher, 25°C or higher, or 30°C or higher and 50°C or lower, 40°C or lower, or 38°C or lower, preferably 20°C to 50°C. Melting can be achieved by subjecting to conditions.
  • the time for the step of thawing platelet-rich plasma and activating platelets is not particularly limited. The lower limit of the melting step time may be 1 minute or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 15 minutes or more, 20 minutes or more, 25 minutes or more, or 30 minutes or more.
  • the upper limit of the melting process time may be 180 minutes or less, 150 minutes or less, 90 minutes or less, 60 minutes or less, 50 minutes or less, 40 minutes or less, or 30 minutes or less.
  • platelets can be activated by allowing a container containing platelet-rich plasma to stand at room temperature for 10 to 30 minutes.
  • a solvent may be added to the activated platelet-rich plasma to resuspend.
  • the solvent for resuspension is any physiologically acceptable solvent. Examples thereof include plasma, physiological saline, buffered physiological saline ⁇ eg, phosphate-buffered saline (PBS) ⁇ , Ringer's solution (eg, lactated Ringer's solution, acetated Ringer's solution, bicarbonate Ringer's solution), and the like.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Ringer's solution eg, lactated Ringer's solution, acetated Ringer's solution, bicarbonate Ringer's solution
  • Any platelet resuspension resuspended in any solvent is referred to herein as "platelet-rich plasma”.
  • the above solvent may be further added to this resuspension, and the liquid after addition is also referred to as "platelet-rich plasma.”
  • the method of this embodiment may further comprise removing blood cells from the platelet-rich plasma.
  • the platelet-rich plasma is preferably controlled at 4-25°C during this cell removal step.
  • Plate-rich plasma contains platelets.” Moreover, according to the method of this embodiment, the platelet-rich plasma also contains white blood cells derived from the buffy coat. Additionally, the platelet-rich plasma may contain a small amount of red blood cells.
  • this step is preferably a filtration treatment step for removing blood cells from the platelet-rich plasma by filtration treatment.
  • the filters used for filtering there are no restrictions on the filters used for filtering, as long as they can remove blood cells. Since platelets are the smallest in blood cell size at about 2 ⁇ m, for example, membrane filters with pore sizes of 1 ⁇ m or less, 0.7 ⁇ m or less, or 0.5 ⁇ m or less can be used. There is no lower limit to the pore size of the membrane filter, but excessively small pore sizes increase the risk of clogging. Therefore, the pore diameter is preferably 0.2 ⁇ m or more, 0.3 ⁇ m or more, or 0.4 ⁇ m or more. Membrane filters commonly available on the market that satisfy this range include a membrane filter with a pore size of about 0.2 ⁇ m and a membrane filter with a pore size of about 0.45 ⁇ m. Any of them can be used in this embodiment, and a membrane filter with a pore size of about 0.45 ⁇ m is the most suitable membrane filter.
  • the filtering process may be performed by centrifugation using a centrifuge tube provided with the aforementioned filter.
  • the centrifugation at this time is, for example, centrifugation at 800 to 1800 G (corresponding to about 1500 to 4000 rpm in a normal centrifuge).
  • the process time is, for example, 1 to 30 minutes, 5 to 15 minutes, or 10 minutes.
  • the method of this embodiment may further comprise freeze-drying the platelet-rich plasma.
  • the freeze-drying method is not particularly limited as long as it is a conventional freeze-drying method for proteins.
  • platelet-rich plasma is frozen and then vacuum freeze-dried.
  • the temperature of the platelet-rich plasma or the environmental temperature is adjusted to -60°C or lower, -70°C or lower, or -80°C or lower. This may be done by contact with liquid nitrogen or storage in a freezer.
  • the execution time of the freezing process can be instant.
  • the freezing process is carried out at the above temperatures for 6-24 hours to ensure that all the platelet-rich plasma is frozen. That is, the interval from the start time of the freezing treatment to the start time of the vacuum freeze-drying treatment may be 0 to 24 hours or 6 to 24 hours.
  • the temperature conditions for the vacuum freeze-drying process There are no particular restrictions on the temperature conditions for the vacuum freeze-drying process.
  • the upper limit of the temperature conditions may be ⁇ 30° C. or less, ⁇ 35° C. or less, ⁇ 40° C. or less, or ⁇ 45° C. or less.
  • the lower limit is not particularly limited, it may be -80°C or higher, -75°C or higher, -70°C or higher, -65°C or higher, -55°C or higher, or -50°C or higher.
  • the upper limit of the atmospheric pressure condition may be 20 Pa or less, 18 Pa or less, 16 Pa or less, or 15 Pa or less.
  • the lower limit is 0 Pa or more, and may be 1 Pa or more, 2 Pa or more, 3 Pa or more, 4 Pa or more, or 5 Pa or more.
  • the time to perform the vacuum freeze-drying process can be set according to the amount of liquid.
  • the lower limit of the freeze-drying time may be, for example, 1 hour or longer, 2 hours or longer, 3 hours or longer, 4 hours or longer, 5 hours or longer, 6 hours or longer, 7 hours or longer, and 8 hours or longer.
  • the upper limit of the freeze-drying time may be 24 hours or less, 20 hours or less, 15 hours or less, 10 hours or less, or 8 hours or less.
  • the blood-derived growth factor-containing composition is a blood-derived growth factor-containing composition prepared from mammalian blood and having an extremely high content of a specific growth factor. be.
  • the blood-derived growth factor-containing composition may be liquid, semi-solid, or dry solid. Ingredients are described in detail below.
  • the blood-derived growth factor-containing composition according to the present embodiment preferably has a growth factor VEGF content of 90 pg/mL or more, more preferably 100 pg/mL or more, still more preferably 200 pg/mL or more, particularly It is preferably 300 pg/mL or more.
  • the upper limit of the VEGF content is, for example, 10000 pg/mL, although it varies depending on individual differences in mammals from which blood is collected.
  • pg/mL in the specification and claims is the concentration in the platelet-rich plasma after the filtration process, or the platelet-rich plasma after the freeze-drying process is melted at 300 mg per 1 mL of solvent.
  • VEGF Concentration in platelet-rich plasma.
  • VEGF is a growth factor abundant in buffy coat, although it is also contained in platelets.
  • VEGF has an angiogenic effect, and a composition containing a large amount of VEGF, which contains a blood-derived growth factor, can be expected to have a higher wound healing effect.
