JP2004507238A - すぐ使用できる、抗原負荷また非負荷の凍結保存された成熟成樹状細胞の調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、未成熟樹状細胞を適切な成熟刺激の存在下で培養し、そして得られた成熟樹状細胞を凍結することを特徴とする、すぐ使用できる、抗原を負荷した、または負荷していない、凍結保存された成熟樹状細胞の調製方法、特に該樹状細胞を含むワクチンの調製方法に関する。凍結前に該樹状細胞を抗原に負荷することが可能である。本発明はまた、本発明の方法により得られるワクチン、および抗原を負荷した凍結成熟樹状細胞を含む組成物に関する。

Description

本発明は、未成熟樹状細胞を適切な成熟刺激剤の存在下で培養し、そして得られた成熟細胞を凍結することによる、すぐ使用できる凍結保存された成熟樹状細胞の調製方法、特にそのような樹状細胞を含有するワクチンの調製方法に関する。凍結の前または後で、樹状細胞を抗原に負荷することが可能である。本発明はまた、本発明の方法によって得られるワクチン、および成熟した、抗原負荷凍結樹状細胞を含有する組成物に関する。
【０００１】
（発明の背景）
樹状細胞（以下「ＤＣ」と略す）は、リンパ球と相互作用することにより免疫系に影響を及ぼす抗原提示細胞である。殆どのＤＣは免疫刺激性の活性を示す。これらの古典的なＤＣは異なる方法で生体内においてヘルパーおよびキラーＴ細胞の形成を誘導することができる（「天然のアジュバント」）。特に、末梢組織に存在する未成熟ＤＣは、抗原と結合し、そこから免疫原性ＭＨＣペプチド複合体を調製する能力を有する（「抗原プロセシングモード」）。炎症性サイトカイン等の成熟を誘導する刺激剤が作用すると、これらの未成熟ＤＣは、接着分子および共刺激性分子の形成の増大を経て、強力なＴ細胞刺激剤となる（「Ｔ細胞刺激モード」）。同時に、これらの細胞は二次リンパ系器官中に移動し、希抗原特異的Ｔ細胞を選択して刺激する。組織または血液から単離して、試験管内で抗原を負荷したＤＣは、注入により生体内に戻すことで、成熟ＤＣとして免疫原性であることが示された。最近、健常なヒトおよび癌患者の両方において、ＤＣはＣＤ４＋およびＣＤ８＋　Ｔ細胞免疫を誘導できることが示された。正常な免疫応答をする健常な被験者においては、成熟ＤＣの１回のブースター注入がＣＤ８＋　Ｔ細胞応答の頻度のみならず機能的強度をも増大させることが可能であった。これらの理由により、ＤＣ（特に成熟ＤＣ）は、ヒトの腫瘍および感染に対する強力で効果的なＴ細胞応答を誘導するための、現在極めて有望なアジュバントである。
【０００２】
ＤＣを免疫療法に用いるための１つの必須条件は、増殖性ＣＤ３４＋前駆体細胞から、または非増殖性もしくは殆ど増殖しないＣＤ１４＋単球前駆体細胞から、培養により大量のＤＣを得ることを可能とする技術の開発である。単球由来のＤＣは、現在頻繁に使用されている。なぜなら、それらはドナーのサイトカイン前処理を行うことなく容易に調製されるからであり、また得られるＤＣ集団がかなり均質で、良好に特徴づけられるからである。例えば、接着性単球をウシ胎児血清（ＦＣＳ）の非存在下で、（ＧＭ−ＣＦＳ＋ＩＬ−４）中で通常６〜７日間培養して未成熟ＤＣを調製し、次にそれを通常１〜３日間成熟させ、自己由来の単球の馴らし培地によって誘導することができる。樹状細胞またはそれらの前駆体細胞の効果的な凍結保存を提供することは、ＦＣＳの存在下を除いて、極めて困難であることが実証されている［Ｔａｙｌｏｒら（１９９０）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　２７，２６９；牧野ら（１９９７）Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．　４５，６１８］。しかし、ワクチン接種中にＦＣＳが存在してはならないので、各ＤＣワクチン接種についてＤＣを新鮮な血液、新鮮な白血球成分採取物、または白血球成分採取物由来の凍結ＰＢＭＣ（「末梢血単核細胞」）アリコートから新たにする必要がいまだにある［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］。凍結ＰＢＭＣもまた、融解後、細胞をまず数日間培養してＤＣに分化させなければならない、という不利な点を有する。Ｌｅｗａｌｌｅら［（２０００）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４０，６９−７８］は、未成熟ＤＣを凍結する方法を開示しているが、非常に貧弱な生存細胞の収量が得られるのみである（７１頁、左欄の上）。ＧＭ−ＣＦＳおよびＩＬ−４によって単球から調製された未成熟樹状細胞の凍結は、ＷＯ　９９／４６９８４にも開示されている。
【０００３】
したがって、本発明の１つの目的は、長期間にわたって活性の実質的損失なしに保存可能であり、かつ必要時に短時間のうちに投与できる、成熟ＤＣを含有するワクチン等の組成物を提供することである。
【０００４】
本発明で用いられるＤＣは、該ワクチンによって処置される患者と同一の患者に由来する（自己由来である）ことが好ましい。あるいは、ＤＣは他の患者（同種異系）、例えば、Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１−１５に記述されているような健常なボランティア由来の白血球成分採取物に由来するものであってもよい。
【０００５】
驚くべきことに、特定の成熟刺激剤を含む適切な「成熟化カクテル」の存在下で培養することにより得られる完全に成熟したＤＣ（以下、「成熟ＤＣ」と略す）のみが、ＦＣＳを用いない凍結および融解の後に高いパーセンテージで生存し、かつ新たに調製された成熟ＤＣの免疫刺激活性に匹敵する免疫刺激活性を有することが明らかとなった。上記成熟化カクテルを用いた培養の間に、未成熟ＤＣは成熟ＤＣに分化する。特に好ましい成熟化カクテルには、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）および「腫瘍壊死因子α」（ＴＮＦ−α）が含まれる。
【０００６】
したがって、本発明は下記の発明に関する：
（１）すぐ使用できる、凍結保存された成熟樹状細胞の調製方法であって、
ａ）未成熟の樹状細胞（ＤＣ）を用意し；
ｂ）成熟ＤＣを獲得するために、１つ以上の成熟刺激剤を有する成熟化カクテルを含む培養培地中で該未成熟ＤＣを培養し；
ｃ）異種血清を含まない凍結用培地中で該成熟ＤＣを凍結すること、
を含んでなる方法；
（２）成熟した凍結保存ＤＣからワクチンを調製するのに適した、上記（１）の方法；
（３）凍結された、抗原を負荷した成熟樹状細胞、特に上記（１）に記載の方法によって得られる樹状細胞；
（４）上記（３）に記載の樹状細胞を含んでなるワクチン；および
（５）ＤＣの凍結に有利な条件を見いだす方法であって、
ａ）未成熟ＤＣを用意し；
ｂ）異なる成熟刺激剤の存在下で該未成熟ＤＣの異なる培養を実施し；
ｃ）次に、該ＤＣをサイトカイン含有または不含培地で培養し、ここでサイトカインの非存在下での培養が好ましく、
ｄ）該サイトカイン含有または不含培地で少なくとも１日培養した後、生存細胞の画分を測定し；そして
ｅ）最も高い生存率となる成熟刺激剤を決定すること、
を含んでなる方法。
【０００７】
本発明の方法（１）および（２）においては、未成熟ＤＣがまず培養され、１つ以上の成熟刺激剤を含む適切な成熟化カクテルがその培養培地に添加される。適切な成熟刺激剤としては、ＩＬ−１β等のＩＬ−１；ＩＬ−６；ＴＮＦ−α；ＰＧＥ_２等のプロスタグランジン；ＩＦＮ−α；ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、リポテイコ酸等のリポ多糖および他の細菌性細胞産物；ホスホリルコリン；カルシウムイオノホア；ＰＭＡ等のホルボールエステル；熱ショックタンパク質；ＡＴＰ等のヌクレオチド；リポペプチド；トール様受容体の人工リガンド；ポリ−Ｉ：Ｃ等の２本鎖ＲＮＡ；免疫刺激性ＤＮＡ配列；ＣＤ４０リガンド等が含まれる。本発明によれば、該培養培地または成熟化カクテルがＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αを含むこと、または該成熟化カクテルが単球馴らし培地（ＭＣＭ）もしくはＰＧＥ_２を添加したＭＣＭであることが特に好ましい。（１）および（２）の方法の好ましい実施態様においては、培養ステップの間に、またはその後で、ＤＣを抗原に負荷することができる。
【０００８】
成熟させ、そして場合により抗原を負荷した後、ＤＣをＦＣＳ等の異種血清を含まない凍結用培地中で凍結させる。本出願において意味する「異種血清」とは、ヒト種に由来しない血清をいう。しかし、本発明によれば、自己血清もしくは血漿（ＤＣが由来するヒトと同一のヒトに由来する）および同種異系血清もしくは血漿（ＤＣが由来するヒトとは異なるヒトに由来する）の両方とも用いることができる。
【０００９】
本出願において意味する未成熟ＤＣとは、成熟ＤＣと比較してほんの少量のクラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣならびに接着または共刺激性分子、例えば、特にＣＶＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０を発現し、適切な成熟刺激剤があると成熟ＤＣに分化する、ＣＤ８３（および／またはｐ５５／ファシンおよび／またはＤＣ−ＬＡＭＰ）陰性（または弱陽性である、および／または低百分率で陽性である）の白血球をいう。
【００１０】
本出願において意味する成熟ＤＣとは、成熟刺激剤の作用下で未成熟ＤＣから発生した白血球であって、ＣＤ８３（および／またはｐ５５／ファシンおよび／またはＤＣ−ＬＡＭＰ）ならびにクラスＩＩおよびクラスＩ　ＭＨＣ分子ならびに接着または共刺激性分子、特にＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０の増大した発現を示す白血球をいう。さらに、成熟ＤＣは、未成熟ＤＣと較べて明らかに増大したＴ細胞刺激能を示す（例えば、未成熟ＤＣとは対照的に、成熟ＤＣはＤＣ：Ｔの比が約＜１：１００でも同種異系ＭＬＲにおいて明確な刺激活性を示す）；さらに、本出願において意味する成熟ＤＣの１つの特徴は、これらのＤＣが安定である、すなわちサイトカインの非存在下で１〜２日またはそれ以上培養された場合でも成熟表現型および強いＴ細胞刺激能という特性を維持するということである。対照的に、まだ完全に成熟していないＤＣは安定ではなく、未成熟なＤＣまたは、例えば、接着性マクロファージに分化する。
【００１１】
