KR100849740B1 - 항원이 로딩된 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한수상돌기 세포 또는 항원이 로딩되지 않은 즉시사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미성숙한 수상돌기 세포를 적당한 성숙 자극제(maturing stimulants)의 존재 하에서 배양하여 얻은 성숙한 수상돌기 세포를 동결시키는, 즉시 사용가능하고, 항원이 로딩되었거나 로딩되지 않은, 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포 제조 방법, 특히 상기 수상돌기 세포를 함유하는 백신의 제조 방법에 관한다. 동결 전에, 수상돌기 세포에 항원이 로딩될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 얻어질 수 있는 백신에 관하며, 항원이 로딩된 동결된 성숙한 수상돌기 세포를 함유하는 조성물에도 관한다.

Description

항원이 로딩된 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포 또는 항원이 로딩되지 않은 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING READY TO USE, ANTIGEN LOADED OR UNLOADED, CRYOCONSERVED MATURE DENDRITIC CELLS}
본 발명은 미성숙한 수상돌기 세포(dendritic cell:樹狀突起 세포)를 적당한 성숙 자극제(maturing stimulants)의 존재 하에서 배양하여 얻은 성숙한 수상돌기 세포를 동결시키는, 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포 제조 방법, 특히 상기 수상돌기 세포를 함유하는 백신의 제조 방법에 관한다. 동결 전 또는 후에, 수상돌기 세포에 항원이 로딩될(loaded) 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 얻어질 수 있는 백신에 관하며, 항원이 로딩된 동결된 성숙한 수상돌기 세포를 함유하는 조성물에도 관한다.
발명의 배경
수상돌기 세포(이하, 간단하게 "DC"라 함)은 림프구와 상호 작용함으로써 면역 시스템에 영향을 미치는, 항원이 존재할 수 있는 세포이다. 대부분의 DC 는 면역자극 활성을 나타낸다. 이러한 종류의 DC 는 생체 내에서 상이한 방법으로 헬퍼 T 세포와 킬러 T 세포의 형성을 유도할 수 있다("nature's adjuvant"). 특히, 말초 조직에서 생기는 미성숙 DC 는 항원과 결합하여 이로부터 면역원성 MHC 펩티드 컴 플렉스를 제조할 수 있다("항원 프로세싱 방법"). 성숙-유도 자극제(이를 테면, 염증성 시토킨)의 작용으로, 이러한 미성숙 DC 는 유착성이고 동시 자극성 분자의 형성을 증대시킴으로써, 강력한 T-세포 자극제로 발생된다("T-세포 자극 방법"). 동시에, 상기 세포는 2차 림프 기관으로 이동하여 희귀한 항원-특히 T-세포를 선택하여 자극시킨다. 조직 또는 혈액으로부터 분리되어 생체 외에서 항원이 로딩된 DC 는 면역원성이 되어, 성숙한 DC 로서 생체 내에 거꾸로 주입될 수 있음은 증명되었다. 최근에는, DC 가 건강한 사람과 암 환자 모두에게서 CD4+ 및 CD8+ T-세포 면역을 유도할 수 있음이 입증되었다. 면역성이 강한 건강한 개체의 경우, 성숙한 DC 와 함께 효능 촉진제(booster)만을 주입하여도, CD8+ T-세포 반응의 빈도수 뿐만 아니라 기능적인 결합성 또한 증가될 수 있을 것이다. 이러한 이유로, DC(특히, 성숙한 DC)는 인간의 종양 및 감염에 대한 강력한 T- 세포 반응 유도에 있어서, 현재 가장 각광받고 있다.
면역치료에 있어서 DC사용의 전제조건은 배양액 내에서, 증식하고 있는 CD34+ 전구 세포 또는 증식하고 있지 않거나 거의 증식하지 않는 CD14+ 단핵 전구 세포로부터 다량의 DC 를 생산할 수 있는 기법을 개발하는 것이다. 단핵 세포로부터 유도된 DC 는 공여자의 시토킨 전처리없이도 용이하게 제조되고, 결과물로 얻은 DC 집단이 완전히 균질하고 최상의 특징을 지니므로, 최근 자주 사용되고 있다. 예를 들어, 미성숙 DC 는 배아 상태 소의 면역혈청(fetal calf serum:FCS)이 없는 유착성 단핵 세포로부터 통상적으로 6-7일동안 (GM-CSF + IL-4) 에서 배양 (대체로 1-3일 동안 이어서 성숙됨)되는 동안, 자원성(自原性) 단핵 세포-조건의 배지에 의하여 유도되어 제조될 수 있다. 수상돌기 세포 또는 이의 전구 세포를 효과적으로 동결저장하는 것은 FCS 가 존재하는 경우 외에는 극히 곤란하다고 알려졌었다.(Taylor 등. (1990) Cryobiology 27, 269; Makino 등. (1997) Scand. J. Immunol. 45, 618). 그러나, FCS는 백신화 과정에서는 존재해서는 안되므로, 각 DC 백신화를 위하여 가공되지 않은 혈액(flesh blood) 또는 가공되지 않은 류카프레시스 (leucapheresis) 생성물 또는 류카프레시스 생성물로부터 얻은 동결된 PBMC("peripheral blood mononuclear cells":말초 혈액 단핵 세포)분획물로부터 여전히 DC 를 동결없이(freshly) 제조할 필요가 있다(Thurner 등. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1). 동결된 PBMC 는 또한 해동 다음에 세포를 먼저 몇 일동안 배양하여 이들을 DC 로 분화시켜야하는 불편함이 있다. Lewalle 등의 (2000) J. Immunol. Methods 240, 69-78에는 미성숙 DC 의 동결 방법이 기재되어 있으나, 생존 세포가 불량한 수율로 얻어질 뿐이다(71쪽, 왼쪽 컬럼 상단). GM CSF 및 IL-4 에 의하여 단핵 세포로부터 제조된 미성숙 수상돌기 세포의 동결 또한 WO 99/46984에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 활성이 실질적으로 손실되지 않으면서 장기간 저장될 수 있고 필요하면 단기간 내에 투여가능한, 성숙 DC 를 함유하는 백신과 같은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 DC 는 바람직하게는 백신으로 치료된 동일한 환자로부터 유도된다(자원성:autologous). 이와는 별개로, DC 는 또한 상이한 환자로부터 유도될 수 있는데(동종:allogenic), 예를 들어 일반적인 자원자로부터 얻은 류 카프레세이트(leucapheresate), (예를 들어 Thurner 등. (1999) J. Immunol. Methods 283, 1-15에 기재된 바와 같이) 유도될 수 있다.
놀랍게도, 특정 성숙 자극제가 있는 적당한 "성숙 혼합물(maturing cocktail)"의 존재 하에서 배양되어 얻어질 수 있는 완전히 성숙한 DC(이하, 간단하게 "천연 DC(nature DCs)"라고 함)만은 FCS 없이 동결하고 해동시킨 다음에도, 높은 비율로 생존할 수 있고, 동결없이(freshly) 제조된 성숙한 DC 의 면역자극 활성에 필적할 만한 활성을 가질 수 있음이 밝혀졌다. 미성숙 DC 가 성숙 혼합물과 함께 배양되는 동안, 이는 성숙한 DC 로 분화된다. 특히 바람직한 성숙 혼합물은 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6 (IL-6), 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 "종양 괴사 인자 α"(TNFα)를 함유한다.
따라서, 본 발명은
(1) a) 미성숙 수상돌기 세포(DC)를 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 성숙 자극제가 있는 성숙 혼합물을 함유하는 배양 배지에서 미성숙 DC 를 배양하여 성숙한 DC 를 얻는 단계;
c) 어떠한 이종(異種) 면역혈청(serum)도 함유하지 않은 동결 배지에서 성숙한 DC 를 동결시키는 단계;
를 포함하는 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법;
(2) 동결저장된 성숙한 DC 로부터 백신 제조에 적당한 (1)에서 기재된 바와 같은 방법;
(3) 항원이 로딩된, 동결된 성숙한 수상돌기 세포, 특히 방법(1)에 의하여 얻어질 수 있는 이와 같은 수상돌기 세포;
(4) (3)에서 정의된 바와 같은 수상돌기 세포를 포함하는 백신; 및
(5) a) 미성숙 DC 를 제공하는 단계;
b) 상이한 성숙 자극제의 존재 하에서 미성숙 DC 를 상이하게 배양하는 단계;
c) 이후 시토킨이 존재하거나 또는 존재하지 않는 배지에서 DC를 배양하는 단계(이 때 시토킨없이 배양하는 것이 바람직함);
d) 시토킨이 존재하거나 존재하지 않는 상기 배지에서 1일 이상 배양한 후 생존 세포의 비율을 측정하는 단계;
e) 가장 생존율이 높은 성숙 자극제를 결정하는 단계;
로 이루어지는 DC 동결에 유리한 조건을 찾는 방법.
본 발명의 방법(1) 및 방법(2)에 있어서, 하나 이상의 성숙 자극제가 있는 적당한 성숙 혼합물을 배양 배지에 가하여, 미성숙 DC 를 먼저 배양한다. 적당한 성숙 자극제에는 IL-1(이를테면, IL-1β등), IL-6, TFN-α, 프로스타글란딘(이를 테면, PGE2 등), IFN-α, 리포다당류 및 기타 박테리아성 세포 생성물(이를테면, MPL(모노포스포릴리피드 A) 및 리포테이코산 등), 포스포릴콜린, 칼슘 이오노포레스, 포르볼 에스테르(이를테면, PMA), 열-충격 단백질, 뉴클레오티드(이를 테면 ATP 등), 리포펩티드, Toll-유사 수용기에 대한 인공 리간드, 이중 나선 RNA(이를테면, 폴리-I:C 등), 면역자극성 DNA 서열, CD40 리간드 등이 포함된다. 본 발명에 따르면, 상기 배양 배지 또는 성숙 혼합물은 IL-1β, IL-6, PGE2 및 TNFα를 함유하는 것이 특히 바람직하고, 상기 성숙 혼합물은 단핵 세포-조건의 배지(MCM) 또는 PGE2가 보충된 MCM이 되는 것이 특히 바람직하다. 방법(1) 및 방법(2)의 바람직한 구체예에 있어서, 배양 단계 동안 또는 배양 이후, DC 에는 항원이 로딩될 수 있다. DC 가 성숙되고 선택적으로 항원이 로딩된 후, 이러한 DC 는 어떠한 이종 면역혈청(이를테면, FCS)도 함유하지 않은 동결 배지에서 동결된다. 본 출원에서 "이종 면역혈청(heterologous serum)"이란 인간으로부터 유도되지 않은 면역혈청을 말한다. 그러나, 본 발명에 따르면, 자원성 면역혈청 또는 혈청(DC 에 있어서는 동일 인간으로부터 유도됨) 및 동종이계 면역혈청 또는 혈청(DC 에 있어서는 상이한 인간으로부터 유도됨)모두를 사용할 수 있다.
본 출원에 있어서 미성숙 DC 란 성숙한 DC에 비하여, 클래스-I (Class-I) 및 클래스-II MHC 는 물론 유착성 또는 공동 자극성 분자(예를 들면, 특히 CVD86, CD80, CD40)를 단지 적은 양으로 발현시키는, CD83(및/또는 p55/fascin 및/또는 DC-LAMP) 네가티브(또는 단지 약한 포지티브 및/또는 낮은 비율임) 백혈구인데, 이는 적당한 성숙 자극제에 의하여 성숙한 DC 로 분화될 것이다.
