CN116546999A - 药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种通过在传统DC疫苗中添加同种异体树突状细胞及(或)病毒抗原肽，借助外源DC作用从而扩大DC疫苗抗原谱，启动适应性免疫应答，增强DC疫苗抗肿瘤效应的方法。

Description

药物组合物及其制备方法和应用
优先权信息
无
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，具体地，本发明涉及药物组合物及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及药物组合物、DC细胞、制备药物组合物或DC细胞的方法、治疗肿瘤患者的方法、提高DC细胞免疫杀伤力的方法。
背景技术
本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体地说是一种树突状细胞(Dendritic cells,DC细胞)组合物或树突状细胞疫苗制剂制备方法，该制剂可用于肿瘤免疫治疗或个体化精准免疫治疗。
肿瘤免疫治疗是当今医学界的研究热点之一，已成为继手术、放化疗之外又一重要的癌症治疗手段。越来越多的研究证实，激活机体免疫系统，产生持久或特异性的抗肿瘤免疫应答，可有效促进癌症或肿瘤病灶消退，防治肿瘤复发、转移。机体免疫系统对恶性肿瘤的发生和发展起关键作用，因此，如能有效控制机体免疫系统，就可以更好地防控肿瘤。
DC细胞是体内功能最强的抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)，其可以摄取、加工及呈递体内外抗原给CD4 +及CD8 +T淋巴细胞，从而诱导机体特异性免疫应答。由于DC细胞在诱导机体免疫应答中的独特作用，近年来，以DC为基础的免疫治疗在临床应用中得到了越来越广泛的关注，并成为国内外研究的热点。
越来越多的研究表明，采用肿瘤相关抗原或癌-睾丸抗原如甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、黑色素瘤抗原基因MAGE-A3、肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1等为疫苗，或以该类抗原肽负载DC细胞作为疫苗激活机体免疫系统，可以有效改善癌症患者的预后。如Palmer等研究证明负载肝癌全细胞抗原(即肿瘤细胞裂解物)的自体DC疫苗能够在一定程度上治疗进展期原发性肝癌病人，其中28％的患者在治疗后达到了部分缓解或病情稳定，23.5％的患者治疗后血清甲胎蛋白AFP水平明显下降。目前全球范围内已经有3支DC肿瘤疫苗获批上市，商品名分别为sipuleucel-T(Dendreon,美国)、CreaVaxRCC(CreaGene,韩国)和Hybricell(Genoa Biotechnologia,巴西)，显示了以DC疫苗为代表的肿瘤免疫治疗的重要研究价值和广阔的临床应用前景。
负载肿瘤抗原的DC疫苗是一种安全有效的肿瘤免疫疗法。然而进一步分析发现，虽然DC疫苗能够使部分患者获益，但是其总体疗效有限且具有不确定性。目前，用于制备DC疫苗的抗原肽多为单抗原(如MAGE、NY-ESO-1、GPC3等)，其抗瘤谱单一，抗原免疫原性有限，使得疫苗接种后激活产生的T淋巴细胞仅具有部分的杀伤活性，不足以清除抗原异质性复杂的肿瘤细胞，难以抑制肿瘤生长；其次，肿瘤在发生发展的过程中，逐步建立了一套复杂的免疫逃逸机制来对抗机体的免疫攻击，如肿瘤抗原表达缺陷/抗原调变、肿瘤细胞表面MHC-I类分子及黏附/共刺激分子表达下调或缺失等，均使得DC细胞在体内无法有效发挥其抗原提呈功能，不足以提供足够的活化信号调动机体免疫系统。
因此，传统抗肿瘤DC疫苗的功能需要进一步改进，以最大限度的发挥其作用。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本申请的发明人通过向传统DC疫苗制剂中添加病毒抗原肽及(或)低剂量同种异体DC细胞，作为非特异性免疫增强剂或免疫佐剂，借助病毒抗原及外源DC细胞启动机体适应性免疫应答的功能，实现了诱导更有效的T细胞反应，增强机体对DC疫苗的免疫应答。该方法高效简便，大大提高了DC疫苗的抗肿瘤效应，为DC疫苗的临床治疗提高了保障。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括自体DC细胞和异体DC细胞。需要说明的是，本申请所述的“自体DC细胞”是指来源于药物组合物需要施用的个体的DC细胞，例如该药物组合物需要施用于癌症患者，那么药物组合物中的自体DC细胞是指来源于该癌症患者的DC细胞；相应的，本申请所述的“异体DC细胞”是指来源于药物组合物不施用的个体的DC细胞，需要注意的是，此处的“不施用的个体”与“需要施用的个体”属于同种异体，例如“异体DC细胞”来源于健康个人。根据本发明实施例的药物组合物在机体内的免疫应答显著提高。