未成熟ＤＣは種々の既知の供給源から用意できる。未成熟ＤＣの前駆体細胞は、通常、非増殖性ＣＤ１４陽性単核細胞（ＰＢＭＣ；単球）または増殖性ＣＤ３４陽性細胞である。例えば、ＰＢＭＣは白血球成分採取物から単離することができる。ＰＢＭＣは、［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．　１９０，１６６９］に記述されているように未成熟ＤＣに分化させることができる。したがって、ＰＢＭＣはＩＬ−４（またはＩＬ−１３；Ｒｏｍａｎｉら（１９９６）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９６，１３７−１５１）およびＧＭ−ＣＦＳ（「顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子」）の存在下で培養される。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αの存在下で培養することにより、ＣＤ１４陽性の単球から未成熟ＤＣが調製される（Ｓａｎｔｉｎｉら（２０００）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．　１９１，１７７７−１７８８）。ＣＤ３４陽性細胞から、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ（「幹細胞因子」）およびＴＮＦ−α存在下で培養することにより、未成熟ＤＣが得られる。また、未成熟樹状細胞は、Ｎｅｓｔｌｅら（１９８８）Ｎａｔ． Ｍｅｄ．　４，３２８等に記述されているように、新鮮な血液から直接得ることもできる。前もって形成されたＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｃ−　ＤＣ［Ｏ−Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８２，４８７−４９３］ならびにＭ−ＤＣ８−　ＤＣ［Ｓｃｈａｋｅｌら（１９９９）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　６７，２８７−２９０］もまた血液中に存在する。これらのＤＣもまた血液から単離して、さらに本発明の方法に用いることができる。
【００１２】
培養培地中の種々の成熟刺激剤の好ましい濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲内である。本発明の特に好ましい成熟化カクテル用には、成熟刺激剤の濃度は０．１から１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、０．１から１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、０．１から１０μｇ／ｍｌのＰＧＥ_２、および０．１から１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αである（最も好ましくは、これら特定の成熟刺激剤の濃度はおよそ１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ_２、および１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αである）。ここに記述した濃度は、ＤＣが培養されている細胞培養培地中の上記物質の最終濃度である。上記活性物質の存在下でＤＣを成熟させる１つの可能性は、単球馴らし培地（ＭＣＭ）の存在下で未成熟ＤＣを培養することである。ＭＣＭは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αを含む。ＭＣＭは、サイトカインを含まない培地でＰＢＭＣを、例えばＲｏｍａｎｉら（１９９６）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９６，１３７に記述されているように培養することによって得ることができる。ＤＣをＭＣＭによって成熟させる場合、培養培地は１から１００％、好ましくは５から２５％のＭＣＭを含む。本発明の別の実施態様においては、ＤＣの成熟化はＭＣＭおよび規定された量のＰＧＥ_２を添加することによって達成される。すなわち、考えうる最良の方法でＤＣを成熟させるＭＣＭの能力の変動は、ＰＧＥ_２の添加（好ましくは上記の濃度で）によって釣り合わせることが可能であることが見いだされた。しかし、本発明によれば、上記物質ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αの規定された最適量を添加することによってＤＣを成熟させることが好ましい。これは、この成熟化組成物が個々の活性物質の精製品から調製されることを意味する。それによって、ＭＣＭまたはＭＣＭ＋ＰＧＥ_２を用いた成熟化と比較して、よりよい結果が得られる。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αは、ＧＭＰ（「医薬品製造管理および品質管理基準　”Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”」）級のものが得られる。通常、成熟化は上記物質の存在下で少なくとも１時間、好ましくは２時間、そしてより好ましくは少なくとも６時間培養することによって実施される。本発明の方法に関して特に好ましいのは、成熟させる時間が６〜９６時間、好ましくは１８〜３６時間（出発材料として白血球成分採取物を用いる場合）または３６から６０時間（出発材料として新鮮な血液または軟膜を用いる場合）である。
【００１３】
本発明によれば、上記の成熟ステップの間に、および／またはその後で、ＤＣを少なくとも１つの抗原または抗原−抗体複合体に負荷する。本発明によれば、抗原負荷は、凍結の間、または凍結後で実施することができる。凍結後に実施する場合は、融解した後でのみＤＣを抗原に負荷する。しかし、好ましいのは、ＤＣを凍結する前に抗原に負荷することである。これは、融解後、直ちにＤＣを使用できるという利点を有する。
【００１４】
本出願において意味する抗原とは、タンパク質、タンパク質断片、ペプチドおよびそれらから誘導される分子（例：グリコシル化化合物または他の化学修飾を有する化合物）であるが、それらをコードする核酸、ウイルス、全ての原核または真核細胞またはそれらの断片、またはアポトーシス性細胞をもいう。「抗原を負荷する」とは、ＤＣの細胞表面に存在するＭＨＣ分子にペプチドを「提示」させる、すなわち、ペプチドがＭＨＣ分子と複合体を形成するプロセスを意味する。特定のペプチドを介して、ＭＨＣ分子を直接負荷することは可能であるが、タンパク質（またはタンパク質断片）は最初にプロセシングされる、すなわち細胞に取り込まれる必要がある。該タンパク質の細胞内での切断およびＭＨＣのペプチドへの負荷の後に、ＭＨＣ　ＩＩ−ペプチド複合体が細胞表面に提示される。適切な抗原としては、主として、タンパク質またはタンパク質断片が含まれる。該タンパク質は天然起源のものでも、組換えによって産生されたものでもよい。成熟化およびタンパク質抗原の負荷によって、加えられた抗原のペプチド断片を含むＭＨＣ　ＩＩ−ペプチド複合体が細胞表面に形成される。培養培地中のタンパク質抗原の濃度は、通常、０．１から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１から５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から１０μｇ／ｍｌである。
【００１５】
上記抗原としてタンパク質（すなわち、５０個以上のアミノ酸残基を有するポリペプチド）を用いる場合、負荷は好ましくはＤＣの成熟の間に実施される。これは、ＭＨＣ　ＩＩ分子による抗原断片の特に効果的な提示をもたらす。該タンパク質（断片）は、成熟期間の全部を通じて存在する必要はないが、該期間の少なくとも一部分で、成熟化組成物および該タンパク質（断片）の両方が同時に存在する必要がある。タンパク質抗原の例としては、陽性対照抗原として広範に用いられているＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）、腫瘍抗原の１例としてのＭＡＧＥ−３タンパク質、およびウイルス性疾患の治療に適切なタンパク質の例としてのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはＨＩＶ−１　ｇｐ１６０が含まれる。
【００１６】
負荷が「短いポリぺプチド」またはタンパク質断片（例えば、ＤＣ表面上のＭＨＣ分子に正確に適合する、アミノ酸残基の数が５０個までの短いポリペプチド）を用いて実施される場合、上記のような成熟期間中の負荷以外に、成熟化後、すなわち、凍結前または融解後に負荷することも可能である。そのように成熟化後に負荷する場合は、短いポリペプチドを洗浄したＤＣに添加する。
【００１７】
抗原負荷の別の可能性は、培養培地へのアポトーシス性細胞または溶解した細胞の添加である。添加された細胞は、ＤＣによって貪食されうる。この方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に加えてクラスＩ分子にも抗原を効果的に負荷できるという利点を有する。例えば、タンパク質（特に粒状性のもの）を添加した場合でも、ＭＨＣクラスＩ分子上で提示が起こるということが示された。例えば、ＤＣをＭａｇｅ−３腫瘍タンパク質またはペプチドの存在下で培養する代わりに、Ｍａｇｅ−３を含有する（壊死性またはアポトーシス性腫瘍細胞の）細胞断片をＤＣに添加することが可能である。
【００１８】
ＤＣを例えば腫瘍細胞と融合させることによっても、ＤＣに抗原を負荷することが可能である。そのような融合は、ポリエチレングリコールを用いて、またはエレクトロポレーションにより可能である。
【００１９】
本発明の別の実施態様においては、ＤＣをトランスフェクトする、またはウイルス感染させることによってＤＣを抗原に負荷する。これによって、抗原をコードする核酸がＤＣに導入されるか、または発現が誘導される。例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡトランスフェクションまたはアデノウイルスによる感染を適切な方法で実施することができる。それによって、ＭＨＣクラスＩ分子の負荷が可能である。例えば、腫瘍細胞から調製したＲＮＡをトランスフェクトすることも可能である。トランスフェクションのためには、エレクトロポレーション等の通常の方法が使用できる。
【００２０】
上述のように、特定の抗原ペプチド（すなわち、「短いポリペプチド」）を成熟期間中または成熟期間後に添加して、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子も直接負荷することができる。このペプチド抗原は、成熟化組成物を添加する前に添加してもよいが、好ましくは同時に、または該組成物の後で添加される。抗原負荷は、好ましくは少なくとも１０分間、より好ましくは１〜２４時間、最も好ましくは３〜１２時間実施される。
【００２１】
上記ペプチド（すなわち、「短いポリペプチド」）は、通常、少なくとも８個のアミノ酸を有する。好ましくは、そのようなペプチドは８〜１２個のアミノ酸（ＭＨＣ　Ｉ）または８〜２５個のアミノ酸（ＭＨＣ　ＩＩ）を有する。負荷のための培養培地における該ペプチドの濃度は、通常、０．０１から１０００μＭ、好ましくは０．１から１００μＭ、最も好ましくは１から２０μＭである。
【００２２】
ＭＨＣ分子によって提示されうる全てのペプチドは、用いるべきペプチドと考えることができる。好ましいのは、病原体由来のタンパク質に由来するペプチドである。それらは天然に存在するアミノ酸配列の変異を示すペプチドであってもよい。そのような変異は、通常、１つ以上のアミノ酸置換である。ペプチド抗原の例としては、アミノ酸配列ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）を有するインフルエンザマトリックスペプチド（ＩＭＰ）または配列ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２）を有するＭｅｌａｎ−Ａ−類似体ペプチドが挙げられる。他の使用可能なペプチドの例を図２６に示す。
