ES2777304T3 - Células TSCM y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para obtener una población autóloga de células enriquecidas para células TSCM adecuadas para introducción en un paciente humano que comprende las etapas de: a) preparar DC maduras PME-CD40L a partir de una fuente de tejido aislado de un paciente humano; b) cultivar PBMC obtenidas de dicho paciente in vitro con dichas DC maduras PME-CD40L en un cocultivo durante un tiempo suficiente para inducir un aumento en el número de células TSCM en dicho cocultivo; c) enriquecer dichas células TSCM a partir de dicho cocultivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Células TSCM y métodos de uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro para obtener una población autóloga de células enriquecidas para células Tscm adecuadas para la introducción en un paciente humano. La presente divulgación también se refiere a células T^scm y usos de las mismas. Las células T^scm se pueden utilizar para ayudar a identificar y tratar a pacientes que probablemente experimentan resultados de tratamiento particulares.

Antecedentes

La terapia celular utiliza células presentadoras de antígeno modificadas (APC) o células efectoras inmunitarias para iniciar una respuesta inmunitaria en un paciente. Las células presentadoras de antígeno son fundamentales para la terapia celular porque inician la respuesta inmunitaria; específicamente, son capaces de inducir una respuesta inmunitaria primaria de los linfocitos T.

Las células dendríticas (DC) son las APC más potentes involucradas en la inmunidad adaptativa. Coordinan el inicio de las respuestas inmunitarias de las células T y las células B nulitratadas e inducen respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno. Las DC están especializadas en varias formas para cebar células T auxiliares y asesinas in vivo. Por ejemplo, las DC inmaduras que residen en tejidos periféricos están equipadas para capturar antígenos y producir complejos de péptido MHC inmunogénicos. En respuesta a estímulos inductores de maduración, tales como las citoquinas inflamatorias, las DC inmaduras se convierten en potentes estimuladores de células T al regular al alza la adhesión y las moléculas coestimuladoras y migran a órganos linfoides secundarios para seleccionar y estimular células T específicas de antígeno raras. Sin embargo, la estimulación potente de las células T ocurre solo después de la maduración de DC, un proceso que aumenta la disponibilidad de complejos de MHC/péptido sobre la superficie celular además de moléculas coestimuladoras que dirigen la función efectora de las células T respondedoras.

La coestimulación es normalmente necesaria para que una célula T produzca niveles suficientes de citoquinas que induzcan la expansión clonal. Una característica de las células dendríticas que las hace potentes células presentadoras de antígeno es que son ricas en moléculas coestimuladoras de la respuesta inmunitaria, tal como las moléculas CD80 y CD86, que activan la molécula CD28 sobre los linfocitos T. A cambio, las células auxiliares T expresan CD40L, que liga CD40 sobre DC. Estas interacciones mutuas entre las DC y las células T conducen a la 'maduración' de las DC y al desarrollo de la función efectora en las células T. La expresión de moléculas de adhesión, como la molécula CD54 o la molécula CD11a/CD18, facilitan la cooperación entre las DC y las células T. Otra característica especial de las DC es desplegar diferentes funciones dependiendo de su etapa de diferenciación. Por lo tanto, la captura de antígeno y su transformación son las dos funciones principales de las células dendríticas inmaduras, mientras que su capacidad para presentar el antígeno para estimular las células T aumenta a medida que las DC migran a los tejidos y los ganglios linfáticos. Este cambio de funcionalidad corresponde a una maduración de la célula dendrítica. Por lo tanto, el paso de la célula dendrítica inmadura a la célula dendrítica madura representa una etapa fundamental en el inicio de la respuesta inmunitaria. Tradicionalmente, esta maduración fue seguida por el monitoreo del cambio de los marcadores de superficie sobre las DC durante este proceso.

Algunos de los marcadores de superficie celular más importantes característicos de las diferentes etapas de maduración de las células dendríticas incluyen CD34+ para células madre hematopoyéticas; CD14++, DR+, CD86+, CD16+/-, CD54+ y CD40+ para monocitos; CD14+/-, CD16-, CD80+/-, CD83-, CD86+, CD1a+, CD54+, DQ+, DR++ para células dendríticas inmaduras, y CD14-, CD83++, CD86++, CD80++, DR+++, DQ++, CD40++, CD54++, CD1a+/- para células dendríticas maduras, en las que “+” indica una expresión positiva, “++” indica una expresión más alta, “+/-” indica una expresión más débil y “-” indica una expresión muy débil o indetectable. Sin embargo, los marcadores de superficie pueden variar según el proceso de maduración.

Las DC maduras se prefieren actualmente a las DC inmaduras para inmunoterapia. Solo la progenie DC completamente madura carece del Receptor GM-CSF (GM-CSF-R) y permanece establemente madura al retirarla y/o en ausencia de GM-CSF. También, se ha mostrado que las DC maduras son superiores en la inducción de respuestas de células T in vitro e in vivo. Las células dendríticas maduras también son útiles para captar y presentar antígeno a los linfocitos T in vitro o in vivo. Las DC y/o células T presentadoras de antígeno modificadas educadas a partir de estas DC modificadas tienen muchas aplicaciones, que incluyen diagnóstico, terapia, vacunación, investigación, cribado y suministro de genes. Es difícil aislar las células dendríticas maduras de la sangre periférica porque menos del 1% de los glóbulos blancos pertenece a esta categoría. Las DC maduras también son difíciles de extraer de los tejidos. Esta dificultad, en combinación con el beneficio terapéutico potencial de las DC en la terapia celular, ha llevado a la investigación y el desarrollo hacia nuevos métodos para generar células dendríticas maduras utilizando fuentes alternativas. Se informa que varios métodos producen DC maduras a partir de células dendríticas inmaduras, y se ha demostrado que diferentes métodos pueden producir DC maduras con diferentes propiedades. Los métodos que producen DC maduras con propiedades particularmente ventajosas incluyen aquellas divulgadas en los documentos WO2006042177 (Healey et al.); WO2007117682 (Tcherepanova et al.); DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305; y Calderhead et al. (2008) J. Immunother. 31: 731-41. Estos métodos en particular producen DC maduras designadas DC “PME-CD40L”, discutidas más adelante en este documento.