根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述自体DC细胞来源于肿瘤患者，所述异体DC细胞来源于健康个体。根据本发明实施例的药物组合物对肿瘤细胞的免疫杀伤效果显著提高。
根据本发明的实施例，所述自体DC细胞和异体DC细胞的个数比为20:1～3:1。发 明人发现，自体DC细胞和异体DC细胞在上述比例范围内，对机体免疫应答的增强效果更加显著。
根据本发明的实施例，所述自体DC细胞负载有肿瘤抗原肽(包括患者个体化新生抗原neoantigen、肿瘤相关抗原(TAA,tumor-associated antigen)、肿瘤特异性抗原(TSA,tumor-specific antigen))和/或病毒抗原肽。负载有肿瘤抗原肽的DC细胞可有效激活产生T淋巴细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤。同时，发明人发现，DC细胞进一步负载病毒抗原肽，可更为有效地诱导T细胞反应，增强机体对药物组合物的免疫应答。
根据本发明的实施例，所述病毒抗原肽包括选自EB病毒(EBV)抗原肽、巨细胞病毒(CMV)抗原肽的至少之一。
根据本发明的具体实施例，所述病毒抗原肽具有SEQ ID NO:1～4任一项所示的氨基酸序列。
GLCTLVAML(SEQ ID NO:1)；
IVTDFSVIK(SEQ ID NO:2)；
ATIGTAMYK(SEQ ID NO:3)；
NLVPMVATV(SEQ ID NO:4)。
其中，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的病毒抗原肽被称为EBV_A2，具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的病毒抗原肽被称为EBV_A11-1，具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的病毒抗原肽被称为EBV_A11-2，具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列病毒抗原肽被称为CMVpp65。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种DC细胞。根据本发明的实施例，所述DC细胞负载有肿瘤抗原肽和病毒抗原肽。根据本发明实施例的DC细胞可更为有效地诱导T细胞反应，增强机体对DC细胞的免疫应答。
根据本发明的实施例，上述DC细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例，所述DC细胞来源于肿瘤患者。
根据本发明的实施例，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的DC细胞。根据本发明实施例的药物组合物可借助病毒抗原启动机体适应性免疫应答的功能，实现诱导更有效的T细胞反应，增强机体对DC疫苗的免疫应答。
根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之 一：
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括肿瘤患者自体DC细胞和/或健康个体异体DC细胞，所述肿瘤患者自体DC细胞负载有肿瘤抗原肽。根据本发明实施例的该药物组合物可诱导更为有效的T细胞反应。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的药物组合物或DC细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症。需要说明的是，本申请所述的“药物”需要做广义理解，它既可以指起预防作用的疫苗，又可以指起治疗作用的药物，例如根据本发明实施例的药物组合物或DC细胞既可用于制备具有预防癌症作用的DC疫苗，也用于制备具有治疗癌症作用的药物。