MX2007012221A - Composicion de celulas dendriticas y metodos. - Google Patents

Composicion de celulas dendriticas y metodos.

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MX2007012221A
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Rebecca Pogue-Caley
Tamara Monesmith
Irina Tcherepanova
Lois Dinterman
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Argos Therapeutics Inc
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Abstract

Se proporcionan metodo para la produccion de celulas dendriticas a partir de monocitos que han sido incubados a una temperatura de 1 degree C-34 degree C durante un periodo de aproximadamente 6 a 96 horas a partir del tiempo en que se aislaron de un sujeto. Despues del periodo de incubacion, los monocitos pueden ser inducidos entonces para diferenciarse en celulas dendriticas. Las celulas dendriticas maduras producidas por los metodos de la invencion tienen niveles incrementados de una mas moleculas CD80, CD83, CD86, MHC de la clase I, o moleculas MHC de la clase II en comparacion con las celulas dendriticas maduras preparadas a partir de monocitos que no han sido mantenidas a 1 degree C-34 degree C durante al menos 6 horas desde el momento en que fueron aislados de un sujeto. Las celulas dendriticas producidas por los metodos de la invencion son utiles para la preparacion de vacunas y para la estimulacion de celulas T.

Description

COMPOSICIÓN DE CÉLULAS DENDRITICAS Y MÉTODOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para la producción de células dendríticas y composiciones relacionadas útiles en el tratamiento de enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Numerosos ensayos clínicos han demostrado la seguridad de las vacunas de células dendríticas, y más de 1000 pacientes han recibido vacunas de células dendríticas sin eventos adversos serios asociados con la terapia y respuestas clínicas a la mitad de los pacientes (Ridgeway (2003) Cáncer Invest 21 : 873-876). Por ejemplo, un estudio reciente mostró que la vacunación usando células dendríticas cargadas con cuatro péptidos de melanoma (gplOO, melan-A/MART-1, antígeno de melanoma de tirosina (MAGE-3) , KLH y matriz de flu dieron como resultado la regresión de melamina metastásica después de cuatro vacunaciones bimensuales (Banchereau et al. (2001) Cáncer Res 61:6451- 6458). Un método común para preparar células dendríticas (DCs, por sus siglas en inglés) es recolectar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés) de un sujeto, y entonces diferenciar los monocitos, los cuales son una pequeña proporción de las PBMCs, en DCs. Ref: 186033 Se creía ampliamente que para actuar como precursores adecuados para la elaboración in vi tro de células dendríticas, los monocitos debían ser congelados o cultivados inmediatamente después del aislamiento de un sujeto. En consecuencia, en los ensayos clínicos anteriores donde las vacunas de células dendríticas eran producidas a partir de monocitos, los PBMC o monocitos serán cultivados a aproximadamente 37 °C o congelados dentro de unas cuantas horas de la recolección de las PBMC de un paciente. Sin embargo, las consideraciones de elaboración prácticas pueden limitar el uso difundido de vacunas procesadas por un método que requiere cultivar o congelar PBMC o monocitos recién aislados. La diferenciación de PBMC en DC toma aproximadamente una semana, requiere una instalación GMP y técnicos expertos. En consecuencia, proporcionar las instalaciones y personal para elaborar vacunas de DC en o cerca de cada sitio clínico donde se obtengan las PBMC de un paciente probablemente tendría un costo prohibitivo. Un modelo comercialmente disponible para elaborar vacunas de DC es proporcionar uno o un número relativamente pequeño de instalaciones que puedan elaborar vacunas de DC de PBMC o monocitos de pacientes recolectados en un sitio clínico y entonces enviarlo al sitio de elaboración. Sin embargo, ese modelo no puede ser aplicado en los métodos de producción de DC actuales que requieren PBMC o monocitos frescos. El congelamiento de monocitos frescos requiere manipulaciones adicionales en el sitio de recolección después de la leucaferesis , y por lo tanto no es una alternativa deseable. En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar métodos para elaborar vacunas de DC usando PBMC o monocitos que hayan sido almacenados durante transporte a una instalación de elaboración. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas adicionales también.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores han encontrado métodos los cuales permiten la preparación de células dendríticas y vacunas de células dendríticas a partir de monocitos que han sido almacenados a 1-3 °C durante periodos de tiempo de 6-96 horas después del aislamiento de un sujeto. La capacidad para producir DC a partir de monocitos almacenados permite una mayor flexibilidad y transporte de los monocitos del sitio de recolección a una instalación de producción. Además, los inventores han encontrado que las vacunas de células dendríticas elaboradas a partir de monocitos almacenados son fenotípicamente superiores a las células dendríticas producidas a partir de monocitos frescos. Por ejemplo, las vacunas de células dendríticas elaboradas a partir de monocitos almacenados tienen niveles mayores de moléculas coestimuladoras como CD80, CD83 y CD86, así como niveles más altos de moléculas MHC de la clase I y moléculas MHC de la clase II en comparación con las células dendríticas preparadas a partir de monocitos frescos. De este modo, en un aspecto, la invención proporciona un método para producir células dendríticas a partir de monocitos, que comprende: a. proporcionar monocitos que han sido incubados a una temperatura de 1°C-34°C durante un periodo de 6 a 96 horas a partir del momento que sean aislados de un sujeto; e b. inducir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas. En una modalidad preferida, los monocitos son obtenidos por leucaferesis para recolectar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que comprenden monocitos. Preferiblemente, la diferenciación es inducida poniendo en contacto los monocitos con el medio de cultivo que comprende la cantidad efectiva de una composición que induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras, como, pero sin limitarse a GM-CSF; GMCSF y IL-4: GM-CSF y IL-13; GM-CSF y IL-15; e IFN . Las células dendríticas inmaduras pueden entonces hacerse madurar para producir células dendríticas maduras. Las células dendríticas maduras producidas por los métodos de la invención son fenotípicamente diferentes que las células dendríticas maduras de la técnica anterior. Por ejemplo, la invención proporciona células dendríticas maduras derivadas de monocitos, donde la relación en estado estacionario de ARN de AL0X15 a ARN actina o ARN de GAPDH en las células es menor de 1.0. Esta es una relación menor en comparación con la relación de ARN de ALOX15 a Actina o GAPDH en células dendríticas maduras preparadas a partir de monocitos frescos. En otra modalidad, la invención proporciona una célula dendrítica madura derivada de monocitos, donde la relación en estado estacionario del ARN de CD52 a ARN de actina o GAPDH en la célula es mayor de 1.0. En otra modalidad más, la invención proporciona una célula dendrítica madura derivada de monocitos, donde la relación en estado estacionario de ARN de TLR1, ARN de TLR2, ARN de IL-lß o ARN de CD69 a ARN de actina o ARN de GAPDH en la célula es menor de 1.0. En otra modalidad más, la invención proporciona una composición que comprende células dendríticas maduras derivadas de monocitos, donde las células dendríticas maduras tienen niveles incrementados de uno o más CD80, CD83, CD86, moléculas MHC de la clase I, o moléculas MHC de la clase II en comparación con las células dendríticas maduras preparadas a partir de monocitos frescos. Además, la invención proporciona células dendríticas maduras derivadas de monocitos que tienen niveles en estado estacionario alterados de ARN de AL0X15, ARN de CD52, ARN de TLR1, ARN de TLR2, ARN de IL-lß o ARN de CD69. Las células dendríticas preparadas por los métodos de la invención son particularmente útiles para preparar vacunas. De este modo, también se proporcionan composiciones y vacunas de células dendríticas relacionadas. En una modalidad preferida, la vacuna es autóloga al sujeto. Preferiblemente, la vacuna de células dendríticas es cargada con antígeno de una célula cancerosa o patógeno presente en el sujeto. De manera sorprendente, los inventores han encontrado que las vacunas de células dendríticas congeladas con DMSO son estables en presencia de DMSO durante al menos dos horas después del descongelamiento. En consecuencia, la invención proporciona el uso de una célula dendrítica cargada con antígeno para la preparación de un medicamento congelado para el tratamiento y prevención del cáncer o infección patógena, donde el medicamento comprende al menos 2% de DMSO y es fácil de administrar durante su descongelamiento. En otra modalidad, la invención proporciona un método para vacunar a un sujeto, que comprende: a. descongelar una vacuna de células dendríticas congelada que contiene al menos 2% de DMSO, y b. administrar la vacuna descongelada al sujeto sin alterar la proporción de las células de DMSO antes de la administración.
Preferiblemente la concentración de DMSO es de aproximadamente el 10%. En otra modalidad, la invención proporciona una célula dendrítica cargada con antígeno, donde la célula se diferenciada in vi tro a partir de un monocito y es capaz de sobrevivir in vivo durante al menos 24 horas después del congelamiento en presencia de >5% de DMSO y descongelamiento. En una modalidad preferida, la célula dendrítica cargada con antígeno es capaz de sobrevivir in vi tro durante al menos 24 horas después del congelamiento en presencia de >10% de DMSO y descongelamiento. En otra modalidad, la invención proporciona una vacuna de células dendríticas, que comprende aproximadamente 5-15% de DMSO, donde la vacuna está lista para ser administrada a un sujeto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Diagrama de un recipiente de transporte y materiales de envase preferidos para el transporte a temperatura controlada de los monocitos (por ejemplo, el producto de la leucaferesis). Figura 2: las DC transfectadas con ARN proporcionan soporte coestimulador funcional. Las DC fueron probadas por su capacidad para estimular la producción de INF-? de PBMC en un ensayo de linfocitos mezclados (MLR) . Las DC descongeladas producidas de 3 donadores diferentes fueron apareadas con PBMC previamente congeladas de cada donador. Todas las combinaciones en pares fueron probadas usando ELISPOT (INF-?) como lectura. Las columnas 1, 4, y 7 representan DC apareadas con PBMC autólogas. Las columnas 2, 3, 5, 6, 8 y 9 representan DC apareadas con PBMC no autólogas. Las columnas 10-12 representan únicamente DC control. Las columnas 13-14 representan únicamente PBMC control. Figura 3: Las DC maduradas con cóctel de citocina fueron comparadas con DC inmaduras del mismo donador por su capacidad para estimular la producción de citocina Thl de células T autólogas. Ambas poblaciones de DC fueron transfectadas con el ARN que codifica para proteína de matriz de Flu y usadas para estimular CTL de memoria específica para Flu de PBMC autólogas. Se muestran los resultados de los análisis ELISPOT (# de manchas/pozo como función de las PBMC alimentadas). Cada conjunto de cuatro columnas está arreglado en el siguiente orden: producción de IFN? obtenida de células de memoria T específicas de Flu por DC inmaduras, producción de IFN? obtenidas de células de memoria T específicas de Flu por DC maduras; producción de IL-2 obtenida de células de memoria T específicas de Flu por DC inmaduras; producción de IL-2 obtenida de células de memoria T específicas de Flu por DC maduras. Figura 4: Se descongelaron dos frascos cada uno de dos preparaciones de células dendríticas cargadas con ARN producidas a partir de PBMC de dos días de antigüedad obtenidas de 2 donadores sanos diferentes. Un frasco de cada donador fue probado inmediatamente en un ensayo de alo MLR mientras que el segundo frasco de cada preparación se dejó permanecer a temperatura ambiente durante 40 minutos antes de ser ensayado por el mismo método. Las PBMC usadas en este experimento incluyeron células autólogas de cada donador así como una tercera muestra de PBMC de un donador no relacionado con cualquiera. La lectura para este ensayo por el ELISPOT (INF-ü) . Figura 5: la funcionalidad de DC precongeladas contra descongeladas posteriormente fue evaluada por la capacidad de las DC para estimular una respuesta de memoria específica de Flu de PBMC autólogas como función de la disminución de la concentración de ARNm de Flu usada para la transfección. La lectura del ensayo fue por ELISPOT (INF-?). Figura 6: Evaluación por citometría de flujo de la expresión de GFP por DC después de la electroporación con ARN que codifica para GFP. No transfectadas (línea punteada). Figura 7: Tinción de citocina intracelular: IL-2/IFN-? sobre células T CD4 y CD8 después de la estimulación con DC transfectadas con ARN que codifica para GFP (control negativo, paneles de la izquierda) o CMV pp65 (paneles de la derecha) . Figura 8: dilución con CSFE en células T CD4 y CD8 después de la estimulación con DC transfectadas con ARN que codifica para GFP (control negativo, paneles de la izquierda) o CMV pp65 (paneles de la derecha) . Figura 9: Fenotipos de células dendríticas inmaduras de 6 días (iDC) preparadas de productos de leucaferesis de dos días de antigüedad. Figura 10: fenotipos de células dendríticas maduras 7 días (mDC) preparadas de producto de leucaferesis de dos días de antigüedad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A través de esta descripción, las diferentes publicaciones, patentes y especificaciones de patente publicadas son referidas por una cita de identificación. Las descripciones de esas publicaciones, patentes y especificaciones de patente publicadas se incorporan por lo tanto aquí como referencia en la presente descripción para describir de manera más completa el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Esas técnicas son explicadas de manera completa en la literatura.
Veáse, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da edición (1989); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. eds. (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR: A Practical Approach (M. MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lañe eds. (1988)); Using Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lañe eds. (1999)); and Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. (1987)).
Definiciones Como se usan aquí, ciertos términos pueden tener los siguientes significados definidos. Como se usa en la especificación y en las reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y "el" incluye referencias a los plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas. El término "antígeno" es bien comprendido en la técnica e incluye sustancias las cuales son inmunogénicas, es decir, inmunógenos, así como epítopes antigénicos. Se apreciará que el uso de cualquier antígeno es contemplado para usarse en la presente invención e incluye de este modo, pero no se limita a, un autoantígeno (ya sea normal o relacionado con una enfermedad) , un antígeno infeccioso (por ejemplo, un antígeno microbiano, antígeno viral, etc.), o algún otro antígeno ajeno (por ejemplo, un componente de un alimento, polen, etc.). El término "antígeno" o alternativamente, "inmunógeno" se aplica a colecciones de más de un inmunógeno, de modo que las respuestas inmunes a inmunógenos múltiples puedan ser moduladas simultáneamente. Sin embargo, el término incluye cualquiera de una variedad de diferentes formulaciones de inmunógenos o antígenos. En modalidades preferidas, el antígeno es de una célula cancerosa o un patógeno. Preferiblemente, la célula cancerosa es una célula de cáncer renal, una célula de mieloma múltiple o una célula de melanoma. Los patógenos preferidos son el VIH y VHC. En modalidades preferidas, el antígeno es proporcionado a la célula presentadora de antígenos (APC) en forma de ARN aislado o derivado de una célula cancerosa o un patógeno. "Forma derivada" incluye, pero no se limita a variantes recombinantes de secuencias naturales, incluyendo fusiones con secuencias no relacionadas o relacionadas. Los métodos para RT-PCR del ARN extraído de cualquier célula (por ejemplo, una célula cancerosa o una célula patógena), y transcripción in vi tro son descritos en la solicitud de patente Estadounidense provisional, copendiente No. 60/525,076, y PCT/US05/053271, el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia. "Cáncer" significa la presencia anormal de células que exhiben crecimiento relativamente autónomo, de modo que una célula cancerosa exhibe un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. Las células cancerosas pueden ser benignas o malignas. En varias modalidades, el cáncer afecta a células de la vejiga, sangre, cerebro, mama, colon, tracto digestivo, pulmón, ovarios, páncreas, glándula próstata o piel. La definición de una célula cancerosa, como se usa aquí, incluye no únicamente una célula cancerosa primaria, sino también a una célula derivada de una célula cancerosa. Esto incluye a las células cancerosas metastasisadas y cultivos in vi tro y líneas celulares derivadas de células cancerosas. El cáncer incluye, pero no se limita a, tumores sólidos, tumores líquidos, enfermedades malignas hematológicas, cáncer de células renales, melanoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de estómago, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, neuroblastoma, glioblastoma, retinoblastoma, leucemias, mielomas, linfomas, hepatoma, adenomas, sarcomas, carcinomas, blastomas, etc. Como se usa aquí, el término "que comprende" pretende significar que la composición y los métodos incluyen los elementos expuestos, pero sin excluir otros. "Que consiste esencialmente de" se usa para definir composiciones y métodos, significará que excluye otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación. De este modo, una composición que consiste esencialmente de los elementos definidos aquí no excluiría contaminantes en trazas del método de aislamiento y purificación y soportes farmacéuticamente aceptables, como solución salina amortiguada con fosfato, preservativos y similares. "Que consiste de" significará que excluye además de los elementos en trazas y otros ingredientes y pasos de métodos sustanciales para administrar las composiciones de la invención. Las modalidades definidas por cada uno de esos términos transitorios están dentro del alcance de la invención. Como se usa aquí, el término "citocina" se refiere a cualquiera de los numerosos factores que ejercen una variedad de efectos sobre células, por ejemplo, que inducen el crecimiento o proliferación. Los ejemplos no limitantes de citocinas que pueden ser usadas solas o en combinación de la práctica de la presente invención incluyen, Interleucina 2 (IL-2), factor de células no diferenciadas (SCF), interleucina 3 (IL-3), interleucina 4 (IL-4), interleucina 6 (IL-6), interleucina 11 (IL-11), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 15 (IL-15), factor estimulador de la colonia de los granulocitos (G-CSF) , factor estimulador de la colonia de los granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interleucina 1 beta (IL-1/3), interferón- ? (IFN?), factor de la necrosis tumoral (TNF a) , prostaglandina E2 (PGE2), MIP-11, factor inhibidor de la leucemia (LIF) , ligando c-kit, trombopoyetina (TPO) y ligando flt3. Las citocinas se encuentran comercialmente disponibles de varios vendedores como, por ejemplo, Genzyme (Framingham, MA) , Genentech (South San Francisco, CA) , Amgen (Thousand Oaks, CA) , R&D Systems (Minneapolis, MN) e Immunex (Seattle, WA) . Se pretende, aunque no siempre se estableció explícitamente, que las moléculas que tienen actividad biológica similar como citocinas naturales o purificadas (por ejemplo, producidas de manera recombinante o muteínas de las mismas) sean usadas dentro del espíritu y alcance de la invención. El término "células dendríticas (DCs)" se refiere a una población diversa de tipos de células morfológicamente similares encontradas en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides, Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol . 9:271-296. Las células dendríticas constituyen las APCs más potentes y preferidas en el organismo. Las células dendríticas pueden diferenciarse de monocitos, y poseen un fenotipo distinto al de los monocitos. Por ejemplo, un marcador diferenciador particular, el antígeno CD14, no se encuentra en las células dendríticas pero los monocitos lo poseen. Se ha mostrado que las DC maduras pueden proporcionar todas las señales necesarias para la activación y proliferación de la célula T. También, las células dendríticas maduras no son fagocíticas, mientras que los monocitos y células dendríticas inmaduras son células fuertemente fagocitantes . Las DC inmaduras son capaces de capturar antígenos por endocitosis, fagocitosis, macropinocitosis, y pinocitosis por adsorción y captación de antígeno mediada por receptor, y son fenotípicamente CD80" o CD80bajo, CD83" o CD83baD°, CD86ba:10, y tienen concentraciones intracelulares altas de moléculas MHC de la clase II. Las CD maduras tienen una morfología auxiliada y menor capacidad para la endocitosis y son fenotípicamente CD80alto, CD83a °, CD86a o en comparación con las CD inmaduras. Preferiblemente, las DC maduras secretan polipéptido o proteína p70 de IL-12, y/o secretan niveles significativamente reducidos (de 0 a 500 pg/ml por millón de DC) de IL-IO. Los niveles de IL-10 y IL-12 pueden ser determinados por ELISA de sobrenadantes de cultivos recolectados hasta 36 horas después de la inducción de la maduración de CD de DC inmaduras Wierda W.G. et al (2000) Blood 96: 2917. Ajdary S et al (2000) Infection and Immunity 68: 1760. Véase Banchereau and Steinman (1998) Nature 392:245 para una revisión. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para obtener resultados benéficos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones, aplicaciones o dosis. Como se usa aquí, "expresión" se refiere a los procesos mediante los cuales los polinucleótidos son transcritos en ARNm y/o el ARNm es traducido en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido es derivado del ADN genómico de un hospedero eucariótico apropiado, la expresión puede incluir el empalme del ARNm. Los elementos reguladores requeridos para la expresión incluyen secuencias promotoras para la unión de la ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripción para la unión ribosomal. Por ejemplo, un vector o cásete de expresión bacteriano incluye un promotor (por ejemplo el promotor lac) y para el inicio de la transcripción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG (Sambrook et al. (1989) supra). De manera similar, un vector o cásete de expresión eucariótico típicamente incluye un promotor heterólogo u homólogo para la ARN polimerasa II, una secuencia de Kozak, del codón de inicio AUG, un codón de terminación para el desprendimiento del ribosoma y una señal de poliadenilación en dirección 3' . Esos vectores pueden ser obtenidos comercialmente o montados por secuencias descritas en métodos conocidos en la técnica. El término "modificado genéticamente" significa que contiene y/o expresa un gen o secuencia de ácido nucleico externa la cual a su vez, modifica el genotipo o fenotipo de las células o su progenie. En otras palabras, se refiere a cualquier adición, supresión o perturbación de nucleótidos endógenos de una célula. El término "aislado" significa separado de los constituyentes, celulares y de otro tipo, en los cuales el polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento de los mismos, estén normalmente asociados en la naturaleza. Por ejemplo, con respecto a un polinucleótido, un polinucleótido aislado es uno que está separado de las secuencias 5' y 3' con las cuales normalmente se asocia en el cromosoma. Como es evidente a aquellos expertos en la técnica, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento de los mismos es natural, no requiere "aislamiento" para distinguir a éste de su contraparte natural. Además, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento de los mismos "concentrado", "separado" o "diluido" se distingue de su contraparte natural en que la concentración o el número de moléculas por volumen es mayor que la de "concentrado" o menos que la del "separado" de su contraparte natural. Un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento de los mismos, el cual difiere o por ejemplo, su patrón de glicosilación, en su forma aislada puesto que es distinguible de su contraparte natural por su secuencia primaria, o de manera alternativa, por otra característica como su patrón de glicosilación. Aunque no se estableció explícitamente para cada una de las invenciones descritas aquí, debe comprenderse que todas las modalidades anteriores para cada una de las composiciones descritas más adelante y bajo las condiciones apropiadas, son proporcionadas por esta invención. De este modo, un polinucleótido que ocurre de manera no natural se proporciona como una modalidad separada del polinucleótido aislado que ocurre por naturaleza. Una proteína producida en una célula bacteriana es proporcionada como una modalidad separada de la proteína que ocurre naturalmente aislada de una célula eucariótica en la cual se produce en la naturaleza. Una célula de mamífero aislada está separada de donde normalmente se encuentra en el cuerpo, o es removida del cuerpo. Por ejemplo, los leucocitos recolectados por leucoferesis son "aislados" y las células dendríticas diferenciadas de los monocitos in vi tro son "aisladas". Los términos "complejo de histocompatibilidad mayor" o "MHC" se refieren a un complejo de genes que codifican para moléculas de la superficie celular que son requeridas para la presentación de antígenos de células T y para el rechazo de injerto rápido. En humanos, el MHC también es conocido como el "antígeno de leucocitos humanos" o complejo "HLA". Las proteínas codificadas por el MHC son conocidas como "moléculas MHC" y se clasifican en moléculas MHC de la Clase I y Clase II. Las moléculas MHC de la Clase I incluyen proteínas heterodiméricas de la membrana constituidas de una cadena alfa codificada en el MHC ligado no covalentemente con la ß2-microglobulina . Las moléculas de MHC de Clase I son expresadas por células casi todas nucleadas y han mostrado funcionar en la presentación de antígenos a células T CD8+. Las moléculas de la Clase I incluyen HLA-A, B, y C en humanos. Las moléculas MHC de la Clase II también incluyen proteínas heterodiméricas en la membrana que consisten de cadenas a y ß no asociadas covalentemente. Se sabe que las moléculas MHC de la Clase II funcionan en las células T CD4+ y, en humanos, incluyen HLA-DP, DQ, y DR. Monocitos significa células mononucleares de sangre periférica CD14+ capaces de diferenciarse en células dendríticas inmaduras en respuesta al GM-CSF y IL-4. "Patógeno", como se usa aquí, se refiere a cualquier organismo o virus causante de una enfermedad, y también a derivados atenuados de la misma. Se pretende que una "composición farmacéutica" incluya la combinación de un agente activo (como una DC cargada con antígeno) con un soporte, inerte o activo, haciendo la composición adecuada para diagnóstico o uso terapéutico in vi tro, in vivo o ex vivo . Como se usa aquí, el término "soporte farmacéuticamente aceptable" abarca cualquier soporte farmacéutico estándar, como suero inactivado con calor más 10% de DMSO más 5% de dextrosa, solución salina amortiguada con fosfato, agua y emulsiones, como una emulsión aceite/agua o agua/aceite, y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir adyuvantes, estabilizadores y preservativos. Para ejemplos de soportes, estabilizadores y adyuvantes, véanse Remington's Pharm. Sci. 18va Ed. (Mack Publ. Co . , Easton (1990)). Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico" se usan de manera intercambiable para referirse a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden efectuar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye por ejemplo, moléculas de una sola hebra, de dos hebras y helicoidales triples, de un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Además de la molécula de ácido nucleico nativa, una molécula de ácido nucleico de la presente invención también puede comprender moléculas de ácido nucleico modificadas. El término "péptido" es usado en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácido o peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar ligadas por enlaces peptídicos. En otra modalidad, la subunidad puede estar ligada por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Como se usa aquí el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo la glicina y ambos isómeros ópticos de D y L, análogos de aminoácido y peptidomiméticos. Un péptido de tres o más aminoácidos es comúnmente llamado oligopéptido si la cadena peptídica es corta. Si la cadena peptídica es larga, el péptido comúnmente se conoce como polipéptido o proteína. Como se usa aquí "sujeto" se refiere a un mamífero, que incluye pero no se limita a, humanos y otros primates roedores, perros y gatos. Preferiblemente, el sujeto es un humano. Los inventores han descubierto que las células dendríticas inmaduras, las células dendríticas maduras y las células dendríticas cargadas con antígeno pueden ser producidas a partir de monocitos almacenados a 1°C-34°C durante aproximadamente 6 a 96 horas después de la recolección de los monocitos de un paciente. Esos resultados son sorprendentes, puesto que comúnmente se creía crítico para preparar las células dendríticas de monocitos recién aislados, más de monocitos que hayan sido almacenados a temperaturas ambiente durante un periodo de tiempo significativo. Además, las vacunas de DC derivadas de monocitos usadas en ensayos clínicos efectuados antes de la invención han sido preparadas cultivando monocitos dentro de menos de 6 horas después de la recolección de un paciente, o congelando las PBMC brevemente después de la recolección, y almacenando las PBMC para el descongelamiento y cultivo posterior de los monocitos. No solo los inventores han encontrado que es posible producir células dendríticas y vacunas de células dendríticas a partir de monocitos que han sido almacenados a 1°C-34°C durante aproximadamente 6 a 96 horas, sino que también han descubierto, de manera sorprendente, que las células dendríticas producidas por este método sean fenotípicamente superiores a las células dendríticas producidas a partir de monocitos frescos. El método de producción y las características de las vacunas de células dendríticas producidas por esos métodos son particularmente relevantes para la potencia de la vacuna, la comercialización exitosa en un área extensa, y en la facilidad de administración. Primero, las células dendríticas maduras producidas usando los métodos de la invención, cuando se comparan con las CD producidas por los métodos de la técnica anterior, expresan niveles incrementados de las moléculas coestimuladoras CD80, CD83 y CD86, así como niveles incrementados de moléculas MHC de la clase I y MHC de la clase II, todas las cuales son indicativas de la madurez y potencia de las DC . Además, las DC maduras de la invención son capaces de inducir la producción de IL-2 de células T de memoria en una forma específica del antígeno. Segundo, no sería comercialmente factible establecer las capacidades de producción de células dendríticas cerca de cada sitio donde sean recolectadas las PBMC de los pacientes. Por lo tanto, la comercialización amplia exitosa de una vacuna de células dendríticas autólogas dependerá de la capacidad para transportar PBC, o monocitos aislados de PBMC a instalaciones de producción centralizadas para la diferenciación en células dendríticas inmaduras y maduras y la preparación de vacunas. Sin embargo, antes de la presente invención, se pensaba ampliamente que las PBMC deben ser congeladas o cultivadas inmediatamente después de removerlas de un paciente. Los métodos de la invención resuelven este problema permitiendo el procesamiento de las PBMC o monocitos aislados de las PBMC las cuales tienen que ser transportadas durante la noche o entregadas después de un tiempo prolongado. Tercero, las células dendríticas cargadas con antígeno son típicamente congeladas en DMSO y almacenadas hasta ser descongeladas, lavando y resuspendiendo en un soporte farmacéuticamente aceptable libre de DMSO antes de la administración a un paciente. El paso de lavado fue incluido en los ensayos clínicos de vacunas de DC anteriores debido a que se pensaba que el DMSO tenía efectos dañinos sobre DC congeladas o descongeladas. De manera sorprendente, los inventores han descubierto que el DMSO no tiene efectos dañinos notables sobre las células dendríticas. De este modo, no existe la necesidad de lavar y resuspender la vacuna de DC descongelada antes de la administración. La omisión de este paso incrementa la facilidad de administración y hace disminuir tanto el riesgo de contaminación como los efectos adversos a las DC debido a manipulaciones adicionales. En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un método para producir células dendríticas a partir de monocitos, que comprende: a. proporcionar monocitos que han sido incubados a una temperatura de 1°C-34°C durante un periodo de aproximadamente 6 a 96 horas desde el momento en que son removidos de un sujeto; y b. inducir la diferenciación de los monocitos incubados en células dendríticas. Como se usa aquí, "monocito" se refiere a un leucocito CD14+ que tiene la capacidad de diferenciarse en una célula dendrítica. El monocito puede ser de cualquier mamífero, y preferiblemente es un monocito humano. Los monocitos pueden ser proporcionados e incubados en composiciones como, pero sin limitarse a, sangre, fracciones de sangre (por ejemplo, células sanguíneas blancas (WBC) , recubrimientos serosos, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), etc., así como en composiciones enriquecidas adicionalmente por monocitos. En una modalidad preferida, los monocitos son proporcionados junto con otras células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por ejemplo, como un producto de la leucaferesis. En otra modalidad, los monocitos son enriquecidos de PBMC, o aislados directamente de sangre periférica. Los métodos de aislamiento de monocitos o PBMC que contienen monocitos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En modalidades preferidas, los monocitos son recolectados junto con otras PBMC por leucaferesis. Los métodos de leucaferesis son conocidos en la técnica. En una modalidad preferida de la invención, las PBMC que comprenden monocitos son recolectadas de un sujeto por leucaferesis en un hospital, clínica, consultorio de un doctor, etc. La leucaferesis es un procedimiento en el cual las células sanguíneas blancas son removidas de la sangre de un sujeto, el resto de la cual es entonces transfundido nuevamente al sujeto. El producto de la leucaferesis es típicamente una fracción de sangre enriquecida con PBMC, con bajos niveles de células sanguíneas rojas, granulocitos y plaquetas contaminantes. El método y equipo para efectuar la leucaferesis son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, gambrobct . com/Products_&_Services/ para la información detallada sobre la leucaferesis. Los ejemplos de aparatos de leucaferesis incluyen al COBESpectraMR fabricado por GAMBRO BCT, y el CS3000 Plus Blood Cell Separator fabricado por Baxter Fenwal. Los monocitos pueden ser enriquecidos de sangre o fracciones de sangre (por ejemplo PBMC) , durante o después del periodo de incubación a 1°C-34°C. Como se usa aquí, "enriquecimiento con monocitos" significa un método el cual incrementa la proporción de monocitos con respecto a otros tipos de células que estaban presentes al inicio del método. Los métodos de enriquecimiento de monocitos de PBMC, sangre y otras fracciones de sangre son conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a elutriación, FACS, tamizado, clasificación magnética, centrifugación en gradiente de Ficoll de baja densidad, y similares. Preferiblemente, los monocitos son enriquecidos de PBMC por elutriación. En una modalidad alternativa, los monocitos son enriquecidos de PBMC después del periodo de incubación de 6-96 horas mediante la selección de monocitos que se adhieren al plástico durante el cultivo celular. En otra modalidad, los monocitos son enriquecidos por selección inmunomagnétic . La selección inmunomagnética puede ser la selección positiva para unirse a los monocitos, o puede ser una selección negativa, para unirse a células que no son monocitos (por ejemplo células T, células B, etc.).
Una vez aislados de un sujeto, los monocitos (por ejemplo los monocitos purificados, monocitos enriquecidos, las PBMC que comprenden monocitos, etc.) son incubados a una temperatura de 1°C - 34 °C durante un periodo de aproximadamente 6 a 96 horas a partir del tiempo en que se aislaron de un sujeto. Como se usa aquí, el tiempo al cual los monocitos o las PBMC que contenían monocitos se aislaron de un sujeto se refiere al tiempo hasta la conclusión del proceso de remover las células del sujeto. Por ejemplo, donde las PBMC son aisladas de un paciente durante el curso de un procedimiento de leucaferesis de 4 horas, el tiempo de aislamiento será el tiempo en el cual finaliza la recolección de PBMC por leucaferesis. Preferiblemente, los monocitos son incubados durante 6 a 96 horas a una temperatura de 3°C-34°C, o 4°C-32°C o 5°C-30°C, de manera más preferible a una temperatura de 6°C-28°C, de manera aún más preferible a una temperatura de 6°C - 27°C, 8°C - 26°C o aproximadamente 14°C - 24°C. Los intervalos de temperaturas más bajas preferidas son 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 10°C, 11°C, 12°C, 13°C y 14°C. Los intervalos de temperaturas más altas preferidos son 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C y 34°C. Preferiblemente, el periodo de incubación es de 8 a 72 horas, de manera más preferible de 10 a 48 horas, de manera aún más preferible de 12 a 24 horas, y de manera más preferible de 15 a 22 horas. Otros intervalos preferidos de tiempos de incubación incluyen de 8 a 48 horas, 10 a 30 horas, 26 a 72 horas y 48 a 80 horas. Los límites inferiores preferidos de los tiempos de incubación pueden ser seleccionados de 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 36 y 48 horas. Los límites superiores preferidos de los tiempos de incubación pueden ser seleccionados de 24, 26, 28, 30, 36, 48, 60, 72, 84 y 96 horas. Los monocitos en cualquier forma (por ejemplo, monocitos en sangre, fracciones de sangre, PBMC, monocitos purificados, etc.) pueden ser transportados de un sitio clínico a un sitio de producción de células dendríticas durante el periodo de incubación de 1°C-34°C. Preferiblemente, los monocitos son transportados en un recipiente a temperatura controlada. Los métodos para mantener la temperatura de los monocitos en 1°C-34°C durante el periodo de incubación son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los monocitos pueden ser incubados en una incubadora o en una sala a 1°C — 34°C. Preferiblemente, los monocitos son sometidos a algún movimiento (ya sea ocasional o continuo) durante el periodo de incubación. El movimiento puede ser el movimiento asociado con el transporte. En otra modalidad, las células pueden ser agitadas o hacerse girar suavemente durante la incubación. Aunque no se desea ser limitados por la teoría, se piensa que el movimiento puede evitar el daño celular asociado con la compactación durante la sedimentación. Durante el periodo de incubación de 6-96 horas a 1°C-34°C, los monocitos son incubados sin cultivo. "Sin cultivo", significa que durante el periodo de incubación de 6 a 96 horas, los monocitos no son cultivados en un medio de cultivo de células de mamífero (incluyendo, pero sin limitarse a, concentraciones fisiológicamente apropiadas (por ejemplo, aproximadamente IX) de medios de cultivo como RPMI, DMEM, X-VIVO 15, AIM-V, StemSpan H2000, y similares) a una temperatura de aproximadamente 36-38°C. En su lugar, los monocitos procesados por los métodos de la invención son incubados a 1°C-34°C, preferiblemente en sangre o fracciones de sangre (por ejemplo, suero, plasma, producto de leucaferesis (por ejemplo, las PBMC), recubrimiento sérico, etc.) solución salina o amortiguadores biológicos como solución salina amortiguada con fosfato (PBS). De manera más preferible, el producto de la leucaferesis que contiene monocitos es incubado a 1°C—34°C en el recipiente de recolección de la leucaferesis (por ejemplo, una bolsa de recolección de sangre) . Aunque el producto de la leucaferesis puede ser transferido a otro recipiente al inicio durante el periodo de incubación, es preferible evitar las transferencias innecesarias, las cuales podrían incrementar la probabilidad de contaminación.