La generación de células T^scm que comprenden la activación de linfocitos T con perlas magnéticas conjugadas con anti-CD3/CD28 y luego el cultivo en presencia de IL-1 e IL-15 se ha descrito en Gattinoni, et al., 2011. Gattinoni et al. 2010 también describe que la infusión de células Tscm en ratones inmunodeficientes induce una respuesta inmunitaria. La generación de células Tscm humanas mediante la activación de células T con perlas a-CD3/CD28 en presencia del inhibidor GSK-3p TWS119 se describe en Cieri et al., 2013. El documento US 2013/280805 describe un método para producir DC maduras PME-CD40L.

Resumen de la invención

Anteriormente, se descubrió que las DC PME-CD40L se pueden utilizar para tratar a un paciente humano que tiene una enfermedad o trastorno inmunitario y también para estimular la producción in vivo de células T ventajosas. Las DC PME-CD40L se producen mediante métodos previamente desarrollados y descritos en los documentos WO2006042177 (Healey et al.); WO2007117682 (Tcherepanova et al.); DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305; y Calderhead et al. (2008) J. Immunother. 31: 731-41. Las DC PME-CD40L se pueden producir, por ejemplo, mediante un método que comprende las etapas secuenciales de: (a) cultivar células dendríticas inmaduras (iDc) aisladas con un agonista del receptor de interferón gamma (IFN-yR) en presencia de un agonista de TNF-aR y PGE2 durante aproximadamente 12 a 30 horas para producir células dendríticas maduras CD83+; y (b) transfectar dichas células dendríticas maduras CD83+ (mDC) con un agonista de CD40 para producir una señal transitoria de CD40. En algunos ejemplos, el agonista de CD40 es ARNm que codifica un polipéptido CD40L. En algunos de estos ejemplos, el ARNm codifica un polipéptido CD40L que consiste en los residuos de aminoácidos 21-261 de la SEQ ID NO: 2 del documento WO2007117682. El ARNm que codifica el polipéptido CD40L se puede cotransfectar con un ARNm que codifica un antígeno. Las DC PME-CD40L son DC maduras que también son fenotípicamente CD83+ y CCR7+.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que las DC PME-CD40L también estimulan la producción de un tipo particular de células T conocidas como células de “memoria de células madre”, también denominadas células “T^scm”, tanto in vivo como in vitro. Las células T^scm son células T de memoria de células madre que son multipotentes y también pueden dar lugar a células de progenie que son células Tscm, lo que hace posible la generación de células Tscm adicionales. La producción de células T^scm por exposición a DC de PME-CD40L puede ocurrir in vivo en pacientes humanos que tienen enfermedades o trastornos inmunitarios, que incluyen SIDA o infección con VIH, y puede servir como un indicador de la respuesta inmunitaria de un paciente y, por lo tanto, el pronóstico clínico. Las DC PME-CD40L también pueden inducir células T^scm in vitro al cocultivanr las DC PME-CD40L con linfocitos. Este cocultivo de DC PME-CD40L con linfocitos da como resultado una población celular enriquecida para células T^scm. Estas células se pueden reintroducir en un paciente para ayudar a estimular la respuesta inmunitaria del paciente del que derivaron (es decir, tratamiento autólogo), y también se pueden utilizar, por ejemplo, para tratar a otro paciente en terapia de transferencia adoptiva (es decir, tratamiento heterólogo). En algunos ejemplos, las células Tscm se purifican adicionalmente de la población de linfocitos o se enriquecen antes de su uso en la terapia de transferencia adoptiva.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para obtener una población autóloga de células enriquecidas para células T^scm adecuadas para introducción en un paciente humano que comprende las etapas de: a) preparar DC maduras PME-CD40L a partir de una fuente de tejido aislado de un paciente humano;

b) cultivar PBMC obtenidas de dicho paciente in vitro con dichas DC maduras PME-CD40L en un cocultivo durante un tiempo suficiente para inducir un aumento en el número de células T^scm en dicho cocultivo;

c) enriquecer dichas células Tscm de dicho cocultivo.

En una realización, las DC maduras PME-CD40L se ubican con un antígeno.

En una realización, las DC se ubican con dicho antígeno mediante transfección con ARN que codifica dicho antígeno. En una realización, el ARN se prepara a partir de células de un paciente infectado con VIH.

En una realización, el antígeno se prepara a partir de células de cáncer de un paciente con cáncer.

En una realización, las células T^scm son CD8+, CD95+, CD28+, CCR7+, y CD45RA+.

En una realización, las células Tscm se enriquecen como células positivas para CD27, CD28, y CD45RA.

En una realización, el método comprende adicionalmente combinar dichas células T^scm con un portador farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra la expansión y detección de CTL Tscm específicas de MART-1. Las DC PME-CD40L se utilizaron para expandir una población de MART-CTL (véase el Ejemplo 2). Se utilizó citometría de flujo multicolor para detectar células CD8+/CD95+/CD28+/CCR7+/CD45RA+ presentes en cocultivos que contienen PBMC y DC PME-CD40L.

Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D muestran el porcentaje de células T CFSElo CD27+/CD28+/CD45RA+ en pacientes clínicos humanos tratados con “AGS-004” (véase Ejemplo 3). Las células Tscm proliferativas que expresan CD27, CD28 y CD45RA se identificaron mediante la activación de la población de CFSE lo. Las células proliferativas CD4 Tscm (Figura 2A y Figura 2B) y las células T^scm CD8 (Figura 2C y Figura 2D) se subcontrolaron adicionalmente para identificar la población CD27+/CD28+/CD45RA+. La media acumulativa de las células T^scm CFSElo se determinó en las visitas 9 y 13 para las poblaciones de células T CD4 (Figura 2A) y CD8 (Figura 2C) promediando el porcentaje de células CFSElo presentes en la región CD27+/CD28+/CD45RA+ para ambos puntos de tiempo de visita 9 y visita 13. El porcentaje de cambio de la visita 3 se determinó al dividir el porcentaje promedio de células en la región de célula T CD4 (Figura 2B) o CD8 (Figura 2D) CD27+/CD28+/CD45RA+ determinada en la visita 9 y la visita 13 por el porcentaje de células en la región de célula T CD4 o CD8 CD27+/CD28+/CD45RA+ determinada en la visita 3 (valor de referencia). La Figura 3 es un diagrama esquemático de un ensayo clínico AGS-004 de Argos Therapeutics en el que los pacientes infectados por el VIH en terapia antirretroviral (ART) se tratan con el tratamiento AGS-004 de Argos, ingresan en Interrupción de Tratamiento Analítico (ATI o ARTI, también referido a otra parte del presente documento como Interrupción Estructurada del Tratamiento o STI), y se controlan los cambios en la carga viral y la respuesta inmunitaria como se indica.

La Figura 4 muestra una estrategia de activación utilizada para identificar células Tscm en proliferación (véase el Ejemplo 3).

La Figura 5 muestra medidas de proliferación de células T CFSElo en pacientes tratados con AGS-004 (véase el Ejemplo 3). Diecinueve pacientes proporcionaron conjuntos completos de extracciones de sangre para el análisis inmunitario. Los subconjuntos de T^scm CD4 y CD8 definidos por la expresión de CD27, CD28 y CD45RA se identificaron mediante la activación de la población de CFSElo determinada en cada visita después de la reestimulación in vitro con DC que codifica los productos del gen VIH Gag, Nef, Vpr y Rev (AGS- 004). Los identificadores de pacientes se presentan en el eje horizontal, y para cada identificador de paciente, los valores de cada visita se muestran en el siguiente orden de izquierda a derecha: visita 3 (valor de referencia); Visita 6 (ART); Visita 8 (ART); Visita 9 (Interrupción Estructurada del Tratamiento (“STI”)); y Visita 13 (STI).

La Figura 6 muestra la determinación de la carga viral en plasma en las visitas indicadas durante semanas de STI. La carga viral se determinó en la visita 8 o 9 antes de la STI y cada 2 semanas durante la interrupción del tratamiento. Los valores representan el número de copias virales/ml detectadas en plasma en las semanas indicadas durante la STI; valores a <50 células/ml están por debajo del límite de detección. El corchete superior indica pacientes que muestran un tiempo prolongado de rebrote viral y el corchete inferior indica pacientes que muestran un tiempo temprano de rebrote viral.

La Figura 7, la Figura 8, la Figura 9 y la Figura 10 muestran la carga viral y los recuentos de células T CD4 en sujetos con un tiempo prolongado de rebrote viral. Los valores de carga viral se muestran en el eje vertical izquierdo y los valores de recuento de células T CD4 se muestran en el eje vertical derecho. Los puntos de datos de carga viral están representados por diamantes, los puntos de datos de recuento de células T CD4 están representados por cuadrados y las visitas de dosificaciones de ^a G^s -004 están representadas por triángulos (en el eje horizontal); en la Figura 7, las visitas de “Seguimiento” se abrevian como “FU”. Los datos se muestran en la Figura 7 para el paciente 011-005; en la Figura 8 para el paciente 011-009; en la Figura 9 para el paciente 023-002; y en la Figura 10 para el paciente 032-001. La Figura 11 muestra una comparación de la expresión de PD-1 en subconjuntos de CTL activados en pacientes en un ensayo clínico AGS-004 durante una STI. El fenotipo activado de las células T CD8+ se definió por citometría de flujo multicolor de PBMC recogidas en la visita 2, visita 8 y visita 13 de seis pacientes. El subconjunto de células T CD8+ PD-1+/CD57 se diferencia más por el patrón de expresión de CD38 y h La -DR. El número de semanas de STI se indica arriba de cada paciente. Los recuentos de los tipos de células que se muestran para cada visita son, de izquierda a derecha, para las células que también son HLA-DR/CD38+; HLA-DR+/CD38+; y HLA-DR+/CD38.

La Figura 12 muestra respuestas de células T multifuncionales de PBMC a partir de experimentos descritos en el Ejemplo 5.

La Figura 13, Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17 y Figura 18 muestran respuestas inmunitarias multifuncionales y trayectorias de carga viral antes, durante, y después de ATI con AGS-004 (véase Ejemplo 5). Los números absolutos de CTL CD28+/CD45RA para cada marcador se muestran en los gráficos de barras; para ambos puntos de tiempo, los datos se muestran de izquierda a derecha para BrdU, CD107a+, Grb+, IFN-gamma+, IL-2+ y TNF-alpha+. Las trayectorias de carga viral se muestran en el gráfico de líneas a la derecha en cada Figura, con la carga viral de plasma en copias/ml en el eje vertical izquierdo y el recuento de CD4 en células/mm3 en el eje vertical derecho. Un asterisco encima de una barra en el gráfico de barras indica una respuesta CTL que cumplió con los criterios de positividad que se definieron como un aumento de al menos 2 veces en el número absoluto de CTL para un antígeno dado (prueba) determinado después de la dosificación en comparación con el número de CTL para dicho antígeno por dosificación (es decir, en la semana 0). Los datos se muestran en la Figura 13 para el paciente 51-100; en la Figura 14 para el paciente 54-100; en la Figura 15 para el paciente 51-102; en la Figura 16 para el paciente 54-101; en la Figura 17 para el paciente 54-102; y en la Figura 18 para el paciente 54-104.