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备前面所述的药物组合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将来自肿瘤患者和健康个体CD14阳性细胞分别进行诱导分化培养，以便获得未成熟DC细胞；(2)将来自肿瘤患者的未成熟DC细胞进行肿瘤抗原肽负载以及诱导成熟处理，以便获得成熟的来自肿瘤患者的DC细胞；(3)将来自健康个体的未成熟DC细胞进行诱导成熟处理，以便获得成熟的来自健康个体的DC细胞；(4)将成熟的来自肿瘤患者的DC细胞以及成熟的来自健康个体的DC细胞进行混合，以便获得所述药物组合物。根据本发明实施例的制备药物组合物的方法具有简便、高效的特点，所获得的药物组合物能激起机体更强免疫反应。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述成熟的来自肿瘤患者的DC细胞与成熟的来自健康个体的DC细胞的个数比为20:1～3:1。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括将来自肿瘤患者的成熟DC细胞进行病毒抗原肽负载处理。
根据本发明的实施例，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种制备前面所述的DC细胞或药物组合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将来自肿瘤患者CD14阳性细胞分别进行诱导分化培养，以便获得未成熟DC细胞；(2)将来自肿瘤患者的未成熟DC细胞进行肿瘤抗原多肽负载以及诱导成熟处理，以便获得成熟的来自肿瘤患者的DC细胞；(3)将来自肿瘤患者的DC细胞进行病毒抗原肽负载处理，以便获得所述DC细胞或药物组合物。根据本发明实施例的制备药物组合物的方法具有简便、高效的特点，所获得的DC细胞或药物组合物能激起机体更强免疫反应。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，将来自肿瘤患者的成熟DC细胞进行病毒抗原肽负载处理是通过如下方式进行的：将所述成熟DC细胞与所述病毒抗原肽在37℃和5％CO 2的条件下进行4～6h孵育，所述成熟DC细胞悬浮于无血清培养中，所述成熟DC细胞在无血清培养基中的浓度为1*10 6/mL，所述病毒抗原肽在孵育体系中浓度为1μM。根据本发明实施例的上述方法，可使得成熟DC细胞病毒抗原肽的负载率达到80-95％。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种治疗肿瘤患者的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：获得肿瘤患者和/或健康个体的PBMC，并从所获得的肿瘤患者和/或健康个体的PBMC中分选CD14阳性细胞；将所述CD14阳性细胞按照前面的方法制备药物组合物或DC细胞；将所述药物组合物或DC细胞回输到所述肿瘤患者体内。根据本发明实施例的方法可持久有效地杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长，治疗效果显著。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，将所述药物组合物或DC细胞回输到所述肿瘤患者体内之前，进一步包括：将所述药物组合物或DC细胞与肿瘤患者自体T细胞进行体外共培养，以便获得激活和扩增后的T细胞，将所述T细胞回输到所述肿瘤患者体内。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种提高自体DC细胞免疫杀伤力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述自体DC细胞与异体DC细胞混合。根据本发明实施例的方法可显著提高DC细胞活化或刺激T细胞增殖能力和对肿瘤细胞的杀伤能力。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例，所述自体DC细胞来自于肿瘤患者，所述异体DC细胞来自于健康个体。
根据本发明的实施例，所述自体DC细胞与异体DC细胞的个数比为20:1～3:1。
根据本发明的实施例，所述自体DC细胞负载有肿瘤抗原肽和/或病毒抗原肽。