  • the VEGF content (pg/1 g of dry matter) relative to the dry mass of the composition is preferably 300 pg/g or more, more preferably 700 pg/g or more, and still more preferably 1000 pg/g or more. be.
  • the upper limit of the VEGF content with respect to the dry mass of the composition varies depending on the individual difference of mammals from which blood was collected, but is, for example, 30000 pg/g.
  • the dry weight of the composition is the weight after drying the composition under the drying conditions described below. (Drying conditions) Using FDU-1110 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.), the composition to be dried is vacuum freeze-dried under conditions of 5 Pa and ⁇ 45° C. for 16 hours.
  • the blood-derived growth factor-containing composition according to this embodiment may contain other growth factors.
  • the type of growth factor is not particularly limited. TGF- ⁇ ), insulin-like growth factor (IGF), hepatocyte growth factor (HGF).
  • the blood-derived growth factor-containing composition according to this embodiment may contain an anti-inflammatory cytokine: an interleukin-1 receptor antagonist (hereinafter also referred to as "IL-1Ra").
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonist
  • the content of IL-1Ra is preferably 100 pg/mL or more, more preferably 150 pg/mL or more, still more preferably 200 pg/mL or more.
  • the upper limit of the IL-1Ra content is, for example, 50,000 pg/mL, although it varies depending on individual differences in mammals from which blood was collected.
  • IL-1Ra is primarily contained in leukocytes.
  • IL-1Ra acts as an antagonist of the inflammatory cytokines IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ and suppresses inflammation.
  • the content of the anti-inflammatory cytokine IL-1Ra (pg/1 g of dry matter) relative to the dry mass of the composition is preferably 300 pg/g or more, more preferably 450 pg/g or more, and still more preferably is 600 pg/g or more.
  • the upper limit of the IL-1Ra content with respect to the dry mass of the composition varies depending on individual differences in mammals from which blood was collected, but is, for example, 150000 pg/g.
  • the dry weight of the composition is the weight after drying the composition under the drying conditions described above.
  • the blood-derived growth factor-containing composition contains inflammatory cytokines: interleukin-1 ⁇ (hereinafter also referred to as “IL-1 ⁇ ”), interleukin-6 (hereinafter referred to as “IL -6”), and Tumor necrosis factor- ⁇ (hereinafter also referred to as “TNF- ⁇ ”).
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • IL-6 interleukin-6
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor- ⁇
  • the contents of IL-1 ⁇ and IL-6 are each independently preferably 10 pg/mL or less, more preferably 9.5 pg/mL or less, still more preferably 9.0 pg/mL or less.
  • the content of TNF- ⁇ is preferably 20 pg/mL or less, more preferably 19 pg/mL or less, still more preferably 18 pg/mL or less. Excessive expression of these inflammatory cytokines may lead to the development of diseases such as rheumatoid arthritis.
  • the inflammatory cytokine contained in the blood-derived growth factor-containing composition according to the present embodiment has a concentration as low as the above range, such side effects are less likely to occur when administered to humans or animals.
  • the contents of IL-1 ⁇ and IL-6 (pg/1 g of dry matter) relative to the dry mass of the composition are each independently preferably 30 pg/g or less, more preferably 28 pg/g or less.
  • the TNF- ⁇ content (pg/1 g of dry matter) relative to the dry mass of the composition is preferably 60 pg/g or less, more preferably 57 pg/g or less, and even more preferably 54 pg/g. It is below.
  • the dry weight of the composition is the weight after drying the composition under the drying conditions described above.
  • the blood-derived growth factor-containing composition according to this embodiment preferably contains growth factors and anti-inflammatory cytokines in a well-balanced manner.
  • the mass ratio of the anti-inflammatory cytokine IL-1Ra to the mass of the growth factor VEGF is preferably 1:1 to 50, more preferably 1:1 to 15, even more preferably. is 1:1-10.
  • a blood-derived growth factor-containing composition containing a growth factor and an anti-inflammatory cytokine in such a ratio has both a wound-healing effect and an anti-inflammatory effect, and therefore exhibits a higher therapeutic effect when administered to humans and animals.
  • the blood-derived growth factor-containing composition preferably contains a large amount of growth factors and little inflammatory cytokines.
  • the mass ratio of the inflammatory cytokine IL-1 ⁇ to the mass of the growth factor VEGF is preferably 1:0.001-0.05, more preferably 1:0.001-0. 0.03, more preferably 1:0.001 to 0.01.
  • a blood-derived growth factor-containing composition containing a growth factor and an inflammatory cytokine in such a ratio hardly causes inflammation when administered to a human body or an animal, and exhibits a high therapeutic effect.
  • Blood-derived growth factor-containing compositions according to this embodiment may be in a lyophilized state.
  • the blood-derived growth factor-containing composition in a freeze-dried state preferably has a growth factor VEGF content of 300 pg/g or more, more preferably 700 pg/g or more, and still more preferably 1000 pg/g. That's it.
  • the upper limit of the VEGF content is, for example, 30,000 pg/g, although it varies depending on individual differences in mammals from which blood is collected.
  • the blood-derived growth factor-containing composition in a lyophilized state according to this embodiment may contain other growth factors.
  • the type of growth factor is not particularly limited. TGF- ⁇ ), insulin-like growth factor (IGF), hepatocyte growth factor (HGF).
  • the blood-derived growth factor-containing composition in a lyophilized state may comprise the anti-inflammatory cytokine IL-1Ra.
  • the content of IL-1Ra is preferably 300 pg/g or more, more preferably 450 pg/g or more, still more preferably 600 pg/g or more.
  • the upper limit of the IL-1Ra content is, for example, 150,000 pg/g, although it varies depending on individual differences in mammals from which blood was collected.
  • Blood-derived growth factor-containing compositions may include the inflammatory cytokines IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ .
  • the contents of IL-1 ⁇ and IL-6 are each independently preferably 30 pg/g or less, more preferably 28 pg/g or less, still more preferably 27 pg/g or less.
  • the content of TNF- ⁇ (pg/1 g of dry matter) is preferably 60 pg/g or less, more preferably 57 pg/g or less, still more preferably 54 pg/g or less.
  • the blood-derived factor-containing composition in a lyophilized state preferably contains a balance of growth factors and anti-inflammatory cytokines.
  • the mass ratio of the anti-inflammatory cytokine IL-1Ra to the mass of the growth factor VEGF is preferably 1:1 to 50, more preferably 1:1 to 15, even more preferably. is 1:1-10.