Descripción detallada de la invención

Anteriormente, se desarrollaron nuevos métodos para producir DC maduras que se describen en detalle en: los documentos WO2006042177 (Healey et al.); WO2007117682 (Tcherepanova et al.); DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305; y Calderhead et al. (2008) J. Immunother. 31: 731-41. En algunos de estos métodos, las DC inmaduras se señalizan secuencialmente con una primera señal (un agonista del receptor IFN-y y/o un agonista del receptor TNF-a) para producir DC maduras CD83+ CCR7‘ y luego se señalizan con una segunda señal (un agonista de CD40), que produce DC CD83+ CCR7+ maduras; se pueden utilizar varios agonistas del receptor de IFN-^y y/o agonistas del receptor de TNF-a.

En un método llamado “proceso PME-CD40L” (por Electroporación Posterior a la Maduración con CD40L), las DC inmaduras maduran primero fenotípicamente al agregar 'mediadores inflamatorios' IFN-y y TNF-a al medio de cultivo; opcionalmente, también se agrega PGE2. Luego, aproximadamente 12-30 horas después (en algunos ejemplos, aproximadamente 18 horas después), las células se electroporan con ARNm de CD40L y, opcionalmente, ARNm que codifica el antígeno. Este 'proceso PME-CD40L' produce DC maduras CD83+ CCR7+. Se mostró que las células recolectadas de este proceso después de la electroporación (por ejemplo, 4 horas después de la electroporación) y formuladas como vacuna median la inmunopotencia máxima en ensayos in vitro.

Las células dendríticas producidas por el proceso PME-CD40L (en el presente documento, “DC PME-CD40L”) son fenotípicamente diferentes que las células dendríticas conocidas previamente. Por ejemplo, las DC PME-CD40L pueden soportar la función efectora de CTL específica de antígeno a largo plazo e inducir un tipo de CTL de memoria efectora designadas como células “de alta avidez de expansión rápida” (“REHA”) (véase DeBenedette et al. (2008) J. Immunol.

181: 5296-5305). Estas células conservan la capacidad de expandirse, producir citoquinas y destruir células objetivo, todos los eventos críticos en la mediación de la función efectora CTL a largo plazo. Por lo tanto, se demostró que las DC PME-CD40L inducen preferiblemente una población de células T efectoras/memoria CD45RA CD28+ a partir de una población de células T específicas a antígenos, que podrían ser células T nulitratadas o células T experimentadas con antígeno. Las células T efectoras/de memoria resultantes produjeron IFN^y e IL-2 y pudieron destruir las células objetivo; por lo tanto, estas células diferían tanto de las células T efectoras (que producen IFN^y y pueden destruir las células objetivo, pero no producen IL-2) como de las células T de memoria (que producen IFNy e IL-2, pero no destruyen las células objetivo).

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que además de inducir células T “REHA”, las DC PME-CD40L son potentes agentes inmunoestimuladores que son útiles en la producción de células T^scm y, por lo tanto, son útiles en los métodos de la invención. Los métodos para producir DC PME-CD40L comprenden las etapas secuenciales de: (a) señalizar células dendríticas inmaduras (iDC) aisladas con una primera señal que comprende un agonista del receptor de interferón gamma (IFN-^yR), y opcionalmente un agonista TNF-aR, para producir el agonista de IFN-^yR señaló células dendríticas; y (b) señalizar dichas células dendríticas señalizadas con el agonista de IFN-yR con una segunda señal transitoria que comprende una cantidad efectiva de un agonista de CD40 para producir células dendríticas maduras CD83+ CCR7+. En algunos ejemplos, las DC maduras CD83+ CCR7+ expresan transitoriamente el polipéptido CD40L; en algunos casos, el CD40L está predominantemente localizado intracelularmente en lugar de en la superficie celular. Al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% del polipéptido CD40L se puede ubicar intracelularmente.

Las DC PME-CD40L exhiben algunas características distintivas, que incluyen: (i) demuestran una expresión elevada de la superficie celular de las moléculas coestimuladoras CD80, CD83 y CD86; ii) son CCR7+; y iii) secretan polipéptido o proteína IL-12 p70, y/o secretan niveles significativamente reducidos (0 a 500 pg por ml por millón de DC) de IL-10 (véase, por ejemplo, datos y experimentos presentados en los documentos WO2006042177 (Healey et al.) y WO2007117682 (Tcherepanova et al.)). Estas CD83+ CCR7+ DC maduras producen al menos 1000 pg de IL-12 por 106 DC; los niveles de IL-10 e IL-12 se pueden determinar mediante ELISA de los sobrenadantes de cultivo recogidos hasta 36 horas después de la inducción de la maduración de DC de DC inmaduras (Wierda et al. (2000) Blood 96: 2917; Ajdary et al. (2000) Infection and Immunity 68: 1760). Un experto en la técnica también puede determinar cuándo se han producido PME-CD40L al muestrear una célula o una pequeña (sub)población de DC de una población celular para detectar la presencia de DC maduras que expresan ARNm CD40L y/o polipéptido CD40L, o que expresan proteína interleuquina 12 (IL-12) p35. Se discuten otras características de estas células, por ejemplo, en el documento WO2006042177 (Healey et al.); WO2007117682 (Tcherepanova et al.); DeBenedette et al. ((2008) J. Immunol. 181: 5296-5305); y Calderhead et al. ((2008) J. Immunother. 31: 731-41).