根据本发明的实施例，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种提高DC细胞肿瘤免疫杀伤力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述DC细胞负载肿瘤抗原肽和病毒抗原肽。根据本发明实施例的方法可显著提高DC细胞活化或刺激T细胞增殖能力和对肿瘤细胞的杀伤能力。
根据本发明的实施例，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明实施例的新型个体化DC疫苗制备流程图；
图2为根据本发明实施例的新型DC疫苗可刺激T细胞分泌更多的IFN-γ的结果图，
其中，T only表示不含DC疫苗的T细胞对照，
DC+T表示常规DC疫苗与T细胞共培养，
DC+EBV+T表示常规DC疫苗添加病毒肽EBV后与T细胞共培养，
DC+alloDC+T表示常规DC疫苗添加少量异体DC后与T细胞共培养，
OKT3+T表示OKT3刺激培养的T细胞，阳性对照；
图3为根据本发明实施例的新型DC疫苗刺激后的T细胞增殖能力更强的结果图；
其中，T only表示不含DC疫苗的T细胞对照，
DC+T表示常规DC疫苗与T细胞共培养，
DC+EBV+T表示常规DC疫苗添加病毒肽EBV后与T细胞共培养，
DC+alloDC+T表示常规DC疫苗添加少量异体DC后与T细胞共培养；
图4为根据本发明实施例的新型DC疫苗刺激后的T细胞体外肿瘤杀伤能力更强的结果图，其中，
T+T2表示对照T细胞与T2肿瘤细胞共培养，
DC+T+T2表示常规DC疫苗刺激的T细胞与T2肿瘤细胞共培养，
DC+EBV+T+T2表示常规DC疫苗添加病毒肽EBV刺激的T细胞与T2肿瘤细胞共培养，
DC+alloDC+T+T2表示常规DC疫苗添加异体DC刺激的T细胞与T2肿瘤细胞共培养；
图5为根据本发明实施例的荷瘤小鼠各组肿瘤生长曲线，其中，
Pbs表示空白对照组，输注PBS，
DC-T表示对照DC-T细胞组，输注不含多肽的常规DC疫苗刺激的T细胞，
alloDC-T表示对照异体DC-T细胞组，输注异体DC细胞刺激的T细胞，
peptide-DC-T表示常规DC疫苗刺激的T细胞治疗组，输注经多肽负载的常规DC疫苗刺激的T细胞，
peptide-alloDC-DC-T表示常规DC疫苗添加异体DC刺激的T细胞治疗组，输注经多肽负载的常规DC疫苗添加异体DC刺激的T细胞；
图6为根据本发明实施例的输注后各组小鼠肿瘤抑瘤率比较结果，其中，
Pbs表示空白对照组，输注PBS，
DC-T表示对照DC-T细胞组，输注不含多肽的常规DC疫苗刺激的T细胞，
alloDC-T表示对照异体DC-T细胞组，输注异体DC细胞刺激的T细胞，
peptide-DC-T表示常规DC疫苗刺激的T细胞治疗组，输注经多肽负载的常规DC疫苗刺激的T细胞，
peptide-alloDC-DC-T表示常规DC疫苗添加异体DC刺激的T细胞治疗组，输注经多肽负载的常规DC疫苗添加异体DC刺激的T细胞；以及
图7为根据本发明实施例的输注后小鼠外周血T细胞检测流式图。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
针对现有DC疫苗制备中，所得DC疫苗抗瘤谱单一、抗原免疫原性有限而影响其有效性和特异性，本发明提供了一种通过添加病毒抗原肽及(或)异体DC来增强传统DC疫苗功能进而提高其激活机体免疫反应的方法。其实现的目的是，得到一种简便、高效，能激起机体更强免疫反应的DC疫苗制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种通过在传统DC疫苗中添加同种异体树突状细胞及(或)病毒抗原肽，借助外源DC的同种异体反应性(alloreactivity)从而扩大传统DC疫苗抗原谱及免疫反应，启动适应性免疫应答，增强DC疫苗抗肿瘤效应的方法，具体包括如下步骤：
(1)获取自体及异体CD14阳性细胞：磁珠法分别分选患者及健康志愿者PBMC中CD14阳性细胞，分选后，将细胞分别用DC无血清培养基( GMP DC Medium，20801-0500)重悬并计数，调整其细胞密度为5X10^5/ml。
(2)自体及异体未成熟DC诱导培养：将患者及志愿者CD14阳性细胞分别以5X10^5/ml密度铺板，并向培养基中添加GM-CSF(800U/ml)及IL-4(1000U/ml)。细胞置于37℃，5％CO 2培养箱中培养5天，期间隔天半量换液1次。换液时，从培养皿或培养瓶中小心吸取出1/2(或1/3)的旧培养基，将旧培养基转移至一个新的15ml离心管中，400g离心5分钟。离心完毕，弃上清，收回细胞沉淀，向其中补充等量新鲜培养基，吹打混匀后加入到原培养皿中，同时补充等量的细胞因子GM-CSF(800U/ml)及IL-4(1000U/ml)。