본 출원에 있어서 성숙한 DC 란 성숙 자극제의 작용으로 미성숙 DC 로부터 발생된 백혈구로서, CD83(및/또는 p55/fascin 및/또는 DC-LAMP) 및 클래스-II 및 클래스-I MHC 분자 및 유착성 또는 공동 자극성 분자, 특히 CD86, CD80, CD40 의 발현을 증대시키는 것으로 나타난다. 추가로, 성숙한 DC 는 미성숙 DC 에 비하여(예를 들면, 미성숙 DC 와는 달리, 이들은 DC:T 의 비가 약 1:100 이하여도 동종이계 MLR 내에서 분명한 자극 활성을 나타냄) 분명히 증대된 T-세포 자극 능력을 보이며; 게다가, 본 출원에서 의미하는 성숙한 DC 의 특성은 이러한 DC 가 안정하다는 사실, 즉 시토킨없이 1-2일 이상 동안 배양하여도, 성숙한 표현형의 특성과 강력한 T-세포 자극 능력을 유지한다는 사실이다. 반대로, 완전히 성숙되지 않은 DC 는 안정하지 않고 미성숙 DC 로 또는 예를 들어, 유착성 마크로파지로 분화될 것이다.
미성숙 DC 는 공지된 다양한 재료로부터 제공될 수 있다. 미성숙 DC 의 전구 세포는 통상적으로 증식되지 않은 CD14-양성 단핵 세포(PBMCs:단핵 세포) 또는 증식되고 있는 CD34-양성 세포이다. 예를 들어, PBMC는 류카프레시스 생성물로부터 분리될 수 있다. PBMC 생성물은 (Thurner 등. (1999) J. Exp. Med. 190, 1669)에 기재된 바와 같이, 미성숙 DC 로 분화될 수 있다. 따라서, PBMC는 IL-4(또는 IL-13;Romani 등. (1996) J. Immunol. Methods 196, 137-151) 및 GM-CSF("과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자")의 존재 하에서 배양된다. CD14-양성 단핵 세포로부터, 미성숙 DC 는 또한 GM-CSF 및 IFNα(Santini 등. (2000) J. Exp. Med. 191, 1777-1788)의 존재 하에서 배양되어 제조될 수 있다. CD34-양성 세포로부터, 미성숙 DC는 GM-CSF, SCF("줄기 세포 인자") 및 TNFα의 존재 하에서 배양되어 얻어질 수 있다. 미성숙 수상돌기 세포는 또한 Nestle 등. (1998) Nat. Med. 4, 328에서 기재된 바와 같이 가공되지 않은 혈액으로부터 직접 얻어질 수 있다. 미리 형성된 CD11c+ 및 CD11c-DC (O-Doherty 등. (1994) Immunology 82, 487-493) 및 M-DC8-DC (Schakel 등. (1999) Pathobiology 67, 287-290) 또한 혈액 내에 존재한다. 이러한 DC 는 또한 혈액으로부터 분리되어 본 발명 방법에 추가로 사용될 수 있다.
배양 배지 내의 다양한 성숙 자극제의 바람직한 농도는 0.1 ng/ml 내지 100 ㎍/ml, 바람직하게는 1 ng/ml 내지 10 ㎍/ml의 범위 내이다. 특히 바람직한 본 발명의 성숙 혼합물에 있어서, 성숙 자극제의 농도는 0.1 내지 100 ng/ml의 IL-1β, 0.1 내지 100 ng/ml의 IL-6, 0.1 내지 10 ㎍/ml의 PGE2 및 0.1 내지 100 ng/ml의 TNFα(가장 바람직하게는 상기 특정 성숙 자극제의 농도는 대략 10 ng/ml의 IL-1β, 10 ng/ml의 IL-6, 1 ㎍/ml의 PGE2 및 10 ng/ml의 TNFα임)이다. 언급된 농도는 DC 가 배양되는 세포 배양 배지 내 물질의 최종 농도이다. 언급된 활성 물질의 존재 하에서 DC 를 성숙시킬 수 있는 한 가지 수단은 미성숙 DC 를 단핵 세포-조건 배지(MCM)의 존재 하에서 미성숙 DC 를 배양하는 것이다. MCM 은 IL-1β, IL-6, PGE2 및 TNFα를 함유한다. 이는 예를 들어 Romani 등 (1996) J. Immunol. Methods 196, 137 에 기재된 바와 같이, 시토킨이 없는 배지에서 PBMC 를 배양함으로써 얻어질 수 있다. DC 가 MCM 에 의하여 성숙되는 경우, 배양 배지는 1 내지 100 %, 바람직하게는 5 내지 25 %의 MCM을 함유한다. 본 발명의 다른 구체예에서, DC 의 성숙은 MCM 및 정해진 양의 PGE2 첨가에 의하여 일어난다. 즉, 가장 실현가능한 수단 에 있어서, DC 를 성숙시키는 MCM 능력의 변화는 PGE2 의 첨가 (바람직하게는 상기 기술된 농도)에 의하여 균형이 잡힐 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 본 발명에 따르면, 정해진 최적량의 활성 물질 IL-1β, IL-6, PGE2 및 TNFα을 첨가함으로써 DC 를 성숙시키는 것이 바람직하다. 이는 각 활성 물질의 정제된 조제물로부터 성숙 조성물이 제조되는 것을 의미한다. 따라서 MCM 또는 MCM + PGE2 로 성숙시키는 경우와 비교하여 더 좋은 결과가 달성된다. IL-1β, IL-6, PGE2 및 TNFα는 GMP("good manufacturing practice") 등급으로서 시판된다. 통상적으로, 1 시간 이상, 바람직하게는 2 시간 이상 및 더욱 바람직하게는 6 시간 이상동안 언급된 물질의 존재 하에서 배양함으로서 성숙된다. 특히, 본 발명에 따르면, 6 내지 96 시간, 바람직하게는 18 내지 36 시간(류카프레세이트가 출발 물질로서 사용되는 경우) 또는 36 내지 60 시간(가공되지 않은 혈액 또는 버피 코트(buffy coat)가 출발 물질로서 사용되는 경우)의 성숙 시간이 바람직하다.
본 발명에 따르면, DC 에는 하나 이상의 항원 또는 항원-항체 컴플렉스가 언급된 성숙 단계 동안 및/또는 후에 로딩된다. 본 발명에 따르면, 항원 로딩은 동결되는 동안 또는 동결된 후에 일어날 수 있다. 동결 후에 상기 로딩이 일어난다면, DC 에는 해동 후에만 항원이 로딩된다. 그러나, DC 동결 전에 항원을 로딩하는 것이 바람직하다. 이는 DC 가 해동 후 즉시 사용될 수 있는 이점을 갖는다.
본 출원에서 뜻하는 항원은 단백질, 단백질 단편, 펩티드 및 이들로부터 유도된 분자(예를 들면, 글리코실레이팅된(glycosylated) 화합물 또는 다른 화학 개 질물이 있는 화합물)는 물론, 이들을 코딩하는 핵산, 바이러스, 모든 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 단편 또는 세포소멸성 세포(apoptotic cell)이다. "항원의 로딩(loading with antigen)"이란 DC 세포 표면 상의 MHC 분자에 "존재하는(present)" 펩티드가 있도록 하는, 즉 펩티드가 MHC 분자와 컴플렉스를 형성하는 과정을 의미한다. MHC 분자의 직접 로딩은 특정 펩티드를 통하여 가능하나, 단백질(또는 단백질 단편)이 먼저 가공, 즉 세포에 의하여 먼저 처리되어야 한다. 단백질이 세포 내 분열되고 펩티드로 MHC 가 로딩된 다음, MHCII-펩티드 컴플렉스는 세포 표면 상에 존재한다. 적합한 항원은 주로 단백질 또는 단백질 단편을 포함한다. 단백질은 음성원(negative origin)일 수 있거나 재조합 방법으로 제조된다. 성숙된 다음 단백질 항원을 로딩시켜, 첨가된 항원의 펩티드 단편을 포함하는 MHCII-펩티드 컴플렉스가 세포 표면 상에 형성된다. 배양 배지 내 단백질 항원의 농도는 통상적으로 0.1 내지 100 ㎍/ml, 바람직하게는 1 내지 50 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 1 내지 10 ㎍/ml이다.
단백질(즉, 50 개 이상의 아미노산 잔기가 있는 폴리펩티드)이 항원으로 사용되면, 바람직하게는 DC 를 성숙시키는 동안 로딩되어야 한다. 이는 특히 MHCII 분자에 의한 항원 단편의 효과적인 존재를 유발한다. 단백질(단편)은 모든 성숙 기간 동안 존재할 필요는 없으나, 최소한 성숙 기간의 일부분 이상의 기간동안에는 존재할 필요가 있고, 성숙 조성물 및 단백질(단편) 모두 동시에 존재하여야 한다. 단백질 항원의 예는 광범위하게 사용되는 양성 조절 항원으로서 KLH(keyhole limpethemocyanin)를 포함한다. 종양 항원의 예로서의 MAGE-3 단백질, 및 바이러스 성 질병 치료에 적합한 단백질의 예로서의 B 형 간염 표면 항원(HBsAg) 또는 HIV-1 gp-160 단백질이 있다.
"짧은 폴리펩티드(short polypeptides)" 또는 단백질 단편(예를 들면, 50 개 이하의 아미노산 잔기가 있고 DC 표면의 MHC 분자에 정확히 들어맞는 짧은 폴리펩티드)으로 로딩되는 경우, 성숙 후, 즉 동결 전 또는 재해동 후에 로딩하는 것이 상기 언급된 성숙되는 동안의 로딩 이외에 가능하다. 이러한 성숙된 후의 로딩의 경우, 짧은 폴리펩티드는 세정된 DC 에 가해진다.
항원으로 로딩되는 또다른 실행가능한 수단은 세포소멸성 세포 또는 용해된 세포(lysed cell)를 배양 배지에 가하는 것이다. 첨가된 세포는 이후 DC 에 의하여 포식(phagocytose)될 수 있다. 상기 방법은 MHC 클래스 II 분자 외에도, 클래스 I 분자도 효과적으로 로딩될 수 있는 이점이 있다. 예를 들어, 단백질(특히 특정 천연의 단백질)이 첨가되는 경우에 MHC 클래스 I 분자상에도 상기 현상이 발생함이 나타났다. 예를 들어, Mage-3 종양 단백질 또는 펩티드의 존재 하에 DC 가 배양되는 대신, Mage-3을 함유하는 세포 단편(괴사 세포 또는 세포소멸성 종양 세포의 단편)이 DC 에 첨가될 수 있다.
또한 DC 를 예를 들면, 종양 세포와 융합시킴으로써 DC 에 항원이 로딩될 수 있다. 이러한 융합은 폴리에틸렌 글리콜 또는 전기침공(electroporation)으로 달성될 수 있다.
본 발명의 기타 구체예에 있어서, 트랜스펙팅되거나(transfected) 또는 바이러스로 감염을 통하여 DC 에 항원이 로딩된다. 따라서 항원을 코딩하는 핵산이 DC 로 주입되거나 또난 발현을 유도한다. 예를 들어, 아데노바이러스로 DNA 또는 RNA 트랜스펙팅 또는 감염시키는 것이 적당한 방법으로 수행될 수 있다. 이로써 MHC 클래스 I 분자의 로딩 또한 가능하다. 예를 들어, 종양 세포로부터 제조된 RNA 또한 트랜스펙팅될 수 있다. 트랜스펙팅에 있어서, 통상적인 방법(이를 테면, 전기침공)이 사용될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 특이 항원 펩티드(즉, "짧은 폴리펩티드")는 성숙 기간동안 또는 성숙 기간 후에 클래스 I 또는 II 의 MHC 분자가 직접 로딩되도록 첨가될 수 있다. 펩티드 항원은 성숙 조성물이 첨가되기 전에 세포에 첨가될 수 있으나, 바람직하게는 동시에 또는 그 이후에 첨가된다. 항원 로딩은 바람직하게는 10분 이상, 더욱 바람직하게는 1 내지 24시간 동안, 가장 바람직하게는 3 내지 12 시간 동안 수행된다.