Las DC inmaduras utilizadas para producir DC PME-CD40L se pueden aislar o preparar a partir de una fuente de tejido adecuada que contiene células precursoras de DC y diferenciarse in vitro para producir DC inmaduras. Por ejemplo, una fuente de tejido adecuada puede ser una o más de: células de médula ósea; células progenitoras de sangre periférica (PBPC); células madre de sangre periférica (PBSC); y células de la sangre del cordón umbilical. Preferiblemente, la fuente de tejido es una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). La fuente de tejido puede ser fresca o congelada, y se puede tratar previamente con una cantidad efectiva de un factor de crecimiento que promueva el crecimiento y la diferenciación de las células no madre o progenitoras, que luego se separan más fácilmente de las células de interés. Estos métodos son conocidos en la técnica y se describen brevemente, por ejemplo, en Romani et al. ((1994) J. Exp. Med. 180: 83) y Caux et al. ((1996) J. Exp. Med. 184: 695). Las DC inmaduras también se pueden aislar de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que opcionalmente se tratan con una cantidad efectiva de factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) en presencia o ausencia de interleuquina 4 (IL-4) y/o IL-13, de modo que las PBMC se diferencian en DC inmaduras. En algunos ejemplos, las PBMC se cultivan en presencia de GM-CSF e IL-4 durante aproximadamente 4-7 días, preferiblemente aproximadamente 5-6 días, para producir DC inmaduras. En algunos ejemplos, la primera señal se da en los días 4, 5, 6 o 7, y más preferiblemente en los días 5 o 6. Además, pueden estar presentes GM-CSF así como IL-4 y/o IL-13 en el medio en el momento de la primera y/o segunda señalización.

Para aumentar el número de células precursoras dendríticas en animales, que incluyen humanos, se puede tratar previamente a los sujetos con sustancias que estimulan la hematopoyesis. Dichas sustancias incluyen, pero no se limitan a, G-CSF y ^g M-CSF. Un experto en la técnica puede determinar la cantidad de factor hematopoyético que se va a administrar al monitorizar la frecuencia de los tipos de células en individuos a quienes se les está administrando el factor. La Patente de Estados Unidos No. 6,475,483 enseña que las dosificaciones de G-CSF de 300 microgramos diarios durante 5 a 13 días y las dosificaciones de GM-CSF de 400 microgramos diarios durante 4 a 19 días dan como resultado rendimientos significativos de células dendríticas.

Alternativamente, las células dendríticas inmaduras se pueden señalizar con una cantidad eficaz de un agonista del receptor de TNF-a seguido de señalización con un agonista de CD40. Las DC inmaduras pueden ponerse en contacto con PGE2 aproximadamente al mismo tiempo que reciben la primera señal de un agonista de IFN-^yR y un agonista de TNF-aR. En algunos métodos, la señalización se produce en ausencia de una cantidad efectiva de IL-1p y/o IL-6. GM-CSF y al menos uno de IL-4 o IL-13 pueden estar presentes en el medio en el momento en que las células dendríticas reciben las primera y segunda señales.

La señalización con agonistas de receptores de IFN-^y, agonistas de receptores de TNF-a y/o agonistas de CD40 se puede lograr al poner en contacto una célula directamente con polipéptidos y/o proteínas de IFN-^y y/o polipéptidos o proteínas de TNF-a y/o agonistas de CD40, respectivamente. De manera similar, los agonistas del receptor de IFN-^y y TNF-a pueden ser aptámeros, anticuerpos y similares, que tienen una actividad biológica similar. Alternativamente, se puede producir la señalización de una célula con agonistas de IFN-^yR, agonistas de TNF-aR y/o agonistas de CD40 tras la traducción del ARNm que codifica dichos polipéptidos o proteínas dentro de la célula dendrítica. Dicho ARNm se puede introducir en la célula mediante transfección u otros medios, y la señalización se produce luego de la expresión del agonista de IFN-^yR, el agonista de TNF-aR y los polipéptidos y/o proteínas agonistas de CD40. Por lo tanto, la señalización puede iniciarse proporcionando el agonista de señalización en el medio de cultivo, la introducción del agonista en la célula y/o tras la traducción dentro de la célula dendrítica de un ARNm que codifica un polipéptido agonista. Los métodos se pueden practicar in vivo o ex vivo. Las células dendríticas maduradas ex vivo de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento se pueden administrar al sujeto para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria junto con las T^scm producidas por cocultivo con las DC.

Las células dendríticas se pueden modificar adicionalmente mediante la administración de un inmunógeno (por ejemplo, un antígeno) a las DC. El inmunógeno se puede suministrar in vivo o ex vivo. El inmunógeno se puede administrar a las células utilizando métodos conocidos en la técnica, y se puede administrar como polipéptidos o proteínas (por ejemplo, “pulsando”) o como ácidos nucleicos que codifican el inmunógeno (por ejemplo, por transfección o electroporación). En algunas realizaciones, el polinucleótido es un ARNm. En algunos métodos de producción de DC PME-CD40L, el ARNm que codifica el antígeno se electropora junto con un ARNm que codifica un agonista de CD40 o sustancialmente concurrente con la señalización de agonista de CD40.