【００２３】
ＤＣに抗原を負荷するためには、「ペプチド／タンパク質パルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）」の他に、「ペプチド／タンパク質トランスローディング（ｔｒａｎｓｌｏａｄｉｎｇ）」を行うこともできる。
【００２４】
上述のように、ＤＣを抗原−抗体複合体に負荷することも可能である。この目的のために適切な抗原としては、上に記述した抗原の全てが含まれる。本発明による「抗原−抗体複合体」とは、上記のような抗原と適切な抗体との複合体、例えば、抗原−ＩｇＧまたは抗原−ＩｇＥ複合体をいう。ＤＣにこのような抗原を負荷することは、本明細書において参照される、Ｒｅｙｎａｌｔ， Ａ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．　１８９（２）：３７１−８０（１９９９）に記述されている。
【００２５】
ＤＣを成熟させ、そして場合により抗原を負荷した後、成熟ＤＣを凍結用培地中で凍結することができる。血清成分に加えて、凍結用培地は１つ以上の凍結保護剤をさらに含むことができる（例えば、０．１から３５％（ｖ／ｖ）、好ましくは５から２５％（ｖ／ｖ））適切な凍結保護剤としては、好ましくは、以下の化合物が含まれる：ＤＭＳＯ、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセリン一酢酸、無機塩等。好ましい凍結保護剤はＤＭＳＯであり、これは凍結用培地中に好ましくは５から２５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１０から２０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約１０％の濃度で含まれる。凍結用培地は、非異種血清成分を好ましくは２から９０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５から８０％（ｗ／ｖ）の濃度で含むことができ、ヒト血清アルブミンでは、好ましくは１０から３０％（ｗ／ｖ）の濃度で含むことが特に好ましい。しかし、より好ましくは、凍結用培地がヒト血清アルブミンの代わりに自己血清または血漿を含むことである。凍結用培地は、ヒトの同種異系血清またはプール血清を含んでもよい。また、凍結用培地は、添加物として炭水化物由来の１つ以上のポリオール化合物、特にグルコース、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、エリトリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、Ｄ−ラクトース、等から選択されるものを、好ましくは２から３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５から１０％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは約５％（ｗ／ｖ）の濃度で含むことができる。最も好ましい凍結用培地は、約１０％のＤＭＳＯおよび約５％のグルコースを添加した純粋な自己血清である。通常、凍結に先立って細胞を遠心にかけて濃縮し、それから凍結用培地に入れる。
【００２６】
凍結用培地中の好ましい細胞濃度は、１から１００×１０^６個／ｍｌ、最も好ましい濃度は約５×１０^６個／ｍｌから２０×１０^６個／ｍｌである。
【００２７】
凍結前または融解後にＤＣを抗アポトーシス分子に接触させることによりＤＣの生存率が増大するということもまた見いだされた。したがって、本発明の方法の好ましい実施態様においては、凍結前または融解後に、ＤＣをアポトーシスを阻害できる分子と接触させる。好ましい抗アポトーシス分子としては、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）［Ｍｏｒｒｉｓら（１９９９）Ｊ． Ｂｉｌｏｌ． Ｃｈｅｍ．　２７４，４１８］、ＴＲＡＮＣＥ［Ｗｏｎｇら（１９９７）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．　１８６，２０７５］またはＲＡＮＫＬ［Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３９０，１７５］が含まれる。好ましくは、これらの分子の少なくとも１つをＤＣの凍結前または融解後に少なくとも１０分間、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも４時間、凍結用培地に添加する。凍結用培地中の好ましい濃度は、１ｎｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌ　（ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ）および１ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ　（ＣＤ４０Ｌ）である。特に好ましい濃度は、０．５から１μｇ／ｍｌ　（ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ）および０．１から０．５１μｇ／ｍｌ　（ＣＤ４０Ｌ）である。
【００２８】
本発明の方法の１つの好ましい実施態様においては、ＤＣは免疫抑制性インターロイキン１０（ＩＬ−１０）またはビタミンＤ３もしくはその誘導体、フマル酸もしくはその誘導体（エステル等）、ミコフェノール酸モフェチル、等の他の免疫／成熟調節剤の存在下でさらに培養される。このように処理した細胞は、免疫系を刺激するためではなく、特定の抗原に対する耐性を誘導する場合に用いられる。このような調節剤およびＩＬ−１０の培地中における濃度は、１から１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０から１００ｎｇ／ｍｌである。
【００２９】
実施態様（４）によれば、本発明はまた、本発明の方法により得られるワクチンに関する。抗原負荷、成熟ＤＣに加えて、本発明のワクチンはさらに、製薬上許容されるアジュバントを含有する。本発明のワクチンを融解した後、製薬上許容される、投与にとって有利な種々の物質が添加される。
【００３０】
実施態様（３）によれば、本発明はまた、凍結された、抗原負荷、成熟樹状細胞に関する。本発明によるこれらの細胞は、該細胞に加えてヒトへの投与に適切な通常の添加剤を含む医薬組成物の一部である。
【００３１】
本発明は、抗原を負荷した成熟ＤＣを含み、かつ凍結させることができるワクチンを初めて提供する。本発明の本質的な利点は、融解後のＤＣの生存率が非常に高いことである。凍結ＤＣの融解後、凍結ＤＣの数に基づいて７５％を超える、好ましくは８５％を超える生存ＤＣが通常得られる。融解ＤＣのこのような高い生存率は、ＦＣＳの添加なしでは以前には達成されなかった。しかし、これは効果的な免疫刺激を達成するための重要な必須条件である。成熟した、抗原を負荷したＤＣを凍結する実質的な利点は、１つのワクチンの多数のアリコートを調製し、凍結できることである。したがって、該ワクチンは必要な時に直ちに使用可能であり、そして長時間の培養ステップなしで極めて短時間のうちに投与することが可能である。凍結および融解させた後で初めて成熟ＤＣを抗原に負荷することによって、個々の状況に応じて変動的にＤＣを抗原に負荷することができる。例えば、ワクチンに使用されたペプチドの１つに対して過剰刺激またはアレルギーが起こる場合は、このペプチドを負荷から除外することができる。
【００３２】
驚くべきことに、ＤＣを凍結するための適切な方法を見出すためには、直接的な凍結パラメータ（凍結用培地および冷却速度、等）を変化させ、そして融解直後の生存率を測定するだけでは十分ではないことが判明した。この直後生存率は、サイトカインの非存在下で数日間培養している間は、新たに調製されたＤＣの生存と必ずしも一致しない。
【００３３】
むしろ、成熟プロセスまたは凍結に先立って用いられた成熟刺激剤が、細胞の生存に重大な役割を果たす。したがって、本発明は、本発明による刺激剤はＤＣの完全な成熟をもたらすばかりでなく、他の刺激剤によって成熟させたＤＣよりも良好に生存するＤＣをももたらす、という認識にも基づいている。今日まで、凍結の点から成熟刺激剤が考慮されることは全くなかった。
【００３４】
ＤＣの凍結プロセスを最適化するための優れた方法は、異なる成熟刺激剤によってＤＣを成熟させ、そしてリードアウトとしてのサイトカインを全く添加せずに完全培地で培養した後の生存を試験することである、ということもまた見いだされた。最大の生存可能ＤＣを誘導する成熟刺激剤が、凍結させるべきＤＣの調製に用いられる。
【００３５】
したがって、本発明の別な態様は、ＤＣの凍結に有利な条件を見いだす方法である。この方法では、未成熟ＤＣを用意し、種々の成熟刺激剤の存在下で培養する；次に、細胞をサイトカイン含有または不含培地で（好ましくは不含培地で）培養し、該サイトカイン含有または不含培地で少なくとも１日培養した後、生存細胞の画分を測定し、そして最後に、ＤＣの最も高い生存率をもたらした成熟刺激剤を決定する。次に、この成熟刺激剤を凍結させるべきＤＣの調製に使用する。好ましくは、生存細胞の数はサイトカイン不含培地で少なくとも２日間、最も好ましくは３日間培養した後に測定される。
【００３６】
以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【００３７】
【実施例】
（実施例１）
新たに調製した未成熟ＤＣおよび異なる成熟刺激剤によって成熟させたＤＣの生存率を測定した。
【００３８】
以下の異なる成熟刺激剤を試験した：
−　［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］に記載されているように調製し、使用した、単球馴らし培地；
−　１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＮＦ−α；
−　１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＮＦ−α＋１μｇ／ｍｌ　ＰＧＥ_２；
−　１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＮＦ−α＋１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−１β＋１００Ｕ／ｍｌ　ＩＬ−６＋１μｇ／ｍｌ　ＰＧＥ_２（「成熟化カクテル」）；
−　１μｇ／ｍｌまでのウマ流産菌（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ）のＬＰＳ；
−　２本鎖ＲＮＡ（ポリ−Ｉ：Ｃ，２０μｇ／ｍｌ）；
−　５０−１０００ｎｇ／ｍｌ　ＣＤ４０Ｌ。
【００３９】