Durante o después de la incubación de 6-96 horas a 1°C-34°C, los monocitos pueden ser enriquecidos antes del paso de diferenciación. Las manipulaciones pueden ser efectuadas sobre los monocitos o PBMC, etc. durante el periodo de incubación, en tanto las manipulaciones son efectuadas a 1°C-34°C. En particular, las PBMC pueden ser purificadas adicionalmente, o los monocitos pueden ser enriquecidos de las PBMC durante este periodo de incubación. Esas manipulaciones incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, elutriación, filtración en flujo tangencial, gradiente de densidad Ficoll, centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll diluido, o centrifugación en gradiente de densidad de Percoll diluido, tamiz con anticuerpos, clasificación celular magnética, selección inmunomagnética positiva o negativa, y similares. En una modalidad, los monocitos pueden ser enriquecidos de PBMC después del periodo de incubación por cultivo en un recipiente (preferiblemente un recipiente de plástico) y la selección de monocitos adherentes. Después de la incubación a una temperatura de 1°C— 34°C durante un periodo de aproximadamente 6 a 96 horas, y un paso opcional de enriquecimiento adicional de los monocitos, los monocitos son inducidos a diferenciarse en células dendríticas. Típicamente, los monocitos se diferencian en células dendríticas inmaduras y entonces las células dendríticas inmaduras pueden ser maduradas en células dendríticas maduras. Una variedad de métodos para diferenciar monocitos en células dendríticas, y para madurar las células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad, los monocitos son cultivados en un medio que comprende una composición que induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras o maduras. Las composiciones que inducen la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Esas composiciones incluyen pero no se limitan a, GM-C?F + IL-4; GM-CSF + IL-13; GM-CSF + IL-15; IFNa; y GM-CSF + TNFa. Preferiblemente la composición que induce la diferenciación es GM-CSF + IL-4. Las concentraciones de GM-CSF e IL-4 pueden fluctuar de aproximadamente 400 a 2000 U/ml de cada citocina. Preferiblemente la concentración de GM-CSF y IL-4 es de 500 a 1000 unidades/ml de cada citocina. En una modalidad, los monocitos se ponen en contacto con GM-CSF e IL-4 durante aproximadamente 4-7 días, de manera más preferible durante aproximadamente 5-6 días, tiempo durante el cual los monocitos se diferencian en células dendríticas inmaduras. Después de la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras, las células dendríticas inmaduras pueden ser maduradas en células dendríticas maduras. Los métodos para madurar células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad, las células dendríticas inmaduras son maduradas por contacto con un medio que comprende GM-CSF, IL-4 y un cóctel de maduración (PGE2, TNFa, IL-6 y IL-lß) . Véase por ejemplo, Jonuliet et al. (1997) Eur J Immunol 27:3135-3142, el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia. En un método de maduración alternativo, las células dendríticas inmaduras son señaladas con una primera señal, que comprende IFN-?, seguida por una segunda señal que comprende CD40L. Por ejemplo, en una modalidad, las células dendríticas inmaduras se ponen en contacto con PGE2, IFN-? y CD40L, preferiblemente en presencia de GM-CSF y IL-4. En una modalidad preferida, el contacto con CD40L es efectuado tras la traducción de un ARNm de CD40L recombinante dentro de las células dendríticas. Preferiblemente, las células dendríticas son transfectadas de manera transitoria con una ARNm que codifica para CD40L o un fragmento activo del mismo. De manera más preferible, las células dendríticas inmaduras se ponen en contacto con PGE2, TNFa, e IFN?, preferiblemente en presencia de GM-CSF e IL-4, para producir células dendríticas maduras. La madurez de las células dendríticas puede incrementarse aún más por transfección, preferiblemente transfección transitoria, con un ARN que codifica para CD40L. Preferiblemente, las células dendríticas son transfectadas con ARN que codifica para CD40L y/o ARN que codifica para uno o más antígenos o epítopes de interés. Los métodos de maduración anteriores son descritos en la Solicitud Estadounidense 11/246,387 el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia. En una modalidad preferida de la invención, las células dendríticas son cargadas con uno o más antígenos. Las células dendríticas cargadas con antígenos son útiles como vacunas y para la estimulación in vi tro de las células T. los antígenos pueden ser cargados en células dendríticas inmaduras o maduras. Si los antígenos son cargados en células dendríticas inmaduras, las células dendríticas inmaduras pueden entonces ser maduradas por el proceso de carga en sí, o por otros métodos de maduración descritos aquí o métodos de maduración alternativos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los antígenos pueden ser cargados como el antígeno en sí (por ejemplo, proteínas, péptidos, epítopes, lisados celulares, partículas virales, etc.) o pueden ser cargados como ácidos nucleicos que codifiquen para antígenos. Preferiblemente, el antígeno es cargado como un ácido nucleico que codifica para el antígeno. De manera más preferible, el ácido nucleico es un ARN, de manera más preferible un ARNm. En una modalidad preferida el ARNm que codifica para uno o más antígenos es cotransfectado con ARNm que codifica para CD40L. Preferiblemente, el antígeno es autólogo al sujeto, y es usado para preparar una vacuna de DC autólogas cargadas con antígeno para la administración al sujeto. Los métodos para cargar células dendríticas con antígenos peptídicos y proteicos, células, lisados celulares o de tejido, virus o partículas virales, ácidos nucleicos y similares son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad preferida, el antígeno es cargado por electroporación de una célula dendrítica (madura o inmadura) con ácido nucleico, preferiblemente un ARNm. Preferiblemente, las células dendríticas son transfectadas con aproximadamente 0.25 a 4 microgramos de ARN por 106 células dendríticas, de manera más preferible con aproximadamente 2 µg de ARN por 106 células dendríticas. En una modalidad, se usa 1 microgramo de .ARN de tumor por un millón de DC por transfección. En otra modalidad, se usan 0.25 a 1.0 µm de cada uno de los cuatro ARN que codifican para cuatro antígenos separados de un patógeno (por ejemplo, VIH) por 106 células dendríticas. El antígeno puede ser de cualquier fuente. Sin embargo, en modalidades preferidas, el antígeno o antígenos son autólogos al sujeto. Autólogo al sujeto significa que el antígeno es obtenido o derivado del sujeto. Como ejemplos no limitantes, los antígenos pueden ser de células cancerosas o tejido tumoral obtenido de un sujeto. Los antígenos cancerosos pueden ser cargados en células dendríticas como células cancerosas, lisados de células o tejidos cancerosos, extractos de células o tejidos cancerosos, componentes purificados o clonados de células o tejidos cancerosos, ARN total o ARNm total, o ARN o ARNm seleccionado de esas células o tejidos, si están presentes en extractos purificados, amplificados, traducidos in vi tro y similares. De manera alternativa, el antígeno puede ser obtenido o derivado de un patógeno o células infectadas con patógeno presentes en un sujeto. Los métodos de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o prevención del cáncer e infección con patógenos. En modalidades preferidas, el cáncer es carcinoma de células renales, melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de estómago o cáncer de próstata. El término patógeno se refiere a cualquier virus u organismo que esté implicado en la etiología de una enfermedad y también a derivados atenuados de los mismos. Esos patógenos incluyen, pero no se limitan a, patógenos bacterianos, protozoarios, fúngales y virales como Heli coba cter, como Heli coba cter pylori , Salmonella , Shigella , En teroba cter, Campy lobacter, varias micobacterias, como Mycoba cteri um leprae, Bacill us an thra cis, Yersínia pestis, Francisella tularensis, Brucella species, Leptospira interrogans, Staphyloccus, (por ejemplo, S. aureus) , Streptococcus, Clostridi um, Candida albi cans, Plasmodi um, Leishmania , Trypanosoma , virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de la hepatitis C (VHC) , virus del papiloma humano (VPH) , citomegalovirus (CMV) , virus linfotrófico T humano (VLTH) , herpes virus (por ejemplo, virus del herpes simple tipo 1, virus del herpes simple tipo 2, coronavirus, varicela-zoster virus, y virus de Epstein-Barr (EBV)), virus del papiloma, virus de la influenza, virus de la hepatitis B, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de las paperas y virus de la rubéola. Preferiblemente el patógeno es un patógeno viral, de manera más preferible un patógeno retroviral, y de manera más preferible VIH o VCH. Las células dendríticas, ya sean maduras o inmaduras, cargadas con antígeno o no, pueden ser congeladas en una composición que comprenda un crioprotector. Numerosos crioprotectores son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos de crioprotectores incluyen, pero no se limitan a, dimetiisulfóxido (DMSO), glicerol, etanol, metanol, acetamida, monoacetato de glicerol, propandiol, polietilen glicol, etilen glicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol, D-sorbitol, D-lactosa, i-inositol, cloruro de colina, aminoácidos, albúmina (preferiblemente albúmina de suero humano) , polivinil pirrolidona, dextran, sucrosa, Ficoll, sales inorgánicas e hidroxietil almidón. En una modalidad preferida, el crioprotector es DMSO. De manera preferible, la concentración de DMSO es de 2-20%, de manera más preferible 5-15%, y de manera más preferible de aproximadamente 10%. También, el medio de congelamiento puede contener uno o más compuestos de poliol derivados de carbohidratos, como la glucosa, dextrosa, sucrosa, etc., preferiblemente en una concentración de 2-30%, de manera más preferible de 5-10%, de manera más preferible 5% de dextrosa. Los métodos para congelar células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la solicitud de Patente Estadounidense No. 20040253574, el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia. Preferiblemente, el crioprotector es dimetiisulfóxido (DMSO). En modalidades preferidas, la concentración de DMSO es de 5% a 20%. De manera más preferible, la concentración de DMSO en la composición es de aproximadamente 10%. De manera sorprendente, las células dendríticas y vacunas de células dendríticas producidas por los métodos de la invención son capaces de sobrevivir in vi tro durante al menos 24 horas después del descongelamiento tras ser congeladas en presencia de 5%-20% de DMSO y descongeladas. Debido a que las células dendríticas cargadas con antígeno de la invención son resistentes al DMSO, no es necesario lavar las células antes de administrar la vacuna de células dendríticas. En consecuencia, las vacunas de células dendríticas descongeladas de la invención están listas para administrarse a un sujeto en cualquier momento después del descongelamiento. La eliminación del paso de lavado reduce el riesgo de contaminación y evita manipulaciones adicionales que puedan dañar a las células dendríticas. De este modo, en una modalidad, la invención proporciona un método para la administración de una vacuna de células dendríticas cargadas con antígeno, que comprende descongelar una vacuna de células dendríticas congeladas que comprende al menos 2% a 20% de DMSO, y administrar la vacuna a un sujeto sin alterar la relación de células dendríticas a DMSO antes de la administración. Preferiblemente, la concentración de DMSO en la vacuna es de aproximadamente 5-20%, y de manera más preferible 10%. En otra modalidad, la invención proporciona el uso de una célula dendrítica cargada con antígeno para la preparación de un medicamento congelado para el tratamiento o prevención del cáncer o infección con patógenos, donde el medicamento comprende al menos 2% de DMSO y está listo para administrarse tras el descongelamiento. Los métodos de la invención permiten la producción de células dendríticas novedosas con un incremento en la funcionalidad y un incremento en los niveles de marcadores de la madurez. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona células dendríticas maduras derivadas de monocitos, donde las células dendríticas maduras tienen niveles incrementados de uno o más de CD80, CD83, CD86, moléculas MHC de la clase I, o moléculas MHC de la clase II en comparación con las células dendríticas maduras preparadas de monocitos frescos. En otra modalidad más, la invención proporciona células dendríticas maduras derivadas de monocitos, donde las células dendríticas pueden producir IL-2 específica del antígeno a partir de células T de memoria. Los métodos para medir IL-2 son conocidos en la técnica. Los marcadores de la superficie celular y expresión de otras moléculas que son características de las células T de memoria, y que las distinguen de otros tipos de células T, son descritas en la Figura 10.35 de Immunobiology, 6ta Edición, Eds. Janeway et al., Garland Science Publishing, New York, NY, 2005; el contenido de la cual se incorpora como referencia. Por ejemplo, las células T de memoria que expresan altos niveles de CD44, CD45RO, CD45RA, Bcl-2, IFND , CD127 y Ly6C; niveles moderados de CD122, y CXCR4 ; bajos niveles de FasL, y son CD69 y CD25 negativas. Como se describe aquí, el análisis de microarreglo de niveles de ARN en estado estacionario muestra expresión genética alterada entre las células dendríticas producidas de monocitos de un día en comparación con células dendríticas producidas de monocitos frescos. De este modo, en una modalidad, la invención proporciona una célula dendrítica madura derivada de monocitos, donde la relación en estado estacionario de ARN de ALOX15 a ARN de D-actina o ARN de GAPDH en las células es menor de 1.0. Preferiblemente, la relación es de entre 0.2 a 0.7, de manera más preferible de entre 0.4 a 0.5, y de manera más preferible de aproximadamente 0.45. En otra modalidad, la invención proporciona una célula dendrítica derivada de monocitos, donde la relación en estado estacionario de ARN de CD52 a ARN de D-actina o GAPDH en la célula es mayor de 1.0. Preferiblemente, la relación es de entre 1.2 a 5.0, de manera más preferible entre 1.5 a 2.2, o de entre 1.8 a 1.9, y de manera más preferible la relación es de 1.86. En otra modalidad más, la invención proporciona una célula dendrítica madura derivada de monocitos, donde la relación en estado estacionario de ARN de TLR1, ARN de TLR2 , ARN de IL-1/3 o ARN de CD69 a ARN 0-actina o ARN de GAPDH en las células menor de 1.0. Preferiblemente, la relación es de entre 0.2 a 0.9, y de manera más preferible de entre 0.5 a 0.8. El ARNm de ALOX15 humano (SEQ ID NO: 1) y las variantes alélicas del mismo pueden ser detectadas usando las sondas Affymetrix de la SEQ ID NOs: 2-12. El ARNm de IL-1/3 humano (SEQ ID NO: 13) y las variantes alélicas del mismo puede ser detectado usando las sondas Affymetrix de SEQ ID NOs: 14-24. El ARNm de TLRl humano (SEQ ID NO: 25) y las variantes alélicas del mismo pueden ser detectado usando las sondas Affymetrix de la SEQ ID NOs: 26-36. El ARNm de TLR2 humano (SEQ ID NO: 37) y las variantes alélicas del mismo pueden ser detectado usando las sondas Affymetrix de la SEQ ID NOs:38-48. El ARNm de CD69 humano (SEQ ID NO:49) y las variantes alélicas del mismo pueden ser detectados usando las sondas Affymetrix de la SEQ ID NOs: 50-60. El ARNm de CD52 humano (SEQ ID NO: 61) y las variantes alélicas del mismo pueden ser detectado usando las sondas Affymetrix de la SEQ ID NOs: 62-77. El ARNm de GAPDH (SEQ ID NO:78) y las variantes alélicas del mismo pueden ser detectado usando las sondas Affymetrix de la SEQ ID NOs: 79-98. El ARNm de ß-actina humana (SEQ ID NO: 99) y las variantes alélicas del mismo pueden ser detectados usando las sondas Affymetrix de la SEQ ID NOs: 100-119. Los niveles de expresión en estado estacionario del ARN pueden ser detectados por microarreglo, usando preferiblemente el arreglo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0. De manera alternativa, la hibridación puede ser efectuada usando las sondas o pruebas específicas del gen en el párrafo anterior. Preferiblemente, las muestras de ARN extraídas de células dendríticas pueden ser aplicadas al arreglo Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Genechip® Expression Analysis Technical Manual, 2004). De manera breve, tres microgramos de ARN total obtenidos con el equipo de control de Poli-A ARN Genechip® (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) son convertidos a la primera hebra de ADNc usando transcriptasa inversa SuperScriptMR II. La síntesis de la segunda hebra del ADNc es seguida por la transcripción in vi tro para la amplificación lineal de cada transcripto y la incorporación de CTP y UTP biotinilado. Los productos del ARNc son fragmentados hasta aproximadamente 100 nucleótidos, e hibridados durante 16 horas para los microarreglos. Los microarreglos son entonces lavados a una rigurosidad baja (6xSSPE) y alta (MES lOOmM, NaCl 0.1 M) y teñidos con estreptavidina-ficoeritrina . La fluorescencia es amplificada agregando anti-estreptavidina biotinilada y una alícuota adicional de tinción de estreptavidina-ficoeritrina . Es usado el GeneChip® Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) para recolectar la señal de fluorescencia a una resolución de 3 Dm después de la excitación a 570 nm. Se calcula la señal promedio de dos exploraciones secuenciales por cada característica del microarreglo de interés. Las imágenes exploradas fueron analizadas con Genechip® Operating Software vl.l (Affymetrix, Santa Clara, Calif.). Preferiblemente, una correlación lineal alta (R2>0.95) de 4 ARN control incluidos en el equipo de Control de Poli-A ARN (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) se confirmó como control para el éxito del proceso de marcación. Los datos de perfil para todos los genes, o solo los genes de interés (por ejemplo, AL0X15, IL-1/3, TLR1, TLR2, CD69 y/o CD52, así como ß-actina y/o GAPDH) son importados al programa de computadora GeneSpringMR y normalizados. Los tres pasos son efectuados en el paso de normalización de acuerdo al método estándar sugerido por el GeneSpringMR para arreglos Affymetrix. 1) transformación de datos (todos los valores menores de 0.01 fueron fijados en 0.01) 2) normalización hasta el 50%. 3) normalización hasta la media. La relación de ARNm en estado estacionario de interés (ALOX15, IL-1/3, TLR1, TLR2, CD69 o CD52 ARNm) a ARNm de GAPDH o D-Actina en estado estacionario puede entonces ser determinada dividiendo la expresión normalizada del ARNm de interés por la expresión normalizada de ARNm de GAPDH -actina. Las células dendríticas cargadas con antígeno de la invención son útiles como vacunas en el tratamiento o prevención de enfermedades o para la activación de células T, las cuales pueden entonces ser usadas en terapias. Por ejemplo, las células dendríticas cargadas con antígeno pueden entonces ser usadas para producir una respuesta inmune contra un antígeno. Ellas pueden ser usadas como vacunas para evitar una infección o enfermedad futura, o para activar el sistema inmune para tratar una enfermedad en curso, como, pero sin limitarse a una infección por patógenos o cáncer. Las células dendríticas cargadas con antígeno pueden ser formuladas para usarse como vacunas o composiciones farmacéuticas con soportes adecuados como amortiguadores fisiológicos u otros líquidos inyectables. Las vacunas o composiciones farmacéuticas serán administradas en cantidades terapéuticamente efectivas suficientes para producir una respuesta inmune. Preferiblemente, las células dendríticas son cargadas con un antígeno autólogo al sujeto del cual se derivaron las células dendríticas, y administradas al mismo sujeto. Véase, por ejemplo, U.S. 5,853,719 (el contenido de la cual se incorpora como referencia) , la cual describe la preparación y usos de células dendríticas cargadas con antígeno y particularmente células dendríticas cargadas con ARN. De manera alternativa, las células dendríticas pueden ser cargadas con un antígeno que no sea autólogo al receptor pretendido de la terapia de DC . Los ejemplos de esos antígenos incluyen, pero no se limitan a antígenos que son blancos terapéuticos conocidos, como la telomerasa, antígeno específico de la próstata, y otros marcadores de tumores o antígenos conocidos de un patógeno.