  • the blood-derived growth factor-containing composition preferably contains a large amount of growth factors and little inflammatory cytokines.
  • the mass ratio of the inflammatory cytokine IL-1 ⁇ to the mass of the growth factor VEGF is preferably 1:0.001-0.05, more preferably 1:0.001-0. 0.03, more preferably 1:0.001 to 0.01.
  • blood-derived components including buffy coat components can be easily recovered, growth factors are dramatically increased, and blood-derived components exhibit wound healing and tissue regeneration effects.
  • Growth factor-containing compositions can be prepared.
  • the blood-derived factor-containing composition according to this embodiment can be used for regenerative medicine and the like, particularly for PRP therapy and the like.
  • one embodiment of the present invention is a method of treatment using a blood-derived growth factor-containing composition.
  • the blood-derived factor-containing composition according to this embodiment can restore tissue and reduce inflammation.
  • the blood-derived factor-containing composition according to the present embodiment is useful for treatment of, for example, chronic tendinosis, chronic muscle rupture (tendonitis), cartilage rupture, chronic degenerative arthritis and damaged connective tissue, atopic dermatitis and chronic wounds. treatment of chronic inflammatory skin diseases including endometriosis, improvement of implantation rate by activation of the endometrium, treatment of periodontal tissue, treatment of thinning hair, and the like.
  • This plasma was subjected to a second centrifugation treatment ⁇ 2680 rpm (equivalent to 1400 G), 10 minutes, 24° C. ⁇ to separate the pellet and supernatant. After separation, the supernatant having a volume ratio of 1:2 based on the volume of the pellet was retained, and the remaining supernatant (plasma) was removed. The remaining supernatant suspended the pellet to obtain a suspension (platelet-rich plasma).
  • This platelet-rich plasma was exposed to an environment of -60°C for 10 minutes and frozen, then taken out and allowed to stand in a dry bath set at 37°C for 15 minutes to melt. After thawing, 6.5 mL of lactated Ringer's solution (manufactured by Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.) was added and resuspended to stabilize the platelet-rich plasma.
  • the platelet-rich plasma was transferred to a vial, subjected to a freezing treatment at -60°C, and stored frozen at the same temperature for 24 hours.
  • Table 1 shows the results.
  • the contents of VEGF, IL-1Ra, IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ were 100 pg/mL or higher, 100 pg/mL or higher, 10 pg/mL or lower, 10 pg/mL or lower and 20 pg/mL or lower, respectively.
  • Table 2 shows the results of growth factor, anti-inflammatory cytokine, and inflammatory cytokine amount/dry matter (1 g) calculated from this.
  • Table 3 shows the amount ratio of each cytokine based on the amount of the growth factor VEGF based on the results of the analysis of the samples of Examples 1 to 5.
  • FIG. 1 shows the amount ratio of each cytokine when the sample prepared without pre-refrigeration after blood collection (Example 6) is taken as 100%. Pre-chilling at 4° C. for 24 hours (Example 7) or 48 hours (Example 8) increased the content of each factor to about 500% for IL-1Ra and about 200% for VEGF. On the other hand, no significant increase in each factor was observed when the product was allowed to stand at room temperature for 24 hours (Example 9) or 48 hours (Example 10) instead of pre-refrigeration.
  • VEGF growth factor
  • IL-1Ra anti-inflammatory cytokine
  • a suspension containing no buffy coat component was also obtained by recovering the upper layer of only the plasma fraction after the first centrifugation under each separation condition except for separation condition B.
  • Each obtained sample was subjected to freeze-thaw activation steps, blood cell removal steps and freeze-drying steps in the same manner as in Examples 1-5.
  • Table 5 shows the anti-inflammatory cytokine (IL-1Ra) amount ratio based on the amount of the growth factor VEGF based on the above analysis results for each sample containing the buffy coat component.