ＰＢＭＣからの単球由来ＤＣの調製：完全培地として、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２ｍＭグルタミンおよび熱で不活性化した（５６℃、３０分）、１％自己ヒト血漿を含むＲＰＭＩ　１６４０を用いた。白血球成分採取物は、健常な血球アフェレーシスのドナー由来の単球分離物として、［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］に記載されているように調製した。次に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ中で遠心により単離し、［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］に記載されているように、ＰＢＭＣのプラスチック付着画分からＤＣを調製した。この目的のため、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）を含む完全培地中で培養することによって未成熟ＤＣを得た。６日目に、上記の異なる成熟刺激剤をＤＣに添加し、そして７日目に成熟ＤＣを回収し、サイトカインの非存在下でさらに２日間培養した。培養２日後の生存率（播いたＤＣに対する百分率）は：
未成熟ＤＣでは３８．２５％；
（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＰＧＥ_２＋ＴＮＦ−α）により成熟させたＤＣでは７６．２％；
ＴＮＦ−αで成熟させたＤＣでは１３．５％；
（ＴＮＦ−α＋ＰＧＥ_２）により成熟させたＤＣでは３７．０％；
（ポリ−Ｉ：Ｃ）で成熟させたＤＣでは３１．８％；および
ＣＤ４０Ｌ（５００ｎｇ／ｍｌ）で成熟させたＤＣでは４９．６％であった。
【００４０】
差は統計的に有意であった。
【００４１】
（実施例２）
成熟ＤＣ（７日目）を以下のように凍結した。すなわち、凍結容器中で、ＤＣを異なる濃度（ｍｌあたり５、２０、４０、６０および１００×１０^６）で、純粋な自己血清または２０％ヒト血清アルブミン［ＨＳＡ；２００ｇのヒト血漿タンパク質（少なくとも９５％のアルブミンを含む）を添加した１０００ｍｌの電解質溶液からなる；ＤＲＫ Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ Ｂａｄｅｎ−Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇ， Ｂａｄｅｎ−Ｂａｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ］中に再懸濁した。形成されたＤＣ懸濁液を、以下に記述する異なる凍結用溶液と１：１で混合し、直ちに１．０または１．８ｍｌの凍結容器に移した。その後、凍結容器を「Ｃｒｙｏ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ」（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｃｒｙｏ １℃ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ、冷却速度：−１℃／分）中で−８０℃まで冷却し、最終的に液体窒素の気相中に移し、そこで最大７ヶ月間保存した。
【００４２】
ａ）凍結用培地
−ＨＳＡ＋ＤＭＳＯ±グルコース［２０％　ＨＳＡ溶液（上記参照）＋１０、１５、２０および２５％（ｖ／ｖ）　ＤＭＳＯ±２、４、６、１０、２０または３０％（ｖ／ｖ）の割合で添加されたグルコース（Ｇｌｕｋｏｓｔｅｒｉｌ ４０％^ＴＭ， Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ， Ｇｅｒｍａｎｙ；有効成分：グルコース一水和物）からなる］；
−血清＋ＤＭＳＯ±グルコース［純粋な自己血清＋２０％（ｖ／ｖ）　ＤＭＳＯ±２、４、６、１０、２０または３０％の割合で添加されたグルコース］；
−Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ^ＴＭ［滅菌水に溶解した３８％グリセリン、２．９％ソルビトールおよび０．６３％塩化ナトリウムからなるＥｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ^ＴＭ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ， Ｄｒｅｉｅｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）］；
−Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ^ＴＭ＋ＤＭＳＯ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ， Ｄｒｅｉｅｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ； ０．９％塩化ナトリウム溶液中の６％ヒドロキシエチルスターチからなる；通常、赤血球の沈降に用いられる）＋１０または１５％（ｖ／ｖ）　ＤＭＳＯ。
【００４３】
ｂ）融解条件
凍結した成熟（７日目）ＤＣを融解するために、下記の４つの方法を検討した：
１．ＤＣを５６℃の水浴中で融解し、次に洗浄せずにテフロンディッシュ（Ｒｏｔｉｌａｂｏ ｂｏｘｅｓ， Ｒｏｔｈ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の中で１０から２０ｍｌの氷冷完全培地（８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌ　ＩＬ−４を添加したもの）中で、３７℃で５％　ＣＯ_２のもとで２時間インキュベートし、次に回収して、１５０×ｇ、２２℃で１０分間遠心した。続いて、細胞数をカウントし、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む完全培地を入れたテフロンディッシュに再度播き（細胞密度１×１０^６／ｍｌ）、一晩培養した。翌日、後で使用するために細胞を回収した。
【００４４】
２．凍結した成熟（７日目）ＤＣを上記１に記述したように融解した。そして、テフロンディッシュ上で、３７℃で５％　ＣＯ_２のもとで２時間放置期間を置いた後、後で使用するために細胞を回収した（１５０×ｇ、２２℃で１０分間遠心）。
【００４５】
３．凍結した成熟（７日目）ＤＣを上記１に記述したように融解した。そして、組織培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）上で３７℃で５％　ＣＯ_２のもとで２時間放置後、後で使用するために細胞を回収した（１５０×ｇ、２２℃で１０分間遠心）。
【００４６】
４．凍結した成熟（７日目）ＤＣを５６℃の水浴中で融解し、１０ｍｌの氷冷”Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ”（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔａｋｅｒ）に添加し、直ちに１３３ｇで４℃で１２分間遠心した。次に、後で使用するために細胞を回収した。
【００４７】
ｃ　ＤＣ生存率の決定
完全培地中でＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加せずに少なくとも４日間培養することによって凍結融解したＤＣの生存率を調べ（「洗い流し試験」）、［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］に記載されているように、ＰＢＭＣの非凍結または凍結アリコートから新たに調製されたＤＣの生存率と比較した。生存ＤＣのそれぞれの量は、細胞カウンター（Ｃａｓｓｙ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｍｏｄｅｌ ＴＴ， Ｓｃｈａｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ；このシステムは「パルス領域分析」を用いており、細胞数、細胞サイズおよび容量ならびに生存細胞が存在するかどうかの決定を可能とする）により測定し、また対照として標準トリパンブルー染色により測定した。
【００４８】
まず、ＤＣ濃度の影響を調べたところ、成熟ＤＣが１０×１０^６個／ｍｌの濃度で凍結した時に最良の結果が得られた。この結果を図１に示す。
【００４９】
さらに、ＤＭＳＯ濃度（最終濃度５から１２．５％　ｖ／ｖ）の影響を調べた。ＤＭＳＯ濃度の変化は、融解したＤＣの生存率に重大な効果を何ら及ぼさなかった。
【００５０】
さらに、ＨＳＡまたは純粋な自己血清がより良好な生存率をもたらすかどうか、およびグルコースの添加（最終濃度ｖ／ｖが１、２、３、５、１０および１５％）が生存率を向上させるかどうかを調べた。結果を図２に示す。ＨＳＡを自己血清で置き換えた場合、数日後のＤＣの生存率は再現的に上昇した。最終濃度５％（ｖ／ｖ）でグルコースを添加することは、結果をさらに改善した。
【００５１】
Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ^ＴＭまたはＣｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）等の市販の種々の凍結培地もまた検討した。しかし、これらは、すでに試験した凍結用培地と比較してより悪い結果をもたらした。
【００５２】
また、細胞が融解後に受けるストレスを最小限にするため、下記のｂ）に記述する種々の融解条件を検討した。試験した４つの方法はいずれも、他の方法に対して明らかな優越性を示さなかった。
【００５３】
成熟（７日目）ＤＣ細胞を実施例１に記述するように調製し、そして下記の条件下で凍結した：
冷却速度１℃／分、純粋な自己血清＋１０％　ＤＭＳＯ＋５％グルコース中、細胞密度１０×１０^６個／ｍｌ。液体窒素の気体相中に少なくとも３時間保存した後、細胞を融解した。融解後、生存ＤＣの百分率を直接測定した（＝Ｄ７）。ＤＣのアリコートを播き、そして実施例１ｃ）に記述するようにサイトカイン不含倍地中で培養し、４日後まで生存率を測定した（「洗い流し試験」）（ｎ＝２０）。結果を下記の表に示す。
【００５４】
【表１】
融解後（７日目）および「洗い流し試験」（８から１１日目）における凍結／融解ＤＣの収率

（実施例３）
最適に成熟させ、凍結したＤＣは、生存率およびＴ細胞刺激活性に関して新たに調製したＤＣと同等である。
【００５５】
ａ）まず、凍結し、再融解したＤＣの生存率が、同一ドナーから新たに調製したＤＣの生存率と同等であるかどうかを調べた。したがって、「洗い流し試験」が実施例２ｃ）に記述するように用いられた。結果を図３に示す。融解ＤＣと同一のドナーから新たに調製したＤＣとの間に全く差がないことが見いだされた。
【００５６】