Métodos para Recolectar Monoci tos o PBMC que Comprenden Monocitos Una variedad de métodos para recolectar monocitos y PBMC que comprenden monocitos de un sujeto son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, gambrobct.com/Products_S._Services/ para información detallada sobre la leucaferesis para la recolección de PBMC y elutriación para la purificación de monocitos. En una modalidad preferida, el producto de la leucaferesis y el plasma son recolectados en bolsas de citoferesis estériles, desechables, de un solo uso son recolectados usando el procedimiento AutoPBSC (Células no Diferenciadas Sanguíneas Periféricas Automatizadas) en un Gambro BCT COBE Spectra (Gambro BCT, Lakewood, CO) . En un método alternativo a la leucaferesis, las PBMC son obtenidas recolectando sangre en una jeringa heparinizada, dilución en PBS, revestimiento sobre Histopaque 1077 (Sigma), centrifugación y recuperación de las PBMC en la interfaz. Véase Woodhead et al. (2000) International Immunol 12:1051-1061. Los métodos adicionales de recolección, purificación o fraccionamiento de PBMC son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Después de la recolección del producto de la leucaferesis u otro producto sanguíneo, los monocitos contenidos en él son incubados a 1-34°C durante 6-96 horas. En una modalidad, el producto de la leucaferesis es recolectado en una bolsa y entonces transportado a la instalación de elaboración de la vacuna en un recipiente de transporte con verificación de la temperatura mantenida a 1-34°C, de manera preferible a aproximadamente 6-28°C, y de manera más preferible a 8-26°C. Pueden ser incluidos paquetes de gel, como aquéllos descritos en la Patente Estadounidense No. 4,102,807, los cuales ayudan a evitar cambios de temperatura, en el recipiente de transporte. Por ejemplo, los monocitos pueden ser transportados en un recipiente aislado (por ejemplo, recipiente aislado con espuma de poliuretano ThermoSafeMR, modelo E65), y envasados con paquetes de gel y mallas de gel U-tek ThermoSafeMR como se muestra en la Figura 1. Por ejemplo, en el procedimiento de envase mostrado en la Figura 1, una malla de gel U-tek de 453.6 gramos (16 onzas) se ajusta a una temperatura de -1°C y se coloca plana en el fondo del recipiente E65. Dos mallas de gel U-tek de 453.6 gramos (16 onzas) (-1°C) son dobladas y colocadas entre la primer malla de gel y la pared corta del recipiente E65. Entonces se colocan dos mallas de gel U-tek de 453.6 gramos (16 onzas) (ajustadas a +18°C) verticalmente a continuación de las mallas de gel anteriores. Se coloca un recipiente de trasplante ThermoSafeMR INF3000 entre los geles. Las bolsas de leucaferesis son colocadas en una bolsa interna sellada (STP711). Puede ser usado un dispositivo que registre la temperatura de la bolsa interna para verificar la temperatura durante el embarque. Ese dispositivo es el ThermoSafeMR DataLogger. La bolsa interna es colocada en una bolsa externa sellada (STP710) y entonces las bolsas son colocadas en el recipiente INF3000. Se coloca un gel U-tek de 453.6 gramos (16 onzas) (+18°C) en la parte superior del recipiente INF300 cerrado, tapado con papel Kraft y entonces un tapón de espuma de 10.16 centímetros (4"). La caja es entonces sellada con cinta y está lista para su transporte. Durante o después del periodo de incubación a 1- 34°C, el producto de la leucaferesis puede ser procesado o purificado adicionalmente, por ejemplo, por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll a temperatura ambiente en tubos cónicos de 50 ml para separar y concentrar la fracción celular mononuclear que incluye los precursores de células dendríticas (monocitos). Preferiblemente, después de pasos de lavado múltiples con solución salina amortiguada de fosfato (PBS) , la concentración celular y la viabilidad celular pueden ser determinadas.
Enriquecimien to de los Monoci tos Los métodos de enriquecimiento para los monocitos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, centrifugación en gradiente de densidad (por ejemplo centrifugación en gradiente de densidad Ficoll diluido, centrifugación en gradiente de densidad de Percoll diluido, etc.), elutriación, adherencia a plástico, filtración en flujo tangencial, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), técnicas de separación celular inmunológica (tamiz con anticuerpos para seleccionar monocitos para remover no monocitos (por ejemplo, leucocitos, macrófagos, granulocitos, etc.), lisis diferencial, clasificación celular magnética, etc.), cultivo en bolsas de cultivo de plástico recubiertas con perlas microportadoras de plástico, etc. Véase, por ejemplo, O'Doherty et al. (1993) J Exp Med 178:1067-1076; Young et al. (1990) J Exp Med 171:1315-1332; Freudenthal et al. (1990) PNAS 87:7698-7702; Bernhard et al. (1995) Cáncer Res 55:1099-1104; Caux et al. (1992) Nature 360:258-261; Read et al. (2003) "Evaluation of a Closed Automated System to Isolate Peripheral Blood Monocytes for Dendritic Dell (DC) Immunotherapy" , Ninth annual meeting of the ISCT; Mu et al. (2003) Scand J Immunol 58:578-586; Maffei et al. (2000) Transfusión 40:1419-1420; mitenyibiotec.com; Meyer-Wentrup et al. (2003) J Hematother Stem Cell Res 12:289-299; y WO 2004/000444, el contenido de las cuales se incorpora como referencia. Por ejemplo, la clasificación celular magnética puede ser usada para enriquecer monocitos por selección positiva (células CD14+) o por selección negativa (es decir, remoción de células que no son monocitos; por ejemplo, células CD3+, CD19+ y CD2+) . Preferiblemente, los monocitos son enriquecidos del producto de la leucaferesis por elutriación, un método automatizado para aislar monocitos de leucaferesis de sujetos. Los métodos de leucaferesis son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la elutriación puede ser efectuada sobre el sistema de separación celular Gambro BCT ElutraMR Cell Separation System (Gambro BCT, Lakewood, CO) . El amortiguador de elutriación puede ser preparado agregando 1000 mL de Suero de Albúmina Humana (HSA) al 5% a una bolsa de 4L de Solución Salina Balanceada de Hank's (HBSS) . Las células pueden ser fraccionadas por elutriación de acuerdo al protocolo del fabricante. En una modalidad preferida, se usa una versión modificada del protocolo del fabricante (Gambro) para la elutriación, donde la fracción del rotor apagado final es la cuarta fracción en lugar de la quinta fracción. El análisis diferencial con CBC puede ser efectuado sobre la fracción de monocitos para verificar la pureza y recuperación. De manera alternativa, la pureza de los monocitos puede ser evaluada por inmunofenotipificación con CD14. Los monocitos enriquecidos pueden entonces ser diferenciados en células dendríticas, o pueden ser congelados y almacenados para su uso posterior. En una modalidad, las células son congeladas en 25 ml o 50 mL de bolsas de congelación. Los ejemplos de bolsas de congelación incluyen las bolsas de congelación CryocyteMR, bolsas de congelación OrigenMR (Cryostore) y bolsas de congelación PallMR. Preferiblemente, cada bolsa de congelación contiene 15 mL de hasta 3 x 109 células en medio de cultivo (por ejemplo, AIM V, X-VIVO, RPMI, etc.) con aproximadamente 10-12% de DMSO y 10-20% de plasma filtrado, inactivado con calor, una concentración final de CaCl2 de aproximadamente 107 a 507 mg/L y una concentración final de MgS04 de aproximadamente 44 a 241 mg/L. Las células pueden ser congeladas usando un congelador a velocidad controlada, y entonces almacenadas criogénicamente . En una modalidad alternativa, después de la incubación de las PBMC y la purificación por gradiente de densidad con Ficoll, las PBMC son resuspendidas en un medio AIM-V y sembradas en matraces TI 50 cm2 a 2.0 x 108 células por frasco. En el caso de que se tenga un número insuficiente de PBMC, las PBMC pueden ser congeladas y combinadas con una segunda leucaferesis. Los monocitos son seleccionados de la población de células mononucleares de PBMC por adhesión a matraces de plástico de cultivo tisular estériles durante 1 a 2 horas a 37°C, 5% de C02, >75% de humedad. Las células no adherentes y semiadherentes son removidas. Se agrega PBS al matraz para remover las células no adherentes, células semiadherentes y medio residual remanentes. Las células adherentes remanentes son predominantemente monocitos, y representan una población de monocitos enriquecidos.
Métodos para Diferenciar Monoci tos en Células Dendrí ticas Una variedad de métodos para diferenciar monocitos en células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Véanse U.S. 6,607,722 , WO 97/29182, Romani, et al. (1994) J. Exp. Med. 180:83-93; Sallusto and Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179:1109 y así sucesivamente, y Reddy et al. (1997) Blood 90:3640-3646; el contenido de las cuales se incorpora como referencia. La mayoría de esos métodos implica cultivar monocitos en presencia de citocinas lo cual induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas. Los ejemplos de métodos alternativos para diferenciar monocitos en células dendríticas incluyen, pero no se limitan a la exposición a perturbación física (por ejemplo, corte), irradiación en presencia de un agente fotoactivable capaz de formar fotoaductos con componentes del ADN celular y/o tratamiento con agente de unión de ADN, seguido por incubación con agentes efectores de enfermedades como microbios, hongos, virus y células malignas. Véase la Patente Estadounidense 6,607,722, el contenido de la cual se incorpora como referencia. En una modalidad, los monocitos son diferenciados en células dendríticas por cultivo en un medio que comprende una composición que incluye la diferenciación de monocitos en células dendríticas. Los medios adecuados para el cultivo de monocitos, células dendríticas inmaduras y maduras incluyen, pero no se limitan a, AIM-V, X-VIVO-15, RPMI, DMEM, y similares. Las composiciones que inducen la diferenciación de los monocitos en células dendríticas son conocidas en la técnica, e incluyen pero no se limitan a, GM-CSF más IL-4; GM-CSF más IL-13; e IFNa. En una modalidad preferida, los monocitos enriquecidos son diferenciados en células dendríticas por cultivo en presencia de GM-CSF e IL-4 (véase, por ejemplo, la WO 97/29182; . Sallusto and Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179:1109; y Romani et al. (1994) J. Exp. Med. 180:83-93). De manera breve, los monocitos enriquecidos, preferiblemente a una concentración de 1 x 106 células/ml son cultivados en un medio AIM V, medio X-VIVO 15, u otro medio adecuado en presencia de 800 U/ml de GM-CSF y 500 U/ml de IL-4 durante aproximadamente 4-7 días, preferiblemente 6 días a 37°C, 5% de C02, >75% de humedad para permitir la diferenciación de monocitos en células dendríticas inmaduras. Las concentraciones de citocina pueden variar. Por ejemplo, las concentraciones preferidas de GM-CSF son de 500 a 1500 U/ml, de manera más preferible de 700 a 1000 U/ml, de manera más preferible de 800 U/ml. Las concentraciones preferidas de IL-4 son 400-1500 U/ml, de manera más preferible 450 a 1000 U/ml, de manera más preferible 500 U/ml. La IL-13 o IL-15 pueden ser usadas en lugar de o además de IL-4. El IFNa puede ser usado en lugar de GM-CSF más IL-4, IL-13 ó IL-15. A medida que los monocitos se diferencian en células dendríticas, progresivamente pierden la expresión de CD14 y adquieren la expresión de CD80 consistente con el fenotipo de las células dendríticas en estado inmaduro.
Métodos para la Maduración de Células Dendrí ticas Inmaduras en Cél ulas Dendrí ticas Maduras Los métodos para madurar células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras son conocidos por aquellos expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, absorción de antígeno y/o contacto con composiciones que induzcan a maduración. Las composiciones que inducen a maduración de células dendríticas inmaduras incluyen pero no se limitan a, medio acondicionado con monocitos; medio acondicionado con PBMC; Staphylococcus a ureus ( PansorbinMR) ; lipopolisacáridos (LPS); otros productos celulares bacterianaos, como monofosforil lípido A (MPL), ácido lipoteicoico, etc.; fosforilcolina; ionóforos de calcio; esteres de forbol como PMA; proteínas de choque térmico; nucleótidos, como el ATP, etc.; lipopéptidos ; receptor 4 similar a Toll; ligandos artificiales para receptores similares a Toll; ARN de doble hebra, como el poli-I:C, etc.; secuencias de ADN inmunoestimulante; cóctel de maduración (TNF-a, IL-6, IL-lß y PGE2); GM-CSF, IL-4 y cóctel de maduración (TNFa, IL-6, IL-lß y PGE2) , GM-CSF, IL-4, PGE2 y señalización secuencial de IFN? seguida por señalización con CD40L; y similares. Véase, por ejemplo, Cisco et al. (2004) J Immunol 172:7162-7168; Jonluit et al. (1997) Eur J Immunol 27:3135-3142; solicitud de patente Estadounidense 20040203143; solicitud PCT PCT/US2005/036304 y solicitud de patente Estadounidense 11/246,387, el contenido de las cuales se incorpora como referencia. En una modalidad, se agrega un cóctel de maduración que contiene TNFD, IL-6, IL-lß y PGE2 a un cultivo de células dendríticas inmaduras. Las células son entonces cultivadas durante la noche (aproximadamente 12 horas o más) para producir células dendríticas maduras. En una modalidad alternativa, las células dendríticas inmaduras son transfectadas, preferiblemente por electroporación con ARNm que codifica para CD40L, y opcionalmente con ARNm que codifica para uno o más antígenos, y entonces cultivadas durante la noche (aproximadamente 12 horas o más) en presencia de IFN? y opcionalmente PGE2 para producir células dendríticas maduras. El ADNc de CD40L y proteína humana se muestran en la SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121, respectivamente. Otros ARNm de CD40L son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad preferida, se agrega una formulación de maduración al medio AIM V directamente a las DC inmaduras para dar una concentración final de TNF-a (10 ng/ml) , IFN-? (1000 U/ml), y PGE2 (1 µg/ml). Las células pueden entonces ser cultivadas durante la noche (aproximadamente 12 horas o más) para producir células dendríticas maduras. La maduración puede incrementarse adicionalmente aún más por la exposición de las células al Ligando de CD40 (CD40L) , ya sea agregado al medio de cultivo, o, de manera más preferible, expresado dentro de la célula. El CD40L puede ser expresado de manera constitutiva o transitoria. Preferiblemente, las células dendríticas maduras son transfectadas con ARNm que codifica para CD40L, y opcionalmente con ARNm que codifica para uno o más antígenos de interés.
An tígenos Cualquier antígeno puede ser cargado en células dendríticas inmaduras o maduras. El antígeno será entonces procesado y presentado por las DC maduras. Los ejemplos de antígenos incluyen, pero no se limitan a, partículas virales, bacterias, u otros patógenos, proteínas y fragmentos de los mismos, polipéptidos, lisados de patógenos, extractos de patógenos, ácidos nucleicos de patógenos, células cancerosas, proteínas de células cancerosas y fragmentos de las mismas, lisados de células cancerosas, extractos de células cancerosas y ácidos nucleicos de células cancerosas. Los antígenos pueden ser naturales, procesados químicamente o producidos de manera recombinante. Los antígenos pueden ser proporcionados a las células como polipéptidos, proteínas o como ácidos nucleicos usando métodos conocidos en la técnica. El antígeno puede ser proporcionado en su forma "natural" es decir sin que haya implicado la intervención humana en la preparación del antígeno o inducir éste al entrar al ambiente en el cual se encuentran las células dendríticas. De manera alternativa o adicional, el antígeno puede comprender una preparación cruda, por ejemplo, del tipo que se administra comúnmente en un ataque de alergia convencional o en un lisado tumoral. El antígeno puede ser, de manera alternativa, purificado sustancialmente, por ejemplo, al menos aproximadamente 90% puro. Donde el antígeno es un péptido, éste puede ser generado, por ejemplo, por escisión proteolítica de las proteínas aisladas. Puede ser utilizada cualquiera de una variedad de agentes de escisión incluyendo, pero sin limitarse a, pepsina, bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, etc. De manera alternativa, los péptidos pueden ser sintetizados químicamente, preferiblemente en un sintetizador automatizado, como los disponibles en la técnica, o expresados de manera recombinante. Además, pueden ser usadas técnicas recombinantes para crear un ácido nucleico que codifique para el péptido de interés, y para expresar ese péptido bajo las condiciones deseadas. De manera alternativa, los ácidos nucleicos que codifican para el antígeno pueden ser purificados o derivados de una célula, tejido o virus. El antígeno puede tener una estructura que sea distinta de cualquier compuesto natural. En ciertas modalidades de la invención, el antígeno es un "antígeno modificado" dado que el antígeno tiene una estructura que es sustancialmente idéntica a la de un antígeno natural pero que incluye una o más desviaciones de la estructura precisa del compuesto natural. Por ejemplo, donde el antígeno natural es un antígeno proteico o polipeptídico, un antígeno modificado en comparación con ese antígeno proteico o polipeptídico tendría una secuencia de aminoácidos que difiere del antígeno natural en la adición, sustitución o supresión de uno o más aminoácidos y/o incluiría uno o más aminoácidos que difieren del aminoácido correspondiente en el antígeno natural por la adición, sustitución o supresión de una o más entidades químicas ligadas covalentemente al aminoácido. En un aspecto, los antígenos naturales y modificados comparten al menos una región de al menos 5 aminoácidos que son al menos 75% idénticos. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que, en la comparación de dos secuencias de aminoácidos para determinar su grado de identidad, la separación entre extensiones (es decir, regiones de al menos dos) de aminoácidos idénticos no necesariamente se preservan con precisión siempre. Los antígenos proteicos o polipeptídicos naturales y modificados pueden mostrar al menos aproximadamente 80% de identidad, de manera más alternativa 85%, 90%, 95%, o más de 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos para al menos una región de al menos 5 aminoácidos. Con frecuencia, puede ser útil para una región mucho más larga (por ejemplo, 10, 20, 50, o 100 o más aminoácidos) que la secuencia de aminoácidos muestre el grado de identidad designado. En modalidades preferidas, el antígeno es proporcionado como un polinucleótido o gen que codifica para el antígeno, de modo que la expresión del gen dé como resultado la producción del antígeno ya sea en el ser individual tratado (cuando sea proporcionado in vivo) o el sistema de cultivo celular (cuando sea proporcionado in vi tro) . Las técnicas para generar ácidos nucleicos, incluyendo un gen expresable o ARNm, y para introducir esos ácidos nucleicos en un sistema de expresión en el cual cualquier proteína codificada por el gen expresado será producida son conocidas en la técnica y descritas de manera breve más adelante. Preferiblemente, el antígeno es proporcionado como un ARNm. El ARN o ARNm obtenido de una célula (por ejemplo una célula cancerosa, célula de patógeno o célula infectada con patógeno) puede ser cargado directamente a las células dendríticas. De manera alternativa, el ARN o el ARNm pueden ser amplificados antes de la carga. En una modalidad, el ARNm blanco es amplificado por RT-PCR usando un cebador que contiene un promotor sentido para producir un plásmido recombinante de expresión de ADNc. El ARN transcrito in vi tro del plásmido recombinante de expresión puede entonces ser usado para cargar las células. Los métodos para el aislamiento, amplificación, transcripción in vi tro del ARN y carga del ARN y otros ácidos nucleicos en células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la PCT/US04/39539 y la solicitud provisional U.S. 60/522,310, el contenido de la cual se incorpora como referencia. En una modalidad de la invención, el antígeno es una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. Como un ejemplo no limitante, el plasma de un paciente infectado por VIH puede servir como fuente para el aislamiento de ARN de VIH. En una modalidad, una porción del plasma es centrifugada, y el sobrenadante es recolectado y filtrado usando filtros de 0.22 µm y almacenado a -20°C hasta su uso en la formulación de la vacuna de células dendríticas. El ARN de VIH presente en el plasma es amplificado por RT-PCR y las reacciones de transcripción in vi tro proporcionan una cantidad suficiente de ARN de VIH amplificado para cargarlo en células dendríticas. De manera breve, el ARN viral es transcrito de manera inversa en ADN de una sola hebra (ss) usando una transcriptasa inversa, amortiguador de reacción apropiados y hexámeros aleatorios o cebadores inversos dirigidos. El ADNc de una sola hebra es entonces amplificado por PCR en ADN de doble hebra en una reacción de PCR primaria usando cebadores múltiples. La identidad de las regiones amplificadas en la reacción de PCR primaria es determinada por la selección de cebadores específicos complementarios a las secuencias blanco que flanquean a aquellas regiones. El producto de la reacción de PCR primario es purificado usando un Equipo de Purificación de PCR QIAquick y entonces sirve como molde o patrón en una segunda ronda o amplificación de PCR anidada. En esta ronda de amplificación, los cebadores 5' contienen una asa con un sitio de unión de ARN polimerasa (por ejemplo, un promotor T7), y el cebador 3' contiene un asa con extensiones de poli T. Las modificaciones introducidas por las regiones del asa en una ronda anidada de PCR permiten la transcripción del producto de la PCR in vi tro y la traducción exitosa tras la liberación en las células dendríticas. La purificación del ARN transcrito in vivo es ® efectuada usando el Equipo Qiagen RNeasy , y el ARN es eluido en agua libre de nucleasa. Si es necesario, se efectúa la precipitación con etanol para concentrar el ARN . El ARN es resuspendido en agua libre de nucleasa y pasado a través de un filtro de poliétersulfona (PES) de 0.8/0.2 µm, entonces dispersado en tubos de polipropileno de bloqueo seguro de 0.5 ml y cargado en las DC o criopreservado a £-150°C hasta el descongelamiento antes de la transfección. En otra modalidad preferida, el AR? o AR?m es extraído de una o más células cancerosas. El ARN o ARNm puede ser cargado directamente en las células dendríticas, o puede ser primero amplificado por RT-PCR y transcripción in vi tro usando los métodos descritos en la PCT/US04/39539.