Como entenderá un experto en la técnica, las DC PME-CD40L también se pueden transfectar con antígenos que codifican ARN de cualquier patógeno o enfermedad de interés; dichos antígenos pueden ser de un sujeto individual o de múltiples sujetos y pueden ser de una infección patógena del sujeto del que se aíslan los antígenos o de otro sujeto. Los antígenos de consenso y los antígenos específicos de patógenos son conocidos en la técnica y también se pueden utilizar en estos métodos de preparación de DC PME-CD40L. Las DC procesarán los antígenos y mostrarán los antígenos en su superficie celular; estas DC maduras se pueden utilizar para educar a las células efectoras inmunitarias nulitratadas. Los antígenos que codifican ARN de una muestra de cáncer y/o tumor extraída de un sujeto se pueden utilizar para transfectar DC de esta manera. El ARN que codifica los antígenos del VIH de una muestra extraída de un sujeto también se puede utilizar para transfectar DC.

Por ejemplo, las DC PME-CD40L que se transfectaron con ARNm que codifica MART estimularon células T CD8+ autólogas para producir células T CD8+ respondedoras, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO2006042177 (Healey et al.) y WO2007117682 (Tcherepanova et al.). Además, las De maduras de PME-CD40L cargadas con ARN tumoral de carcinoma de células renales amplificado total (“RCC”) indujeron una respuesta CTL completamente autóloga (véase documento WO2006042177 (Healey et al.)).

En algunos ejemplos, las DC PME-CD40L utilizadas en los métodos descritos en este documento para producir células Tscm se transfectan con ARN que codifica parte o todas las proteínas de VIH Gag, Nef, Tat y Rev, como se describe en los documentos WO2006031870 y Pub. U.S. No. 20080311155 (Nicolette et al.). Brevemente, las DC se transfectan con ARN que codifica uno o más polipéptidos de múltiples cepas de VIH presentes en un sujeto individual; el ARN se deriva de la amplificación de ácido nucleico de los polinucleótidos patógenos. Los cebadores para amplificar dichos polinucleótidos patógenos pueden diseñarse para compensar la variabilidad de secuencia entre múltiples cepas de dicho patógeno, por ejemplo, cuando dicho patógeno es VIH, como se describe en el documento WO2006031870 y Pub. US No. 20080311155. Dichos cebadores pueden incluir, por ejemplo, cebadores divulgados en el documento WO2006031870, que incluyen cebadores directos e inversos para Gag, Nef, Tat y Rev. Se ha demostrado que las DC resultantes de este proceso pueden estimular una respuesta inmunitaria a VIH en pacientes con VIH. De esta manera, se puede producir una vacuna DC autóloga para un paciente y utilizarla para estimular una respuesta inmunitaria a las cepas de VIH encontradas en ese paciente.

Las DC PME-CD40L también se pueden almacenar al poner en contacto una población de células dendríticas enriquecidas con un crioconservador adecuado bajo condiciones adecuadas y congeladas (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2002016560 y la patente de los Estados Unidos No. 8,74,901 (Schuler et al.)).

Se conocen muchos métodos en la técnica para el aislamiento y la expansión de diversas células para la expansión y diferenciación in vitro en células dendríticas, incluidas las células madre CD34+ (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,199,942). Las siguientes descripciones son solo para fines ilustrativos y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.

Las células madre CD34+ se pueden aislar a partir de las células de la médula ósea o al hacer un barrido de las células de la médula ósea u otras fuentes con anticuerpos que se unen a las células no deseadas, tales como CD4+ y CD8+ (células T) (véase, por ejemplo, Inaba, et al. 1992) J. Exp. Med. 176: 1693-1702). Las células CD34+ humanas se pueden obtener de una variedad de fuentes, que incluyen sangre del cordón umbilical, explantes de médula ósea y sangre periférica movilizada. La purificación de las células CD34+ se puede lograr mediante procedimientos de afinidad de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en Paczesny et al. (2004) J. Exp. Med. 199: 1503-11; Ho et al. (1995) Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105; Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2:7-17; y Yu, et al. (1995) PNAS 92: 699­ 703.

Las células madre CD34+ se pueden diferenciar en células dendríticas al incubar las células con citoquinas apropiadas, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas CD34+ humanas se pueden diferenciar in vitro cultivando las células con g M-CSf y TNF-a humanos (véase, por ejemplo, Szabolcs, et al. (1995) J. Immunol.

154: 5851-5861). Opcionalmente, se agrega SCF u otro ligando de proliferación (por ejemplo, F1t3). Las células dendríticas se pueden aislar mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) basada en la expresión de marcadores de superficie celular o mediante otros métodos estándar.

Como es evidente para aquellos expertos en la técnica, los rangos de dosificaciones para diferenciar células madre y monocitos en células dendríticas son aproximadas. Diferentes proveedores y diferentes lotes de citoquinas del mismo proveedor varían en la actividad de la citoquina. Un experto puede valorar fácilmente cada citoquina que se utiliza para determinar las dosificaciones óptimas para cualquier citoquina particular.

Se pueden generar DC a partir de precursores CD14+ no proliferantes (monocitos) en sangre periférica mediante cultivo en medio que contiene GM-CSF e IL-4 o GM-CSF e IL-13 (véase, por ejemplo, documentos WO 97/29182; Sallusto y Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179: 1109 y Romani et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 83). En algunos casos, los pacientes pueden ser pretratados con citoquinas como G-CSF, pero en la mayoría de los casos esto no es necesario porque los precursores CD14+ son suficientemente abundantes (Romani et al. (1996) J. Immunol. Methods 196: 137). Otros demostraron que es posible evitar proteínas no humanas tales como el FCS (suero de ternera fetal), y obtener DC maduras y estables total e irreversiblemente utilizando un medio acondicionado de monocitos autólogos como estímulo de maduración (véase, por ejemplo, Romani et al. (1996) Immunol. Methods 196: 137; Bender et al. (1996) J. Immunol. Methods 196: 121). Sin embargo, estos estudios no dieron como resultado que las DC maduras tuvieran niveles aumentados de IL-12 y/o niveles disminuidos de IL-10 y, por lo tanto, no produjeron DC PME-CD40L.