また、融解ＤＣの形態および表現型を新たに調製したＤＣのそれと比較した。細胞の形態は、倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｋａ ＤＭ ＩＲＢ， Ｌｅｉｋａ Ｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｅ ｕｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ， Ｗｅｔｚｌａｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検査し、写真に記録した。細胞集団の表現型は、一連のモノクローナル抗体によって検査し、そしてＦＡＣＳｃａｎ装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）を用いて、［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］に記載されているように調べた。死滅細胞を、それらの光分散特性によって選別した。結果を図４および５に示す。凍結し、再融解したＤＣもまた、それらの特徴的な形態特性および表現型を数日間にわたって保持する。
【００５７】
ｂ）次に、再融解したＤＣがそれらの機能特性をも維持しているかどうかを調べた。
【００５８】
１．したがって、再融解したＤＣが、新たに調製された非凍結成熟ＤＣと同じほど効果的に一次同種異系ＭＬＲを誘導できるかどうかを調べた。この試験を、［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］に記載されているように実施した。ＤＣを段階的な用量で平底９６ウエルプレート中のウエルあたり２×１０^５個の同種異系Ｔ細胞に添加し、（ゲンタマイシン、グルタミン、および５％同種異系熱不活化ヒト血清（プール血清）を添加た）ＲＰＭＩ　１６４０中で４〜５日間共培養した。そして、共培養の最後の１２から１６時間に^３Ｈ−チミジン（最終濃度４μＣｉ／ｍｌ）を添加することにより増殖を測定した。結果を図６に示す。凍結し再融解したＤＣは、新たに調製した成熟ＤＣと同じくらい効果的に一次同種異系ＭＬＲを誘導する。
【００５９】
２．凍結し再融解したＤＣがいかに効果的に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導できるかもまた調べた。この目的のため、ＩＭＰ（インフルエンザマトリックスペプチド）をパルスした成熟ＤＣによるＩＭＰ特異的ＣＴＬの誘導を測定した。このアプローチは、Ｔ細胞の助けおよび外因性ＩＬ−２が無い状態で実施した場合、成熟ＤＣに特異的である。（業者Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙの仕様に従ってＣＤ８マイクロビーズを用いて、磁気セルソーティング／ＭＡＣＳによってＰＢＭＣより単離された）精製ＣＤ８＋　Ｔ細胞の刺激によって、または非付着性ＰＢＭＣ画分を（ＨＬＡ−Ａ２．１＋ドナー由来の自己ＰＢＭＣより調製された）ＤＣと共に用いた他の実験において、インフルエンザマトリックスＡ２．１ペプチド（ＩＭＰ）またはＭｅｌａｎ−Ａ　Ａ２．１ペプチドに特異的なＣＤ８＋　Ｔ細胞の誘導がもたらされた。上記の他の実験において、非付着性ＰＢＭＣ画分およびＤＣは、パルスしないか、またはＨＬＡ−Ａ２．１制限ＩＭＰ（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ［配列番号１］、１０μＭ、１時間、３７℃、完全培地ｍｌあたりＤＣ　１×１０^６個）もしくはＭｅｌａｎ−Ａ類似体ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ［配列番号２］、１０μＭ）を用いて、ＤＣ：Ｔの比が１：１０または１：３０で、７日間サイトカインを添加せずにパルスした。標準的溶解アッセイ［Ｂｈａｒｄｗａｊら（１９９４）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．　９４，７９７］または３７℃での四量体染色［Ｗｈｅｌａｎら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６３，４３４２］によりＣＴＬを定量した。標準的４時間^５１Ｃｒ放出アッセイ、これはエフェクター／標的細胞比を様々に変えて実施されるが、この標的細胞はＩＭＰでパルス（１０μｇ／ｍｌ、１時間、３７℃）したＴ２Ａ１細胞、パルスしていないＴ２Ａ１細胞およびＫ５６２標的細胞であった（すべて^５１Ｃｒで標識した）。全ての実験は、ナチュラルキラー細胞活性をブロックするため、８０倍過剰のＫ５６２細胞を用いて実施した。特異的溶解％は、（特異的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００という式により計算した。可溶性ＩＭＰおよびＭｅｌａｎ−Ａ／ＨＬＡ　Ａ２．１四量体を調製し、Ｔ細胞の形成を３７℃におけるフローサイトメトリーにより、（Ｗｈｅｌａｎら、１９９９）により記述されているように分析した。１μｌの四量体（０．５から１ｍｇ／ｍｌ）を約６０μｌ（遠心にかけ、上清を捨てた後に容器に残っている容量）の、ゲンタマイシン、グルタミンおよび５％の同種異系熱不活化ヒト血清（プール血清）を添加したＲＰＭＩ　１６４０からなる培地中にある２×１０^６個の細胞に、１５分間、３７℃で添加した。次に、細胞を洗浄せずに冷却し、そして３重に染色したヒトＣＤ８に対するモノクローナル抗体（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に氷上で１５分間インキュベートした。３回の洗浄ステップの後、細胞をＦＡＣＳｃａｎ装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【００６０】
結果を図７および８に示す。
【００６１】
ＤＣの凍結および融解は、成熟ＤＣの強いＩＭＰ特異的ＣＬＴ応答を誘導する能力を変えない。また、ＨＬＡ−Ａ２．１／ペプチド四量体分析によって示されるように、凍結および融解は、成熟ＤＣの強いＩＭＰ特異的ＣＤ８＋　Ｔ細胞応答を誘導する能力を変えない。
【００６２】
これらの実験は、凍結および融解後に、新たに調製されたＤＣと完全に同等の生存ＤＣが得られたことを示している。
【００６３】
（実施例４）
凍結および再融解したＤＣの生存率を増加させるため、以下の異なる抗アポトーシス刺激剤をＤＣに異なる濃度で、異なる時点で添加した：
１．組換えマウスまたはヒト三量体ＴＲＡＮＣＥ［Ｗｏｎｇら（１９９７）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．　１８６，２０７５］を１００、２００および５００ｎｇ／ｍｌの濃度で；
２．ＲＡＮＫＬ［Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３９０，１７５］を１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度で；
３．三量体可溶性ＣＤ４０Ｌ［Ｍｏｒｒｉｓら（１９９９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．　２７４，４１８］を５０、１００および５００ｎｇ／ｍｌの濃度で。
【００６４】
ＤＣを異なる抗アポトーシス刺激剤に３７℃で、凍結に先だつ培養の最後の１２−１６時間の間一晩、凍結に先立って４時間（細胞密度：ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む完全培地中１×１０^６個）、および融解後４時間（細胞密度：ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む完全培地中１×１０^６個）さらした。
【００６５】
融解したＤＣを抗アポトーシス刺激剤に短時間さらすことは、凍結前にＤＣを処理することと同じくらい効果的であり、生存率を増加させた。しかし、これはしばしば「洗い流し試験」では３日後になって初めて目に見えるようになった。ＣＤ４０Ｌ（図９）およびＴＲＡＮＣＥ／ＴＡＮＫＬ（結果は示していない）は、類似の成果をもたらした。ＣＤ４０ＬまたはＴＲＡＮＣＥ／ＴＡＮＫＬの添加により、ＤＣの生存率が３日目以降に向上することを結果は示している。
【００６６】
（実施例５）
凍結前にＤＣに抗原をうまく負荷できるかどうかを調べるため、ＤＣを（タンパク質抗原の例として）破傷風トキソイド（ＴＴ）に、または（モデルペプチドとして）ＩＭＰに負荷した。ＴＴをパルスするため、白血球成分採取物由来のＰＢＭＣの新鮮または凍結アリコートからＤＣを調製した（上記参照）。５日目にＴＴを未成熟細胞に１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。７日目に成熟細胞を回収し、そして凍結しないで、または凍結融解後（４時間後）にＰＢＭＣ中でＴＴ特異的増殖性応答を誘導する能力について調べた。すなわち、パルスしていない、およびＴＴをパルスしたＤＣの段階的な量をＰＢＭＣ（１０×１０^４個／ウエル）に添加し、そして［Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２２３，１］に記載されているように、５日目に^３Ｈ−チミジンをパルスした。ＩＭＰを負荷するため、凍結前または融解後に、１０μＭのペプチドをＤＣにパルスした（１時間、３７℃、完全培地ｍｌあたり１×１０^６個のＤＣ）。ＩＭＰをうまく提示する能力を上記のように試験した。
【００６７】
凍結した、ＴＴをパルスしたＤＣは、新たに調製した、ＴＴをパルスしたＤＣと同一の刺激特性を有していた（図１０）。凍結前にＩＭＰまたはＭｅｌａｎ−Ａを負荷したＤＣ、および融解後に負荷したＤＣの両方とも、ＩＭＰまたはＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＴＬを等しく良好に刺激した（図８および１１）。これらの結果は、すでに抗原を負荷してあり、融解後直ちに使用できる、成熟ＤＣの凍結アリコートを調製することが可能であることを示している。
【００６８】
（実施例６）
病期ＩＶの黒色腫患者に、本明細書に記述する方法に従って調製して抗原を負荷した、ペプチドおよびタンパク質を負荷したＤＣを用いてワクチン接種を行った。図１２は、ワクチン接種を受けた全患者におけるＫＬＨに対する１型ヘルパー細胞応答の誘導を示す。各患者は、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４および本願に記述する成熟化組成物（例：図１および３）を用いて、白血球成分採取物から調製された４００万個の成熟ＤＣを皮下に１回注入された。その際に、対照抗原であるＫＬＨを１０μｂ／ｍｌの濃度で成熟化組成物と同時に添加し、そしてＤＣを小分けして凍結させた。ワクチン接種前、および上記４００万個のＤＣを１回投与した１４日後に、血液を採取し、標準的Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ（１００μｇ／ｍｌのＫＬＨを５００，０００個のＰＢＭＣに添加し、インターフェロンγまたはＩＬ−４を産生する細胞の数を測定する；ＫＬＨを添加しないバックグラウンド値は、ほぼ０である）によって検査した。ワクチン接種前には、ＫＬＨ提示後、インターフェロンγもインターロイキン４も産生されないことが判明した。他方、ＫＬＨを負荷したＤＣで１回ワクチン接種を行った１４日後には、全患者において、インターフェロンγを産生するがインターロイキン４は産生しないか、またはごく少量しか産生しないＴ細胞が誘導された（対照実験において、ＰＢＭＣからＣＤ４細胞を除去することによって、反応性細胞はＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞であることが示された）。
【００６９】
（実施例７）
実施例６の試験に参加した患者の１人は、ＤＣによるワクチン接種を数回受けた。そのワクチン接種において、各４００万個の再融解ＤＣは図１３、１４または１５に記載のペプチド（すなわち、各４００万個のＤＣにつき、たった１つのペプチド）が負荷されており、皮下に注射された。初回ワクチン接種の前、および前のワクチン接種の１４日後で次のワクチン接種の直前に、それぞれ血液を採取し、そしてＴｈｕｒｎｅｒら（１９９９）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．　１９０，１６６９−１６７８の「材料および方法」に記述されているように標準的Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを実施した。ワクチン接種に用いたＤＣは、図８および１１の説明および実施例５に記述するように調製し、それぞれのペプチドを融解後に負荷した。図１３−１５から分かるように、数個のクラスＩ（図１３および１４）およびクラスＩＩペプチド（図１５）に対する免疫が誘導された。使用したペプチドの特徴は表Ｉからわかる。この特定の患者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ　２．１＋およびＨＬＡ−Ａ３＋ならびにＨＬＡ−ＤＲ　１３＋、ＨＬＡ−ＤＰ４＋（しかしＤＲ４−）であることに注意すべきである。図１３は、１回のワクチン接種後の、インフルエンザペプチドＮＰ−Ａ３およびＩＭＰ−Ａ２に対する免疫の誘導を示し（図中Ｎｏ．２は、ワクチンＮｏ．２投与の少し前の採血およびＥｌｉｓｐｏｔ測定を意味する）、そして次のワクチン接種後の増大をしめしている。しかし、ワクチン接種に用いなかったＥＢＶ−Ａ２およびＩＶ−９−Ａ２ペプチドについては全く変化がなかった。図１４は、クラスＩに限定される４つの腫瘍ペプチドに対する免疫の誘導、明確で疑いの余地がないＭｅｌａｎ　Ａ−Ａ２．１に対する誘導を示す。図１５は、クラスＩＩに限定される２つの腫瘍ペプチド（Ｍａｇｅ　３−ＤＲ１３および−ＤＰ４）に対する免疫の誘導を示すが、チロシナーゼ−ＤＲ４およびＧＰ　１００　ＤＲ４に対しては免疫が誘導されないことを示す（患者がＤＲ４陰性であったので、これは陰性対照であり、したがってＤＣにこれらのペプチドを負荷することはできなかった）。
【００７０】
（実施例８）
腫瘍細胞調製物（腫瘍細胞溶解物、壊死性またはアポトーシス性腫瘍細胞）を用いて抗原を負荷した後の樹状細胞の凍結保存
樹状細胞（ＤＣ）は、白血球成分採取物により大量に生成させることができる。ワクチン接種のためにこれらの細胞を分けて使用することを可能とする、成熟ＤＣを凍結保存する方法が開発された。今日まで、成熟ＤＣには、使用前に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の腫瘍抗原決定配列に対応するペプチドを負荷してきた。ここに記述する実験においては（図１６参照）、異なる腫瘍細胞調製物を負荷し、その後成熟させた未成熟ＤＣもまた凍結保存できるかどうかが検討された。
【００７１】
腫瘍細胞調製物：腫瘍細胞調製物を作製するたに、Ｍｅｌ５２６黒色腫細胞株を用いた。Ｍｅｌ５２６細胞をＲＰＭＩで洗浄し、次に５７℃で加熱および液体窒素中で冷却という操作を反復することにより処理した。次に、超音波処理装置によって細胞を破砕した。この加熱／凍結サイクルが壊死を誘導するので、全細胞成分を含有するこの種の腫瘍細胞調製物を以下「壊死性細胞物質」と呼ぶ。溶解物を得るため、我々はこれらのステップの後で超遠心分離を実施して細胞成分を除去し、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心管中でタンパク質を精製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析の結果にしたがって、我々はより高い活性を有するタンパク質画分、すなわち１０ｋＤａ以上のタンパク質画分を用いた。広範囲ＵＶＢ照射装置を用いてアポトーシス性腫瘍細胞を誘導し、アネキシンＶ試験によって確認した。
【００７２】
ＤＣの生成：実験的免疫療法で用いられている技術にしたがって、ＤＣを白血球成分採取物から生成した。ＰＢＭＣをＮｕｎｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓに播き、１０００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５００ＩＵ／ｍｌ　ＩＬ−４を添加したＲＰＭＩ（熱不活化１％自己血漿）を用いて培養した。５日目に、ＤＣ（その時点では未成熟であった）を用い、上記の腫瘍細胞調製物を１：１の濃度で４時間にわたって負荷した。
【００７３】
負荷：５ｍｌのポリプロピレン反応容器中で３７℃で５％　ＣＯ_２のもとで負荷が行われた。負荷後、ＤＣを１２ｍｌの組織培養ディッシュに播き、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＰＧＥ_２からなる成熟化カクテルと共に２４時間培養した。
【００７４】
凍結／融解：それぞれの負荷ＤＣの半分を、それぞれ１．８ｍｌのＮｕｎｃ凍結用バイアル中で−８０℃で３時間、［Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ， Ｂ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４５：１５−２９（２０００）］に記載された方法にしたがって凍結保存した。その後、上記記載の方法にしたがって細胞を再融解し、ＲＰＭＩ培地中で１時間、３７℃で５％　ＣＯ_２のもとで培養した。次に、このＤＣの画分および非凍結画分を分析し、さらなる実験に使用した。
【００７５】
文献に記述されている実験の構成を、図１６にフローチャートとして示す。
【００７６】
細胞数および生存率：上記のような負荷、および凍結保存した後、ＤＣの全細胞数および生存率をトリバンブルーを用い、顕微鏡により測定した。最初に、５×１０^５個のＤＣを用いた。非凍結保存細胞と比較して、負荷と凍結保存を行ったＤＣに前者と匹敵する細胞数を見いだし、また生存率には何ら差を見いださなかった（図１７Ａ、１８Ａ）。凍結保存によるのではなく、負荷による細胞数の減少が、特に壊死性細胞を用いたときに観察できた。
【００７７】
機能性：機能的能力を試験するため、混合白血球反応試験（ＭＬＲ）を実施した。負荷ＤＣを同種ＭＬＲに用いた（同種白血球と共に４日間インキュベーション）。次に、放射活性チミジン（^３Ｈ−チミジン）を１３時間パルスした。凍結保存した、および凍結保存しなかった、負荷ＤＣについて、類似した同種刺激能が得られた（図１７Ｂ、１８Ｂ）。
【００７８】
表現型：抗原提示に関連する表面分子の発現およびＤＣの機能条件を評価するため、対応する抗体を用いてＦＡＣＳ分析を実施した。異なる抗原負荷方法および凍結保存後の両方について、類似した表面発現パターンが見いだされた（図１７Ｃ）。
【００７９】
抗原の直接検出：腫瘍抗原の直接的検出のため、ＨＬＡ−Ａ１を背景にした、すなわち、Ｍａｇｅ−１ペプチドとＨＬＡ−Ａ１分子との複合体中でＭＡＧＥ−１を認識する抗体を用いた。異なる方法による負荷ＤＣをこの抗体で染色し、ＦＡＣＳで分析した。ペプチドを負荷した（２０μｇのＭＡＧＥ−１ペプチドを３時間／ｍｌ）ＤＣを用いた場合、凍結保存後に、凍結保存しなかった場合に検出されたものに匹敵する、ある程度の率のＭＡＧＥ−１／Ａ１抗原が検出されうることが判明した（図１８Ｃ）。この実験から、凍結保存は抗原の損失をもたらさないと結論できる。
【００８０】
さらなる実験において、異なる負荷方法の効果を確認するために、ＭＡＧＥ−１／Ａ１抗体を用いた。腫瘍細胞調製物（使用した黒色腫細胞株がＭａｇｅ−１抗原を発現する）を用いて、ペプチドパルシングの抗原濃度の約２０％に達する程有意な負荷を達成することができた（図１８Ｄ）。凍結保存前後のＭＡＧＥ−１／ＨＬＡ−Ａ１複合体の発現は、類似した量で検出することができた（未負荷のＤＣのバックグラウンド値に対する陽性率として計算される）。
【００８１】
結論：本発明の方法は、何も負荷していないＤＣまたはペプチドもしくはタンパク質を負荷したＤＣの効果的な凍結保存を可能とするばかりでなく（実施例１−７に示す）、（腫瘍）細胞調製物（単なる壊死性腫瘍細胞、腫瘍細胞から調製された溶解物、またはアポトーシス性腫瘍細胞）を負荷したＤＣの同様に効果的な凍結保存をも可能とする、ということもまた示している。「効果的に」とは、凍結後、ｉ）融解後の細胞損失が非凍結ＤＣと比較して＜２５％である、ｉｉ）融解ＤＣが非凍結ＤＣのそれに匹敵するＴ細胞刺激能を有する（同種ＭＬＲで試験した時に）、およびｉｉｉ）抗原およびＴ細胞受容体のリガンド（すなわち、特異的ＭＨＣペプチド複合体）の表面発現が、凍結および融解プロセスの後で保持される（特定ペプチド／ＭＨＣ複合体、すなわちＭＡＧＥ−１／ＨＬＡ−Ａ１複合体の、この複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた直接検出によるモデルにおいて示される）。
【００８２】
（実施例９）
アデノウイルストランスフェクションによる抗原負荷後の樹状細胞の凍結保存　アデノウイルスをトランスフェクトした樹状細胞は、本発明の方法により、該樹状細胞の特性がトランスフェクトされていない樹状細胞の特性に同等となるように、凍結することができる。この目的のため、成熟ＤＣにグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｃＤＮＡを含むアデノウイルスベクター（ＡＤ５）を多重感染度（ＭＯＩ）５００で２時間感染させた。２回洗浄後、細胞をＨＳＡ、１０％　ＤＭＳＯおよび５％グルコース（最終濃度）中で細胞濃度１０×１０^６個／ｍｌで凍結し、４時間保存した。融解後、細胞の生存率をトリパンブルー色素排除法によって測定した。生存細胞の回収率を凍結ＤＣの百分率として図２０に示す。
【００８３】
さらに、アデノウイルスに感染したＤＣの同種刺激活性は、凍結保存によって変化しないことを示すことができた。成熟ＤＣにＭＯＩ　５００でアデノ−ＧＦＰに感染させ、上記のように凍結保存した。再融解し、２４または７２時間培養した後、樹状細胞を同種異系ＣＤ４＋　Ｔ細胞（ウエルあたり２×１０^５）と共に図２１に記述する条件下で共培養した。４日後、細胞を［^３Ｈ］−チミジンで１６時間パルスし、取り込まれた放射能を測定した。図２１に、３回の計測の平均値を対応する標準偏差と共に示す。Ｔ細胞単独またはＤＣ単独の場合の値は、常に１分あたり１０００未満であった。
【００８４】
さらに、上記のように成熟ＤＣをＭＯＩ　５００でアデノ−ＧＦＰと共に凍結保存した。再融解し、上記の培養時間を置いた後、ＣＤ８３、ＣＤ２５、ＣＤ８６、ＣＤ８０に特異的な抗体およびその後でＰＥ結合ヤギ／マウスＩＧ（Ｆａｂ’）_２断片を用いて細胞を対比染色した。結果を図２２Ａに示す。ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ４０に特異的な抗体を用いた比較実験において、図２２Ｂに示す結果が得られた。