Carga de Antígeno de las Células Dendrí ticas Las células dendríticas pueden ser cargadas con uno o más antígenos como células dendríticas inmaduras, células dendríticas maduras, o durante la diferenciación de células dendríticas inmaduras a maduras. Las células dendríticas son capaces de ingerir antígenos, como proteínas, péptidos, virus, células, lisados celulares y similares. En consecuencia, la carga de antígeno puede ser efectuada simplemente poniendo en contacto las células dendríticas con el antígeno o ácido nucleico que codifique para el antígeno. Otros métodos para cargar las células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a transfección de ácido nucleico, exosomas, vectores virales, liberación de micropartículas, etc. Véase por ejemplo, Mitchell et al. (2000) Curr Opin Mol Ther 2:176-181; Zitovogel et al. (1998) Nature 4:594-600; Jenne et al., (2001) Trends Immunol 22:102-106, y la publicación de Patente Estadounidense 2005/0158856 el contenido de las cuales se incorpora como referencia. Uno o más antígenos pueden ser cargados directamente en células dendríticas, o ácidos nucleicos que codifiquen para uno o más I antígenos pueden ser cargados (transfectados) en células dendríticas. En una modalidad preferida, las células dendríticas son cargadas con ácidos nucleicos que codifican 5 para uno o más antígenos. Preferiblemente, el ácido nucleico ! es un ARNm. i Los métodos para transfectar ácidos nucleicos en I 1 células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transfección 10 pasiva, transfección mediada por lípidos, transfección catiónica mediada por lípidos (por ejemplo, DOTAP), transfección catiónica mediada por péptidos, electroporación. Véase Nair et al. (1998) Nat Biotechnology 16:364-369; Van Tendeloo et al. (2001) Blood 98:49-56; Saeboe-Larssen et al. 15 (2002) J Immunol Methods 259:191-203; Boczkowski et al (2000) Cáncer Res 60:1028-1034; Gilboa et al. Immunol Rev (2004) 199:251-263; solicitud provisional Estadounidense 60/583,579; y solicitud de Patente Estadounidense 10/177,390, el contenido de las cuales se incorpora como referencia. 20 Carga de Células Dendrí ticas por Pulsación Peptídica Los métodos para cargar células dendríticas con proteínas, polipéptidos, péptidos, extractos celulares o de tejidos, y otros tipos de antígenos son conocidos por 25 aquellos expertos en la técnica. En modalidades preferidas, las células dendríticas inmaduras son cargadas con uno o más antígenos. En una modalidad de la invención, los péptidos, polipéptidos y/o extractos celulares o tisulares son cargados simplemente por incubación con células dendríticas inmaduras en medio de cultivo.
Carga de An tígeno por Electropora ción Seguida por Maduración de Cél ulas Dendrí tica s Inmaduras Usando un Cóctel de Ci tocina En una modalidad de la invención, las células dendríticas inmaduras son cosechadas inclinando el matraz de cultivo para desalojar las células. Las células en suspensión son entonces transferidas a tubos cónicos. Se agrega PBS al matraz de cultivo para remover las células flotantes restantes del medio residual, lo cual se agrega al matraz cónico. Algunas células dendríticas inmaduras pueden permanecer adheridas al matraz. El desprendimiento de esas células es promovido por la adición de PBS e incubando el matraz en cualquier lugar de 2°C hasta temperatura ambiente. Al final del periodo de incubación, los matraces son inclinados y las células desalojadas son agregadas a los tubos cónicos. La suspensión celular total es entonces centrifugada, lavada en PBS y resuspendida en ViaSpan® frío a 4xl07/ml en 0.5 ml y colocada sobre hielo. Las DC son mezcladas con ARNm a 2 µg/106 células de ARNm que codifica para el antígeno y colocadas en una cubeta de electroporación de 4 mm de separación y electroporadas a un pulso de 275-350V, 100-300 O y 150 µF, y preferiblemente a 325V, 200D. Inmediatamente después de la electroporación, las DC son lavadas en medio X-VIVO 15 y resuspendidas a lxl06/ml en X-VIVO 15 suplementado con GM-CSF (800U/ml), IL-4 (500U/ml) y PGE2 (lµg/ml), TNF-c (lOng/ml), IL-1/3 (lOng/ml) e IL-6 (lOOng/ml). Las células dendríticas inmaduras son entonces incubadas durante la noche a 37 °C, 5% de C02, >75% de humedad para producir células dendríticas maduras estables. Las células dendríticas maduras son entonces lavadas en PBS.
Carga de Antígeno por Electroporación y Maduración Usando CD40L En una modalidad de la invención, las células dendríticas inmaduras son maduradas usando CD40L e IFN-?. Preferiblemente, las DC inmaduras son transfectadas con 4 µg de ARNm de CD40L por 106 y ARNm (2 µg/106 células) que codifica para uno o más antígenos por electroporación como se describió anteriormente y entonces son cultivadas durante la noche en X-VIVO 15 suplementada con GM-CSF (800-1000 U/ml), IL-4 (500-1000 U/ml), IFN-? (500-1000U/ml) o TNF-a. (lOng/ml) y PGE2 (1 µg/ml) para generar células dendríticas maduras estables. Las células dendríticas maduradas por este proceso secretan altos niveles de IL-12 (un factor de crecimiento de las células T), e IL-10 mínima, en comparación con las células dendríticas maduradas por el proceso con cóctel de citocina descrito anteriormente.
Carga de An tígeno por Electropora ción de Cél ulas Dendrí ti cas Maduras Las células dendríticas maduras pueden ser cargadas con antígenos por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad no limitante de la invención, el sexto día después del inicio de la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras, se agrega una formulación de maduración en medio AIM V directamente a las DC inmaduras para dar una concentración final de TNF-a; (10 ng/ml), IFN-? (1000 U/ml), y PGE2 (1 µg/ml). Las células son entonces cultivadas durante la noche para producir células dendríticas maduras. Las DC son entonces cosechadas y coelectroporadas con 1 µg de ARN que codifica para el antígeno y opcionalmente con 4 µg de ARN de CD40L por 106 células. Después de la electroporación, las células son cultivadas durante 4 horas en medio AIM V con 1 x 106 células suplementado con GM-CSF (800 U/mL) , e IL-4 (500 U/mL) . Las células pueden entonces ser formuladas para la administración a un sujeto sin congelamiento, o formuladas para su congelamiento. Para el congelamiento, las células son formuladas preferiblemente en plasma autólogo inactivado con calor, 10% de DMSO, y 5% de dextrosa a 2 x 107 células/mL. Los frascos criogénicos son llenados con 0.7 L para un número total de 1.4 x 107 células por frascos. Los frascos son entonces congelados en cajas de alcohol a -85°C durante un mínimo de 4 horas y transferidos al congelador criogénico para su almacenamiento. La vacuna de células dendríticas congelada puede entonces ser descongelada y administrada a un sujeto sin lavar o reformulación.
Análisis de Ci tometría de Flujo de DC para Evaluar la Maduración En un método preferido, se cosechan 106 DC y se resuspenden en PBS/1% de FCS frío. Los anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE) o FITC específicos para moléculas MHC (HLA-ABC, HLA-DR) , moléculas coestimuladoras (CD80, CD86) , marcadores de maduración (CD83) y marcadores monocíticos (CD14) son mezclados con 1 x 105 DC por pozo en una placa de 96 pozos (BD Biosciences) e incubadas a 4°C durante un mínimo de 15 minutos. Se usaron anticuerpos iguales en isotipo como control. Después de un lavado perfecto, se efectuó el análisis por fluorescencia con un citómetro de flujo FACScalibur (BD Biosciences) usando el programa CellQuest (BD Biosciences) .
Formula ción de la Va cuna Los métodos para formular vacunas de células dendríticas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad preferida, las células dendríticas maduras son lavadas y resuspendidas en plasma inactivado con calor (preferiblemente plasma autólogo) y 10% de dextrosa a una concentración de 4 x 107 células/ml. Las células pueden entonces ser diluidas 1:1 con una mezcla de plasma inactivado con calor y 20% de DMSO para dar una concentración final de 5% de dextrosa, 10% de DMSO en plasma inactivado con calor. La formulación llena final blanco es de 1.4 x 107 células/0.7 ml en un recipiente adecuado para la criopreservación. Las células dendríticas pueden entonces ser administradas a un paciente o congeladas, preferiblemente a -85°C, y almacenadas en un congelador criogénico (preferiblemente en un congelador de nitrógeno líquido seco diseñado para evitar la contaminación) , preferiblemente a una temperatura de <-150°C. La vacuna congelada puede entonces ser transportada a un sitio clínico para la administración al paciente (preferiblemente por inyección intradérmica) . Tras el descongelamiento, la vacuna puede ser administrada directamente al paciente sin mayor procesamiento. Otras formulaciones adecuadas para la administración pueden incluir soluciones para inyección estériles, isotónicas, acuosas, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hagan la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores, preservativos, inmunoestimulantes, citocinas y adyuvantes.
En una modalidad preferida, las células dendríticas maduras son suspendidas en plasma autólogo inactivado con calor y 10% de dextrosa, a una concentración final de 4 x 107 células/ml. Esas células son entonces diluidas 1:1 con una mezcla de plasma autólogo inactivado con calor y 20% de DMSO para dar una concentración final de 2 x 107 células/ml en plasma autólogo inactivado con calor el cual contiene 5% de dextrosa y 10% de DMSO. La formulación llena final es de 1.4 x 107 células/0.7 ml en un recipiente adecuado para la criopreservación. La vacuna es entonces congelada y almacenada a <-150°C en un congelador de nitrógeno líquido seco. La vacuna está lista para administrarse después del descongelamiento, sin la necesidad de lavado y resuspensión.
Métodos de Adminis tra ción La vacuna de células dendríticas puede ser administrada por una variedad de métodos, como, pero sin limitarse a, inyección (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intravenosa, intralinfática, intraarticular, intramuscular, intraperitoneal), por infusión continua, liberación sostenida de implantes, etc. Las vacunas de DC han sido típicamente administradas a intervalos de 2 a 4 semanas. Las vacunas de células dendríticas pueden ser administradas con soporte, amortiguadores, diluentes, adyuvantes, inmunomoduladores, etc. fisiológicamente aceptables.
Preferiblemente, la vacuna de células dendríticas es autóloga al paciente al que se administra, o es igualada en HLA. La dosis de células (por ejemplo, células T activadas, o células dendríticas) administradas a un sujeto es en una cantidad efectiva, efectiva para lograr la respuesta terapéutica benéfica deseada en el sujeto con el tiempo, o para inhibir el crecimiento de células cancerosas, o para inhibir la infección. Una dosis preferida es de aproximadamente 107 células. Son agregados opcionalmente modificadores de la respuesta biológica para el tratamiento por las DC o células T activadas de la invención. Por ejemplo, las células son administradas opcionalmente con un adyuvante, o citocina como GM-CSF, IL-12 o IL-2.
Métodos para Eva l uar la Inmunogenicidad de Cél ulas Dendrí ticas Ca rgadas con An tígeno o Cél ulas T Educadas La inmunogenicidad de las células dendríticas cargadas con antígeno o células T educadas producidas por el método de la invención puede ser determinada por metodologías bien conocidas incluyendo, pero sin limitarse a las siguientes: Ensayo de lisis con liberación de 51Cr. La lisis de blancos marcados con 51Cr impulsados por péptidos por células T específicas de antígenos puede ser comparada. Las composiciones "más activas" mostraran mayor lisis de blancos como función del tiempo. La cinética de la lisis así como la lisis total del blanco a un punto en el tiempo fijo (por ejemplo, 4 horas) puede ser usado para evaluar el desempeño. Ware, C.F. et al. (1983) J. Im unol. 131:1312.
Ensayo de liberación de citocina. El análisis de los tipos y cantidades de citocinas secretadas por las células T tras el contacto de APC modificadas puede ser una medida de la actividad funcional. Las citocinas pueden ser medidas por ensayos de ELISA o ELISPOT para determinar el porcentaje y cantidad total de producción de citocina. Fujihashi, K. et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:181; Tanquay, S. and Killion, JJ. (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13:259.
Educación de células T in vi tro . Las composiciones de la invención pueden ser ensayadas por la capacidad para producir poblaciones de células T reactivas de PBMC derivadas de donadores normales o pacientes. En este sistema, las células T producidas pueden ser probadas por su actividad lítica, liberación de citocina, policlonalidad, y reactividad cruzada con el epítope antigénico. Parkhurst, M.R. et al. (1996) J. Im unol. 157:2539. Ensayos de Proliferación. Las células T proliferarán en respuesta a composiciones reactivas. La proliferación puede ser verificada de manera cuantitativa midiendo, por ejemplo, la absorción de, 3H-timidina. Caruso, A. et al. (1997) Cytometry 27:71. Modelos de animales transgénicos . La inmunogenicidad puede ser evaluada in vivo vacunando ratones transgénicos HLA con las composiciones de la invención y determinando la naturaleza y magnitud de la respuesta inmune inducida. De manera alternativa, el modelo de ratón hu-PBL-SCID permite la reconstitución de un sistema inmune humano en un ratón por transferencia adoptiva de PBL humano. Esos animales pueden ser vacunados con la composición y analizados por la repuesta inmune como se mencionó anteriormente en Shirai, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:2733; Mosier, D.E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2443.
Modelos con primates. Puede ser utilizado un sistema modelo de primate no humano (chimpancé) para verificar inmunogenicidades in vivo de ligandos restringidos a HLA. Se ha demostrado que los chimpancés comparten especificidades de ligando de MHC superpuestas con moléculas MHC humanas permitiendo de este modo probar ligandos restringidos a HLA por la inmunogenicidad relativa in vivo . Bertoni, R. et al. (1998) J. Immunol. 161:4447.
Verificación de Eventos de Transducción de Señales TCR. Varios eventos de transducción de señales intracelulares (por ejemplo, fosforilación) están asociados con el acoplamiento exitoso de TCR por complejos ligandos de MHC. El análisis cualitativo y cuantitativo de esos eventos ha sido correlacionado con las capacidades relativas de las composiciones para activar células efectoras a través del acoplamiento de TCR. Salazar, E. et al. (2000) Int. J. Cáncer 85:829; Isakov, N. et al. (1995) J. Exp. Med. 181:375).
Métodos para Aislar y Caracterizar Células Inmunes El aislamiento de células o inmunoensayos para la detección de células durante la purificación de células puede ser efectuado en cualquiera de varias configuraciones, por ejemplo, aquellas revisadas en Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Ratón, Fia.; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, " Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; Harlow and Lañe, supra; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, Fia.; Price and Newman (eds.) (1991) Principies and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY. Las células pueden ser aisladas y caracterizadas por métodos de citometría de flujo como el análisis FACS. Se conoce una amplia variedad de métodos de citometría de flujo. Para un panorama general de la citometría de flujo activada por fluorescencia véase, por ejemplo, Abbas et al. (1991) Cellular and Molecular immunology W.B. Saunders Company, particularly chapter 3, y Kuby (1992) Immunology W.H. Freeman and Company, particularmente el capítulo 6. Las máquinas de FACS están disponibles, por ejemplo, de Becton Dickinson. Los agentes de marcación que pueden ser usados para marcar a antígenos celulares incluyen, pero no se limitan a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, proteínas, u otros polímeros como matrices de afinidad, carbohidratos o lípidos. La detección procede por cualquier método conocido, como el inmunomanchado, análisis Western blot, rastreo de marcadores radioactivos o bioluminiscentes, electroforesis capilar, u otros métodos que rastrean una molécula sobre la base de su tamaño, carga o afinidad. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, más que limitar la invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Células Dendríticas Preparadas a Partir de Leucaferesis de Un Día Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron recolectadas de 4 donadores humanos por leucaferesis y transportadas entregándola durante la noche a una instalación productora de células dendríticas en recipientes de transporte de temperatura verificada mantenidos a una temperatura de 8°C-26°C. El día de la entrega, el producto de la leucaferesis fue sometido a centrifugación en gradiente de densidad Ficoll en tubos cónicos de 50 ml (800 x g) durante 20 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 19-22°C) para separar y concentrar la fracción de células mononucleares que incluirá los precursores de células dendríticas (monocitos) . Después de dos pasos de lavado con solución salina amortiguada con fosfato (PBS), se determinaron la concentración celular y viabilidad celular. Después del tercer paso de centrifugación/lavado con PBS, las células mononucleares fueron resuspendidas en medio StemSpanMR H2000 (StemCell Technologies, Inc.) y sembradas en matraces T150 cm2 a 2.0 x 108 células por matraz. Los monocitos fueron entonces seleccionados de la población de células mononucleares por adición al matraz de plástico de cultivo tisular estéril durante 1-2 horas a 37°C, 5% de C02, >75% de humedad. Las células no adherentes y semiadherentes (linfocitos primarios) fueron desechadas. Las células adherentes restantes, las cuales fueron predominantemente monocitos, fueron cultivadas en medio StemSpanMR H2000 que contenía GM-CSF (800 U/ml) y IL-4 (500 U/ml) . Esas células fueron incubadas durante 6 días a 37°C, 5% de C02, >75% de humedad para permitir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras.