En algunos ejemplos, las DC utilizadas para producir células Tscm en los métodos descritos en el presente documento se derivan del mismo paciente o sujeto; es decir, las DC y las células T^scm o sus células precursoras se obtienen del mismo paciente o sujeto (es decir, son autólogas). En otros ejemplos, las células DC y Tscm se derivan de diferentes sujetos (es decir, son alogénicas o heterólogas).

En algunos métodos de esta divulgación, las células T se aíslan de mamíferos y se cocultivan con DC PME-CD40L in vitro para producir células T^scm. Por ejemplo, en uno de estos métodos, se utilizan procedimientos establecidos para separar las PBMC de los glóbulos rojos y los neutrófilos con centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Las células se lavan con AIM-V modificado (que consiste en AIM-V (GIBCO® Life Technologies) con glutamina 2 mM, 10 |jg/ml de sulfato de gentamicina, 50 jg/ml de estreptomicina) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 1%. Las células T se enriquecen mediante selección negativa y/o positiva con anticuerpos monoclonales apropiados acoplados a columnas o perlas magnéticas de acuerdo con técnicas estándar y/o instrucciones del fabricante o proveedor. Se analiza una alícuota de células para determinar el fenotipo de la superficie celular que incluye CD4, CD8, CD3 y CD14, y solo con fines ilustrativos, las células se lavan y se resuspenden a una concentración de aproximadamente 5 x 105 células por ml de AIM-V modificado como anteriormente y que contiene FBS al 5% y 100 U/ml de IL-2 recombinante (rIL-2) (denominado “AIM-V suplementado”). El término “cocultivo” se refiere a un cultivo celular que se sabe que contiene al menos dos tipos diferentes de células.

Cuando las células se aíslan de un paciente con VIH, las células infectadas con VIH pueden eliminarse preferiblemente de la población utilizando reactivos tales como, por ejemplo, CD4-PE40 (por ejemplo, a 25 nM). CD4-PE40 es una proteína recombinante que consiste en el dominio c D4 de unión al VIH-1 unido a los dominios de translocación y ribosilación de ADP de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa; Se ha demostrado que inhibe la producción de p24 en cultivos celulares infectados por VIH y destruye selectivamente las células infectadas por VIH-1. Para estimular la proliferación celular, se puede agregar el anticuerpo monoclonal OKT3 (Ortho Diagnostics™, Inc.).

Las células Tscm se pueden aislar del material del paciente; por ejemplo, los CTL de Tscm se pueden aislar de sangre periférica o linfocitos infiltrantes de tumores. En algunos métodos de la invención, las células T o PBMC se aíslan de pacientes humanos y se cocultivan con DC PME-CD40L derivadas del mismo paciente o sujeto para producir y/o expandir células Tscm in vitro. Estos CTL de Tscm se pueden utilizar para la terapia de transferencia adoptiva al infundirlos nuevamente en el mismo paciente (terapia autóloga) o en otro paciente (terapia alogénica). La terapia de transferencia adoptiva alogénica exitosa de células madre hematopoyéticas y linfocitos ha sido reportada, por ejemplo, en Cieri et al. ((2014) Immunol. Rev. 257: 165-180) y Kolb et al. ((1995) Blood 86: 2041-50).

Los CTL de T^scm pueden identificarse en cocultivos de células T y DC PME-CD40L y aislarse y/o expandirse in vitro. Si las DC PME-CD40L se cargan con antígeno y se utilizan para expandir una población de células Tscm, la población resultante incluirá células Tscm que son reactivas al antígeno (por ejemplo, al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% o más de las células Tscm producidas por la expansión serán reactivas al antígeno). Esto se demuestra, por ejemplo, con los datos proporcionados en la Figura 1 y discutidos en el Ejemplo 2, que ilustra la capacidad de las DC PME-CD40L cargadas con el antígeno tumoral MART-1 para expandir una población de CTL Tscm reactivos con MART-I. De esta manera, se pueden producir CTL de T^scm que son reactivos a cualquier antígeno o antígenos particulares; Estos se pueden utilizar para mejorar o estimular la respuesta inmunitaria del paciente al antígeno mediante la terapia de transferencia adoptiva. Por ejemplo, los antígenos pueden prepararse a partir de las propias células cancerosas de un paciente y cargarse en DC que se utilizan para expandir una población de CTL de T^scm que luego se infunden nuevamente en el paciente. En algunos ejemplos, los antígenos se preparan a partir de un paciente con VIH (es decir, un paciente infectado con VIH) y se cargan en DC que se utilizan para expandir una población de CTL de T^scm que se infunden nuevamente en el paciente. Los métodos para preparar antígenos de pacientes con VIH y preparar DC que los presentan son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento WO2006031870 (Nicolette et al.) Y se discuten con más detalle en otra parte del presente documento.

Los CTL de T^scm también pueden producir diversas citoquinas, tal como, por ejemplo, TNF-a o IFN-^y. Los datos mostrados en la Figura 1 revelaron que algunos de los CTL MART-1+ Tscm eran “multifuncionales”, con un 1.8% que expresa TNF-a, un 3.2% que expresa CD107a y un 1.5% que expresa IFN-^y; No se detectó la expresión de IL-2. Se conocen métodos en la técnica para separar células en base a atributos funcionales particulares tales como su expresión de citoquinas específicas (por ejemplo, como se discutió en Kammula et al. (1999) J. Immunol. 12: 6867-75 y Kammula et al. (2008) J. Transl. Med. 2008: 60), y las células se pueden seleccionar sobre la base de la expresión de citoquinas utilizando un reactivo de captura de citoquinas (por ejemplo, como se discutió en Brosterhus et al. (1999) Eur. J. Immunol. 12: 4053-59).