펩티드(즉, "짧은 폴리펩티드")에는 통상적으로 8 개 이상의 아미노산이 있다. 바람직하게는, 이러한 펩티드에는 8 내지 12 개의 아미노산(MHCI) 또는 8 내지 25 개의 아미노산(MHCII)가 있다. 로딩을 위한 배양 배지의 상기 펩티드 농도는 0.01 내지 1000 μM, 더욱 바람직하게는 1 내지 100 μM, 가장 바람직하게는 1 내지 20 μM이다.
MHC 분자에 의하여 나타날 수 있는 모든 펩티드는 사용될 수 있는 펩티드로서 고려될 수 있다. 병원체로부터 유도된 단백질로부터 유도된 펩티드가 바람직하다. 이들은 또한 천연적으로 존재하는 아미노산 서열의 변종을 나타내는 펩티드일 수 있다. 이러한 변종에는 통상적으로 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이 있다. 펩티드 항원의 예에는 아미노산 서열 GILGFVFTL(서열 번호 1) 을 갖고 있는 인플루엔자 매트릭스 펩티드(IMP) 또는 서열 ELAGIGILTV(서열 번호 2)를 갖고 있는 Melan-A-유사 펩티드가 있다. 기타 가능한 펩티드의 예를 도 26 에 나타내었다.
이 밖에도, "펩티드/단백질 펄싱(pulsing)", "펩티드/단백질 트랜스로딩 (transloading)" 또한 DC 에 항원을 로딩시키기 위하여 수행될 수 있다.
상술된 바와 같이, DC 에는 또한 항원-항체 컴플렉스가 로딩될 수 있다. 이러한 목적에 적당한 항원에는 상기 언급된 모든 항원이 포함된다. 본 발명에 의한 "항원-항체 컴플렉스"는 적합한 항체와 상기 항체의 컴플렉스(예를 들면, 항체-IgG 또는 항체-IgE 컴플렉스)이다. 이러한 항원을 DC 에 로딩하는 것은 Reynault, A. 등. J. Exp. Med. 189(2):371-80(1999)에 기재되어 있는데, 이는 이하 본 문헌에 포함된다.
성숙시키고 항원을 DC 에 로딩시킨 후, 성숙한 DC 는 동결 배지에서 동결될 수 있다. 면역혈청 성분 외에, 동결 배지는 하나 이상의 동결보호제(cryoprotectant)(예를 들면, 0.1 내지 35 % (v/v), 바람직하게는 5 내지 25 % (v/v))를 추가로 함유할 수 있다. 적합한 동결보호제는 바람직하게는 하기 화합물을 포함한다: DMSO, 글세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 콜린 클로라이드, 아미노산, 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트, 무기 염 등. 바람직한 동결보호제는 DMSO 인데, 동결 배지 내에 바람직하게는 5 내지 25 % (v/v), 더욱 바람직하게는 10 내지 20 % (v/v), 가장 바람직하게는 약 10 % 의 농도의 DMSO 가 함유된다. 동결 배지는 이종이 아닌 면역혈청 성분을 바람직하 게는 2 내지 90 % (v/v), 바람직하게는 5 내지 80 % (v/v)으로 함유하는데, 이 때 인간 면역혈청 알부민은 바람직하게는 10 내지 30 % (w/v)가 특히 바람직하다. 그러나, 더욱 바람직하게 동결 배지는 인간 면역혈청 알부민 대신, 자원성 면역혈청 또는 혈청을 함유한다. 이는 또한 인간 동종이계의 면역혈청 또는 풀(pool)면역혈청을 함유할 수 있다. 또한, 동결 배지가 첨가제로서 카보하이드레이트, 특히 글루코스, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, 에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-소르비톨, 이노시톨, D-락토스 등에서 선택된 카보하이드로레이트에서 유도된 하나 이상의 폴리올 화합물을, 바람직하게는 2 내지 30 %, 더욱 바람직하게는 5 내지 10 %, 가장 바람직하게는 약 5 % (w/v)의 농도로 함유할 수 있다. 가장 바람직한 동결 배지는 약 10 %의 DMSO 및 약 5 %의 글루코스가 있는 순수한 자원성 면역혈청이다. 통상적으로, 세포는 동결 전에 원심분리되어 농축되고 동결 배지에 처리된다.
동결 배지 내 세포의 바람직한 농도는 1 내지 100 ×106 cells/ml이며, 가장 바람직한 농도는 약 5 ×106 cells/ml 내지 20 ×106 cells/ml이다.
또한 DC 생존율은 DC 를 항-세포소멸 분자와 동결 전 또는 해동 후 접촉시킴으로써 증가된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 방법에 있어서 바람직한 구체예에서, DC 는 동결 전 또는 해동 후에 세포소멸을 방지할 수 있는 분자와 접촉된다. 바람직한 항-세포소멸 분자는 CD40 리간드(CD40L) (Morris 등. (1999) J. Biol. Chem. 274, 418), TRANCE (Wong 등. (1997) J. Exp. Med. 186, 2075) 또는 RANKL (Anderson 등 (1997) Nature 390, 175)를 포함한다. 바람직하게는 하나 이상 의 상기 분자가 DC 동결 전 또는 해동 후에 10분 이상 동안, 바람직하게는 1 시간 이상동안, 더욱 바람직하게는 4 시간 이상 동안 배양 배지에 첨가된다. 배양 배지 내의 바람직한 농도는 1 ng/ml 내지 5 ㎍/ml(RANKL/TRANCE) 및 1 ng/ml 내지 1 ㎍/ml(CD40L)이다. 특히 바람직한 농도는 0.5 내지 1 ㎍/ml(RANKL/TRANCE) 및 0.1 내지 0.5㎍/ml(CD40L)이다.
본 방법의 바람직한 구체예에 있어서, DC 는 면역억제성 인터루킨-10(IL-10) 또는 기타 면역/성숙 조절제(이를테면, 비타민 D3 및 이의 유도체), 푸마르산 및 이의 유도체(이를테면, 에스테르 등), 미코페노레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 등의 존재 하에서 추가로 배양된다. 이렇게 처리된 세포는 면역 시스템 자극에는 사용되지는 않으나, 오히려 특정 항원에 대한 저항성이 유도된다. 이러한 조절제 및 IL-10의 배지 내 농도는 1 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml이다.
구체예(4)에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 백신에 관한다. 성숙한 항원이 로딩된 DC 외에, 본 발명에 의한 백신은 약제학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명에 따르는 백신을 해동시킨 다음, 약제학적으로 허용가능하고 투여를 편리하게 하는 다양한 물질이 첨가될 수 있다.
구체예(3)에 따르면, 본 발명은 또한 항원이 로딩된 동결된 성숙한 수상돌기 세포에 관한다. 본 발명에 의한 이러한 세포는 이 세포 이외에도 인간에게 투여하기에 적당한 통상적인 보조제를 함유하는 약제학적 조성물의 일부가 될 수 있다.
본 발명은 먼저 항원이 로딩된 성숙한 DC 를 함유하고 동결될 수 있는 백신을 제공한다. 본 발명의 중요한 잇점은 해동된 다음의 매우 높은 DC 생존율이다. 동결되었던 DC 를 해동시킨 다음, 동결된 DC 의 갯수를 기초로 하여 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상의 생존 DC 가 통상적으로 얻어진다. 이와 같은 해동된 DC의 높은 생존율은 FCS 를 첨가하지 않고 종래에는 달성된 적이 없다. 그러나, 이것은 효과적인 면역자극을 달성하기 위한 중요한 전제조건이다. 항원이 로딩된 성숙한 DC 동결의 실질적인 잇점은 복수 개의 백신 분획물이 제조되고 동결될 수 있다는 점이다. 따라서, 백신은 필요하면 즉시 사용가능하고 매우 단기간 내에 매우 긴 배양 단계 없이도 사용할 수 있다. 단지 동결 및 해동 후에 성숙한 DC 에 항원을 로딩함으로써, 각각의 환경에 따라 DC 를 다양하게 로딩시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 백신화에 사용된 펩티드 중 하나에 대하여 자극과도 또는 알레르기가 발생하는 경우, 이러한 펩티드는 로딩에서 생략될 수 있다.
놀랍게도, DC 동결에 적합한 방법에 있어서, 직접적인 동결 파라메터(이를테면, 동결 배지 및 냉각율)를 변경하고 해동 후 즉시 생존율을 측정하는 것은 충분치 않음이 밝혀졌다. 이러한 직접적인 생존율은 시토킨이 없이 몇 일간 배양하는 동안 가공되지 않으면서(freshly) 제조된 DC 의 생존율과 반드시 일치하는 것은 아니다.
오히려, 동결 과정 또는 동결 전에 사용된 성숙 자극제 또한 세포 생존에 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 의한 성숙 자극제가 완전한 DC 성숙을 유도할 뿐만 아니라, 다른 자극제로 성숙된 DC 보다 더 생존할 수 있는 DC 를 생산한다는 인식을 기초로 하고 있다. 추정을 위하여 (to date), 성숙 자극제를 동결을 고려하여 전혀 고려하지 않았다.
또한 DC 동결 과정을 최적화 하는 우수한 방법은 DC 를 상이한 성숙 자극제로 성숙시킨 다음 이미 읽혀진 바와 같이 시토킨을 가하지 않은 완전 배지에서 배양하여 그 생존율을 테스트하는 것임이 밝혀졌다. 가장 잘 생육할 수 있는 DC 를 유도하는 성숙 자극제가 이후 동결된 DC 의 제조에 사용된다.
따라서, 본 발명의 기타 양상은 유리한 DC 동결 조건을 찾는 방법으로서, 미성숙 DC 를 제공받아 이를 다양한 성숙 자극제 존재 하에서 배양한 다음, 상기 세포를 이후 시토킨이 존재하거나 또는 존재하지 않는(바람직하게는 시토킨이 존재하지 않음)배지에서 배양하여, 생존한 세포의 비율을 시토킨이 존재하거나 존재하지 않는 배지 내에서 1일 이상동안 배양한 후 측정하고, 마지막으로 가장 높은 DC 생존율을 나타내는 성숙 자극제를 결정하는 방법이다. 상기 성숙 자극제는 이후 동결될 DC 제조에 사용된다. 바람직하게, 생존 세포의 갯수는 시토킨이 없는 배지 내에서 배양한지 2 일 이상, 바람직하게는 3 일 이상 후 평가된다.
도 1 은 동결 용기 내 세포 농도가 해동 후 DC 수율에 미치는 영향을 나타내는 것이다. 성숙한 DC 는 건강한 성인의 류카프레시스 생성물로부터 제조되었는데, 이 때 유착성 단핵 세포를 먼저 GM-CSF + IL-4 에서 6일 정도 배양함으로써 미성숙 DC 로 전환시킨 다음, TNFα+ IL-1β+ IL-6 + PGE2(실시예 1 참조)로 이루어진 4성 분계 혼합물로 1일 동안 성숙시켰다. 성숙한 (7일) DC 를 -1℃/min 의 동결률로 순수한 자원성 면역혈청 + 10 % DMSO + 5 % 글루코스 내에서 상이한 세포 밀도(DC의 갯수/ml)로 동결시켰다. 성숙한 DC 를 해동시킨 다음, 생존 DC 의 수율(동결된 DC 갯수에 대한 퍼센트 비율로 기술됨)을 즉시(=d7) 및 배양한지 몇 일 후(1일 후=d8, 2일 후=d9 등)에 측정하였다. 후자는 완전 배지에서 측정하였으나, GM-CSF 또는 IL-4 를 첨가하지 않았는데, 이와 같이 복잡한 "wash-out test"는 DC 가 실질적으로 완전히 성숙화되어 안정한 경우의 측정을 위해 확립된 방법이기 때문이다. 10 ×106 성숙한 DC/ml 에서 동결할 경우 가장 좋은 결과를 얻었다(7일이 경우 p<0.05, 기타 다른 날의 경우 p<0.01; n=3)
도 2 는 해동 후 DC 수율에 다양한 동결 배지가 미치는 영향을 나타낸 것이다. DC 는 상기 도 1의 설명에 기재된 바와 같이 제조되었고, 분획물은 10 ×106 DCs/ml의 농도로 HSA + 10 % DMSO, 자원성 면역혈청 + 10 % DMSO, 및 자원성 면역혈청 + 10 % DMSO + 5 % 글루코스(최종 농도) 내에서 동결시켰다. 동결 및 재해동 후의 DC 수율을 도 1 에 기재된 바와 같이 측정하였다. 자원성 면역혈청 + 10 % DMSO + 5 % 글루코스 내에서 동결시킨 경우 가장 좋은 결과를 나타내었다(8일의 경우 p<0.05; n=4).