La población rica en células dendríticas inmaduras fue cosechada inclinando suavemente los matraces para desalojar las células. Las células en suspensión fueron transferidas a tubos cónicos. Se agregó PBS adicional a los matraces para remover las células flotantes restantes y los medios residuales y se agregaron la suspensión celular en los tubos cónicos. El desprendimiento de las células adherentes restantes fue completado agregando PBS e incubando los matraces a 2-8 °C durante aproximadamente 10 minutos. Mientras esas células estaban incubando, la suspensión celular en los tubos cónicos fue centrifugada, el sedimento celular fue resuspendido en PBS. Al final del periodo de incubación, los matraces fueron inclinados suavemente y el contenido agregado a la suspensión celular en los tubos cónicos. La suspensión celular total fue sedimentada y resuspendida en PBS, y se removió una muestra para la concentración celular, viabilidad celular e inmunofenotipificación. Se examinaron los siguientes cuatro conjuntos de marcadores celulares por citometría de flujo: marcadores de linaje monocíticos (CD3, CD14, CD19, y CD56) , indicación de la presencia de células dendríticas (CDllc) , un marcador de células presentadoras de antígenos (HLA-DR) , y un marcador de células dendríticas maduras (CD83) . La preparación enriquecida en células dendríticas inmaduras expresó niveles insignificantes de marcadores de linaje y CD83, y altos niveles de CDllc y HLA-DR.
Las células dendríticas inmaduras fueron lavadas una ve z con un medio reducido en suero OPTI -MEM® I ( GIBCOMR) con amortiguador de HEPES , L-glutamina , sin roj o de fenol . Las células dendríticas fueron entonces transfectadas con ARN tumoral ampli ficado por electroporación a una relación de aproximadamente 2 µg de ARN por 106 células dendríticas . La electroporación fue efectuada en cubetas con una separación de 4 mm que contenían 600 µL de una suspensión celular que contenía 5 x 107 células /ml , a un impulso de 500 V durante 500 µs . Después de la electroporación, las células trans fectadas fueron trans feridas a matraces TI 50 ( una cubierta por matra z ) que contenían medios StemSpan H2000MR (medio de cultivo libre de suero ) , suplementado con IL-4 ( 500 U/ml ) y GM-CSF ( 800 LVml ) . Las células transfectadas fueron incubadas durante 2-3 horas a 37 ° C , 5% de C02 , >75% de humedad para permitir que las células se recuperaran de la electroporación . Las células dendríticas electroporadas inmaduras fueron maduradas en medio StemSpan H2000MR, suplementado con IL-4 (500 U/ml) y GM-CSF (800 U/ml) y un cóctel de maduración ( IL-l a 5 ng/ml, IL-6 a 150 ng/ml, TNF-a a 5 ng/ml y PGE2 a 1 µg/ml) a 37 °C, 5% de C02, >75% de humedad durante 20-24 horas . Todas las citocinas, así como la PGE2, fueron reconstituidas o diluidas (en el caso de PGE2) en PBS con 1% de HSA. Antes del paso de dilución, la PGE2 fue reconstituida en etanol . Las células dendríticas maduras fueron entonces enjuagadas en PBS antes 71 de agregarse al amortiguador de disociación (libre de tripsina) y entonces se lavaron 3 veces con PBS para remover el amortiguador de disociación celular. Se recolectaron muestras para la concentración celular, viabilidad e inmunofenotipificación. Una comparación de la inmunofenotipificación de células dendríticas inmaduras y maduras se muestra en la Tabla 1. Tabla 1 Las células dendríticas maduras transfectadas fueron suspendidas en plasma autólogo en una concentración final de 2 x 107 células/ml. Las células fueron entonces diluidas 1:1 con una mezcla de 80% de plasma y 20% de DMSO para dar concentraciones finales de 3 x 106 o 1 x 107 células/ml en 90% de plasma con 10% de DMSO, entonces congeladas en criofrascos usando congelamiento a velocidad controlada, y almacenadas a <-150°C.
Ejemplo 2 Vacunas de Células Dendríticas Preparadas a Partir del Producto de la Leucaferesis de un Día que Permaneció Viable Durante al Menos 2 Horas Después del Des conge lamient o en 10% de DMSO Una vacuna de células dendríticas congeladas preparada como se describió en el Ejemplo 1 fue descongelada a 37°C, y mantenida a 20-25°C o a 2-8°C durante 2 horas. La viabilidad fue determinada inmedi tamente después del descongelamiento y a intervalos de 30 minutos hasta 2 horas. La viabilidad inmediatamente después del descongelamiento a 37°C fue del 92%. Los resultados se muestran en la tabla 2, y confirman que la vacuna puede ser descongelada y almacenada en DMSO al 10% durante al menos 2 horas.
Tabla 2 Ejemplo 3 Aislamiento de Células Mononucleares de un Paciente y Di erenciación de Monocitos en Células Dendriticas Inmaduras Se recolectaron células mononucleares de sangre periférica y plasma de un paciente o voluntario por leucaferesis a temperatura ambiente en un sitio clínico. El producto de la leucaferesis (PBMC) y el suero fueron transportados durante la noche en un recipiente a temperatura controlada mantenido a una temperatura en el intervalo de 6-28°C. El día después de la leucaferesis, las PBMC fueron purificadas por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll en tubos cónicos de 50 ml a temperatura ambiente para separar y concentrar la fracción de célula mononucleares que incluyen los monocitos (los precursores de las células dendríticas) y leucocitos. Las células mononucleares fueron lavadas varias veces en solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y se determinó la concentración celular. Después del paso de centrifugación/lavado final con PBS, las células mononucleares fueron resuspendidas en medio AIM-V y sembradas en matraces T150 cm2 a 2.0 x 108 células por matraz. Los monocitos fueron entonces seleccionados de la población de células mononucleares por adhesión a matraces de cultivo tisular estériles durante 1 ó 2 horas a 37°C, 5% de C02, >75% de humedad. Las células no adherentes y semiadherentes fueron removidas lavando suavemente con PBS. Las células adherentes restantes, las cuales fueron predominantemente monocitos, fueron cultivadas en medio de cultivo X-VIVO 15 que contenía 1000 U/ml de GM-CSF y 1000 U/ml de IL-4. Las células fueron incubadas durante 6 días a 37 °C, 5% de C02, > 75% de humedad para permitir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras. Después del cultivo in vi tro, la población rica en células dendríticas inmaduras fue cosechada inclinando los matraces para desalojar las células. Las células en suspensión fueron transferidas a tubos cónicos. Se agregó PBS a los matraces para remover las células flotantes restantes y el medio residual, y entonces se agregó a la suspensión celular en los mismos tubos cónicos. El desprendimiento de las células dendríticas inmaduras adherentes restantes fue promovido por incubación en PBS a 2-8°C. Al final del periodo de incubación, los matraces fueron inclinados y el contenido agregado a la suspensión celular en los mismos tubos cónicos. La suspensión celular total fue entonces sedimentada y resuspendida en PBS, y se removió una muestra para determinar la concentración celular. Las células dendríticas inmaduras fueron lavadas y resuspendidas en ViaSpan y transfectadas con 2 µg de ARN que codifica para el antígeno por 106 células dendríticas. La electroporación fue efectuada en cubetas de 4 mm de separación que contenían 0.4 ml de la suspensión celular (4 x 107 células/ml) a un impulso de 300V, 100O y 150 µF. Después de la electroporación, las células transfectadas fueron diluidas con medio X-VIVO 15, centrifugadas y resuspendidas en medio X-VIVO 15 (libre de suero) suplementado con GM-CSF (800 U/ml), IL-4 (500 U/ml), IL-1/3 (10 ng/ml), IL-6 (150 ng/ml) , TNF-a. (10 ng/ml) y PGE2 (1 µg/ml) . Las células fueron incubadas a 37 °C, 5% de C02, >75% de humedad durante la noche para madurar. Las células dendríticas maduras transfectadas fueron suspendidas en plasma autólogo inactivado por calor y 10% de dextrosa, a una concentración final de 4 x 107 células/ml. Las células fueron entonces diluidas 1:1 con una mezcla de 20% de DMSO para dar una concentración final de 2 x 107 células/ml en plasma autólogo inactivado por calor el cual contiene 10% de DMSO y 5% de dextrosa, y entonces congeladas en criofrascos estériles a <150°C.
Ejemplo 4 Caracterización Física y Funcional de las Células Dendríticas Preparadas a Partir de Monocitos Incubados Durante la Noche a 6-28°C Los datos en este ejemplo apoyan la funcionalidad y factibilidad de la producción de células dendríticas transfectadas con ARN a partir de un producto de aféresis de un día. Las células dendríticas fueron preparadas por el método descrito en el Ejemplo 3. Los datos más adelante muestran que las células dendríticas pueden ser producidas de manera reproducible al rendimiento apropiado a partir de un producto de aféresis de un solo día y que las células resultantes (1) exhiben un fenotipo maduro clásico, (2) pueden ser transfectadas eficientemente con ARN, y (3) pueden ser criopreservadas con una alta viabilidad después del descongelamiento . Inmunof enotipo de las DC . Las DC maduras fueron caracterizadas exhaustivamente por tinción con FACS por marcadores moleculares que deben estar presentes o ausentes de la preparación celular final. HLA-DR, CD83, CD86, CD80, CDla, y CD209 mostraron alta expresión CD14, CD56, CD19, y Cd3 mostraron una baja expresión. La Tabla 3 (a continuación) muestra los resultados (media y desviación estándar para por ciento de células positivas) recopilados de 11 ensayos consecutivos de producción de vacunas de células dendríticas a partir de PBMC obtenidas de diferentes donadores sanos.
Tabla 3 Expresión de Marcadores de la Superficie Celular en DC Producidas a Partir de Monocitos de Un Día Esos datos, junto con las fotomicrografías (no mostradas) demuestran que las DC producidas por los métodos de las condiciones de la invención exhiben el fenotipo y morfología de DC clásicas. Además, las desviaciones estándar relativamente bajas son indicativas de la reproducibilidad de esos procesos. Rendimiento, Fenotipo y Viabilidad. Los métodos de células dendríticas han sido perfectamente probados y muestran una reproducibilidad que genera células dendríticas maduras transfectadas con ARN de alta calidad. La Tabla 4 muestra el resultado de 11 ensayos de vacuna usando ARN de línea celular tumoral amplificado total como la carga útil de antígeno y células dendríticas donadoras normales como el vehículo.
Tabla 4 Resumen de los resultados de la prueba de liberación para el producto de vacuna de DC generado en 11 ensayos de consistencia La s DC maduradas transfectadas con ARN expresan CCR 7 y son migra torias . Además de los marcadores de DC maduros descritos anteriormente, se evaluó la expresión de CCR7 , la cual es crítica para la migración en el nodo linfático de las DC in vivo . En este estudio se usó el análisis FACS con anticuerpo específico para CCR7 para examinar DC transfectadas con ARN descongeladas producidas usando el proceso GMP a escala completa (ensayos de consistencia 3, 4, 6, 7, 8 y 10) . Los resultados se muestran en la Tabla 5 a continuación: Tabla 5 Porcentaje de Células Dendríticas CCR7+ *% de cél ulas posi tiva s Además de demostrar la presencia física de CCR7 sobre las DC después de la maduración, se demostró que las DC también tienen capacidad migratoria usando el ensayo de migración espontánea de matriz de gel de colágeno, el cual indica que el CCR7 expresado es también funcional (no se muestran los datos) . Las DC transfectadas con ARN proporcionan soporte coes timulador funciona l . Los experimentos descritos anteriormente muestran que las DC producidas expresan todos los marcadores coestimuladores críticos, mientras que los experimentos siguientes demuestran que esas moléculas son funcionales. Hasta este punto, la capacidad de las DC para estimular la producción de interferón gamma (IFN-?) a partir de PBMC en un ensayo de linfocitos mezclados con alio (MLR) fue determinada usando DC descongeladas a partir de 3 donadores diferentes junto con PBMC previamente congeladas de cada donador. La expectativa fue que las DC no estimularían la producción de INF-? a partir de sus PBMC autólogas similares en HLA sino que los harían cuando se mezclaran con PBMC no autólogas. Todas las combinaciones apareadas fueron probadas usando ELISPOT (INF-?) como la lectura. Los datos se presentan en la Figura 2. Los resultados de estos experimentos demuestran que, como se anticipaba, únicamente las combinaciones de DC/PBMC diferentes dan lugar a la producción de INF-?, una propiedad la cual requiere expresión de MHC funcional y moléculas coestimuladoras . Las DC maduras tienen funcionalidad adicional . En este experimento, el cóctel de citocinas usado para madurar las DC después de la transfección y antes del congelamiento contiene TNF-a, IL-lß, IL-6, y PGE2. Para demostrar que las DC maduras son superiores a las DC inmaduras, la capacidad de esas dos poblaciones (del mismo donador) para estimular la producción de citocina TH1 de células autólogas T. Ambas poblaciones de DC fueron transfectadas con ARN que codifica para la proteína de la matriz de Flu y usadas para estimular CTL de memoria específicas de Flu de PBMC autólogas. La figura 3 muestra más adelante los resultados de los análisis ELISPOT (# de manchas/pozo como función de las PBMC alimentadas). No se observó diferencia estadística entre las DC inmaduras y maduras para obtener la producción de INF-? de células T de memoria específica de Flu. Sin embargo, únicamente las DC maduras pudieron también dar lugar a la producción de IL-2 de esas células. Se considera que la inducción de IL-2 es importante debido a que (1), la secreción inducida de IL-2 sostiene la proliferación de CTL específicas del antígeno, autocrinas y, (2) la baja producción de INF-? e IL-2 recientemente ha mostrado correlacionarse con el riesgo en el incremento de la mortalidad en pacientes con VIH y en un estudio reciente, la falta de secreción de INF-? o IL-2 ha dado como resultado un deterioro en la función de las células T y una incapacidad para mantener la respuesta de memoria central. Con el propósito de simplificar, no se graficaron los controles negativos. El número promedio de manchas observadas de las PBMC solas (es decir, sin DC) , fue de 9.7 (INF-?) y 1.3 (IL-2) . Este experimento se repitió con vacunas producidas a partir de PBMC de 3 donadores independientes y los resultados fueron cualitativamente idénticos. En consecuencia, las DC maduras tienen una funcionalidad superior adicional en comparación con las DC inmaduras. La s DC transfectadas con ARN después del descongelamien to son estables . Aunque los protocolos clínicos se pueden especificar, la inyección inmediata de la vacuna de células dendríticas tras el descongelamiento, podrían surgir circunstancias no contempladas que puedan retrasar la administración. Para demostrar que las DC permanecerían viables y funcionales si son descongeladas pero no inyectadas inmediatamente, se efectúo el siguiente experimento. Dos frascos cada uno de 2 preparaciones de células dendríticas correspondientes a 2 donadores sanos diferentes fueron descongelados. Un frasco de cada donador fue probado inmediatamente en un ensayo de alo MLR mientras que el segundo frasco de cada preparación se dejó permanecer a temperatura ambiente durante 40 minutos antes de ser ensayado por el mismo método. La PBMC usadas en este experimento incluyeron células autólogas de cada donador así como una tercera muestra de PBMC de un donador no relacionado con cualquiera. La lectura para este ensayo fue ELISPOT (INF-?). El resultado de este experimento se muestra en la Figura 4 e indica que no existe diferencia apreciable en la función entre las DC ensayadas inmediatamente tras el descongelamiento y aquéllas que permanecieron a temperatura ambiente durante 40 minutos. Además de este ensayo funcional, se determinó la viabilidad celular después del descongelamiento y 40 minutos después de descongelamiento por exclusión de tinte de trypan y se obtuvieron resultados idénticos (no se muestran los datos ) .
El congelamien to-descongelamien to no afecta la función de las DC. Para evaluar si la función de las DC es afectada de manera adversa por el proceso de congelamiento-descongelamiento, se comparó la funcionalidad de las DC antes del congelamiento y después del congelamiento. La funcionalidad fue evaluada por la capacidad de las DC para estimular una respuesta específica de Flu de memoria de PBMC autólogas como función de la disminución de la concentración de ARNm de Flu usada para la transfección. La lectura del ensayo fue ELISPOT (INF-?). Los resultados se muestran en la figura 5 más adelante e indican que el proceso de congelamiento-descongelamiento no tuvo efecto sobre la funcionalidad de las DC en este ensayo. Se mezcló una cantidad constante de ARNm de GFP (0.5 µg) para verificar las eficiencias de transfección. Las muestras descongeladas posteriormente fueron descongeladas después de ser congeladas durante 24 horas. Expresión de proteína después de la electropora ción de DC con ARNm . Como un primer paso, evaluamos si la transfección de DC con ARNm conduce expresión apropiada de la proteína codificada por el ARNm. Para la preparación de las DC, las PBMC (ya sea frescas o congeladas) obtenidas por leucaferesis de voluntarios sanos fueron enriquecidas en monocitos por adherencia a un matraz de plástico después de una incubación de 2 horas ín vitro. Después de lavar, las células adherentes fueron cultivadas durante 6 días en medio X-VIVO 15 suplementado con factor estimulante de colonia de los granulocitos/macrófagos (rGM-CSF) recombinante e interleucina-4 (rIL-4) para generar DC inmaduras (iDC). Las iDC fueron entonces electroporadas (300V, 150µF, 100O) con ARN que codifica para proteínas viral o control e inducidas a madurar durante 24 horas en medio X-VIVO 15 suplementado con IL-lß, IL-4, IL-6, GM-CSF, TNF-a y prostaglandina E2 (PGE2). Para probar la expresión de la proteína después de la transfección, las DC fueron electroporadas con ARN que codifica para la Proteína Fluorescente Verde (GFP) y la expresión fue medida por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 6, una gran fracción de DC maduras producidas de monocitos de un día expresa altos niveles de GFP hasta cuatro días después de la transfección, confirmando que este método es eficiente en la promoción de la expresión de proteína a largo plazo en DC . A continuación, se determinó la capacidad de las DC autólogas transfectadas por electroporación con ARNm que codifica para la proteína pp65 CMV para inducir respuestas de células T CD4 y CD8 en PBMC de individuos infectados con CMV. Los sujetos infectados con CMV fueron identificados estimulando las PBMC de varios donadores de sangre con péptidos inmunodominantes bien definidos derivados de la proteína pp65 y midiendo la secreción de IL-2/IFN-? así como la proliferación celular en ambas células T CD4 y CD8. Los individuos en los cuales se detectaron respuestas positivas de las células T específicas de CMV y que consintieron ser sometidos a leucaféresis después de obtener su consentimiento fueron seleccionados para estudios adicionales. Las DC de esos individuos fueron preparadas como se describió anteriormente. Las DC maduras transfectadas con ARN codifica para la proteína pp65 de CMV fueron incubadas durante 16 horas (ICS) o 6 días (proliferación) con PBMC autólogas a una relación de 1/40. Después de la estimulación, se evaluó la secreción de IL-2 e IFN-? (Figura 7) y la proliferación (Figura 8) de células T CD4 y CD8 específicas de CMV por citometría de flujo. Las DC electroporadas con ARN de pp65 CMV indujeron selectivamente una alta expresión de IFN-? e IL-2 así como la proliferación de células T CD8 de sujetos infectados con CMV. Sin embargo, este protocolo induce una activación mínima de células T CD4, como es mostrado por el bajo nivel de secreción de citocina y detección de proliferación en las células T CD4 (Figuras 7 y 8, paneles inferiores) .