【００８５】
（実施例１０）
ＲＮＡトランスフェクションによる抗原負荷後の樹状細胞の凍結保存
ＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞は、本発明の方法により、該樹状細胞の特性がトランスフェクトされていない樹状細胞の特性と同等になるように凍結することができる。ＤＣが未成熟な段階でＲＮＡをトランスフェクトし、成熟させ、次に成熟ＤＣとして凍結することができる（データ未出）。好ましくは、すでに成熟しているＤＣをＲＮＡでトランスフェクトし、凍結保存する。結果を図２５から２７に要約する。
【００８６】
すなわち、成熟樹状細胞をＲＰＭＩで２回、およびＯｐｔｉｍｉｘ ｋｉｔ（ＥＱＵＩＢＩＯ， Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ Ｋｅｎｔ， ＵＫ）の洗浄溶液で１回洗浄した。Ｏｐｔｉｍｉｘ培地中でＤＣの最終濃度を４０×１０^６個／ｍｌとした。次に、１．５ｍｌの反応容器中で、この細胞懸濁液の０．１ｍｌを４０μｇの試験管内で転写したＥＧＦＰ　ＲＮＡと混合した。最大３分間室温でインキュベートした後、細胞懸濁液を０．４ｃｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて電圧２６０Ｖおよび電気容量１５０μＦでパルスをかけた。対照ＤＣは、ＲＮＡを添加せずにパルスをかけた。細胞を（１０％　ＤＭＳＯおよび５％グルコースを含む（最終濃度））ＨＳＡ中で濃度１０×１０^６個／ｍｌで凍結し、４時間保存した。融解後、細胞の生存率をトリパンブルー色素排除法によって測定した。生存細胞の回収率を凍結ＤＣの百分率として図２５に示す。
【００８７】
上記のように成熟ＤＣにＥＧＦＰ　ＲＮＡをエレクトロポレートし、凍結保存した。再融解して４８時間培養した後、樹状細胞を同種異系ＣＤ４＋　Ｔ細胞（ウエルあたり２×１０^５）と共に図２６に記述する条件下で共培養した。４日後、細胞を［^３Ｈ］−チミジンで１６時間パルスし、取り込まれた放射能を測定した。図２６に、３回の計測の平均値を（標準偏差と共に）示す。Ｔ細胞単独またはＤＣ単独の場合の値は、常に１分あたり１０００未満であった。
【００８８】
ＲＮＡをエレクトロポレーションしたＤＣの凍結保存は、表現型に関するＤＣマーカーを変化させない。そこで、成熟ＤＣを上記のようにＥＧＦＰ　ＲＮＡの存在下または非存在下でエレクトロポレーションし、凍結保存した。再融解し、４８時間培養した後、図２７に記載のマウスモノクローナル抗体およびＰＥ結合抗マウスＩＧ（Ｆａｂ’）_２断片を用いてＤＣを対比染色し、次にＦＡＣＳ分析を実施した。図２７において、四角の右底部にある数字はＥＧＦＰ陽性ＤＣに関し、また上部右部分にある数字はＥＧＦＰ／ＤＣマーカー二重陽性ＤＣに関する。
【００８９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、凍結容器中の細胞濃度が融解後のＤＣの収率に及ぼす影響を示す。健常な成人由来の白血球成分採取物から成熟ＤＣを調製した。この調製では、まず最初に接着性単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で６日間培養することによって未成熟ＤＣに変換し、次にＴＮＦ−α＋ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＰＧＥ_２からなる４成分カクテルによって１日間成熟させた（実施例１参照）。成熟（７日目）ＤＣを−１℃／分の冷凍速度で、純粋な自己血清＋１０％　ＤＭＳＯ＋５％グルコース中で、異なる細胞濃度（ＤＣの数／ｍｌ）で冷凍した。この成熟ＤＣを融解した後、生存ＤＣの収率（凍結ＤＣの数の百分率で表わす）を直ちに（＝ｄ７）、および数日間培養した後（１日後＝ｄ８、２日後＝ｄ９、等）を測定した。後者の測定は、完全培地中で、ただしＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４を添加せずに実施した。なぜなら、このハードな「洗い流し試験」は、ＤＣが本当に完全に成熟して、そして安定であるかどうかを確認するための確立された方法だからである。成熟ＤＣ　１０×１０^６個／ｍｌという濃度での凍結が、最良の結果をもたらした（７日目にｐ＜０．０５；他の全ての日にｐ＜０．０１；ｎ＝３）。
【図２】
図２は、再融解後のＤＣの収率に及ぼす種々の凍結用培地の影響を示す。図１の説明に記述するようにＤＣを調製し、アリコートを１０×１０^６個／ｍｌという濃度で、ＨＳＡ＋１０％　ＤＭＳＯ中；自己血清＋１０％　ＤＭＳＯ中；および自己血清＋１０％　ＤＭＳＯ＋５％グルコース（最終濃度）中でそれぞれ凍結させた。凍結し、再融解した後のＤＣの収率を、図１の説明に記述するように測定した。自己血清＋１０％　ＤＭＳＯ＋５％グルコース中での凍結が最良の結果をもたらした（８日目にｐ＜０．０５；ｎ＝４）。
【図３】
図３は、「洗い流し試験」における凍結し、再融解したＤＣの生存率と比較した、新鮮なＤＣの生存率を示す。図１の説明に記述するように成熟（７日目）ＤＣを調製した。次に、新たに調製したＤＣ、および凍結し（−１℃／分の速度で、純粋な自己血清＋１０％　ＤＭＳＯ＋５％グルコース中で、細胞密度１０×１０^６個／ｍｌで）、液体窒素の気体相中で３時間以上保存した後に再融解したＤＣを、図１の説明に記述するように数日間サイトカインを含まない培地で培養した（「洗い流し試験」）。生存ＤＣの収率は、７日目にウエルに播いたＤＣの総数に対する百分率で表わす。新たに調製したＤＣと凍結／融解したＤＣの間に統計的有意差はなかった（ｎ＝４）。
【図４】
図４は、凍結および再融解が成熟ＤＣの特徴的形態を変化させないことを示す。図１の説明に記述するように調製した成熟（７日目）ＤＣを、直ちにさらに２日間培養した；または、凍結し、液体窒素の気相中に少なくとも３時間保存し、再融解した後に、さらに培養した。サイトカインの非存在下で（「洗い流し試験」）さらに４８時間培養した後でさえ、非凍結（左）および凍結／融解（右）ＤＣは安定した非接着性細胞のままであった。
【図５】
図５は、凍結および再融解が成熟ＤＣの特徴的表現型を変化させないことを示す。図１の説明に記述するように新たに調製した成熟（７日目）ＤＣを、ＦＡＣＳ分析によって表現型別にした（新鮮ＤＣ、７日目）。アリコートを凍結し、少なくとも３時間液体窒素の気相中に保存し、再融解し、そして表現型を直接測定するか（ＤＣ凍結／融解ｄ７）またはサイトカインの非存在下（「洗い流し試験」）さらに３日間培養した後に表現型を測定した（ＤＣ凍結／融解ｄ１０）。凍結／融解成熟ｄ７　ＤＣは、サイトカインを除去してさらに３日間培養した後でも、成熟ＤＣの特徴的表現型（ＣＤ１４−、ＣＤ８３均質に＋＋）を維持した。
【図６】
図６は、凍結および再融解が一次同種ＭＬＲ（「混合白血球反応」）における成熟ＤＣの刺激能を変化させないことを示す。図１の説明に記述するように成熟（７日目）ＤＣを調製し、そして新たに調製した非凍結ＤＣの同種刺激力と、凍結し（液体窒素中に３時間保存後）再融解したＤＣのアリコートの同種刺激力とを比較した。
【図７】
図７は、凍結および再融解が、強いＩＭＰ特異的ＣＴＬ応答を誘導する成熟ＤＣの能力を変化させないことを示す。新たに調製した、または凍結／融解したＨＬＡ−Ａ２．１＋成熟７日目ＤＣにインフルエンザマトリックスペプチド（ＩＭＰ）ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）を負荷するか、または未処理のままにし、そして自己ＣＤ８＋　Ｔ細胞と共に（Ｔ：ＤＣ比＝１０：１）サイトカインを全く添加せずに培養した。さらに、精製ＣＤ８＋　Ｔ細胞を、ＩＭＰ負荷または非負荷ＤＣの非存在下で培養した。７日後、Ｔ細胞を回収し、標準的^５１Ｃｒ放出アッセイを用いて細胞傷害活性を調べた。１０μｇ／ｍｌのＩＭＰの非存在下で、または存在下でパルスしたＴ２細胞が標的細胞の役割を果たした。
【図８】
図８は、凍結および再融解が、強いＩＭＰ特異的ＣＤ８＋　Ｔ細胞応答を誘導する成熟ＤＣの能力を変化させないことを示す（ＨＬＡ−Ａ２．１／ペプチド四量体分析）。新たに調製した、または凍結／融解したＨＬＡ−Ａ２．１＋成熟７日目ＤＣにＩＭＰを負荷するか（凍結／融解細胞の場合には凍結前または融解後）、または未処理のままにし、そして自己ＰＢＭＣの非接着性画分（ＰＢＭＣ：ＤＣ比＝３０：１）と共にサイトカインを全く添加せずに７日間共培養した。細胞を回収し、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＩＭＰ四量体（Ｘ軸）および抗ＣＤ８（Ｙ軸）を用いて二重染色した。ＩＭＰペプチド特異的ＣＤ８＋　Ｔ細胞の増大（四量体結合ＣＤ８＋　Ｔ細胞の百分率を図中に示す）は、新鮮なＤＣと凍結ＤＣの間で類似している。凍結の前または融解の後でＤＣにＩＭＰを負荷することは、何ら差を生じない。
【図９】
図９は、ＣＤ４０Ｌとの接触が融解ＤＣの生存率をさらに向上させることを示す。図１の説明に記述するように成熟（７日目）ＤＣを調製した。融解後、可溶性一次ＣＤ４０Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）を４時間添加し、次にＤＣを洗浄し、図３の説明に記述するようにサイトカインを含まない培地中で数日間培養した（「洗い流し試験」）。生存ＤＣの収率（凍結ＤＣの百分率で表わす）を直ちに測定し（ｄ＝７）、また数日培養した後に測定した（１日後＝ｄ８、２日後＝ｄ９、等）。ＤＣのＣＤ４０Ｌ処理は、特にさらなる培養の２日目以降に、生存率の向上をもたらした（１０日目および１１日目にｐ＜０．０１；ｎ＝５）。
【図１０】
図１０は、凍結前にＤＣをタンパク質抗原にうまく負荷することができることを示す。６日目にモデル抗原である破傷風トキソイド（ＴＴ）（１０μｇ／ｍｌ）を添加することにより、未成熟段階でＤＣにパルスした。次に、成熟ＤＣを７日目に回収し、図３の説明に記述するように凍結した。凍結した、ＴＴをパルスしたＤＣは、新たに調製した、ＴＴをパルスした成熟ＤＣと同じように刺激性であった。
【図１１】
図１１は、凍結前にＤＣをタンパク質抗原にうまく負荷することができることを示す。凍結／融解した（図３参照）ＨＬＡ−Ａ２．１＋成熟７日目ＤＣをＭｅｌａｎ−Ａ類似体ペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２）に凍結前または融解後に負荷するか、または未処理のままにし、そして自己ＰＢＭＣの非接着性画分（ＰＢＭＣ：ＤＣ比＝２０：１）と共にサイトカインを全く添加せずに７日間共培養した。細胞を回収し、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｍｅｌａｎ−Ａ四量体（Ｘ軸）および抗ＣＤ８（Ｙ軸）を用いて二重染色した。Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド特異的ＣＤ８＋　Ｔ細胞の増大（四量体結合ＣＤ８＋　Ｔ細胞の百分率を図中に示す）は、凍結前または融解後に上記ペプチドを負荷した凍結ＤＣと類似している。図８も参照されたい。
【図１２】
図１２は、実施例６に記述するようにワクチン接種を受けた患者における、ＫＬＨに対する１型ヘルパー細胞応答の誘導を示す。
【図１３】
図１３は、実施例７の結果を示す。
【図１４】