도 3 은 동결되고 재해동된 DC 의 생존율과 비교하여 가공되지 않은 DC 의 생존율을 "wash-out-test"에서 나타낸 것이다. 성숙한 d7 DC 를 도 1에 기재된 바와 같이 제조한 다음, 가공하지 않고 제조하는 것은 물론 동결(순수한 자원성 면역 혈청 + 10 % DMSO + 5 % 글루코스 내에서 10 ×106 DCs/ml 의 세포 밀도로 -1℃/ml) 및 액체 질소의 가스 상에서 3시간 이상동안 저장한 다음에 재해동시켰다. DC 를 시토킨없는 배지 내에서 도 1 에 기재된 바와 같이 몇 일 동안 배양("wash-out test")하였다. 생존 DC 의 수율은 7일 째의 용기에 점점이 박혀 있는 DC 의 총수에 대한 퍼센트 비로서 기술된다. 가공없이 제조된 DC 와 동결/해동된 DC 사이에 통계적으로 상당할 정도의 차이는 없었다 (n=4).
도 4 는 동결 및 해동이 성숙한 DC 의 특징적인 형태(morphology)를 변화시키지 않음을 나타낸 것이다. 도 1 에 기재된 바와 같이 제조된 성숙한 d7 DC 를 즉시 2일 더 배양하거나 또는 동결(3 시간 이상 동안 액체 질소의 가스상에 저장)하고 재해동시켜 배양하였다. 시토킨이 없이 48시간 더 배양("wash-out-test")한 후에도, 동결되지 않은 DC(왼쪽)와 동결/해동된 DC(오른쪽)는 안정한 비-유착성(non-adherent) 세포로 남아 있다.
도 5 는 동결과 해동이 성숙한 DC 의 특징적인 표현형을 변화시키지 않음을 나타내는 것이다. 도 1 에 기재된 바와 같이 가공과정없이 제조된 성숙한 d7 DC 의 표현형을 FACS 분석으로 관찰하였다(가공되지 않은 DC, 7일). 분획물을 액체 질소 가스 상에 3 시간 동안 두어 동결시킨 다음 재해동시켜, 이들의 표현형을 즉시 평가하거나(DC 동결/재해동 d7) 또는 시토킨이 없는 배양액에서 추가로 3일동안 ("wash-out test")둔 다음 평가하였다(DC 동결/재해동 d10). 동결/재해동 성숙한 d7 DC 는 시토킨을 제거하고 추가로 3일동안 더 배양하여도, 성숙한 DC의 특징적인 표현형(CD14-, CD83 유사 ++)을 유지하였다.
도 6 은 동결 및 해동이 주요 동종이계 MLR ("mixed leucocyte reaction") 내의 성숙한 DC 의 자극 능력을 변화시키지 않는다는 것을 나타낸 것이다. 성숙한 d7 DC 를 도 1 에 기재된 바와 같이 제조하고, 가공과정없이 제조된 동결되지 않은 DC 의 동종 자극 능력을 동결되고 재해동(기체 질소에서 3 시간동안 저장된 후)된 상기 DC 분획물의 동종 자극 능력과 비교하였다.
도 7 은 동결 및 재해동이 강력한 IMP-특이 CTL 반응을 유도하는 성숙한 DC 의 능력을 변화시키지 않음을 나타내는 것이다. 가공과정없이 제조되었거나 동결/재해동된 HLA-A2.1 + 성숙한 d7 DC 에 인플루엔자 메트릭스 펩티드(=IMP) GILGFVFTL(서열 번호 1) 를 로딩시키거나 또는 이와 같이 처리하지 않은 다음에, 어떠한 시토킨도 가하지 않은 자원성 CD8 + T 세포 (T:DC 비=10:1)에서 배양하였다. 이밖에도, 정제된 CD8 + T 세포를 DC ±IMP의 첨가없이 배양하였다. 7일 후, T 세포를 수거하여 이들의 세포파괴 활성을 표준 51Cr 방출 조사기를 이용하여 평가하였다. 10 ㎍/ml의 IMP 가 있거나 없는 펄싱된(pulsed) T2 세포를 표적 세포(target cell)로 사용하였다.
도 8 은 동결 및 재해동이 강력한 IMP-특이 CD8 + T 세포 반응을 유도하는 성숙한 DC의 능력을 변화시키지 않은 것을 나타낸 것(HLA-A2.1/펩티드 테트라머 분석)이다. 가공과정없이 제조되었거나 또는 동결/재해동된 HLA-A2.1 + 성숙한 d7 DC에 IMP(동결/재해동된 세포의 경우, 동결 전 또는 해동 후)를 로딩하거나 또는 이 를 처리하지 않은 다음, 시토킨을 가하지 않은 자원성이고 비-유착성인 PBMC 의 단편에서 공동배양(PBMC:DC 비=30:1)한 다음, 수거하여 HLA-A2.1/IMP 테트라머(X 축) 및 항-CD8(Y 축)으로 이중-스테이닝(double-stained)시켰다. IMP-펩티드-특이 CD8 + T 세포의 확장(테트라머-결합 CD8 + T 세포의 퍼센트는 도면에 기술되어 있음)은 동결되지 않은 DC 와 동결된 DC 에 있어서 필적할 만하다. 동결 전 또는 해동 전의 DC 로딩은 차이가 없다.
도 9 는 CD40L 과 접촉시키는 것은 DC의 생존율을 더욱 개선시키는 것을 나타내는 것이다. 성숙한 d7-DC 를 도 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 해동 후, 용해가능한 주요 CD40L(100 ng/ml)를 4 시간 동안 가한 다음, 도 3의 설명에 기재된 바와 같이 DC 를 세척하고 시토킨이 없는 배지에서 몇 일동안 배양("wash-out test")하였다. 생존 DC 의 수율(동결 DC 에 대한 퍼센트로 기술되어 있음)을 즉시(=d7) 및 배양한 지 몇 일(1일 후=d8, 2일 후=d9 등)에 측정하였다. DC 에 대한 CD40L 처리는 개선된 생존율을 나타내었는데, 특히 추가로 2 일 더 배양한 경우 개선된 생존율을 나타내었다(10일째 및 11일째의 경우 p<0.01 ; n=5)
도 10 은 동결 전 DC 에 단백질 항원을 성공적으로 로딩할 수 있음을 나타낸 것이다. DC 를 6일 째에 이의 미성숙 단계에서 모델 항원 파상풍 유독소 (model antigen tetanus toxoid) (TT)(10㎍/ml)를 가함으로서 펄싱시켰다. 성숙한 DC 를 7일째에 수거한 다음 도 3의 설명에 기재된 바와 같이 동결시켰다. 동결된 TT-펄싱된 DC 는 동결없이 제조된 TT-펄싱된 성숙한 DC 와 유사하게 자극성이었다.
도 11 은 동결 전 DC에 단백질 항원이 성공적으로 로딩될 수 있음을 나타낸 것이다. 동결 전 또는 해동 후, 동결/해동된(도 3 참조) HLA-A2.1 + 성숙된 d7 DC 에 Melan-A-유사 펩티드 ELAGIGISTV(서열 번호 1)를 로딩시키거나 또는 이를 처리하지 않은 다음, 7일동안 어떠한 시토신도 가하지 않은 자원성이고 비-유착성인 PBMC 단편(PBMC:DC 비=20:1)의 존재 하에서 공동배양한 다음, 수거하여 HLA-A2.1/Melan-A 테트라머(X 축) 및 항-CD8(Y 축)으로 이중-스테이닝(double-stained)시켰다. Melan-A-펩티드-특이 CD8 + T 세포의 확장(테트라머-결합 CD8 + T 세포의 퍼센트가 도면에 기술되어 있음)은 동결 전 또는 해동 후에 로딩된 동결 DC 에 필적할 만하다. 도 9도 참조.
도 12 는 실시예 6 에 기재된 바와 같이 백신화된 KLH에 대한, 환자에 있어서의 헬퍼 세포형 1 반응 유도를 나타낸 것이다.
도 13-15 는 실시예 7 의 결과를 나타낸 것이다.
도 16 은 실시예 8 의 실험 과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 실시예 8 의 결과는 도 17 및 도 18 에 요약된다.
도 17A 는 종양 세포 용해물 또는 괴사 종양 세포로 로딩된 다음 동결저장된 후의 DC 총수를 나타낸 것이다.
도 17B 는 종양 세포 용해물 또는 괴사 종양 세포로 로딩된 다음 동결저장된 후의 DC 동종 자극 능력을 나타낸 것이다.
도 17C 는 종양 로딩 및 동결저장 후의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 18A 는 세포소멸성 종양 세포로로 로딩시킨 다음 동결저장된 후의 DC 총수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 18B 는 세포소멸성 MEL 526 흑색종 세포로 로딩시킨 다음 동결저장된 후의 DC 동종이계적 자극 능력을 나타낸 것이다.
도 18C 는 동결저장 전후에 Mage-1 펩티드-펄싱된 DC 상에서의 MAGE-1/HLA-A1 Ag 발현을 FACS 로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18D 는 동결저장 전후에, 상이한 방법으로 DC 상에 로딩된 MAGE-1/HLA-A1 컴플렉스의 발현 비교를 나타내는 것이다(MAGE-1/HLA-A1 컴플렉스에 대한 항체를 이용하여 결정됨).
도 19 는 동결저장하거나 또는 동결저장하지 않은 아데노바이러스-감염된 수상돌기 세포를 비교하는 실시예 9 의 실험 과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 실시예 9 의 결과는 도 20 내지 23 에서 요약된다.
도 20 은 동결저장 후, 아데노바이러스-감염된 수상돌기 세포의 수거를 나타낸 것이다. 동결 및 재해동 후의 아데노-GFP 감염된 DC 의 수거율은 마구-처리된(트랜스펙팅되지 않은)DC의 수거율에 필적한다.
도 21 : 동결저장 후 아데노바이러스-감염된 수상돌기 세포의 D4 T-세포 자극 활성. 동결저장은 아데노바이러스-감염된 DC 의 동시 자극 활성을 변화시키지 않음을 나타낸 것이다.
도 22A 및 22B 는 동결저장되었거나 동결저장되지 않은 아데노바이러스-감염된 DC 내에서 유사한 표현형이 관찰되는 것을 나타낸 것이다.
도 23A 및 23B 는 동결저장되었거나 동결저장되지 않은 아데노바이러스-감염된 DC 의 표현형을 나타낸 것이다.
도 24 는 동결저장되었거나 동결저장되지 않은 RNA-전기침공된 DC 와 비교하면서, 실시예 10 실험의 도식적 과정을 나타낸 것이다. 결과는 도 25 내지 27 에 요약되었다.