(3)肿瘤患者个体化新生抗原长肽负载DC及DC成熟诱导：自体未成熟DC诱导培养第5天，于换液后向培养液中加入10μM长肽(27-30aa)，让未成熟DC吞噬，置于37℃，5％CO 2培养箱中培养16h，长肽负载DC细胞后可同时激活CD4及CD8阳性T细胞；第6天，向未成熟DC培养液中补加成熟因子TNF-α(40ng/ml)+IL-6(20ng/ml)+IL-1β(20ng/ml)+PGE2(100ng/ml)+PolyIC(5ug/ml)，诱导DC细胞成熟。
(4)肿瘤患者个体化新生抗原短肽负载DC：培养第7天，DC细胞成熟，显微镜下可看到大多数细胞呈悬浮状态并有明显小突触。此时，收集悬浮的DC细胞，400g离心5分钟，弃上清，重新用培养基重悬，计数，调整细胞密度为1X10^6/ml，然后加入1μM抗原短肽(如DC疫苗治疗方案为只用长肽负载DC，则此步可省略)，置于37℃，5％CO 2培养箱中孵育4h，短肽负载的DC细胞可用来激活CD8阳性T细胞。孵育结束，用培养基洗涤肽负载的DC细胞，400g离心5分钟，收集细胞沉淀重悬于培养基中，备用。此时获得的DC细胞可直接作为制备新型DC疫苗的材料，或体外与自体T淋巴细胞共培养用于后面的功能分析及流式鉴定。
(5)流式检测DC细胞表型：将上一步获得的DC细胞分别用下述抗体染色：CD80(PE-Cy7)，CD83(APC)，CD86(PE)，HLA-DR(PerCP-Cy5.5)，CD14(APC-Cy7)，然后通过流式细胞仪分析，检测各抗体表达及DC成熟情况。
(6)DC收获及新型DC疫苗终制品制备：DC细胞成熟培养后两天，收集DC细胞悬液并做微生物、内毒素及支原体检测，将检验合格的无菌、无支原体、无内毒素的自体DC细胞与异体DC混合，混合比例可以是20:1，10:1，5:1，3:1或20:1～3:1之间的任意比例，即获得含异体DC的新型个体化DC疫苗制剂；若在DC成熟后，用相关 病毒抗原肽如EBV抗原肽,CMV抗原肽等负载自体DC细胞后，再与异体DC混合，则获得含异体DC及病毒抗原肽的新型个体化DC疫苗；以此类推，也可获得仅用病毒抗原肽负载而不含异体DC的新型个体化DC疫苗。
(7)新型DC疫苗体外功能检测：将制备好的新型DC疫苗与T细胞共培养，一周后，可体外检测其活化T细胞及促进T细胞增殖能力；将DC-T细胞与相应肿瘤细胞共培养，可体外检测其杀瘤效果及IFN-γ分泌情况。
为了便于理解，申请人将上述新型个体化DC疫苗的制备流程表示为图1。
经上述方法制备获得的新型DC疫苗，与传统DC疫苗相比，其活化/刺激T细胞增殖能力可提高5-50倍，T细胞可扩增200～500倍，有效T细胞肿瘤杀伤能力可提高3-6倍。
本发明经上述方法培养后，所得到的DC疫苗激活/刺激T细胞能力、体外肿瘤杀伤能力与原有技术相比，可提高3～6倍，有效T细胞扩增倍数可以提高5～50倍；体内小鼠实验显示该方法培养获得的DC-T细胞肿瘤抑制率可达80％，显著高于传统DC-T细胞治疗组，这表明DC疫苗的有效性和特异性得到了极大提高。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Miltenyi Biotec公司。
实施例1 CD14阳性细胞分选
Ficoll淋巴细胞分离法获得HLA0201结直肠癌患者及健康志愿者PBMC(不限制HLA分型)，并用磁珠法分离CD14阳性细胞，具体操作如下：1)将血样转移到50ml离心管中，加入1倍体积的DPBS稀释血样，用移液管轻轻吹打混匀；2)吸取18mL Ficoll分离液至50ml离心管中备用；3)向含Ficoll分离液的离心管中缓慢加入20mL稀释后的血样，使其平铺于Ficoll分离液液面上；4)800g离心25分钟，离心后，将白膜层单核细胞小心吸出，并转移至无菌50mL离心管中；5)向离心管中加入3倍单核细胞液体积的DPBS，并轻轻吹打数次混匀，400g离心10分钟；6)离心后弃上清，轻弹离心管底细胞沉淀，加入1mL T009无血清培养基重悬，再次400g离心10分钟；7)PBMC计数，按每1X10^7个细胞加入20μL CD14分选磁珠，80μLMACS buffer(缓冲液)计算，加入磁珠，将磁珠与细胞混合物轻轻混匀，置于4度冰箱避光孵育15分钟；8)孵育结束，按1-2mL buffer/10 7cells加入MACS buffer洗涤，300g离心10分钟；9)将细胞沉淀用1mLMACS buffer重悬，置于磁力分选架筛选， 分别收集未标记的流出的细胞悬液，以及分选柱中标记的细胞，计数，备用。