図１４は、実施例７の結果を示す。
【図１５】
図１５は、実施例７の結果を示す。
【図１６】
図１６は、実施例８の実験構成を図式的に示す。実施例８の結果を、図１７および１８に要約する。
【図１７】
図１７Ａは、腫瘍細胞溶解物または壊死性腫瘍細胞を負荷し、その後で凍結保存したＤＣの総数を示す。
図１７Ｂは、腫瘍細胞溶解物または壊死性腫瘍細胞を負荷し、その後で凍結保存したＤＣの同種刺激力を示す。
図１７Ｃは、腫瘍負荷および凍結保存を行なった後のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図１８】
図１８Ａは、ＤＣをアポトーシス性腫瘍細胞に負荷し、その後で凍結保存したＤＣの総数の測定結果を示す。
図１８Ｂは、アポトーシスＭＥＬ ５２６黒色腫細胞を負荷し、その後で凍結保存したＤＣの同種刺激力を示す。
図１８Ｃは、Ｍａｇｅ−１ペプチドをパルスしたＤＣ上の、凍結保存前および後のＭＡＧＥ−１／ＨＬＡ−Ａ１　Ａｇ発現のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
図１８Ｄは、異なる方法で負荷をかけたＤＣ上の、凍結保存前および後のＭＡＧＥ−１／ＨＬＡ−Ａ１複合体の発現（ＭＡＧＥ−１／ＨＬＡ−Ａ１複合体に対する抗体によって測定した）の比較を示す。
【図１９】
図１９は、凍結保存した、または凍結保存していないアデノウイルス感染樹状細胞を比較する実施例９の実験構成を図式的に示す。実施例９の結果は、図２０から２３に要約する。
【図２０】
図２０は、凍結保存後のアデノウイルス感染樹状細胞の回収を示す。凍結および再融解後のアデノ−ＧＦＰ感染ＤＣの回収率は、モックで処理した（トランスフェクトしていない）ＤＣの回収率に匹敵する。
【図２１】
凍結保存後のアデノウイルス感染樹状細胞のＣＤ４　Ｔ細胞刺激活性。凍結保存はアデノウイルス感染ＤＣの同種刺激活性を変えないことが見て取れる。
【図２２】
図２２Ａおよび２２Ｂは、凍結保存した、または凍結保存していないアデノウイルス感染ＤＣに類似の表現型が観察されることを示す。
【図２３】
図２３Ａおよび２３Ｂは、凍結保存した、または凍結保存していないアデノウイルス感染ＤＣの表現型を示す。
【図２４】
図２４は、凍結保存した、または凍結保存していない、ＲＮＡをエレクトロポレーションしたＤＣを比較する実施例１０の実験の流れを示す。結果を図２５から２７に要約する。
【図２５】
図２５は、ＥＧＦＰ−ＲＮＡをエレクトロポレーションしたＤＣの凍結保存後の回収は、対照実験における回収と類似していることを示す。
【図２６】
図２６は、凍結保存がＥＧＦＰ−ＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣの同種刺激能を変化させないことを示す。
【図２７】
図２７は、ＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣの表現型が対照実験における表現型と類似していることを示す。
【図２８】
図２８は、本発明の方法に用いることができる、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩに限定される黒色腫およびインフルエンザウイルスペプチドを示す。略語：ＡＳ＝アミノ酸、ＮＴ＝ヌクレオチド、ＮＰ＝核タンパク質、ａｎａ＊＝ペプチド類似体
^ａ最頻出ＤＲ４サブタイプ、約８０％
^ｂ最頻出ＤＲ４サブタイプ、約８０％
^ｃ今日まで、３０のＨＬＡ　ＤＲ１３対立遺伝子が記述されている。ＤＲＢ１＊１３０１およびＤＲＢ１＊１３０２（これらはＤＲ１３対立遺伝子の８０％を構成する）に対する限定が示された。他のＤＲ１３対立遺伝子もまた該ペプチドを提示できる。
^ｄ対立遺伝子ＤＰＢ１＊０４０１と比較して、この第２　ＨＬＡ　ＤＰ４対立遺伝子によるエピトープの提示はより効果的でない。

Claims (21)

1. すぐ使用できる、凍結保存された成熟樹状細胞の調製方法であって、
   ａ）未成熟の樹状細胞（ＤＣ）を用意し；
   ｂ）１つ以上の成熟刺激剤を含む成熟化カクテルを含有する培養培地中で該未成熟ＤＣを培養して成熟ＤＣを獲得し；
   ｃ）異種血清を含まない凍結用培地中で該成熟ＤＣを凍結する、
   ことを含んでなる方法。
2. 凍結前または凍結ＤＣの再融解後に、該ＤＣを抗原または抗原−抗体複合体に負荷する、請求項１に記載の方法。
3. （ｉ）該未成熟ＤＣがＣＤ１４＋単核細胞（単球）またはＣＤ３４＋細胞から調製される；および／または
   （ｉｉ）該未成熟ＤＣが血液から直接単離される；および／または
   （ｉｉｉ）該未成熟ＤＣまたはその前駆体細胞が白血球成分採取物から得られる；および／または
   （ｉｖ）該未成熟ＤＣまたはその前駆体細胞が新鮮な血液または骨髄から得られる、
   請求項１または２に記載の方法。
4. 該成熟刺激剤がＩＬ−１β等のＩＬ−１；ＩＬ−６；ＴＮＦ−α；ＰＧＥ_２等のプロスタグランジン；ＩＦＮ−α；ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）およびリポテイコ酸等のリポ多糖および他の細菌性細胞産物；ホスホリルコリン；カルシウムイオノホア；ＰＭＡ等のホルボールエステル；熱ショックタンパク質；ＡＴＰ等のヌクレオチド；リポペプチド；トール（Ｔｏｌｌ）様受容体に対する人工リガンド；ポリ−Ｉ：Ｃ等の２本鎖ＲＮＡ；免疫刺激性ＤＮＡ配列；ＣＤ４０リガンド；等から選択され、該培養培地または該成熟化カクテルが特にＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αを含み、または該成熟化カクテルが単球馴らし培地（ＭＣＭ）もしくはＰＧＥ_２を添加したＭＣＭである、請求項１から３のいずれか１つ以上に記載の方法。
5. 該未成熟ＤＣが０．１から１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、０．１から１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、０．１から１０μｇ／ｍｌのＰＧＥ_２、および０．１から１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの存在下で培養される、請求項４に記載の方法。
6. 成熟化のためにＤＣに添加される活性物質ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αがそれぞれの活性物質の精製品に由来することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
7. （ｉ）成熟化が少なくとも１時間、好ましくは少なくとも６時間実施される；および／または
   （ｉｉ）成熟化の間、該培養培地の該成熟化カクテルが交換される、および／またはさらなる成熟刺激剤が該培養培地に添加される；および／または
   （ｉｉｉ）免疫／成熟調節剤、特にＩＬ−１０、フマル酸およびそのエステル、ミコフェノール酸モフェチルおよびビタミンＤ３から選択される免疫／成熟調節剤が該培養培地に添加される；
   請求項１から６のいずれか１つ以上に記載の方法
8. 上記いずれかの請求項に記載の方法であって、
   （ｉ）５から２５％（ｖ／ｖ）の１つ以上の凍結保護剤、特にＤＭＳＯ、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセリン一酢酸および無機塩より選択される凍結保護剤、より好ましくはＤＭＳＯ；および／または
   （ｉｉ）２から３０％（ｗ／ｖ）の１つ以上のポリオール化合物、特にグルコース、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、エリトリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトールおよびＤ−ラクトースから選択されるポリオール化合物、より好ましくはグルコース；および／または
   （ｉｉｉ）２から９０％（ｗ／ｖ）の非異種血清成分、特に自己血清もしくは血漿または同種異系血清もしくは血漿、より好ましくはヒト血清アルブミン、自己血清、同種異系ヒト血清もしくはプール血清、
   を該凍結用培地が含む方法。
9. 該細胞が５×１０^６から１００×１０^６個／ｍｌの濃度で凍結されることを特徴とする、上記いずれかの請求項に記載の方法。
10. 凍結に先立って該ＤＣを抗原または抗原−抗体複合体に負荷する、請求項２から９のいずれか１つ以上に記載の方法。
11. 該ＤＣに負荷する該抗原がタンパク質または少なくとも８個のアミノ酸を有するその断片であり、該タンパク質またはその断片が該培養培地に特に０．０１から１０００μＭの濃度で添加され、そして好ましくは同時に該培地にＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ_２およびＴＮＦ−αが含まれている、請求項２から１０のいずれか１つ以上に記載の方法。
12. 該ＤＣを該抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子に負荷する、請求項２から１０のいずれかに記載の方法。
13. タンパク質断片、細胞もしくは細胞断片、または核酸配列が該抗原−抗体複合体における抗原の役割を果たし、そして該抗体はＩｇＧのクラスの１つもしくはＩｇＥの抗体である、請求項２から１０のいずれか１つ以上に記載の方法。
14. 凍結前または再融解後に、該ＤＣをアポトーシスを抑制できる分子と接触させる方法であって、アポトーシスを抑制できる分子がＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＮＣＥおよびＲＡＮＫＬからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか１つ以上に記載の方法。
15. 該ＣＤの凍結および再融解後に、凍結ＣＤの数に基づいて７５％以上の、好ましくは８５％以上の該ＣＤが生存する、請求項１から１４のうちいずれか１つ以上に記載の方法。
16. 成熟した凍結保存ＰＣからワクチンを調製するのに適している、請求項１から１５のいずれか１つ以上に記載の方法。
17. ＤＣの凍結に有利な条件を見いだす方法であって、
    ａ）未成熟ＤＣを用意し；
    ｂ）異なる成熟刺激剤の存在下で該未成熟ＤＣの異なる培養を実施し；
    ｃ）次に、該ＤＣをサイトカイン含有または不含培地で培養し、ここでサイトカインの非存在下での培養が好ましく、
    ｄ）該サイトカイン含有または不含培地で少なくとも１日培養した後、生存細胞の画分を測定し；そして
    ｅ）最も高い生存率をもたらした成熟刺激剤を決定する、
    ステップを含む方法。
18. 該生存細胞の画分が該サイトカイン含有または不含培地で少なくとも２日、好ましくは少なくとも３日培養した後に測定される、請求項１７に記載の方法。
19. 凍結された、成熟した、抗原を負荷した樹状細胞。
20. 請求項１から１６のうちいずれか１つ以上に記載の方法によって得られる、請求項１９に記載の細胞。
21. 請求項１９または２０に記載の樹状細胞を含んでなるワクチン。

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