도 25 는 EGFP-RNA-전기침공된 DC 의 동결저장 후의 수거가 대조 실험구에서의 수거와 유사함을 나타낸 것이다.
도 26 은 동결저장은 EGFP-RNA-트랜스팩팅된 DC 의 동시 자극 능력을 변화시키지 않음을 나타낸 것이다.
도 27 은 RNA-트랜스펙팅된 DC 의 표현형이 대조 실험구의 표현형과 유사함을 나타낸 것이다.
도 28 은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는, MHC 클래스 I 및 II 이 제한된 흑색종 및 인플루엔자 바이러스 펩티드를 나타낸 것이다.
약어:AS=아미노산, NT=뉴클레오티드, NP=뉴클레오단백질, ana*=유사 펩티드.
a가장 많은 DR4 하위형, 약 80%
b가장 많은 DR4 하위형, 약 80%
c기록을 위하여, 30개의 상이한 HLA DR13 대립 형질 유전자가 기재되어 있다. DR13 대립 형질 유전자의 80% 를 구성하는 DRB1*1301 및 DRB1*1302 에 대한 제한이 기재되어 있다. 기타 DR13 대립 형질 유전자 또한 펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
d에피토프는 DPB1*0401 의 대립 형질 유전자에 비하여 상기 두 번째 HLA DP4 대립 형질 유전자에 의하여 덜 효과적으로 나타난다.
하기 실시예는 이에 의하여 제한됨이 없이 본 발명을 추가로 예시하려는 것이다.
실시예 1
가공과정없이(freshly) 제조된 미성숙 DC 및 상이한 성숙 자극제에 의하여 성숙된 DC 의 생존율을 평가하였다.
하기 상이한 성숙 자극제를 테스트하였다:
- (Thurner 등. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1)에 기재되어 있는 바와 같이 제조되고 사용되는 단핵 세포-조건의 배지 ;
- 10 ng/ml 의 TNFα;
- 10 ng/ml 의 TNFα+ 1 ㎍/ml 의 PGE2 ;
- 10 ng/ml 의 TNFα+ 10 ng/ml 의 IL-1β+ 100 U/ml 의 IL-6 + 1 ㎍/ml 의 PGE2 ("성숙 칵테일(maturing cocktail)") ;
- 1.0 ㎍/ml 의 살모넬라 유산 이퀴(Salmonella abortus equi) LPS ;
- 이중-나선 RNA (폴리-I:C, 20 ㎍/ml) ;
- 50 내지 1000 ㎍/ml 의 CD40L.
PBMC 로부터 단핵 세포-유도된 DC 의 제조 : 완전 배지로서, 20 ㎍/ml 의 겐 타마이신, 2 mM 의 글루타민 및 1% 의 열-불활성화된 (56℃, 30분) 자원성 인간 헐청이 있는 RPMI 1640 을 사용하였다. 류카프레시스 생성물을 단핵 세포 분리 생성물로서 건강한 시타페레시스 공여자로부터 (Thurner 등. (1999) J. Immunol. Method 223, 1)에 기재되어 있는 바와 같이 제조하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 림프프레프(lymphoprep)로부터 원심분리시켜 분리한 다음 (Thurner 등. (1999) J. Immunol. Method 223, 1)에 기재되어 있는 바와 같이, DC 를 PBMC 의 플라스틱-유착성 단편으로부터 제조하였다. 이를 위하여, 미성숙한 DC 를 재조합 인간 GM-CSF(800 U/ml) 및 IL-4(500 U/ml)가 있는 완전 배지에서 배양하여 얻었다. 6 일 째에, 상기 언급된 상이한 성숙 자극제를 DC 에 가하고, 7 일 째에는 성숙한 DC 를 수거하여 시토킨없이 2 일 더 배양하였다. 배양한지 2 일 후, 용기에 퍼져 있는 DC 의 생존율(%)은 다음과 같다:
미성숙 DC 경우 38.25 % ;
(IL-1β+ IL-6 + PGE2 + TNFα)-성숙한 DC 경우 76.2 % ;
TNFα- 성숙한 DC 경우 13.5 % ;
(TNFα+ PGE2)-성숙한 DC 경우 37.0 % ;
(폴리-I:C)-성숙한 DC 경우 31.8 % ; 및
CD40L-성숙한 DC (500 ng/ml) 경우 49.6 %.
차이점은 통계학적으로 상당하였다.
실시예 2
성숙한(7일)DC 를 하기와 같이 동결시켰다:DC 를 순수한 자원성 면역혈청 또는 20 % 인간 면역혈청 알부민(HSA ; 95 % 이상의 알부민이 있는 200 g 의 인간 혈청 단백질이 보충된 1000 ml 의 전해질 용액으로 이루어짐 ; 독일 Baden-Baden DRK Blutspendedienst Baden-Wuerttemberg)내에 상이한 농도(1 ml 당 5, 20, 40, 60 및 100 ×106 )로 동결용기에서 현탁시켰다. 형성된 DC 현탁액을 이하 기재될 상이한 동결 용액과 1:1로 혼합한 다음 즉시 1.0 또는 1.8 ml 동결용기로 옮겼다. 이후 즉시, 용기를 " Cryo Freezing Container" (Nalgene Cryo 1 ℃ Freezing Container, 냉각율 -1℃/min)에서 -80 ℃까지 냉각시키고 최종적으로 액체 질소의 기체상으로 옮겨서 7 개월동안 두었다.
a) 동결 배지
- HSA + DSMO ±글루코스 [20 %의 HSA 용액(상단 참조) + 10, 15, 20 및 25 % (v/v) DMSO ±2, 4, 6, 10, 20 또는 30 % (v/v) 의 글루코스 (Glukosteril 40 %TM, Fresenius, 독일, 활성 성분 : 글루코스 모노하이드레이트)로 이루어짐] ;
- 면역혈청 + DMSO ±글루코스 [순수한 자원성 면역혈청 + 20 % (v/v) DMSO ±2, 4, 6, 10, 20 또는 30 % 로 첨가된 글루코스]
- Erythrocyte Freezing SolutionTM [살균수 내 38 % 의 글리세롤, 2.9 %의 소르비톨 및 0.63 %의 소듐 클로라이드로 이루어진 Erythrocyte Freezing SolutionTM (독일 Dreieich, Fresenius)]
- Cell Processing SolutionTM + DMSO (독일 Dreieich, Fresenius, 0.9 %의 소듐 클로라이드 내 6 %의 하이드록시에틸스타취로 이루어지고, 통상적으로 에리트로사이트(erythrocyte)의 침전물로 사용됨) + 10 또는 15 % (v/v) 의 DMSO.
b) 해동 조건
동결된 성숙된(7일)DC 를 해동시키기 위하여, 하기의 4 가지 방법을 평가하였다:
1. DC 를 56 ℃ 의 물 배쓰에서 해동시킨 다음, 세척하지 않고 테플론판(Teflon dishes)(독일 Karlsruhe, Rotilabo boxes)에 있는 10 내지 20 ml 의 얼음처럼 차가운 완전 배지(800 U/ml 의 GM-CSF 및 500 U/ml의 IL-4가 보충됨)에서 37℃ 및 5 % 의 CO2 로 2 시간 동안 인큐베이팅한 후, 수거하여 10 분동안 150 ×g 및 22 ℃로 원심분리하였다. 이어서, 세포의 갯수를 측정한 다음 이를 다시 테플론판에 있는 GM-CSF 및 IL-4 가 있는 완전 배지에 뿌리고(세포 밀도는 1 ml 당 1 ×106) 밤새도록 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하여 추가로 사용하였다.
2. 동결된 성숙한(7일)DC 를 1 에서와 같이 해동시키고, 테플론판에서 37 ℃ 및 5 % CO2 로 2 시간 동안 둔 다음, 세포를 수거(150 ×g 및 22 ℃로 10 분 동안 원심분리)하여 이를 추가로 사용하였다.
3. 동결된 성숙한(7일)DC 를 1 에서와 같이 해동시키고 조직배양판(미국, 뉴저지, Falcom Becton Dickinson Labware)에서 37 ℃ 및 5 % CO2 로 2 시간 동안 둔 다음, 세포를 수거(150 ×g 및 22 ℃로 10 분 동안 원심분리)하여 이를 추가로 사용하였다.
4. 동결된 성숙한(7일)DC 를 56 ℃의 물 배쓰에서 해동시킨 다음, 10 ml 의 얼음처럼 차가운 "Hank's Balanced Salt Solution" (Bio Whitaker)에 가하고 즉시 133g 및 4 ℃에서 12 분동안 원심분리시켰다. 이어서, 세포를 수거하여 추가로 사용하였다.
c DC 생존율의 결정
동결되고 재해동된 DC 의 생존율을 GM-CSF 및 IL-4 를 가하지 않은 완전 배지에서 4 일 이상 배양("wash-out-test")함으로써 측정하였고,(Thurner 등. (1999) J. Immunol. Methods 223, 1)에 기재된 바와 같이, 동결되지 않은 PBMC 및 동결된 PBMC 로부터 가공없이(freshly)제조된 DC 의 생존율와 비교하였다. 생존하는 DC 의 각각의 양은 세포 카운터(counter)(독일, Reutlingen, Schaerfe System, Cassy Cell Counter and Analyser System, Model TT ; 상기 시스템은 "펄스(pulse)영역 분석"을 사용하고 세포 카운트, 세포 크기 및 부피는 물론 생존 세포가 존재하는지 여부도 측정할 수 있음)로 측정하였고 대조구로서 표준 트리판 블루 염색을 통하여도 측정하였다.
먼저, DC 농도의 영향을 조사였는데, 이 때 10 ×106 성숙한 DCs/ml 에서 동결된 경우 가장 좋은 결과를 얻었다. 결과를 도 1 에 나타내었다.
또, DMSO 농도(5 내지 12.5 % v/v 의 최종 농도)의 영향을 조사하였다. DMSO 농도의 변화는 해동된 DC 의 생존율에 결정적인 정도의 영향을 미치지는 않았다.
또한, HSA 또는 순수한 자원성 면역혈청으로 더 나은 생존율을 얻을 수 있는지 여부 및 글루코스(1, 2, 3, 5, 10 및 15 % 의 최종 농도 v/v)의 첨가가 생존율을 개선시키는지 여부를 조사하였다. 결과를 도 2 에 나타내었다. HSA 가 자원성 면역혈청으로 교체된 경우, 수일 후 DC 의 생존율은 재생적으로 증가하였다. 최종 농도를 5 % (v/v)로 하여 글루코스를 첨가하면 결과가 더욱 개선되었다.
다양한 시판되는 동결 배지(이를 테면, Erythrocyte, Freezing SolutionTM 또는 Cell Processing Solution(Fresenius))를 또한 조사하였다. 그러나, 이들은 이미 테스트된 동결 배지에 비하여 불량한 결과를 나타내었다.
또한, b)에서 언급된 다양한 해동 조건을 해동 후 세포가 받게되는 스트레스를 최소화하기 위하여 조사하였다. 테스트된 4 가지의 방법 중 어느 것도 다른 것보다 분명한 우월함을 나타내지 못했다.
성숙한(7일)DC 를 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조하고 하기 조건 하에서 동결시켰다:
순수한 자원성 면역혈청 + 10 % DMSO + 5 % 의 글루코스 내에서 10 ×106 /ml 의 세포 밀도로 1 분당 1 ℃ 씩의 냉각율. 액체 질소의 기체 상에서 3 시간 이상 저장한 다음, 세포를 해동시켰다. 해동시킨 후, 생존 DC 의 퍼센트를 직접 측정(=d7)하였다. DC 의 분획물을 뿌리고 나서, 시토신이 존재하지 않는 배지에서 배양("wash-out-test")한지 최대한 4 일이 지난. 다음 실시예 1c) 에 기재된 바와 같이 생존율을 측정하였다(n=20). 결과를 하기 표에 나타내었다.