实施例2 DC细胞培养
1)CD14阳性细胞刺激分化：将分选后的结直肠癌患者及健康志愿者CD14阳性细胞分别以5X10^5/mL密度铺板，并向培养基中添加GM-CSF(800U/mL)及IL-4(1000U/mL)。细胞置于37℃，5％CO 2培养箱中培养5天，期间隔天半量换液1次。换液时，从培养皿或培养瓶中小心吸取出1/2(或1/3)的旧培养基，将旧培养基转移至一个新的15mL离心管中，400g离心5分钟。离心完毕，弃上清，收回细胞沉淀，向其中补充等量新鲜培养基，吹打混匀后加入到原培养皿中，同时补充等量的细胞因子GM-CSF(800U/mL)及IL-4(1000U/mL)。
2)DC细胞成熟培养及负载多肽：自体未成熟DC诱导培养第5天，于换液后向培养液中加入10μM结直肠癌患者个体化新生抗原长肽IC-1，IC-2或IC-3等(其中，IC-1，IC-2或IC-3的氨基酸序列如下所述：IC-1:WPLLVFLLPACLYLFASCCAHTFSSMS；IC-2:KSLRVQKIRPSILDCNILRVEYSLLIY；IC-3:LVIPLVELSAKQVTFHIPFEVVEKVYP)，让未成熟DC吞噬，置于37℃，5％CO 2培养箱中培养16h；第6天，向未成熟DC培养液中补加成熟因子TNF-α(40ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-1β(20ng/mL)+PGE2(100ng/mL)+PolyIC(5μg/mL)，诱导DC细胞成熟。健康志愿者DC细胞不需多肽负载，可直接在第6天加入成熟因子TNF-α(40ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-1β(20ng/mL)+PGE2(100ng/mL)+PolyIC(5μg/mL)，刺激成熟，备用。
3)病毒抗原肽负载自体DC细胞(可选)：培养第7天，DC细胞成熟，收集悬浮的DC细胞，400g离心5分钟，弃上清，用DC无血清培养基重悬，计数，调整细胞密度为1X10^6/mL，然后加入1μM病毒抗原肽EBV_A2或CMVpp65等(其中，EBV_A2或CMVpp65的氨基酸序列如下所述：EBV_A2：GLCTLVAML，CMVpp65：NLVPMVATV)，置于37℃，5％CO 2培养箱中孵育4h。孵育结束，用培养基洗涤肽负载的DC细胞，400g离心5分钟，收集细胞沉淀重悬于培养基中，备用。
实施例3 DC细胞表型检测
将上一步获得的DC细胞分别用下述抗体染色：CD80(PE-Cy7)，CD83(APC)，CD86(PE)，HLA-DR(PerCP-Cy5.5)，CD14(APC-Cy7)，然后通过流式细胞仪分析，检测各抗体表达及DC成熟情况。
实施例4 DC疫苗终制品制备
DC细胞成熟培养后两天，收集DC细胞悬液并做微生物、内毒素及支原体检测，将检 验合格的无菌、无支原体、无内毒素的自体结直肠癌患者DC细胞与健康志愿者异体DC混合，混合比例分别为20:1，10:1，3:1，即获得含异体DC的结直肠癌病人新型个体化DC疫苗；若将上述实施例2用相关病毒抗原肽(EBV,CMV等)负载的结直肠癌患者自体DC细胞，与健康志愿者异体DC混合，则获得含异体DC及病毒抗原肽的新型个体化DC疫苗；同理，也可获得仅用病毒抗原肽负载而不含异体DC的新型个体化DC疫苗。不同批次新型DC疫苗细胞Marker表达情况如表1所示。
表1：不同批次新型DC疫苗细胞Marker表达情况
批次 HLA-DR(％) CD86(％) CD80(％) CD83(％)
NO.1 99.7％ 98.1％ 90.3％ 67.1％
NO.2 99.8％ 99.2％ 97.1％ 73.8％
NO.3 99.9％ 99.8％ 98.4％ 75.3％
NO.4 99.9％ 99.4％ 98.0％ 74.9％
实施例5 体外功能检测
将上述制备好的新型DC疫苗体外与自体T淋巴细胞共培养，可检测其活化T细胞、促T细胞增殖能力，肿瘤杀伤能力及细胞因子分泌功能。结果如图2～图4所示。结果显示新型DC疫苗可刺激T细胞分泌更多的IFN-γ、新型DC疫苗刺激后的T细胞增殖能力更强以及新型DC疫苗刺激后的T细胞体外肿瘤杀伤能力更强
实施例6 体内小鼠实验
1)含结直肠癌患者个体化突变的小鼠肿瘤模型构建