  • IL-1Ra anti-inflammatory cytokine

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Abstract

創傷治癒や組織再生に対してより効果的な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法を提供する。本発明のある態様は、哺乳類の血液から血液由来成長因子含有組成物を調製する方法である。当該方法は、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、を含む方法である。

Description

血液由来成長因子含有組成物及びその調製方法
　本発明は、血液由来成長因子含有組成物及びその調製方法に関する。
　自己の血液を遠心分離することで調製される血小板を濃縮した血漿、多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｍａ：以下、「ＰＲＰ」とも呼ぶ）を用いる治療法がある。この多血小板血漿は、多種の成長因子を豊富に含む。これら成長因子が創傷治癒や組織再生に効果的な役割を果たすため、多血小板血漿は再生医療分野において有望な材料である（例えば、特許文献１）。
　ＰＲＰの調製には、血小板を活性化し、血小板に含まれる成長因子等を放出させる工程が含まれる。血小板の活性化には、血小板由来因子放出刺激物質、例えば、トロンビン、塩化カルシウムが用いられている。
特開２００９－１９５７３９号公報
　本発明は、創傷治癒や組織再生に対して効果的な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法の提供を主課題とする。さらには、本発明は、投与時の強い痛みを緩和可能な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法の提供を副課題とする。
　本発明者らは、前記主課題について鋭意研究した結果、特定の成長因子｛血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：以下、「ＶＥＧＦ」とも呼ぶ）｝及びその量に着目することが重要であることを見出した。さらに、本発明者らは、原料及びプロセスの無数の組み合わせの中、特定の原料及びプロセス（キレート剤の使用、バフィーコート層を採取、凍結融解）を選択することで、前記特定の成長因子を所望量以上含有する血液由来成長因子含有組成物を調製することが可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、前記副課題についても鋭意研究した結果、所定サイズのフィルターで濾過処理も併せて実施することで、投与時の強い痛みを緩和可能な血液由来成長因子含有組成物を調製することができることを見出した。具体的には、下記発明である。
　すなわち、本発明によれば、
〔１〕　哺乳類の血液から血液由来成長因子含有組成物を調製する方法であって、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、を含み、前記多血小板血漿を分離する工程が、前記抗凝固剤が添加された前記血液について５～２０００Ｇ、１～６０分による第１の遠心分離処理を施して血漿及びバフィーコートを含む上層部を回収するステップを含み、且つ、前記上層部を回収するステップにおいて、全液量の体積を基準として、回収する前記上層部の体積比が、１：０．１～０．５である方法；
〔２〕　前記上層部を回収するステップの後に、さらに、前記上層部について１００～２５００Ｇ、１～３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板及びバフィーコート成分をペレット化するステップ；及び上清を除去し、前記血小板及び前記バフィーコート成分を懸濁して多血小板血漿を得るステップ；を含み、且つ、
　前記多血小板血漿を得るステップにおいて、ペレットの体積を基準として、体積比が１：１～１０の体積量の上清を残しそれ以外を除去する、前記〔１〕に記載の方法；
〔３〕　前記第１の遠心分離処理が、１００～１０００Ｇ、１～３０分であり、且つ、前記第２の遠心分離処理が、１０００～２５００Ｇ、１～３０分である、前記〔２〕に記載の方法；
〔４〕　前記抗凝固剤が、クエン酸、ＥＤＴＡ、又はこれらの塩を含む、前記〔１〕～〔３〕いずれかに記載の方法；
〔５〕　前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程が、－２００℃～－２０℃、１０分以上の処理による凍結と、その後の２０℃～５０℃、１０分以上の処理による融解により行われる、前記〔１〕～〔４〕いずれかに記載の方法；
〔６〕　前記多血小板血漿を分離する工程の前に、前記抗凝固剤を添加された血液を０～１０℃で予冷蔵する工程をさらに含む、前記〔１〕～〔５〕いずれかに記載の方法；
〔７〕　孔径０．２～１μｍのフィルターを用いて、活性化された前記多血小板血漿を濾過処理する工程をさらに含む、前記〔１〕～〔６〕いずれかに記載の方法；
〔８〕　活性化された前記多血小板血漿を凍結乾燥する工程をさらに含む、前記〔１〕～〔７〕いずれかに記載の方法；
〔９〕　哺乳類の血液から血液由来成長因子含有組成物を調製する方法であって、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、孔径０．２～１μｍのフィルターを用いて、活性化された前記多血小板血漿を濾過処理する工程と、を含む方法；
〔１０〕　前記〔１〕～〔７〕及び〔９〕のいずれかに記載の方法により調製された血液由来成長因子含有組成物；
〔１１〕　前記〔８〕に記載の方法により調製された血液由来成長因子含有凍結乾燥物；
が提供される。
　本発明によれば、創傷治癒や組織再生に対して効果的な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法を提供することができる。さらには、本発明によれば、投与時の強い痛みを緩和可能な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法をも提供することができる。
図１は、実施例６～１０の血液由来成長因子含有組成物における成長因子（ＶＥＧＦ）と抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１Ｒａ）の量を示すグラフである。 図２は、所定の分離条件によって得られた血液由来成長因子含有組成物における成長因子（ＶＥＧＦ）の量を示すグラフである。 図３は、所定の分離条件によって得られた血液由来成長因子含有組成物における抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１Ｒａ）の量を示すグラフである。
　以下、本発明について詳述する。なお、本明細書中、数値範囲の説明における「ａ～ｂ」との表記は、特に断らない限り、ａ以上ｂ以下であることを表す。また、複数の上限値と複数の下限値とが別々に記載されている場合、これらの上限値と下限値とを自由に組み合わせて設定可能な全ての数値範囲が記載されているものとする。
　以下、本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物の調製方法を説明し、次いで、前記調製方法により得られる、本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物を説明する。
≪血液由来成長因子含有組成物の調製方法≫
　本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物の調製方法は、哺乳類の血液から血液由来成長因子組成物を調製する方法であって、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程（以下、「添加工程」とも呼ぶ）と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程（以下、「分離工程」とも呼ぶ）と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程（以下、「凍結融解工程」とも呼ぶ）と、を少なくとも含む方法である。ここで、「哺乳類の血液」とは、成長因子が含有されていれば特に制限されず、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ及びサル等由来の血液であり、好ましくはヒト由来の血液である。また、前記「哺乳類の血液」は好ましくは自己由来である。以下、上述した各工程について詳述する。
　＜添加工程＞
　本実施形態の方法においては、金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤が添加された血液を使用する。抗凝固剤は、採取された血液に後から添加してもよいが、予め抗凝固剤を含む採血管又は採血バッグ等の容器に血液を採取することが望ましい。