해동된 후 (7일) 및 "wash-out-test" 에서의 동결/해동된 DC 의 수율(8-11일)
일 수율(%) 95% 의 신뢰 구간
7 93.3 100.0-85.8
8 74.1 81.7-66.6
9 63.3 70.8-55.7
10 55.8 63.4-48.2
11 47.1 57.9-36.2
실시예 3
선택적으로 성숙되고 동결된 DC 는 생존율 및 T-세포 자극 활성에 있어서 가공없이(freshly) 제조된 DC 와 대등하다.
a) 먼저, 동일한 공여자로부터 얻은 동결되고 재해동된 DC 의 생존율이 가공없이 제조된 DC 의 생존율에 필적할만한지 여부를 조사하였다. 따라서, 실시예 2c)에 기재된 바와 같이 "wash-out-test" 를 사용하였다. 결과를 도 3 에 나타내었다. 동일한 공여자로부터 얻은 해동된 DC 와 가공없이 제조된 DC 사이에는 차이가 없다는 것이 밝혀졌다.
또한, 해동된 DC 의 형태 및 표현형을 가공없이 제조된 DC 의 형태 및 표현형과 비교하였다. 세포의 형태를 전환상 현미경(독일, Wetzler, Lika Mikroskopie und Systeme Gmbh, Leika DM IRB)로 조사하고 사진을 찍어 기록하였다. 세포 군집의 표현형을 (Thurner 등. (1999) J. Immunol. Methodes 223, 1)에 기재된 바와 같이, 일련의 단핵 세포 항체로 조사하여, FACScan 장치(미국, 뉴저지, Becton Dickinson)상에서 조사하였다. 사멸한 세포는 이들의 광-분산성때문에 분리되었다. 결과를 도 4 및 도 5 에 나타내었다. 동결되고 재해동된 DC 는 수일이 지나도 이들의 특징적인 형태와 표현형을 유지한다.
b) 그리고 나서, 재해동된 DC 가 이들의 기능성도 유지하는지 여부를 조사하였다.
1. 따라서, 재해동된 DC 가 주요한 동종 MLR 을 가공없이 제조되고 동결되지 않은 성숙한 DC 만큼 효과적으로 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. 상기 테스트를 (Thurner 등. (1999) J. Immunol. Methodes 223, 1)에 기재된 바와 같이 수행하였다. DC 를 바닥이 평평한 96-용기판에 용기당 2 ×105 로 있는 동종 T-세포에 분리된 양으로 가하고, 4-5 일동안 RPMI 1640(겐타마이신, 글루타민 및 5 % 읠 동종 열-불활성화된 인간 면역혈청(풀 면역혈청)이 보충됨)내에서 공동 배양한 다음, 3H-티미딘(4μCi 최종 농도/ml)을 가하여 12 내지 16 시간의 동시 인큐베이팅을 하면서 이 때의 증식을 측정하였다. 결과를 도 6 에 나타내었다. 동결되고 재해동된 DC 는 가공없이 제조된 성숙한 DC 만큼 효과적으로 주요한 동종 MLR 을 유도한다.
2. 동결되고 재해동된 DC 가 얼마나 효과적으로 세포독성 T 백혈구(CTL)을 유도하는지를 또한 조사하였다. 이를 위하여, IMP-펄싱된 성숙한 DC 에 의하여 IMP(인플루엔타 매트릭스 펩티드) 특이 CTL의 유도를 측정하였다. 상기 연구는 T 세포 및 외인성 IL-2가 없이 수행되는 경우 성숙한 DC 에 특이하다. 인플루엔자 매트릭스 A2.1 펩티드(IMP) 또는 Melan-A A2.1 펩티드에 특이한 CD8+ T세포의 유도는 정제된 DC8+ T세포(독일, Bergisch Gladbach, Miltenyi Biotec, 공급자의 설명에 따라 CD8 마이크로베이스가 있는 자기 전지 솔팅(sorting)/MACS에 의한 PBMC 로 부터 분리됨)의 자극에 의하여 일어나거나, 또는 다른 실험에서는 HLA-A2.1 제한 IMP(GILGFVFTL [서열 번호 1], 10 μM, 1 시간동안 37 ℃에서 1 ×106 DC/ml 의 완전 배지)로 펄싱되지 않거나 펄싱된, DC 가 있는 비-유착성 PBMC 단편(HLA-A2.1+ 공여자로부터 자원성 PMBC 로부터 제조됨) 또는 Melan-A-유사 펩티드(ELAGIGILTV [서열 번호 2], 10μM)의 자극에 의하여 일어났다(DC/T 의 비가 1:10 또는 1:30 으로 7일 간 시토킨의 첨가는 없음). CTL 을 표준 용해 평가기(Bhardwaj 등 (1994) J. Clin. Invest. 94, 797) 또는 37 ℃의 테트라머 스테이닝(staining)(Whelan 등. (1999) J. Immunol. 163, 4342)에 의하여 정량하였다. 상이한 효과기(effector)/표적 세포 비에서 수행되는, 표준 4시간 51Cr-방출 조사기를 위한 표적 세포는, IMP-펄싱된(1 시간 동안 37 ℃에서 10 ㎍/ml)된 T2A1 세포, 펄싱되지 않은 T2A1 세포 및 K562 표적 세포(모두 51Cr으로 라벨링됨)이었다. 실험은 자연산 킬러 세포 활성을 막기위하여 K562 세포를 80 배 초과하여 수행되었다. 특이 용해(%) 를 (특이 방출-자발 방출)/(최고 방출-자발 방출) ×100 의 공식에 의하여 계산하였다. 용해가능한 IMP 및 Melan A/HLA A2.1 테트라머를 제조하고. T 세포의 형성을 플로우 시토 메트리(flow cytometry)로 37 ℃에서 (Whelan 등. (1999))에 기재된 바와 같이 분석하였다. 1 ㎕의 테트라머(0.5 내지 1 mg/ml) 를 약 60 ㎕ 의 배지(겐타마이신, 글루타민 및 5 % 의 동종 열-불활성화된 인간 면역혈청(풀 면역혈청)이 보충된 RPMI 1640으로 이루어짐) 내의 2 ×106 세포(원심분리 및 상청액을 버린 다음 용기에 남아 있는 물질)에 가하였다. 이어서, 세포를 세척하지 않고 냉각시키고 얼음 상에서 15 분동안 삼중 스테이닝된 인간 CD8 DP 대한 단핵 세포 항체(California, Burlingame, Caltag Laboratories)와 함께 인큐베이팅시켰다. 3 번 세척한 다음 상기 세포를 FACScan 장치(Becton Dickinson)상에서 분석하였다.
결과를 도 7 및 도 8 에 나타내었다.
DC 를 동결 및 재해동시키는 것은 강력한 IMP-특이 CLT 반응을 포함하여, 성숙한 DC 의 성능을 변화시키지 않는다. 또한, 동결 및 재해동은 강력한 IMP-특이 CD8+ T 세포 반응을 포함하여 성숙한 DC 의 성능을, HLA-A2.1/펩티드 테트라머 분석에 의하여 나타나는 바와 같이, 변화시키지 않는다.
상기 실험은 동결 및 재해동 후, 가공없이 제조된 DC 와 완전히 동일한 생존 DC 가 얻어짐을 나타낸다.
실시예 4
동결되고 재해동된 DC 의 생존율을 증대시키기 위하여, 하기의 상이한 항-세포소멸 자극제를 상이한 농도로 상이한 시간에 DC 에 가하였다.
1. 100, 200, 500 ng/ml 의 재조합 뮤린(murine) 또는 인간 삼중 TRANVE(Wong 등. (1997) J. Exp. Med. 186, 2075) ;
2. 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml 및 1 ㎍/ml 의 RANKL(Anderson 등. (1997) Nature 390, 175) ;
3. 50, 100 및 500 ng/ml의 삼중 용해가능한 CD40L(Morris 등. (1999) J. Biol. Chem. 274, 418).
DC 를 상이한 항-세포소멸 자극제에 37 ℃에서 최소한 12-16 시간의 배양을 위하여 동결 전에 밤새도록 두고, 동결 전의 4 시간동안 두고(GM-CSF 및 IL-4가 있는 완전 배지 내 1 ×106 의 세포 밀도), 또한 해동 후에도 4 시간 동안(GM-CSF 및 IL-4가 있는 완전 배지 내 1 ×106 의 세포 밀도) 두었다.
해동된 DC 를 항-세포소멸 자극제에 간단하게 노출되는 것은 동결 전 DC 처리만큼 효과적이고, 증가된 생존율을 얻게 되나, 이는 종종 "wash-out-test"에서는 3 일후만 관찰가능하다. CD40L(도 9 ) 및 TRANCE/RANKL(결과를 나타내지 않음)는 유사한 결과를 생성한다. 결과는 CD40L 및 TRANCE/RANKL의 첨가는 3 일 이상의 DC 의 생존율을 개선시킴을 보여준다.
실시예 5
DC 동결 전에 DC 에 항원이 성공적으로 로딩되는지 여부를 조사하기 위하여, DC 에 파상풍 유독소(TT)(단백질 항원의 예로서) 또는 IMP(펩티드 형태로서)를 로딩하였다. TT 로 펄싱하기 위하여, DC 를 류카프레시스 생성물로부터 얻은 PBMC 의 가공되지 않았거나 동결된 분획물(상기 내용 참조)로부터 제조하였다. TT 를 미성 숙 세포에 10 ng/ml 로 5 일째에 가하였다. 성숙한 DC 를 7 일 째에 수거하고 동결하지 않거나 또는 동결 및 해동을 한 다음에(4 일 후), PBMC 내에서의 이들의 TT-특이 증식 반응 유도 능력을 조사하였다. 따라서, 펄싱되지 않고 TT 펄싱된 DC 의 분량이 나눠진 양은 PBMC(10 ×104/well)에 가하고 (Thurner 등. (1999) J. Immunol. Methodes 223, 1)에 기재된 바와 같이 5 일 째에 3H-티미딘으로 펄싱시켰다. IMP로 로딩하기 위하여, DC 를 동결 전 또는 해동 후에 10 μM 의 펩티드(1 시간 동안, 37 ℃, 1 ×106 DC/ml의 완전 배지)로 펄싱시켰다. IMP가 성공적으로 존재하는 능력을 상기와 같이 테스트하였다.
동결된 TT-펄싱된 DC 는 가공하지 않고 제조된 TT-펄싱된 DC 와 동일한 자극 특성을 갖는다(도 10). 동결 전에 IMP 또는 Melan A 가 로딩된 DC 모두 및 해동 후에 로딩된 DC 는 모두는 IMP- 또는 Melan-A-특이 CTL 을 동일하게 잘 자극하였다(도 8 및 11). 이러한 결과는 이미 항원이 로딩되어 해동 후 즉시 사용될 수 있는 성숙한 DC 의 동결된 분획물을 제조하는 것이 가능한 것을 나타낸다.