首先构建含结直肠癌病人特有抗原肽mine-gene的K562稳转细胞株，该细胞株由我司委托武汉维诺赛生物技术有限公司构建完成。然后用含10％FBS的RPMI1640培养基体外扩增培养该细胞株至合适数量，皮下输注于6周龄NSG免疫缺陷小鼠中，每只小鼠输注mine-gene-K562细胞1x10^7个，输注后，适时观察肿瘤组织生长情况，约5天，待肿瘤组织体积为50-100mm 3时，备用。
2)分组及细胞输注
将上述建模成功的NSG小鼠随机分为以下5组，5只/组，按实验方案依次输注各组细胞：
a.空白对照组：每只小鼠尾静脉注射PBS100μL；
b.对照DC-T细胞组：每只小鼠尾静脉注射经结直肠癌患者自体DC刺激的T细胞，即DC-T细胞2x10^7个，用100μLPBS混悬；
c.对照异体DC-T细胞组：每只小鼠尾静脉注射经异体DC刺激的结直肠癌患者T细胞，即alloDC-T细胞2x10^7个，用100μLPBS混悬；
d.peptide-DC-T细胞组：每只小鼠尾静脉注射经结直肠癌患者个体化抗原肽负载的自体DC刺激的T细胞，即peptide-DC-T细胞2x10^7个，用100μLPBS混悬；
e.peptide-alloDC-DC-T细胞组：每只小鼠尾静脉注射含异体DC的结直肠癌患者个体化抗原肽负载DC疫苗刺激的T细胞2x10^7个，即本方法制备的新型DC疫苗刺激的T细胞，命名为peptide-alloDC-DC-T细胞，用100μLPBS混悬。
3)输注后检测及结果分析
量瘤径及体重：输注后每隔2天小鼠称重一次，量瘤径一次，当对照组小鼠肿瘤组织平均长至2500mm 3时，结束观测；最后一次观测时，各组小鼠拍照，并取瘤称重，结果如图5和图6所示。结果显示，新型DC疫苗刺激后的T细胞体内抑瘤能力更强，小鼠肿瘤组织生长明显减慢，输注新型DC疫苗刺激的T细胞小鼠组抑瘤率可达80％。
外周血T细胞分析：分别于输注后1周及结束观测时，每组随机取小鼠2只，尾静脉采血20μL，流式分析小鼠外周血中人CD3阳性T细胞比例如表2和图7所示。结果显示，输注一周或9天后，治疗组小鼠外周血中仍能检测到T细胞。
表2：输注后9天，各组小鼠外周血中检测到的CD3阳性人T细胞比例。
病理学观察：将对照组和治疗组小鼠皮下肿瘤组织分别进行HE染色和TUNEL检测各组肿瘤组织凋亡情况。
综合上述检测结果，分别从肿瘤生长曲线、抑瘤率、外周血人T细胞分布情况、各组肿瘤组织凋亡情况等，综合评估抑瘤效果：本发明提出的一种通过向传统DC疫苗中添加少量同种异体树突状细胞或病毒抗原肽的方法，可有效提高DC疫苗活化T细胞能力，促进初始T细胞有效增殖，进而增强DC疫苗及DC-CTL抗肿瘤效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范 围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims (26)

  1. 一种药物组合物，其特征在于，包括自体DC细胞和异体DC细胞。
  2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述自体DC细胞来源于肿瘤患者，所述异体DC细胞来源于健康个体。
  3. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述自体DC细胞和异体DC细胞的个数比为20:1～3:1。
  4. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述自体DC细胞负载有肿瘤抗原肽和/或病毒抗原肽。
  5. 根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
  6. 一种DC细胞，其特征在于，所述DC细胞负载有肿瘤抗原肽和病毒抗原肽。
  7. 根据权利要求6所述的DC细胞，其特征在于，所述DC细胞来源于肿瘤患者。
  8. 根据权利要求6所述的DC疫苗，其特征在于，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
  9. 一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求6～8任一项所述的DC细胞。
  10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括肿瘤患者自体DC细胞和/或健康个体异体DC细胞，所述肿瘤患者自体DC细胞负载有肿瘤抗原肽。