Ejemplo 5 Comparación de la Diferenciación de Monocitos en Células Dendríticas usando 500 U/ml o 1000 U/ml de IL-4 PBMC de leucaferesis de un día mantenida a temperatura de 6-28°C fueron lavadas y sembradas @~2xl08/matraz en medios AIM-V durante un paso de adherencia de 2 horas. Después de dos horas, las células no adherentes fueron removidas, y las células adherentes fueron lavadas y resuspendidas en X-VIVO 15 suplementado con 1000 U/ml de GMCSF y 500 U/ml o 1000 U/ml de IL-4; incubadas @37°C durante 6 días. Además, para el cultivo en X-VIVO 15 suplementado con 1000 U/ml de GM-CSF y 500 U/ml de IL-4, se comparó el efecto de cambiar el medio el día 3 para cultivar durante 6 días sin un cambio en el medio. Específicamente, en el día 3, los medios fueron removidos junto con las células en suspensión, el matraz fue lavado suavemente en medios X-VIVO para cosechar las células adherentes sueltas y los medios y el lavado fueron centrifugados 01300 rpm durante 8 minutos hasta células sedimentadas. Las células fueron resuspendidas en medio X-VIVO 15 fresco suplementado con 1000 U/ml de GM-CSF y 500 U/ml de IL-4; los medios y células se agregaron nuevamente al matraz que aún contenía las células adherentes; y los matraces fueron incubados @37°C durante tres días adicionales. Todos los matraces fueron cosechados individualmente por electroporación. Las DC de 6 días fueron transfectadas con 2 µg de GFP por 106 células (20µg de GFP por 5xl06 células), suspendidas en X-VIVO 15 y sembradas por lxloVml; suplementadas con 800 U/ml de GM-CSF y 500 U/ml de IL-4 y maduradas con cóctel de citocina (TNFa-lOng/ml; IL-lß-lOng/ml ; IL- 6-100ng/ml ; PGE2- lµg /ml ) . Las DC fueron incubadas durante la noche a @37°C; 5% de C02. Se efectuó la fenot ipi f icación sobre DC inmadura el día 6 ( DC inmaduras; Figura 9) y 24 horas después de la transfección ( DC maduras; Figura 10) . El rendimiento (% Rec) y viabilidad (% V) para cada condición de cultivo inmediatamente después de la transfección y 24 horas después de la transfección se muestra en las Tablas 6A-C . Tabla 6A 1000 U/ml de IL-4 Tabla 6B 500 U/ml de IL-4 Tabla 6C 500 U/ml de IL-4, cambio de medio en el día 3 Ejemplo 6 Enriquecimiento de Monocitos por Elutriación y Diferenciación en DC Inmaduras y Maduras La elutriación, también conocida como centrifugación en contraflujo, fue efectuada en un Sistema de Separación Celular ElutraMR (Gambro BCT, Lakewood, CO) como un método automatizado para aislar monocitos de una leucaferesis de un día, los cuales habían sido transportados a la instalación de producción desde un sitio de recolección por entrega nocturna en un recipiente a temperatura controlada (6-28°C). El amortiguador de elutriación fue preparado agregando lOOOmL de Suero de Albúmina Humana al 5% (HSA, Baxter Healthcare, Westlake, CA) a una bolsa de 4L de Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS, Cambrex Bio Science, Walkersville, MD) . Este amortiguador de elutriación fue agregado al producto de la feresis de un día en un volumen igual al de la feresis. El Sistema de Separación Celular Elutra™ (Gambro BCT, Lakewood, CO) fue cebado con amortiguador de elutriación y fue cargado el producto de la feresis. Después de que se efectuó el procedimiento de elutriación, los monocitos fueron recolectados de la fracción fuera del rotor. Los monocitos fueron almacenados congelados. Los monocitos elutriados congelados fueron descongelados, y entonces diferenciados a 1 millón de células/mL en X-VIVO 15 (Cambrex Bioscience, Walkersville, MD) con 800 U/mL GM-CSF (Berlex Laboratories, Richmond, CA) y 500 U/mL de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) en matraces durante 5 días para producir células dendríticas inmaduras (iDC) . Las iDC fueron cosechadas, y el antígeno cargado con ARN de tumor de RCC amplificado usando electroporación. Las células fueron cultivadas con 800 U/ml de GM-CSF, 500 U/ml de IL-4 y citocinas de maduración (T?F-a, IL-lµ, IL-6 y PGE2) y cosechadas después de 24 horas de cultivo. El conteo celular y viabilidad de las células dendríticas maduras (mDC) fue determinado exclusión de azul de Trypan por el ViCell (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA) . Las mDC resultantes fueron fenotipificadas . Las células cultivadas en matraces fueron 99% CD83+ y 0.2% CD14+. El rendimiento de mDC fue de 34% de las células CD14+ cultivadas en los matraces.
Ejemplo 7 Comparación de la Expresión de Moléculas Coestimuladoras en DC Preparadas a Partir de Leucaferesis Fresca contra la de Un Dia Se recolectó sangre periférica de 3 donadores humanos sanos en tres días separados por leucaferesis y se transportó a la Universidad de Montreal dentro de 30 minutos después de la recolección. Se removieron veinte mL de leucaferesis y se preparó plasma antologo por centrifugación. El volumen de la leucaferesis fue dividido en dos partes iguales. Una parte fue procesada inmediatamente para generar monocitos "frescos" aunque la segunda parte fue almacenada como alícuotas de 20 mL en tubos cónicos de 50 mL para generar células de una "feresis de un día". Los tubos fueron colocados en un recipiente de plástico dentro de una caja que fue almacenada inclinada sobre una plataforma de agitación entre 16-20°C durante 24 horas. Después del periodo de incubación, las PMBC fueron separadas usando gradiente de densidad de Ficoll. Una fracción de células mononucleares que incluye los precursores de células dendríticas (monocitos) fue separada de la feresis fresca y de un día usando un gradiente de densidad de Ficoll. La leucaferesis fue colocada sobre Ficoll en tubos cónicos de 50 mL y los tubos fueron centrifugados (800Xg) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas cuatro veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS), y contadas para determinar la concentración celular y viabilidad celular. Para obtener una población de monocitos altamente purificados, la fracción mononuclear fue purificada adicionalmente usando microperlas de CD14 (Miltenyi) . Se resuspendieron lxlO9 células en 8 mL de amortiguador que contenía PBS, 0.5% de BSA y EDTA 2 mM (amortiguador de Miltenyi) . Se agregaron 2 mL de microperlas de CD14 a cada tuvo de 50 mL que contenía lxlO9 células y se incubó a 4°C durante 15 minutos. Las células fueron lavadas en 100 mL del mismo amortiguador, centrifugadas a 300Xg y resuspendidas en 20 mL de amortiguador de Miltenyi. La suspensión celular fue aplicada a cuatro columnas de LS situadas bajo un campo magnético (Miltenyi QuadromaxMR) . Después de la aplicación de las células usando flujo por gravedad, las columnas fueron lavadas tres veces con 3 mL de amortiguador Miltenyi. Los monocitos fueron eluidos dos veces en ausencia de un campo magnético con 5 mL de amortiguador de Miltenyi y centrifugados a 300Xg durante 10 minutos. La pureza del eluato y de las fracciones a través del flujo fueron determinadas con citometría de flujo usando anticuerpos específicos para CD3, CD19, CD16, CD56, CD14 y CD209. La fracción del eluato contenía 88-98% de monocitos y menos de 2% de células pequeñas. Las fracciones no adherentes contenían solo un pequeño porcentaje (2%) de monocitos. Se extrajo el ARN total de una porción de los monocitos purificados (50 millones) en ese momento. Para preparar DC diferenciadas maduras, se sembraron 50 millones de monocitos en matraces T150cm2 en medio X-VIVO que contenía IL-4 y GM-CSF a 37 °C durante cinco días. Se agregó un cóctel de citocina (TIP) que contenía factor de necrosis tumoral, interferón gamma y prostaglandina E2 a las células el día cinco. Las células fueron cosechadas el día seis del cultivo y en ese momento fueron llamadas "TIP-DCs". La población rica en células dendríticas fue cosechada inclinando suavemente los matraces para desalojar las células, los lavados adicionales con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y el desprendimiento de las células adherentes remanentes incubando el PBS y a 2-8 °C durante aproximadamente 10 minutos. La suspensión celular total fue sedimentada y resuspendida en PBS, y analizada por la concentración celular, viabilidad celular e inmunofenotipificación. Se examinaron los siguientes conjuntos de marcadores celulares por citometría de flujo: marcadores de linaje monocítico (CD3, CD14, CD19, CD16 y CD56) , indicación de la presencia de células dendríticas (CDllc, CDla y CD209) , un marcador de células presentadoras del antígeno (HLA-II), marcadores de la migración (CD38 y CCR7) y marcadores de las células dendríticas maduras (CD83 y CD86) . Se resuspendieron 20 millones de TIP-DC en 600 µl de ViaSpanMR y se electroporaron con ARN de CD40L en una relación de 4 µg de ARN por un millón de células dendríticas. La electroporación fue efectuada en cubetas con una separación de 4 mm, a un impulso de 300V durante 300 µs . Después de la electroporación, las células fueron transferidas a matraces T75 (una cubeta por matraz) que contenían medio X-VIVO (medio de cultivo libre de suero) , suplementado con IL-4 y GM-CSF. Las células transfectadas fueron incubadas durante 4 horas a 37°C, 5% de C02, >75% de humedad para permitir que las células se recuperaran de la electroporación. Después de esto las células fueron maduradas adicionalmente y llamadas "PME-CD40L DC" . Se aisló el ARN de una porción de las PME-CD40L DC generadas. La PME-CD40L DC fueron congeladas en 90% de plasma autólogo con 10% de DMSO, en criofrascos usando congelamiento a velocidad controlada, y almacenadas a <-85°C. Una vacuna de células dendríticas preparadas como se describió anteriormente fue descongelada a 37°C, mantenida a 20-25°C durante 30 minutos. La viabilidad fue determinada inmediatamente después del congelamiento y a intervalos de 10 minutos hasta 30 minutos. Las PME-CD40L DC después del congelamiento fueron analizadas por citometría de flujo usando anticuerpos específicos para marcadores de linaje monocítico (CD14), marcadores de células dendríticas (CDllc, CDla, y CD209), un marcador de células presentadoras de antígeno (HLA-II), marcadores de migración (CD38 y CCR7) y marcadores de células dendríticas maduras (CD80, CD83 y CD86) .
Resultados Genera ción de Monoci tos Los datos de los tres donadores demuestran que la selección positiva usando perlas de CD14 da como resultado una población 88-98% pura de monocitos (Tabla 7) . La cantidad máxima de contaminación de células pequeñas es del 2% (Tabla 7) . La fracción no adherente (a través del flujo) tuvo hasta 2% de monocitos (células grandes) en los tres donadores (no se muestran los datos) . Por lo tanto, no hay pérdida significativa de monocitos en la fracción no adherente. La contaminación por población de células pequeñas presente en el eluato está compuesta principalmente de células T como es evidente de la alta expresión de CD3 y la baja expresión de los marcadores CD19, 16 o 56 (no se muestran los datos) . No existieron diferencias visibles en la expresión de los marcadores CD83, CD86, CD11C, HLA-I, o HLA-II en la fracción de eluato entre la leucaferesis fresca y de un día.
TIP-DC Los monocitos fueron inicialmente muy puros (90%), y la pureza mejoró aún más durante el proceso de diferenciación cuando el porcentaje de células grandes en TIP-DC de los tres donadores fue de 98-99% y, de este modo, el porcentaje de células pequeñas fue menor de 2% (no se muestran los datos) . El análisis del fenotipo de TPI-DC con citometría de flujo reveló que hubo una diferencia en la expresión de CD83 entre las TIP-DC generadas de leucaferesis fresca y de 1 día. El porcentaje de células positivas se refiere al número de células positivas para un marcador bajo investigación. El porcentaje de DC que expresan el marcador de maduración de la superficie CD83 fue menor en las TIP-DC de los 3 donadores preparados de leucaferesis fresca que aquellos preparados de leucaferesis de un día (Tabla 8) . No hubo diferencias significativas en ningún otro marcador de las TIP-DC generadas a partir de leucaferesis fresca y de un día.
PME-CD40L DC 4 horas después de la Transfección Las DC después de la transfección (PME-CD40L DC) fueron analizadas por la expresión de CD154 (CD40L) cuatro horas después de la transfección. Las PME-CD40L DC de leucaferesis de un día expresaron más CD40L en los donadores 1 y 2 cuatro horas después de la transfección que las PME-CD40L DC generadas a partir de leucaferesis fresca (Tabla 9) . Hubo una diferencia en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las CD40L entre las PME-CD40L DC generadas a partir de feresis fresca y de un día en los donadores uno y dos (Tabla 9) .
PME-CD40L DC después del Descongelamiento Las PME-CD40L-DC fueron analizadas por la expresión de una variedad de marcadores de DC después del descongelamiento. Hubo diferencias en el fenotipo de las PME-CD40L DC después del descongelamiento generadas a partir de leucaferesis fresca contra la de un día. La intensidad de fluorescencia media de la expresión de CD40L en PME-CD40L DC preparadas a partir de leucaferesis fresca fue menor que la de la DC preparadas de leucaferesis de un día (Tabla 9) . También hubo una tendencia que sugiere que, en dos donadores, la eficiencia de la transfección (del por ciento positivo de expresión de CD40L) es menor en las DC generadas de leucaferesis fresca (Tabla 9) .
El por ciento de células positivas medido por citometría de flujo reveló que, en dos de tres casos, más células se tiñeron positivas con anticuerpos CD83 en células dendríticas generadas de la porción de un día de la leucaferesis (Tabla 10).
Aunque la diferencia en el por ciento de células positivas para CD80, CD83 y CD86 no es siempre mayor en las DC generadas de leucaferesis de un día (Donador 3, Tabla 10), la intensidad de fluorescencia media de las células generadas a partir de leucaferesis de un día teñidas con anticuerpos específicos es mayor en todos los donadores (Tabla 11). Además CD80, CD86, y CD83, HLA-I y HLA-I I exhibieron el mismo resultado (Tabla 11). La señal de intensidad de fluorescencia media se correlaciona con un mayor nivel de expresión de proteína por célula en la expresión de moléculas CD80, CD83, CD86, HLA-I y HLA-II es sobrerregulada en las DC maduras. Por lo tanto, el fenotipo de esas células refleja un estado más maduro de las células dendríticas obtenidas de la porción de un día en los tres donadores. Esos cambios reflejan el estado de maduración de las DC . Tomados junto a los datos obtenidos con la medición del por ciento de células positivas así como la intensidad fluorescente media permite concluir que las células generadas de la porción de un día de una leucaferesis exhiben un fenotipo más maduro.