　金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤として、金属イオン（例えばカルシウムイオン）とキレート錯体を形成する化合物、例えば、ポリカルボン酸及びその塩が挙げられる。ポリカルボン酸としては、クエン酸及びＥＤＴＡ等が挙げられる。ポリカルボン酸塩として、クエン酸２Ｎａ（クエン酸塩）、ＥＤＴＡ－２Ｋ、及びＥＤＴＡ－２Ｎａ等のＥＤＴＡ塩が挙げられる。
　抗凝固剤は、固体のまま添加してもよいが、当該抗凝固剤を純水などの溶媒（生理学的に許容されるものが好ましい）に溶解させた溶液として添加してもよい。全血に抗凝固剤を添加した後のもの（全血＋抗凝固剤、又は全血＋抗凝固剤溶液）における抗凝固剤最終濃度は、クエン酸２Ｎａの場合には、好ましくは０．５～１．５質量％、さらに好ましくは０．８～１．０質量％であり、ＥＤＴＡ－２Ｋの場合には、好ましくは０．５～２．０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１．１～１.７ｍｇ／ｍＬであり、ＥＤＴＡ－２Ｎａの場合には、好ましくは０．５～２．０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１．０～１．５ｍｇ/ｍＬである。
　＜予冷蔵工程＞
　本実施形態の方法は、金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤が添加された血液から多血小板血漿を分離する工程の前に、抗凝固剤が添加された血液を予冷蔵する工程をさらに含んでもよい。血液を予冷蔵する工程における冷蔵温度は、例えば、０～１０℃である。血液を予冷蔵する工程の工程時間は、例えば、０時間超７２時間以下である。当該工程時間の下限値は、３０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、８時間以上としてもよい。当該工程時間の上限値は、６０時間以下、４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下としてもよい。
　＜分離工程＞
　本実施形態の方法は、抗凝固剤が添加された血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程を含む。ここで、「バフィーコート」とは、血液を遠心分離したとき赤血球と血漿画分の中間にできる白血球を多く含んだ薄く白い層を指す。また、「バフィーコート成分を含む」とは、バフィーコートの少なくとも一部を含むことを意味する。
　この分離工程の間において、血液及び多血小板血漿の温度は、４～２５℃に制御することが好ましい。
　血液（全血）から多血小板血漿を分離する手段に制限はなく、公知の任意の手段が使用可能である。通常は、血液について比較的低速度の第１の遠心分離処理を施して、赤血球を含む画分と、バフィーコートと、多血小板血漿（ＰＲＰ）と、少血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｐｏｏｒ　ｐｌａｓｍａ）とに分離して、多血小板血漿が得られる。ここで、分離工程は、比較的低速度の第１の遠心分離処理と比較的高速度の第２の遠心分離処理を含むことが好適である。第１の遠心分離処理及び第２の遠心分離処理は、それぞれ独立して複数回実行してもよい。または、比較的低速度の第１の遠心分離処理単独によって多血小板血漿及びバフィーコートを取得してもよい。以下、第１の遠心分離処理、第２の遠心分離処理並びに血小板及びバフィーコート成分の濃縮・純化処理を詳述する。
　（第１の遠心分離処理）
　比較的低速度の第１の遠心分離処理は、５～２０００Ｇ（通常の遠心分離機においては２００～２０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離であることが好ましい。回転条件は、１００～１０００Ｇ、１５０～７５０Ｇ、２００～５００Ｇとしてもよい。処理時間は、１～６０分、１～３０分、５～２０分、１０～１５分としてもよい。
　比較的低速度の第１の遠心分離処理後、血漿画分全て（多血小板血漿及び少血小板血漿）及びバフィーコートを含む上層部を回収する。
　前記上層部を回収する工程は、赤血球を含む画分を（例えば視認上）可能な限り含まないように、任意の体積量を回収することが好ましい。具体的には、例えば、全液量の体積を基準として、回収する前記上層部の体積比が好ましくは１：０．１～０．５であり、より好ましくは１：０．２～０．５であり、さらに好ましくは１：０．３～０．５、特に好ましくは１：０．３５～０．５、最も好ましくは１：０．４～０．５である。
　（第２の遠心分離処理）
　血小板及びバフィーコート成分が、第１の遠心分離処理後に回収した前記上層部について比較的高速度の第２の遠心分離処理によってペレット化される。
　比較的高速度の第２の遠心分離処理は、１００～２５００Ｇ（通常の遠心分離機においては７００～５０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離であることが好ましい。回転条件は、１１００～２０００Ｇ、１２００～１５００Ｇとしてもよい。処理時間は、１～３０分、５～２０分、１０～１５分としてもよい。
　（血小板及びバフィーコート成分の純化・濃縮処理）
　第２の遠心分離処理により得られたものから上清を除去し、その後、懸濁させることで、血小板及びバフィーコート成分を純化・濃縮することができる。ここで、上清を除去する工程では、任意の体積量を除去できる。具体的には、例えば、ペレットの体積を基準として、体積比が好ましくは１：１～１０であり、より好ましくは１：１～５であり、さらに好ましくは１：１～３の体積量の上清を残しそれ以外を除去できる。
　＜凍結融解工程＞
　本工程によって、多血小板血漿が活性化され、多数の成長因子及び抗炎症性サイトカインが放出される。
　多血小板血漿を活性化する方法として、薬剤添加が知られている。多血小板血漿を活性化する薬剤としては、一般的には、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウムイオン源化合物が挙げられる。本実施形態の方法においては、薬剤添加によらず、凍結融解により、多血小板血漿の活性化を達成できる。このため、カルシウムイオン源化合物の使用を極力減らし、添加物を最小限にできる。
　多血小板血漿の凍結は、多血小板血漿を凍結が起こる低温に暴露することにより行うことができる。具体的には、多血小板血漿を、例えば、－１０℃以下、－２０℃以下、－１００℃以下、又は－２００℃以下、好ましくは－２０℃～－２００℃の温度条件下に置くことにより凍結させることができる。これは液体窒素との接触やフリーザー中での保存によって実行されてもよい。
　多血小板血漿を凍結して血小板を活性化する工程の時間は、特に制限はない。当該凍結する工程時間は、１分以上、５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、２５分以上、３０分以上としてもよい。他方、１８０分以下、１５０分以下、９０分以下、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下としてもよい。具体的には、例えば、多血小板血漿を含む容器を液体窒素中に１分以上浸漬することにより凍結を実施することができる。
　多血小板血漿の融解は、多血小板血漿を融解が起こる温度に暴露することにより行うことができる。具体的には、凍結した多血小板血漿を、例えば、２０℃以上、２５℃以上、又は３０℃以上、かつ５０℃以下、４０℃以下、又は３８℃以下、好ましくは２０℃～５０℃の温度条件下に置くことにより融解を行うことができる。多血小板血漿を融解して血小板を活性化する工程の時間は、特に制限はない。当該融解する工程時間の下限値は、１分以上、５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、２５分以上、３０分以上としてもよい。他方、当該融解する工程時間の上限値は、１８０分以下、１５０分以下、９０分以下、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下としてもよい。具体的には、例えば、多血小板血漿を含む容器を室温で１０分～３０分静置することにより血小板を活性化することができる。
　活性化させた多血小板血漿に溶媒を添加して、再懸濁してもよい。再懸濁させる溶媒は、生理学的に許容されるものであれば任意である。例えば、血漿、生理食塩水、緩衝生理食塩水｛例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）｝、リンゲル液（例えば乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液）などが挙げられる。なお、いずれの溶媒に再懸濁させたいずれの血小板再懸濁液も、本明細書においては『多血小板血漿』と表現する。また濃度調整や添加剤の配合などを目的として、この再懸濁液に上記溶媒をさらに添加してもよく、添加後の液も『多血小板血漿』と表現する。
　＜細胞除去工程＞
　本実施形態の方法は、多血小板血漿から血液細胞を除去する工程をさらに含んでもよい。
　この細胞除去工程の間において、多血小板血漿は４～２５℃に制御することが好ましい。
　多血小板血漿は血小板を含んでいる。また、本実施形態の方法によると、当該多血小板血漿は、バフィーコート由来の白血球も含む。さらに、当該多血小板血漿は僅かな量の赤血球を含む場合もある。