  11. 一种制备权利要求1～5任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括：
    (1)将来自肿瘤患者和健康个体CD14阳性细胞分别进行诱导分化培养，以便获得未成熟DC细胞；
    (2)将来自肿瘤患者的未成熟DC细胞进行肿瘤抗原肽负载以及诱导成熟处理，以便获得成熟的来自肿瘤患者的DC细胞；
    (3)将来自健康个体的未成熟DC细胞进行诱导成熟处理，以便获得成熟的来自健康个体的DC细胞；
    (4)将成熟的来自肿瘤患者的DC细胞以及成熟的来自健康个体的DC细胞进行混合，以便获得所述DC药物组合物。
  12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述成熟的来自肿瘤患者的DC细胞与成熟的来自健康个体的DC细胞的个数比为20:1～3:1。
  13. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括将来自肿瘤患者的成熟DC细胞进行病毒抗原肽负载处理。
  14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
  15. 一种制备权利要求6～8任一项所述的DC细胞或权利要求9～10任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括：
    (1)将来自肿瘤患者CD14阳性细胞分别进行诱导分化培养，以便获得未成熟DC细胞；
    (2)将来自肿瘤患者的未成熟DC细胞进行肿瘤抗原多肽负载以及诱导成熟处理，以便获得成熟的来自肿瘤患者的DC细胞；
    (3)将来自肿瘤患者的DC细胞进行病毒抗原肽负载处理，以便获得所述DC细胞或药物组合物。
  16. 根据权利要求13或15所述的方法，其特征在于，将来自肿瘤患者的成熟DC细胞进行病毒抗原肽负载处理是通过如下方式进行的：
    将所述成熟DC细胞与所述病毒抗原肽在37℃和5％CO 2的条件下进行4～6h孵育，所述成熟DC细胞悬浮于无血清培养中，所述成熟DC细胞在无血清培养基中的浓度为1*10 6/mL，所述病毒抗原肽在孵育体系中浓度为1μM。
  17. 一种治疗肿瘤患者的方法，其特征在于，包括：
    获得肿瘤患者和/或健康个体的PBMC，并从所获得的肿瘤患者和/或健康个体的PBMC中分选CD14阳性细胞；
    将所述CD14阳性细胞按照权利要求11～16任一项所述的方法制备药物组合物或DC细胞；
    将所述药物组合物或DC细胞回输到所述肿瘤患者体内。
  18. 根据权利要求17所述的方法，其特征在于，将所述药物组合物或DC细胞回输到所述肿瘤患者体内之前，进一步包括：
    将所述药物组合物或DC细胞与肿瘤患者自体T细胞进行体外共培养，以便获得激活和扩增后的T细胞，将所述T回输到所述肿瘤患者体内。
  19. 一种提高自体DC细胞免疫杀伤力的方法，其特征在于，包括：将所述自体DC细胞与异体DC细胞混合。
  20. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述自体DC细胞来自于肿瘤患者，所述异体DC细胞来自于健康个体。
  21. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述自体DC细胞与异体DC细胞的个数比为20:1～3:1。
  22. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述自体DC细胞负载有肿瘤抗原肽和/或病毒抗原肽。
  23. 根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
  24. 一种提高DC细胞肿瘤免疫杀伤力的方法，其特征在于，包括：使所述DC细胞负载肿瘤抗原肽和病毒抗原肽。
  25. 根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原肽包括选自EBV抗原肽、CMV抗原肽的至少之一。
  26. 权利要求1～5或9～10任一项所述的药物组合物或权利要求6～8任一项所述的DC细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症。
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