Ejemplo 8 Análisis de Microarreglo de Expresión de Genética en Monocitos Frescos Contra los de un Día y Células Dendriticas Preparadas de los Mismos Las muestras de ARN de monocitos frescos y monocitos de un día (monocitos los cuales habían sido incubados a 16-20°C durante 24 horas después de la leucaferesis), y ARN de DC preparadas de monocitos frescos y de un día, como se describe en el Ejemplo 8, fueron aplicadas al Arreglo Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, Calif) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Genechip® expresión análisis Technical Manual, 2004). De manera breve, se convirtieron tres microgramos de ARN total obtenido con el Equipo de Control de Poli-A ARN Genechip® (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) a la primera hebra de ADN usando transcriptasa inversa SuperScripMR II. La Síntesis de la segunda hebra de ADNc fue seguida por transcripción in vi tro para al amplificación lineal de cada transcripto e incorporación de CTP y UTP biotiniliado . Los productos del ARNc fueron fragmentados alrededor de 100 nucleótidos, e hibridazos durante 16 horas a los microarreglos. Los microarreglos fueron entonces lavados a una rigurosidad baja (6XSSPE) y alta (MES lOOmM, NaCl 0.1 M) y teñidos con estreptavidina-ficoeritrina . La fluorescencia fue agregada amplificando anti-estreptavidina biotinilada y una alícuota adicional de tinción de estreptavidina-ficoeritrina . Se usó el GeneChip® Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) para recolectar la señal de fluorescencia a una resolución de 3 µm después de la excitación a 570 nm. Se calculó la señal promedio de dos exploraciones secuenciales para cada característica del microarreglo. Las imágenes exploradas fueron analizadas con el Genechip® Operating Software vl.l (Affymetrix, Santa Clara, Calif.). Se confirmó una alta correlación lineal (R2>0.95) de 4 ARN control incluidos en el equipo de control de Poli-A ARN (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) para garantizar el éxito del proceso de marcación. Todos los datos de perfil fueron importados al programa de computadora Genespring y fueron normalizados de acuerdo al tipo de muestras (es decir, las muestras de monocitos a monocitos y las muestras dendríticas a dendríticas) . Se efectuaron tres pasos en el paso de normalización y se hizo de acuerdo al método estándar sugerido por Genespring para arreglos de Affymetrix. 4) Transformación de datos (todos los valores menores de 0.01 fueron fijados en 0.01) 5) Normalización al 50 por ciento. 6) Normalización a la media. Los datos fueron filtrados primero por indicadores con manchas ausentes. Los datos fueron entonces analizados con una anova unidireccional sin modelos de predicción aleatoria con un nivel de confianza de p.05 o p.l. La lista de genes filtrados generados fue entonces analizada por cambios de pliegue, nivel de expresión o confianza. Esto se efectúa usando las muestras, promedios o como muestras individuales. El nivel de expresión entre los monocitos o células dendríticas frescos o de un día se compararon antes o después de la anova. La lista de genes se comparó con otra y aquéllos que se superpusieron en varias listas fueron elegidos por su confiabilidad. Los genes con niveles de ARN en estado estacionario alterado en células dendríticas preparadas de monocitos de un día contra células dendríticas preparadas de monocitos frescos se listan en la Tabla 12A. Las descripciones de esos genes se listan en la Tabla 12B. Los genes con niveles de ARN estado estacionario alterados en los monocitos de un día contra los monocitos frescos se listan en la Tabla 13A. Las descripciones de esos genes se listan en la Tabla 13B. Esos resultados demuestran que los monicitos frescos son fenotípicamente diferentes de los monocitos de un día, y que las células dendríticas preparadas de monocitos frescos son fenotípicamente diferentes de las células dendríticas preparadas de los monocitos de un día. Tabla 12A Genes con Niveles de ARN en Estado Estacionado Alterado en Células Dendríticas preparadas a partir de Monocitos de un Día en comparación con Células Dendríticas Preparadas a partir de Monocitos Frescos Tabla 12B Descripción de los Genes Listados en la Tabla 12A Tabla 13A Genes con Niveles de ARN en Estado Estacionario Alterados en Monocitos de un Día en Comparación con Monocitos Frescos Tabla 13B Descripción de los Genes Listados en la Tabla 13A Los genes de células dendríticas fueron normalizados adicionalmente para la expresión de dos genes domésticos que muestran permanecer constantes entre la DC producidas de monocitos frescos y un día. La expresión promedio de cada gen (normalizada) fue dividida por la expresión promedio (normalizada) de GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) o µ-actina para producir una relación de expresión con relación al gen doméstico. Los resultados de seis genes se muestran en la Tabla 14. "DCdo" se refiere a DC preparadas de monocitos de un día. "DCf" se refiere a DC preparadas de monocitos frescos.
Tabla 14 Relaciones de Expresión de ARN en Estado Estacionario de Ciertos ARN para GAPDH o ß-Actina en DC preparadas de Monocitos de un Día o Frescos Se efectuó la verificación adicional, a la fecha de la expresión diferencial en monocitos de dos de los genes candidatos por PCR en Tiempo Real Cuantitativa (QPCR) usando los cebadores mostrados en la Tabla 15. La primera hebra de ADNc fue generada a partir de cada ARN total (idéntico al que se usó en el análisis GeneChip) usando cebadores oligo (dT) y sistema de síntesis de la primera hebra SuperScriptMR III para la RT-PCR de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). La QPCR fue efectuada usando un sistema de detección de secuencias ABl Prism® 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Guía del Usuario del Sistema de Detección de Secuencia ABl Prism® 7900HT). Los ensayos de expresión de genes TaqMan® o ensayos de expresión de genes TaqMan® adaptados (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) fueron usados como sondas TaqMan®. Las reacciones de PCR fueron efectuadas por triplicado usando mezclas AbsoluteMR QPCR ROX Mix (Abgene, Surrey, RU) . La cuantificación de las concentraciones relativas de ADNc se efectuó usando el método de la curva estándar relativa de acuerdo a lo descrito en el Boletín del Usuario #2 del Sistema de Detección de Secuencias ABl Prism® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Se usó un ADNc con la mayoría de la expresión de cada gen en el análisis GeneChip para generar la curva estándar relativa. Todos los datos se muestran como la expresión relativa a la expresión interna de GAPDH. Se demostró que APAF-1 y la proteína efectora 2 CDCA2 disminuyen, con relación a GAPDH, al menos 2.5 veces y tres veces, respectivamente entre los monocitos frescos y de un día.
Tabla 15 Cebadores Ejemplo 10 Comparación de las Células Dendríticas Preparadas a Partir de PBMC incubadas a temperatura ambiente durante 23, 48 {o 71 horas a partir del momento del aislamiento de un donador Métodos : Los productos de la leucaferesis de "donadores sanos" de dos donadores fueron recibidas después de ser transportadas durante la noche. Aproximadamente un tercio de cada producto fue procesado para la generación de DC a los tiempos especificados después de la recolección de la aféresis como sigue. El producto de la leucoferesis (es decir, PBMC) fue incubado a temperatura ambiente durante 23, 48 o 71 horas antes de la centrifugación en gradiente de ficoll-histopaque y el paso de adherencia descrito más adelante. Después del periodo de incubación a temperatura ambiente, se determinaron la viabilidad de las PBMC y la presencia de células B, células T, monocitos y células NK. Los resultados se muestran en la Tabla 16.
Tabla 16 Caracterización del producto celular al Día 0 de cultivo Genera ci ón de Productos de DC Se prepararon PBMC por centrifugación por densidad con ficoll-histopaque, y se lavaron cuatro veces en PBS a temperatura ambiente. Se resuspendieron 2 x 108 PBMC en 30 ml de medio AIM-V (Invitrogen) y se dejaron adherir a matraces de plástico de 150 cm3 durante dos horas a 37°C. Las células no adherentes fueron removidas y las células restantes cultivadas en medio X-VIVO 15, suplementado con 1000 U/ml de GM-CSF (Leukine) y 1000 U/ml de IL-4 (R&D systems), durante 5 días a 37 °C, 5% de C02. Las DC inmaduras fueron maduradas inicialmente mediante la adición de TNF-a; (10 ng/ml), IFN-? (1000 U/ml) y PEG2 (1 µg/ml) . Después de cultivar durante la noche, los productos intermedios de TIP-DC fueron cosechados por remoción de los medios, y un lavado con PBS frío. Las TIP-DC fueron fenotipif icadas para confirmarla generación de una población madura de células. Para generar DC completamente maduras, cargadas con antígeno, las TIP-DC fueron electroporadas: las células fueron resuspendidas en Viaspan frío a 4 x 107/ml en 0.5 ml y colocadas sobre hielo. Las DC fueron mezcladas con ARNm de carcinoma de células renales, tumoral, total amplificado a 1 µg/106 células, como una carga de codificación de antígeno modelo, más 4 µg/106 ARNm de CD40L, y colocadas en una cubeta de electroporación, separación de 4 mm, seguida por electroporación usando un sistema Biorad GenePulsar Xcell. Inmediatamente después de la electroporación, las DC fueron lavadas en medio X-VIVO 15 y finalmente resuspendidas en 20 ml de X-VIVO 15 suplementado con GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (500 U/ml) a 1 x 106/ml, y cultivadas durante 4 horas a 37 °C en matraces T75 de baja adherencia. Los cultivos celulares y determinaciones de viabilidad se efectuaron usando yoduro de propidio y perlas de conteo CalTag de acuerdo a lo descrito por el fabricante. Las muestras de PBMC después del ficoll, TIP-DC de 6 días, DC recuperadas 4 horas después de la electroporación y cultivo (PME-CD40L DC) , y después del congelamiento del producto final, fueron todas sometidas a conteo celular y análisis de viabilidad. Los resultados se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17 Recuperación y Rendimiento de DC durante la generación de PME-CD40L DC Fenotipif icación de productos de PBMC y DC Todos los anticuerpos fueron obtenidos de BD Biosciences y usados a las diluciones recomendadas por el fabricante. PBMC: 3xl05 células fueron teñidas cada una con CD19-PE, CD14-PE y CD3-PE, o controles conjugados con isotipo similar por incubación en anticuerpo durante 30 minutos a 4°C. Después de la incubación, las células teñidas fueron lavadas 3 veces en FBS al 1%/PBS frío y resuspendidas en PBS para el análisis de fluorescencia usando un citómetro de flujo FACScalibur (BD Biosciences) usando el programa CellQuest (BD Biosciences) . 3 minutos antes de la adquisición, se agregó yoduro de propidio (lµg/ml) a cada muestra como un tinte de viabilidad para propósitos de recabación. DC: se resuspendieron lxlO6 células (TIP-DC y PME-CD40L DC) en PBS/1% frío FBS. Anticuerpos conjugados con PE o FITC específicos para moléculas MHC (HLA-ABC, HLA-DR) , o moléculas coestimuladoras (CD80, CD86) , o marcadores de maduración (CD83) o marcadores de linaje monicitos/CC (CD14, CD209) fueron mezclados con lxlO5 DC e incubados a 4°C durante 30 minutos. Los anticuerpos de isotipo igual fueron usados como controles. Después de lavar perfectamente las células estas fueron sometidas a citometría de flujo como se describió anteriormente. El CD40L intracelular fue determinado como sigue: se resuspendieron 2xl05 PME-CD40L DC en 250 µL de solución de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) durante un mínimo de 10 minutos hasta 2 horas a 4°C. Las células fueron lavadas dos veces con 2ml de amortiguador de tinción (PBS; BSA, NaN3 y EDTA), resuspendidas en 0.5 ml de amortiguador de tinción y almacenadas durante la noche a 4°C. Las células fueron resuspendidas en 2.0 ml de solución de Perm/Lavado (BD Biosciences) durante 15 minutos, centrifugadas y resuspendidas en 100 µL de suspensión Perm/Lavado. Se agregaron 20 µL de anti APC de 40 L humano de ratón o APC IgGl de ratón a cada preparación de CC y se preincubó a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad. Las células fueron lavadas dos veces con lml de solución de Perm/Lavado y resuspendidas en amortiguador de tinción antes del análisis citométrico de flujo. Los resultados se muestran en la Tabla 18.
Tabla 18 Fenotipo de las TIP-DC intermediarias y producto de PME_CD40L DC final Se comprenderá que las modalidades particulares descritas aquí se mostraron a manera de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden ser empleadas en varias modalidades sin apartarse del alcance de la invención. Aquellos expertos en la técnica reconocerán y podrán determinar, usando más de una experimentación de rutina, numerosas equivalentes a los procedimientos específicos descritos aquí. Esos equivalentes se consideran dentro del alcance de esta invención y son cubiertos por las reivindicaciones. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente, y en particular las porciones relevantes de las mismas, se incorporan aquí como referencia en el mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuese específica e individualmente indicada como incorporada como referencia. Todas las composiciones y/o métodos descritos y reclamados aquí pueden ser producidos y ejecutados sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de las modalidades preferidas, será evidente a aquellos expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o métodos en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito aquí sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes los cuales están tanto química como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos aquí alcanzándose a la vez los mismos y similares resultados. Todos aquellos sustituyentes similares y modificaciones evidentes a aquellos expertos en la técnica se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención de acuerdo a lo definido por las reivindicaciones anexas. Los datos en la Tabla 16, de dos experimentos independientes, muestran que los productos de la aféresis que son almacenados hasta 72 horas después de la recolección del paciente pueden producir poblaciones de PBMC altamente viables, sin desviación significativa en el subconjunto de leucocitos recuperados. El sembrado de los matraces de PBMC de cada punto en el tiempo, y el cultivo para la generación de DC maduras (TIP-DC) da como resultado una alta frecuencia de células viables, aunque la recuperación total de productos de aféresis usando DC mantenida durante periodos de tiempo prolongados decline (Tabla 17). No obstante, pueden ser generadas DC suficientes para su procesamiento adicional por electroporación con ARN de tumor amplificado total, y ARN de CD40L. De manera más importante, las Tablas 17 y 18 muestran que la TIP-DC generadas de varios productos iniciales es igualmente adecuada para la electroporación y recuperación, con una total maduración en el producto final, PME-CD40L DC. Las PME-CD40L DC generadas en este estudio pueden ser formuladas, "vacuna" y congeladas y descongeladas sin deterioro de las preparaciones de DC. En conclusión, los productos de la aféresis almacenados hasta 72 horas después de la recolección son de material crudo viable para la elaboración centralizada de vacunas de DC para aplicarse en clínicas. Referencias numéricas de las figuras 1. Tapón de espuma 2. Papel Kraft 3. Gel Utek de 453.6 gramos (16 oz) IR x 4. Bolsa de Leucaferesis de 1 x 180 mL 5. Bolsa interna (STP711) 6. Bolsas de Leucaferesis de 1 x 150 mL 7. Bolsa secundaria (STP710) 8. INF 300 9. Geles Utek 2R x 453.6 gramos (16 oz) 10. 11 y 12 Mallas de gel Utek 2RT x 453.6 gramos (16 oz) 13. Mallas de gel Utek 1RT x 453.6 gramos (16 oz) 10. Recipiente E65 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para producir células dendríticas a partir de monocitos, caracterizado porque comprende: b. proporcionar monocitos que han sido incubados a una temperatura de 1°C-34°C durante un periodo de aproximadamente 6 a 96 horas a partir del momento en que se aislaron de un sujeto; y c. inducir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los monocitos son monocitos humanos. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura de incubación es de 6°C-28°C. . El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la temperatura de incubación es de 8°C-26°C. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el periodo de incubación es de 8 a 48 horas . 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el periodo de incubación es de 10 a 30 horas. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el periodo de incubación es de 26 a 72 horas. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el periodo de incubación es de 48 a 80 horas. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la diferenciación es inducida poniendo en contacto los monocitos con un medio de cultivo que comprende una cantidad efectiva de una composición que induce la diferenciación de monocitos en células dendríticas inmaduras . 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la composición es GM-CSF y IL-4; GMCSF y IL-13; GM-CSF y IL-15; o IFNa. 11. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque los monocitos están presentes junto células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) durante todo o una porción del periodo de incubación . 12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque las PBMC son aisladas del sujeto por leucaferesis . 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los monocitos son enriquecidos de PBMC durante o después del periodo de incubación. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los monocitos son enriquecidos de la PBMC por elutriación, centrifugación en gradiente con Ficoll diluido, centrifugación en gradiente de densidad Percoll diluido o clasificación con perlas magnéticas. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los monocitos son enriquecidos de PBMC después del periodo de incubación permitiendo que los monocitos se adhieran a plástico. 16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además un paso de madurar la células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además cargar uno más antígenos en las células dendríticas maduras. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso comprende poner en contacto las células dendríticas inmaduras con PGE2, TNFa , IL-6 y ILlß. 19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso comprende señalar las células dendríticas inmaduras con IFN-?, seguido por la señalización de las células dendríticas con CD40L. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la señalización con CD40L es efectuada tras la traducción del ARNm CD40L recombinante dentro de las células dendríticas. 21. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso comprende poner en contacto las células dendríticas inmaduras con PGE2, TNFa, y IFN-?, para producir células dendríticas maduras. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende además transfectar las células dendríticas maduras con ARN que codifica para CD40L y/o ARN que codifica para uno o más antígenos o epítopes de interés . 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el ARN codifica para uno o más antígenos de célula cancerosa. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22 caracterizado porque el ARN codifica para uno o más antígenos de patógenos. 25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además cargar las células dendríticas con uno o más antígenos para producir una célula dendrítica cargada con antígenos. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el antígeno es antologo al sujeto. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el antígeno es cargado transfectando las células dendríticas con uno o más ARN que codifican para los antígenos. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las células dendríticas son transfectadas con el ARN por electroporación. 29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las células son transfectadas con aproximadamente 1-4 µg de ARN por 106 células dendríticas. 30. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque las células dendríticas están inmaduras al momento de la carga del antígeno. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende además madurar las células dendríticas inmaduras cargadas con antígeno y células dendríticas maduras cargadas con antígeno. 32. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el antígeno es de o derivado de una o más células cancerosas o patógenos. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de cáncer de células renales, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de estómago y cáncer de pancreático. 34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el patógeno es VIH o VHC. 35. Uso de una vacuna de células dendríticas congelada que comprende al menos 2% de DMSO, para elaborar una preparación farmacéutica para ser administrada a un sujeto sin alterar la relación de células a DMSO antes de la administración. 36. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en donde la concentración en la vacuna es de aproximadamente 10%. 37. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en donde las células dendríticas son preparadas por el método de conformidad con la reivindicación 16. 38. El uso de una célula dendrítica cargada con antígeno para la preparación de un medicamento congelado para el tratamiento o prevención del cáncer o infección con patógenos, donde el medicamento comprende al menos 2% de DMSO y está listo para ser administrado después de ser descongelado . 39. El uso de conformidad con la reivindicación 38, donde el medicamento comprende al menos 10% de DMSO. 40. Una composición, caracterizada porque comprende células dendríticas preparadas por el método de conformidad con la reivindicación 16. 41. La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque las células dendríticas están cargadas con antígeno. 42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque las células dendríticas son transfectadas con ARNm que codifica para CD40L. 43. La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque las células dendríticas maduras tienen niveles incrementados de uno o más de CD80, CD83, CD86, MHC moléculas de la clase I, o moléculas MHC de la clase II en comparación con las células dendríticas maduras preparadas a partir de monocitos frescos. 44. Una composición, caracterizada porque comprende células dendríticas maduras derivadas de monocitos, donde las células dendríticas maduras tienen niveles incrementados de uno o más de CD80, CD83, CD86, moléculas MHC de la clase I, o moléculas MHC de la clase II en comparación con las células dendríticas maduras preparadas de monocitos frescos. 45. La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque las células dendríticas maduras son transfectadas de manera transitoria con ARNm que codifica para CD40L. 46. Una célula dendrítica derivada de monocitos, caracterizada porque la relación en estado estacionario de ARN de AL0X15 a ARN de ß-actina o ARN de GAPDH en la célula es menor de 1.0. 47. La célula dendrítica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la relación es de entre 0.2 a 0.7. 48. La célula dendrítica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la relación es de entre 0.4 a 0.5. 49. Una célula dendrítica derivada de monocitos, caracterizada porque la relación en estado estacionario de ARN de CD52 a ARN de ß-actina o GAPDH en la célula es mayor de 1.0. 50. La célula dendrítica de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la relación es de entre 1.2 a 5.0. 51. La célula dendrítica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la relación es de entre 1.5 a 2.2. 52. La célula dendrítica de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la relación es de entre 1.8 a 1.9. 53. Una célula dendrítica madura derivada de monocitos, caracterizada porque la relación en estado estacionario de ARN de TLRl, ARN de TLR2, ARN de lL-lß ó ARN de CD69 a ARN de ß-actina o ARN de GAPDH en las células es menor a 1.0. 5 . La célula dendrítica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque la relación es de entre 0.2 a 0.9. 55. La célula dendrítica de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque la relación es de entre 0.5 a 0.8. 56. Una vacuna, caracterizada porque comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-55.
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