　血液細胞を除去する手段は、例えば、加熱処理、酸処理、フィルタリング処理等が挙げられる。これらのうち、成長因子の変性を招くリスクが小さいことからフィルタリング処理が好ましい。すなわち本工程は、フィルタリング処理によって多血小板血漿から血液細胞を除去する濾過処理工程であることが好ましい。
　フィルタリング処理に使用するフィルターは、血液細胞を除去できるものであれば制限はない。血液細胞の大きさは、血小板が約２μｍで最も小さいため、例えば、孔径が１μｍ以下、０．７μｍ以下、０．５μｍ以下のメンブレンフィルターを使用することができる。なお、メンブレンフィルターの孔径の下限値に制限はないが過度に小さいものは目詰まりを起こすリスクが大きくなる。そのため、孔径は０．２μｍ以上、０．３μｍ以上、０．４μｍ以上が好ましい。通常市販されているメンブレンフィルターのうち、この範囲を満たすものとしては孔径が約０．２μｍのメンブレンフィルターと孔径が約０．４５μｍのメンブレンフィルターがある。本実施形態においてはいずれも使用可能であり、孔径が約０．４５μｍのメンブレンフィルターが最適なメンブレンフィルターである。
　フィルタリング処理は、前述のフィルターが設けられた遠心分離用チューブを用いた遠心分離によって実行されてもよい。この際の遠心分離は、例えば、８００～１８００Ｇ（通常の遠心分離機においては１５００～４０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。工程時間は、例えば、１～３０分、５～１５分、１０分である。
　この処理の結果、フィルターを通過した、血液細胞を実質的に含まない多血小板血漿を得ることができる。
　＜凍結乾燥工程＞
　本実施形態の方法は、多血小板血漿を凍結乾燥する工程をさらに含んでもよい。
　凍結乾燥の手法は、従来周知のタンパク質の凍結乾燥手法であれば特に制限はない。
　凍結乾燥は、多血小板血漿を冷凍処理し、その後真空凍結乾燥処理を行う。
　冷凍処理において、多血小板血漿の温度又は環境温度が－６０℃以下、－７０℃以下、又は－８０℃以下になるように調節される。これは液体窒素との接触やフリーザー中での保存によって実行されてもよい。
　冷凍処理の実行時間は一瞬でもよい。通常は、多血小板血漿全てが確実に冷凍されるように冷凍処理の上述温度において６～２４時間に亘って実行される。すなわち冷凍処理の開始時刻から真空凍結乾燥処理の開始時刻のインターバルは０～２４時間又は６～２４時間でもよい。
　真空凍結乾燥処理の温度条件は、特に制限はない。当該温度条件の上限値は、－３０℃以下、－３５℃以下、－４０℃以下、－４５℃以下としてもよい。下限値に特に制限はないが、－８０℃以上、－７５℃以上、－７０℃以上、－６５℃以上、－５５℃以上、－５０℃以上としてもよい。
　真空凍結乾燥処理の気圧条件は、特に制限はない。当該気圧条件の上限値は、２０Ｐａ以下、１８Ｐａ以下、１６Ｐａ以下、１５Ｐａ以下としてもよい。下限値は０Ｐａ以上であり、１Ｐａ以上、２Ｐａ以上、３Ｐａ以上、４Ｐａ以上、５Ｐａ以上としてもよい。
　真空凍結乾燥処理を実行する時間は、特に制限はなく、液量に応じた時間を設定し得る。当該凍結乾燥処理時間の下限値は、例えば、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上としてもよい。他方、当該凍結乾燥処理時間の上限値は、２４時間以下、２０時間以下、１５時間以下、１０時間以下、８時間以下としてもよい。
　真空凍結乾燥処理を実行する手段は特に制限はなく任意の手段が使用される。例えば、ＦＤＵ－１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて実行してもよい。
　真空凍結乾燥処理を終えると、ほぼ完全に乾燥した粒状又は粉末状の多血小板血漿を得ることができる。
≪血液由来成長因子含有組成物≫
　本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物は、哺乳類の血液から調製された血液由来成長因子含有組成物であって、特定の成長因子の含有量が極めて高い血液由来成長因子含有組成物である。当該血液由来成長因子含有組成物は液体、半固体、又は乾燥固体であってもよい。以下、含有成分について詳述する。
　＜成長因子＞
　（ＶＥＧＦ）
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、成長因子ＶＥＧＦの含有量が好ましくは９０ｐｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上である。ＶＥＧＦの含有量の上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１００００ｐｇ／ｍＬである。ここで、本明細書及び本特許請求の範囲における「ｐｇ／ｍＬ」は、濾過処理工程後の多血小板血漿における濃度であり、又は凍結乾燥工程後の多血小板血漿を、溶媒１ｍＬあたり３００ｍｇ融解した多血小板血漿における濃度である。ＶＥＧＦは、血小板にも含まれるが、バフィーコートに多く含まれる成長因子である。ＶＥＧＦは血管新生作用があり、ＶＥＧＦを多く含む血液由来成長因子含有組成物は、より高い創傷治癒効果が期待できる。また、当該組成物の乾燥質量に対する、ＶＥＧＦの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは７００ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは１０００ｐｇ／ｇ以上である。当該組成物の乾燥質量に対する、ＶＥＧＦの含有量の上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば３００００ｐｇ／ｇである。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は、下記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
　（乾燥条件）
　ＦＤＵ－１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて、５Ｐａ、－４５℃の条件下、１６時間に亘って、乾燥対象の組成物に対して真空凍結乾燥処理を施す。
　（他の成長因子）
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、他の成長因子を含んでもよい。成長因子の種類は、特に限定されないが、例えば、血小板由来成長因子（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
　＜抗炎症性サイトカイン＞
　（１Ｌ－１Ｒａ）
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、抗炎症性サイトカイン：インターロイキン－１レセプターアンタゴニスト（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：以下、「ＩＬ－１Ｒａ」とも呼ぶ）を含んでもよい。ＩＬ－１Ｒａの含有量は、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上である。ＩＬ－１Ｒａの含有量の上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば５００００ｐｇ／ｍＬである。ＩＬ－１Ｒａは主に白血球に含まれる。ＩＬ－１Ｒａは、炎症性サイトカインＩＬ－１α及びＩＬ－１βのアンタゴニストとして作用し、炎症を抑制する。また、当該組成物の乾燥質量に対する、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは４５０ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６００ｐｇ／ｇ以上である。当該組成物の乾燥質量に対する、ＩＬ－１Ｒａの含有量の上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１５００００ｐｇ／ｇである。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は上記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
　＜炎症性サイトカイン＞
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、炎症性サイトカイン：インターロイキン－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β：以下、「ＩＬ－１β」とも呼ぶ）、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６：以下、「ＩＬ－６」とも呼ぶ）、及び腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α：以下、「ＴＮＦ－α」とも呼ぶ）を含み得る。ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量はそれぞれ独立に、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは９．５ｐｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは９．０ｐｇ／ｍＬ以下である。ＴＮＦ－αの含有量は、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１９ｐｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１８ｐｇ／ｍＬ以下である。これらの炎症性サイトカインの過剰な発現は、関節リウマチなどの疾患発症を招くおそれがある。本実施形態による血液由来成長因子含有組成物に含まれる炎症性サイトカインは上記範囲のような低濃度にすることで、人体や動物に投与してもこのような副作用を引き起こしにくい。