실시예 6
5기 흑색종 환자에 대하여, 본원에서 보여진 본 발명의 방법에 따라 제조되고 항원이 로딩된, 펩티드- 및 단백질이 로딩된 DC 를 접종하였다. 도 12 는 접종된 모든 환자에 있어서, KLH 에 대한 헬퍼 세포형 1 반응 유도를 나타낸 것이다. 각각의 환자에게 GM-CSF 및 인터루킨-4 및 본 발명에 기재된 바와 같은 성숙 조성물(예를 들면, 도 1 및 3)을 이용하여 류카프레세이트로부터 제조된 4 밀리온의 성 숙한 DC 를 피하 주입하였다. 이 때, 조절 항원 KLH 를 10 ㎍/ml의 농도로 성숙 조성물과 동시에 가하고, DC 를 부분적으로 동결시켰다. 접종 전 전 및 4 밀리온의 DC 만을 투여한지 14 일 후에, 혈액을 제거하고 표준 Elispot 조사기(10 ㎍/ml 의 KLH 를 500,000 PBMC 에 첨가 및 인터페론-γ또는 IL-4 를 생산하는 다수의 세포의 측정; KLH 가 첨가되지 않은 기준은 거의 0임)로 조사하였다. 접종 전에는 KLH 존재에 의하여는 인터페론-γ및 인터루킨-4 모두가 생성되지 않지만, 반면 KHL 이 로딩된 DC 만을 접종한지 14 일 후에는 인터페론-γ을 생산하나, 인터루킨-4 를 생성하지 못하거나 미량만이 생성하는 T 세포가 모든 환자에게 유도됨이 밝혀졌다(대조구에서는, CD4 세포를 반응 세포가 CD4-양성 헬퍼 T 세포인 PBMC 로부터 제거함으로써 나타남).
실시예 7
실시예 6 의 실험의 환자는 수 회의 DC 피하 접종받았는데, 각 DC 의 4 밀리온에는 도 13, 14 및 15 에서 기재된 바와 같이 펩티드가 로딩(즉, 4 밀리온의 DC 당 1 개의 펩티드만)되어 있었다. 첫번째 각각의 접종 전 및 접종을 하는 14일 후 및 다음 각각의 접종 직전에, 혈액을 제거하고 표준 Elispot 평가기를 Thurner 등. (1999) J. Exp. Med. 190, 1669-1678, under Materials and Methods에 기재되어 있는 바와 같이 적용하였다. 접종에 사용된 DC 를 도 8 및 도 11 및 실시예 5 에서 기술되는 바와 같이 제조하였고, 각 펩티드를 해동 후에만 로딩하였다. 도 13 내지 15 에서 볼 수 있는 바와 같이, 몇몇의 클래스 I (도 13 및 14) 및 클래스-II 펩티드(도 15)에 대한 면역은 유도되었다. 사용된 펩티드의 특성은 도 I.로부터 알 수 있다. 특별한 환자의 HLA 형은 HLA-A 2.1+ 및 HLA-A3 는 물론 HLA-DR 13+, HLA-DP4+(그러나, DR4-)임이 인지된다. 도 13 은 한 번의 접종(제2란 제2의 백신 접종 전의 간단한 혈액 제거 및 Elispot 평가를 의미함)으로 인플루엔자 펩티드 NP-A3 및 IMP-A2에 대한 면역 유도를 나타내고, 추가 접종 후에는 증가를 보이나, 접종에 사용되지 않은 EBV-A2 및 IV-9-A2 펩티드 내에서는 변화가 없다고 나타난다. 도 14 는 4 가지의 클래스-I 제한 종양 펩티드, 명확하고 애매하지 않게는 Melan A-A2.1 에 대한 면역 유도를 나타낸다. 도 15 는 두 개의 제한된 종양 펩티드 클래스-II(Mage 3-DR13 및 - DP4)에 대한 면역 유도지만 티로시나아제-DR4 및 GP 100 DR4 에 대한 면역 유도는 아님을 나타낸다(환자는 DR4-네가티브이어서 DC 에는 이러한 펩티드가 로딩될 수 없으므로 이는 네카티브 대조구임)
실시예 8
종양 세포 제조물(종양 세포 용해물, 세포파괴 또는 세포소멸 종양 세포)로 항원 로딩 후 수상돌기 세포의 동결저장
수상돌기 세포(DC)는 류카프레스로부터 다량으로 생산될 수 있다. 성숙한 DC 의 동결저항 방법은 이러한 세포를 부분적으로 접종에 사용할 수 있도록 개발되어 왔다. 이번에는, 사용하기 전에 성숙한 DC 에 종양과 관계된 항원(TAA)의 면역우성 서열과 일치하는 펩티드를 로딩하였다. 여기에 기술된 실험에 있어서(도 16 참조), 상이한 종양 세포 조제물로 로딩되고 이후 성숙된 미성숙 DC 가 또한 동결저장될 수 있는지 여부를 조사하였다.
종양 세포 조제물:종양 세포 조제물을 제조하기 위하여, Mel526 흑색종 세포 계를 사용하였다. Mel526 세포를 RPMI 내에서 세척하고 57 ℃에서 반복가열 처리한 다음 액체 질소로 냉각하였다. 이후, 세포 물질을 초음파 장치를 이용하여 흔들었다. 가열/동결 순환은 네크로시스(necrosis)를 유도하기 때문에, 모든 세포 성분을 함유하고 있는 이러한 종류의 종양 세포 제조물을 하기에서는 괴사성 세포 물질이라고 한다. 용해물을 얻기 위하여, 이러한 단계 후 초원심분리를 수행하여 세포 성분을 제거하고 Centricon 원심분리 용기 내에서 단백질을 정제하였다. Bradford 분석 결과에 따라, 높은 활성을 지닌, 즉 ≥10kDa 인 단백질 분획물을 사용하였다. 세포소멸성 종양 세포는 광범위 UVB 방사선 방치로 유도되고 Annexin V 테스트로 입증되었다.
DC 의 생산: 실험적인 면역치료에 사용되는 기법에 따라 류카프레시스로부터 DC 를 생산하였다. PBMC 를 Nunc Cell Factories에 놓고 1000 IU/ml 의 GM-CSF 및 500 IU/ml 의 IL-4가 보충된 RPMI(1 % 의 자원성 열-불활성화된 혈청)과 배양하였다. 5 일째 되는 날, 미성숙한 DC 를 이용하여 4 시간동안 종양 세포 조제물로 1:1 의 농도로 기술된 바와 같이 로딩하였다.
로딩: 37 ℃ 및 5 % 의 CO2에서 5 ml의 폴리프로필렌 반응 용기 내에서 로딩이 일어났다. 로딩된 다음, DC 를 12 ml의 조직 배양판에 놓고 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2 로 이루어진 성숙 혼합물로 24시간동안 배양하였다.
동결/해동:각각의 로딩된 DC 의 반을 1.8 ml Nunc 동결 유리관에서 -80 ℃로 3 시간동안 (Feuerstein B. 등., J. Immunol. Methods 245:15-29(2000))에 기재되 어 있는 방법에 따라 각각 동결저장하였다. 따라서, 세포를 다시 기재된 방법에 따라 해동시키고 37 ℃ 및 5 % 의 CO2에서 RPMI 배지 내에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 DC 분획물은 물론 동결되지 않은 분획물을 분석하여 실험에 사용하였다.
기재된 실험 과정을 도 16 의 흐름도로 나타내었다.
세포 합계 및 생존가능성:세포의 총계 및 DC 의 생존 가능성을 기재된 로딩 및 동결저장을 수행한 다음에 트리펜 블루로 현미경을 이용하여 측정하였다. 최초에는, 5 ×105 DC 가 사용되었다. 우리는 필적할 만한 세포 합계를 찾았고 로딩되고 동결저장된 DC 의 생존 가능성에 있어서는 동결저장되지 않은 세포와 비교하였을 때 차이를 발견하지 못하였다(도 17A, 18A). 동결저장에 의한 것이 아니라 로딩에 의한 세포, 특히 괴사 세포 합계의 감소는 관찰될 수 있다.
기능성:기능을 테스트하기 위하여, 혼합된 백혈구 반응 테스트(MLR)을 수행하였다. 로딩된 DC 를 동종 MLR (동종 백혈구로 4 일동안 인큐베이팅됨)사용한 후 방사선 티미딘(3H-티미딘)으로 13시간동안 펄싱하였다. 필적할 만한 동종 자극 성능이 동결저장된 로딩된 DV 및 동결저장되지 않은 로딩된 DC 에 대하여 얻어졌다(도 17B, 18B).
표현형:항원 존재 및 DC 의 기능적 존재와 관련된 표면 분자의 발현을 평하하기 위하여, FACS 분석을 대응되는 항원에 대하여 수행하였다. 필적할 만한 표면 발현 형태가 상이한 로딩 방법 및 동결저장 후에 발견되었다(도 17).
직접 항원 탐지:직접 종양 항원을 탐지하기 위하여, HLA-A1 상황에서, 즉 Mage-1 펩티드와 HLA-A1 분자의 컴플렉스 상황에서, MAGE-1을 인식하는 항체를 사용하였다. 상이하게 로딩된 DC 를 상기 항체로 염색하고 FACS 로 분석하였다. 펩티드가 로딩된 (3 시간/ml의 20 μM 의 MAGE-1 펩티드)DC 를 사용하는 경우, 동결저장 후에 MAGE-1/A1 항원의 비율은 탐지될 수 있는데, 이는 동결저장없는 경우에 탐지된 비율에 필적할 만하였다(도 18C). 상기 실험으로부터, 동결저장은 항원의 손실을 초래하지 않는다고 결론지어질 수 있다.
추가의 실험에서, MAGE-1/A1 항체를 상이한 로딩 방법의 효과 조사에 사용하였다. 종양 세포 조제물(사용된 흑색종 세포계는 Mage-1-항원을 나타냄)에 있어서, 약 20 % 의 펩티드 펄싱의 항원 밀도에 도달하는 중요한 로딩을 달성할 수 있다(도 18D). 동결저장 전후의 MAGE-1/HLA-A1 컴플렉스의 발현은 필적할 만한 양으로 탐지될 수 있다(로딩되지 않은 DC 를 기준으로 하여 양성으로서 계산됨)
결론:본 발명이 로딩되지 않은 DC 또는 펩티드 또는 단백질이 로딩된 DC (실시예 1-7 에 나타남)의 효과적인 동결저장뿐만 아니라, (종양)세포 조제물(단순 괴사 종양 세포, 종양 세포로부터 제조된 용해물, 또는 세포소멸 종양 세포)이 로딩된 DC 의 유사하게 효과적인 동결저장을 가능하게 함을 보여줄 수 있다. 동결에 있어서 "효과적"이란, i) 해동 후의 세포 손실이 동결되지 않은 DC 에 비하여 25 % 미만인 경우, ii) 해동된 DC 가 동결되지 않은 DC(동종 MLR 에서 처리됨)에 필적할 만한 T 세포 자극 능력을 갖고 있는 경우, 및 iii) 항원 및 T 세포 수용체에 대한 리간드의 표면 발현(즉, 특이 MHC 펩티드 컴플렉스)가 동결 및 해동 과정 후에도 유지되는 경우(특별한 펩티드/MHC 컴플렉스, 즉 MAGE-1/HLA-A1 컴플렉스를 특이하게 인식하는 단핵 세포 항체를 이용하여, 이들을 직접 탐지하여 모델에서 나타남)이다.
실시예 9
항원 로딩후 아데노바이러스 트랜스펙팅을 이용한 수상돌기 세포의 동결저장
아데노바이러스로 트랜스펙팅된 수상돌기 세포는 본 발명에 의한 방법에 따라 수상돌기 세포의 특성이 트랜스펙팅된 수상돌기 세포의 특성에 필적할 만한 방법으로 동결될 수 있다. 이를 위하여, 성숙한 DC 는 녹색 형광 단백질(GFP)를 코딩하는 cDNA 를 2 시간동안 500 의 감염 개체(MOI)를 얻을 수 있는 아데노바이러스 벡터(AD5)로 감염되었다. 2번 세척한 후, 세포를 HSA 및 5 % 의 글루코스 내의 10 % DMSO(최종 농도) 내에서 10 ×106 DCs/ml의 농도로 동결시키고 4 시간동안 저장하였다. 해동 후, 세포의 생존 능력을 트리판 블루 배제로 측정하였다. 생존가능한 세포의 수거율은 도 20 에서 동결된 DC 에 대한 퍼센트로 기술되었다.
이에 더하여, 아데노바이러스-감염된 DC 의 동종 자극 활성은 동결저장에 의하여 변화되지 않음이 보여질 수 있다. 따라서, 성숙한 DC 를 아데노-GFP 로 500 의 MOI 로 감염시키고 상기 기재된 바와 같이 동결저장하였다. 재해동 및 24 또는 72 시간동안 배양한 후, 수상돌기 세포를 동종 CD4+ T 세포(용기당 2 ×105)에서 도 21 에 기재된 조건 하에서 공동 배양하였다. 4 일 후, 세포를 [3H]-티미딘으로 16시간동안 펄싱시키고, 합체된 방사선을 측정하였다. 도 21 에서, 3 가지 합계의 평균 수치를 대응되는 표준 편차와 함께 기술하였다. T 세포만 또는 DC만에 대한 수치는 항상 1 분당 1000 미만이었다.
이에 더하여, 성숙한 DC 를 아데노-GFP 와 함께 500의 MOI 로 상기 기재된 바와 같이 동결건조시켰다. 재해동 및 기술된 배양 시간 후, 세포를 CD83, CD25, CD86, CD80에 이어서 PE-컨쥬게이팅된 염소/마우스 IG(Fab')2 에 대하여 특이한 항체를 사용하여 동결저장시켰다. 결과를 도 22A 에 나타내었다. HLA 클래스 I, HLA-DR 및 CD40 에 대하여 특이한 항체를 사용하는 필적할 만한 실험에 있어서, 도 22B 에 나타낸 결과를 얻었다.
실시예 10
RNA 트랜스펙팅을 사용하여 항원 로딩 후 수상돌기 세포의 동결건조
RNA로 트랜스펙팅된 수상돌기 세포는 본 발명에 의한 방법에 따라 수상돌기 세포의 특성이 트랜스펙팅되지 않은 수상돌기 세포의 특성에 필적할 만한 방법으로 동결될 수 있다. 미성숙 단계에서 DC 는 RNA 로 트랜스펙팅될 수 있고 이후 성숙되어 성숙한 DC 로서 동결된다.(나타내지 않음). 바람직하게는, 이미 성숙한 DC 가 RNA 로 트랜스펙팅되고 동결저장된다. 결과를 도 25 내지 27 에 나타내었다.
따라서, 성숙한 수상돌기 세포를 RPMI 로 두 번 세척하고 Optimix kit(EQUIBIO, Maidstone Kent, 영국)의 세척액으로 한 번 세척하였다. DC 를 Optimix 배지에서 40 ×106 DCs/ml 의 최종 농도로 하였다. 이후, 세포 현탁액의 0.1ml를 40 ㎍의 생체 외 전사된 EGFP RNA 와 1.5 ml 의 반응 용기에서 혼합하였 다. 최대 3 분동안 상온에서 인큐베이팅한 다음, 세포 현탁액을 0.4cm 갭(gap) 전기침공 큐벳에 옮기고 260V 의 전압 및 Gene Pulser II 가 있는 150 μF 의 캐페시턴스(독일, Munich, Biorad)로 펄싱시켰다. 대조 DC 를 RNA 를 가하지 않고 펄싱시켰다. 세포를 10 ×106 DCs/ml 의 농도에서 HSA (10 % 의 DMSO 및 5 % 의 글루코스(최종 농도)가 있음) 내에서 동결시키고 4 시간 동안 저장시켰다. 해동 후, 세포의 생존 가능성을 트리판 블루 배제로 측정하였다. 생존가능한 세포의 수거율을 동결된 DC 에 대한 퍼센트로서 도 25 에 나타내었다.
성숙한 DC 를 EGFP RNA 로 전기천공시키고 상기 기재된 바와 같이 동결건조시켰다. 재해동 및 48 시간 동안의 배양 후에, 수상돌기 세포를 동종 CD4+ T 세포(용기당 2 ×105)와 함께 도 26 에 기술된 조건 하에서 공동 배양하였다. 4 일 후, 세포를 [3H]-티미딘으로 16 시간 동안 펄싱시킨 다음 합체된 방사선을 측정하였다. 도 26 에서, 3 번 측정된 된 평균치(표준 편차가 있음)가 보여진다. T 세포만 또는 DC만 있는 경우의 수치는 항상 분당 1000 보다는 작다.
RNA-전기침공된 DC 의 동결저장은 DC 마커의 표현형을 변화시키지 않는다. 따라서, 성숙한 DC 는 EGFP RNA 로 전기침공되고 상기 기재된 바와 같이 동결저장되었다. 재해동 및 48 시간의 배양 후, DC 를 도 27 에 기재된 바와 같은 마우스 단핵 세포 항체 및 PE-컨쥬게이팅된 항-마우스 IG(Fab')2단편을 사용하여 카운터스테이닝(counterstained)한 다음, FACS 분석을 하였다. 도 27 내의 사각형의 오른쪽 아래 부분의 모습은 EGFP-양성 DC와 관계있고, 오른쪽 상단의 모습은 EGFP/DC-마커 이중-양성 DC 와 관계있다.

















SEQUENCE LISTING <110> GEROLD SCHULER <120> Method for the preparation of ready-for-use antigen-loaded or non-antigen-loaded cryoconserved mature dendritic cells <130> 010589wo/JH/ml <140> <141> <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 1 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mart1/MelanA-analogue peptide (AA 26-35) <400> 2 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 3 Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: gp100-analogue peptide, AA 209-217 <400> 5 Ile Met Asp Gln Val Pro Phe Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys Val 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Leu Tyr Asp Gly Met Glu His Leu 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val 1 5 10 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 10 Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 11 Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: tyrosinase-analogue peptide, AA 243-251 <400> 14 Lys Ser Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 15 Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Val Tyr Phe Phe Leu Pro Asp His Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: tyrosinase-analogue peptide, AA 450-462 <400> 24 Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Val Pro Asp Ser Phe Gln Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Trp Asn Arg Gln Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp 1 5 10 15 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu 1 5 10 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr 1 5 10 15

Claims (32)

  1. a) 미성숙한 수상돌기 세포(DC)를 제공하는 단계;
    b) 하나 이상의 성숙 자극제가 있는 성숙 혼합물(maturing cocktail)을 함유하는 배양 배지에서 상기 미성숙한 DC를 배양하여 성숙한 DC를 얻는 단계;
    c) 상기 단계 b)에서 수득된 성숙한 DC를 자가 혈청(autologous serum) 또는 자가 혈장, 5 내지 25%(v/v)의 DMSO 및 2 내지 30%(w/v)의 하나 이상의 폴리올 화합물을 포함하는 동결 배지에서 동결시키는 단계
    를 포함하는 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DC는 상기 DC 동결 전 또는 동결된 DC를 재해동시킨 후, 항원 또는 항원-항체 컴플렉스로 로딩되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (i) 상기 미성숙한 DC 가 CD14+ 단핵 세포(단구 세포) 또는 CD34+ 세포로 부터 제조되거나; 또는
    (ii) 상기 미성숙한 DC 가 혈액으로부터 직접 분리되거나; 또는
    (iii) 상기 미성숙한 DC 또는 이의 전구 세포가 류카프레세이트(leucapheresates)로부터 얻어지거나; 또는
    (iv) 상기 미성숙한 DC 또는 이의 전구 세포가 가공되지 않은 혈액 또는 골수로부터 얻어지는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성숙 자극제는 IL-1, IL-6, TNF-α, 프로스타글란딘, IFN-α, 리포다당류(lipopolysaccharide) 및 기타 박테리아성 세포 생성물, 포스포릴콜린, 칼슘 이오노포레스, 포르볼 에스테르, 열-충격 단백질, 뉴클레오티드, 리포펩티드, Toll-유사 수용체에 대한 인공 리간드, 이중 가닥 RNA, 면역자극성 DNA 서열, 및 CD40 리간드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성숙한 세포를 얻기 위한 단계 b)의 배양은 1 시간 이상 수행되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리올 화합물은 글루코스, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, 에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-소르비톨, 이노시톨 및 D-락토스로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 성숙한 DC가 5 ×106 내지 100 ×106 세포/ml의 농도로 동결되는 것을 특징으로 하는 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 DC는 동결되기 전에 항원 또는 항원-항체 컴플렉스로 로딩되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 DC에 로딩된 상기 항원은 단백질 또는 8 개 이상의 아미노산을 갖는 이의 단편인 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 DC는 상기 항원을 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자로 로딩되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  13. 제2항에 있어서, 상기 항원-항체 컴플렉스에서 단백질 단편, 세포 또는 세포 단편 또는 핵산 서열이 항원으로서 작용하고, 항체는 클래스 IgG 또는 IgE 중 하나인 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DC가 동결되기 전 또는 재해동된 후 세포소멸(apoptosis)을 억제할 수 있는 분자와 접촉되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 동결된 DC의 갯수를 기준으로 하여 75 % 이상의 DC가 상기 DC의 동결 및 재해동 후에 생존하는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 성숙한 동결저장된 DC로부터의 백신 제조에 이용할 수 있는 것인 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제2항의 방법에 의해 제조된 항원이 로딩된 동결된 성숙한 수상돌기 세포.
  20. 삭제
  21. 제19항의 수상돌기 세포를 포함하는 백신.
  22. 제4항에 있어서, 상기 IL-1은 IFL-1β이거나, 상기 프로스타글란딘은 PGE2이거나, 상기 리포다당류 및 기타 박테리아성 세포 생성물은 MPL(모노포스포릴리피드 A) 또는 리포테이코산이거나, 상기 포르볼 에스테르는 PMA이거나 상기 뉴클레오티드는 ATP이거나 또는 상기 이중가닥 DNA는 Poly-I:C인 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  23. 제4항에 있어서, 상기 배양 배지 또는 상기 성숙 혼합물은 IL-1β, IL-6. PGE2 및 TNFα를 포함하거나, 또는 상기 성숙 혼합물은 단핵세포 조건 배지(MCM) 또는 PGE2가 보충된 MCM인 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 미성숙 DC는 0.1 내지 100 ng/ml의 IL-1β, 0.1 내지 100 ng/ml의 IL-6, 0.1 내지 10 ㎍/ml의 PGE2 및 0.1 내지 100 ng/ml의 TNF-α의 존재 하에서 배양되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 성숙 자극제로 첨가되는 활성 물질 IL-1β, IL-6, PGE2 및 TNFα는 각각 개별적인 활성 물질의 정제된 조제물로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 b)의 배양 동안, 상기 배양 배지의 성숙 혼합물이 교체되거나 또는 추가적인 성숙 자극제가 상기 배양 배지에 첨가되거나, 또는 상기 배양 배지의 성숙 혼합물이 교체되고, 추가적인 성숙 자극제가 첨가되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역 조절제(immune modulator) 또는 성숙 조절제(maturing modulator)가 상기 배양 배지에 첨가되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 면역 조절제 또는 성숙 조절제는 IL-10, 푸마르산 및 이의 에스테르, 미코페놀레이트 모페틸 및 비타민 D3로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  29. 제8항에 있어서, 상기 폴리올 화합물은 글루코스인 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  30. 제11항에 있어서, 상기 단백질 또는 단편은 상기 배양 배지에 0.01 내지 1000 μM 의 농도로 첨가되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  31. 제11항 또는 제30항에 있어서, 상기 단백질 또는 단편은 IL-1β, IL-6. PGE2 및 TNFα가 상기 배양 배지에 포함되어 있는 경우, 상기 배지에 첨가되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
  32. 제14항에 있어서, 상기 세포소멸을 억제할 수 있는 분자는 CD40 리간드, TRANCE 및 RANKL로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 즉시 사용가능한 동결저장된 성숙한 수상돌기 세포의 제조 방법.
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