　また、当該組成物の乾燥質量に対する、ＩＬ－１β及びＩＬ－６及びの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）はそれぞれ独立に、好ましくは３０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは２８ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは２７ｐｇ／ｇ以下である。さらに、当該組成物の乾燥質量に対する、ＴＮＦ－αの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは６０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは５７ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは５４ｐｇ／ｇ以下である。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は上記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
　＜成分比＞
　（成長因子と抗炎症性サイトカイン）
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子と抗炎症性サイトカインをバランスよく含む。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準とした、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、好ましくは１：１～５０であり、より好ましくは１：１～１５であり、さらに好ましくは１：１～１０である。このような比率で成長因子と抗炎症性サイトカインを含む血液由来成長因子含有組成物は、創傷治癒効果と炎症抑制効果を併せ持つため、人体や動物に投与したときにより高い治療効果を奏する。
　（成長因子と炎症性サイトカイン）
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子を多く含みつつ、炎症性サイトカインをほとんど含まない。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準とした、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、好ましくは１：０．００１～０．０５であり、より好ましくは１：０．００１～０．０３であり、さらに好ましくは１：０．００１～０．０１である。このような比率で成長因子と炎症性サイトカインを含む血液由来成長因子含有組成物は、人体や動物に投与したときに炎症を引き起こしにくく、高い治療効果を奏する。
≪凍結乾燥品（血液由来成長因子含有凍結乾燥物）≫
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、凍結乾燥状態にあってもよい。
　＜成長因子＞
　（ＶＥＧＦ）
　本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、成長因子ＶＥＧＦの含有量が好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは７００ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは１０００ｐｇ／ｇ以上である。ＶＥＧＦの含有量の上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば３００００ｐｇ／ｇである。
　（他の成長因子）
　本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、他の成長因子を含んでもよい。成長因子の種類は、特に限定されないが、例えば、血小板由来成長因子（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
　＜抗炎症性サイトカイン＞
　（１Ｌ－１Ｒａ）
　本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａを含んでもよい。ＩＬ－１Ｒａの含有量は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは４５０ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６００ｐｇ／ｇ以上である。ＩＬ－１Ｒａの含有量の上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１５００００ｐｇ／ｇである。
　＜炎症性サイトカイン＞
　本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、炎症性サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを含み得る。ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量はそれぞれ独立に、好ましくは３０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは２８ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは２７ｐｇ／ｇ以下である。また、ＴＮＦ－αの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは６０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは５７ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは５４ｐｇ／ｇ以下である。
　＜成分比＞
　本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来因子含有組成物は、好適には、成長因子と抗炎症性サイトカインをバランスよく含む。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準とした、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、好ましくは１：１～５０であり、より好ましくは１：１～１５であり、さらに好ましくは１：１～１０である。また、当該血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子を多く含みつつ、炎症性サイトカインをほとんど含まない。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準とした、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、好ましくは１：０．００１～０．０５であり、より好ましくは１：０．００１～０．０３であり、さらに好ましくは１：０．００１～０．０１である。
　以上説明したように、本実施形態によれば、バフィーコート成分を含む血液由来成分を簡便に回収することができ、成長因子が飛躍的に増大し、ひいては創傷治癒や組織再生効果を奏する血液由来成長因子含有組成物を調製できる。
　本実施形態による血液由来因子含有組成物は再生医療等に使用でき、特に、ＰＲＰ療法等に使用できる。すなわち、本発明の一実施形態は、血液由来成長因子含有組成物を用いた治療方法である。本実施形態による血液由来因子含有組成物によって、組織の回復や炎症の軽減が可能である。本実施形態に係る血液由来因子含有組成物は、例えば、慢性腱症、慢性筋断裂(腱炎)、軟骨断裂、慢性変性関節症及び損傷した結合組織等の治療、アトピー性皮膚炎及び慢性創傷を含む慢性炎症性皮膚疾患の治療、子宮内膜活性化による着床率の改善、歯周組織に対する治療、並びに薄毛治療等に適用できる。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　＜血液由来成長因子含有組成物における成長因子量等の評価＞
　（実施例１～５の作製）
　男性５人からそれぞれ約３４ｍＬの全血をＡＣＤ溶液入り採血管（ＢＤバイキュアナ採血管　日本ベクトン・ディッキンソン株式会社＃３６４６０６）に適宜採取した。これらを恒温槽において４℃で一晩（約１６時間）冷蔵保存した。保存後、第１の遠心分離処理｛１２００ｒｐｍ（２８０Ｇ相当）、１０分間、２４℃｝を行い、血漿画分全て及びバフィーコートを含む上層部（１５ｍＬ：全液量の体積を基準として、回収した体積比は１：０．４）を回収した。この血漿について第２の遠心分離処理｛２６８０ｒｐｍ（１４００Ｇ相当）、１０分間、２４℃｝を行い、ペレットと上清に分離した。分離後、ペレットの体積を基準として、体積比が１：２となる上清は残し、それ以外の上清（血漿）を除去した。残った上清によってペレットを懸濁させ、懸濁液（多血小板血漿）を得た。
　この多血小板血漿を、－６０℃環境下に１０分間暴露し凍結させた後、取り出して３７℃に設定したドライバス中に１５分間静置することにより融解させた。融解後、多血小板血漿の安定化のために、乳酸リンゲル液（扶桑薬品工業株式会社製）をそれぞれ６．５ｍＬ添加し、再懸濁した。
　これをシリンジに移し替え、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターによってフィルタリングした。このフィルタリングによって多血小板血漿は、フィルター上に残留する血小板などの細胞と、フィルターを通過した多血小板血漿とに分離された。当該多血小板血漿をバイアルに移して－６０℃で冷凍処理を施し、同温度にて２４時間凍結保存した。
　各バイアルについて、ＦＤＵ－１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて、約５Ｐａ、約－４５℃の条件下、約１６時間に亘って真空凍結乾燥処理を施した。こうして実施例１～５の試料を得た。
　（各因子の測定）
　実施例１～５の試料について、乾燥物３００ｍｇに対して注射用水を１ｍＬ加え融解し、ＥＬＩＳＡ法によって成長因子、抗炎症性サイトカイン、及び炎症性サイトカインの量／濃度を解析した。その結果を表１に示す。ＶＥＧＦ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの含有量はそれぞれ１００ｐｇ／ｍＬ以上、１００ｐｇ／ｍＬ以上、１０ｐｇ／ｍＬ以下、１０ｐｇ／ｍＬ以下及び２０ｐｇ／ｍＬ以下であった。
　また、これより算出された成長因子、抗炎症性サイトカイン、及び炎症性サイトカインの量／乾燥物（１ｇ）の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１～５の試料についての前記解析した結果に基づき、成長因子ＶＥＧＦの量を基準としたときの各サイトカイン量比を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜予冷蔵による影響評価＞
　（実施例６～１０の作製）
　男性１人から約８５ｍＬの全血をＡＣＤ溶液入り採血管に採取し、５本に分注した。こうして検体６～１０を得た。その後、検体７及び８は、冷蔵庫において４℃で、それぞれ約２４時間及び約４８時間に亘り冷蔵した。また、検体９及び１０は、室温（２５℃）で、それぞれ約２４時間及び約４８時間に亘り静置した。これら検体６～１０について、実施例１～５と同様に、多血小板血漿を回収する工程、凍結融解し活性化する工程及び、凍結乾燥する工程を施し、実施例６～１０の試料を得た。
　（予冷蔵による影響の確認）
　実施例６～１０の試料について、乾燥物３００ｍｇに対して注射用水を１ｍＬ加え融解し、ＥＬＩＳＡ法によって成長因子(ＶＥＧＦ)、抗炎症性サイトカイン(ＩＬ－１Ｒａ)の量／濃度を解析した。採血後、予冷蔵を経ずに作製したもの（実施例６）を１００％としたときの各サイトカイン量比を図１に示す。４℃で２４時間（実施例７）又は４８時間（実施例８）予冷蔵した場合、各因子の含有量がＩＬ－１Ｒａは約５００％、ＶＥＧＦは約２００％に増加していた。一方、予冷蔵に代えて、室温に２４時間（実施例９）又は４８時間（実施例１０）静置した場合は、各因子の顕著な増加は確認されなかった。
　＜分離条件による影響評価＞
　（サンプルの作製）
　男性１人（検体１１）及び女性１人（検体１２）からそれぞれ約７６．５ｍＬの全血をＡＣＤ溶液入り採血管に採取し、９本に分注した。これらを恒温槽において４℃で一晩（約１６時間）冷蔵保存した。保存後、表４に示す各分離条件に従って遠心分離し、懸濁液（多血小板血漿）を得た。このとき、第１の遠心分離後の回収した上層部の全液量に対する体積比及び（分離条件Ｂを除く）第２の遠心分離後の除去した上清量は、実施例１～５と同様の条件とした。また、このとき、比較のために、分離条件Ｂを除く各分離条件について、第１の遠心分離後に血漿画分のみの上層部を回収した、バフィーコート成分を含まない懸濁液も取得した。取得した各サンプルについて、実施例１～５と同様に、凍結融解し活性化する工程、血液細胞を除去する工程及び凍結乾燥する工程を施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（分離条件による影響の確認）
　各サンプルについて、乾燥物３００ｍｇに対して注射用水を１ｍＬ加え融解し、ＥＬＩＳＡ法によって成長因子(ＶＥＧＦ)、抗炎症性サイトカイン(ＩＬ－１Ｒａ)の量／濃度を解析した。その結果を、図２（ＶＥＧＦ）及び図３（ＩＬ－１Ｒａ）に示す。図２及び図３より、バフィーコート成分を含むサンプルは、分離条件によらず、ＶＥＧＦ及びＩＬ－１Ｒａを多く含む血液由来成長因子含有組成物を製造できることが分かった。
　続いて、バフィーコート成分を含む各サンプルについての前記解析した結果に基づき、成長因子ＶＥＧＦの量を基準としたときの抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１Ｒａ）量比を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５より、分離条件Ａを採用した場合に、成長因子と抗炎症性サイトカインをバランスよく含む、より好適な血液由来成長因子含有組成物を取得できることが分かった。

 

Claims (11)

  1. 　哺乳類の血液から血液由来成長因子含有組成物を調製する方法であって、
    　金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、
    　前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、
    　前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、
    を含み、
    　前記多血小板血漿を分離する工程が、
    　前記抗凝固剤が添加された前記血液について５～２０００Ｇ、１～６０分による第１の遠心分離処理を施して血漿及びバフィーコートを含む上層部を回収するステップを含み、且つ、
    　前記上層部を回収するステップにおいて、全液量の体積を基準として、回収する前記上層部の体積比が、１：０．１～０．５である方法。
  2. 　前記上層部を回収するステップの後に、さらに、前記上層部について１００～２５００Ｇ、１～３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板及びバフィーコート成分をペレット化するステップ；及び上清を除去し、前記血小板及び前記バフィーコート成分を懸濁して多血小板血漿を得るステップ；を含み、且つ、
    　前記多血小板血漿を得るステップにおいて、ペレットの体積を基準として、体積比が１：１～１０の体積量の上清を残しそれ以外を除去する、請求項１記載の方法。
  3. 　前記第１の遠心分離処理が、１００～１０００Ｇ、１～３０分であり、且つ、前記第２の遠心分離処理が、１０００～２５００Ｇ、１～３０分である、請求項２記載の方法。
  4. 　前記抗凝固剤が、クエン酸、ＥＤＴＡ、又はこれらの塩を含む、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程が、－２００℃～－２０℃、１０分以上の処理による凍結と、その後の２０℃～５０℃、１０分以上の処理による融解により行われる、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記多血小板血漿を分離する工程の前に、前記抗凝固剤を添加された血液を０～１０℃で予冷蔵する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　孔径０．２～１μｍのフィルターを用いて、活性化された前記多血小板血漿を濾過処理する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　活性化された前記多血小板血漿を凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　哺乳類の血液から血液由来成長因子含有組成物を調製する方法であって、
    　金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、
    　前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、
    　前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、
    　孔径０．２～１μｍのフィルターを用いて、活性化された前記多血小板血漿を濾過処理する工程と、
    を含む方法。
  10. 　請求項１～７及び９のいずれか１項記載の方法により調製された血液由来成長因子含有組成物。
  11. 　請求項８に記載の方法により調製された血液由来成長因子含有凍結乾燥物。

     
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