En otro aspecto, los marcadores de superficie celular se pueden utilizar para identificar y/o aislar células para diversos fines. Por ejemplo, las DC se pueden distinguir de otras células porque expresan moléculas de MHC y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, B7-1 y B7-2) y carecen de marcadores específicos para granulocitos, células NK, células B y células T. Los CTL de Tscm tienen algunos marcadores en común con las células nulitratadas tales como, por ejemplo, CD27, CD28 y CD45RA. Sin embargo, dado que las células T^scm se han expuesto al antígeno, también expresan marcadores de activación como, por ejemplo, CD95 y CD122. Las células Tscm pueden ser CD4+ o CD8+, y también pueden ser CCR7+. La expresión de marcadores facilita la identificación, purificación y separación de estas células de otras células que expresan al menos un marcador diferente; se puede utilizar cualquier combinación adecuada de marcadores y un experto en la técnica la determina fácilmente. También se puede utilizar marcador negativo o selección celular. De esta manera, la divulgación proporciona métodos para identificar y/o separar, aislar o enriquecer células Tscm de otras células sobre la base de la expresión de uno o más de CD27, CD28, CD45RA, CD95, CD122, CD4, CD8, CCR7, y PD-1. En algunas realizaciones, las células Tscm se enriquecieron como células que son positivas para CD27, CD28 y CD45RA. En algunas realizaciones, las células Tscm se enriquecen adicionalmente como positivas para CD8, CD95, CD28, CD7 y CD45RA. Las células Tscm también pueden identificarse y/o separarse o enriquecerse de otras células con base en su expresión de PD-1.

Las células se pueden aislar y/o caracterizarse por métodos de citometría de flujo, tales como análisis FACS, así como por cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a métodos tales como cromatografía en columna, transferencias Western, radiografía, electroforesis, capilar electroforesis, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión y similares, y varios métodos inmunológicos como reacciones de precipitina en fluido o gel, inmunodifusión (simple o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes y similares.

Los agentes de marcado que se pueden utilizar para marcar antígenos celulares (que incluyen marcadores de la superficie celular) incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, proteínas u otros polímeros tales como matrices de afinidad, carbohidratos o lípidos. La detección se realiza por cualquier método conocido, tal como inmunotransferencia, análisis de transferencia Western, seguimiento de marcadores radiactivos o bioluminiscentes, electroforesis capilar u otros métodos que rastrean una molécula basada en el tamaño, la carga o la afinidad.

Los CTL de T^scm se pueden identificar mediante citometría de flujo multicolor como células que son positivas (es decir, expresan a niveles detectables) los marcadores CD8, CD95, CD28, CCR7 y CD45RA (también designado “CD8+/CD95+/CD28+/CCR7+/CD45RA+”). Para uso posterior in vivo o in vitro, los CTL de Tscm también se pueden enriquecer, aislar o purificar a partir de otras células utilizando el aislamiento con perlas magnéticas de las células que tienen uno o más de estos marcadores, o en algunos casos puede ser preferible eliminar otros tipos de células de una población que incluye células Tscm utilizando marcadores apropiados.

Los métodos de separación celular basados en la expresión de marcadores de superficie son conocidos en la técnica e incluyen el uso de aislamiento de perlas magnéticas, clasificación de FACS (por ejemplo, como se discutió en Basu et al. (2010) J. Vis. Exp. 41), y la clasificación basada en chips de sistemas microelectromecánicos (chips “MEMS”) (por ejemplo, como se discutió en Shoji y Kawai (2011) Top. Curr. Chem. 2011: 1-25). Las máquinas FACS y los clasificadores de células están disponibles comercialmente (por ejemplo, BD Bioscience LSRII y BD FACSAria) y se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células se pueden aislar o separarse de otras células mediante selección positiva o negativa cuando sea apropiado, o mediante selección positiva y negativa. Por ejemplo, las células Tscm pueden enriquecerse a partir de una población que incluye otras células, como PBMC o linfocitos, utilizando selección negativa para agotar otros tipos de células, seguido opcionalmente por selección positiva para CD8 y/o CD4 y selección positiva para CD95. Los kits y reactivos son conocidos en la técnica para una variedad de etapas de purificación, lo que permite a un experto en la técnica aislar o purificar un tipo de célula conocido; por ejemplo, el kit de células T humanas Dynabeads® Untouched™ de Invitrogen está diseñado para agotar las células B humanas, las células NK, los monocitos, los macrófagos, las plaquetas, las células dendríticas, los granulocitos y los eritrocitos utilizando anticuerpos que incluyen anticuerpos IgG de ratón contra células no T: CD14 humano, CD16, CD19, CD36, CD56, CDw123 y CD235a. A partir de este ejemplo, se apreciará que un experto en la técnica es capaz de seleccionar anticuerpos particulares (a menudo disponibles en el mercado) y herramientas de selección para enriquecer y/o agotar los tipos de células conocidas de una población de células.

La selección de células que llevan marcadores particulares se puede realizar para un marcador a la vez o para más de un marcador a la vez (por ejemplo, como se discutió en Stemberger et al. (2012) PLoS One 4: e35798). La selección también se puede realizar en serie, y se pueden utilizar diferentes tipos de selección en un grupo particular o población de células en etapas de selección posteriores para obtener una subpoblación deseada. Las células también pueden seleccionarse basándose en su especificidad de antígeno directamente aislando células T reactivas a complejos HLA-péptido (por ejemplo, como se discutió en Keenan et al. (2001) Br. J. Haematol. 2: 428-34). Los marcadores celulares que son útiles para la identificación, cribado y/o selección incluyen CD4, CD8, CD27, CD28, CD38, CD57, PD-1, HLA-DR, CD45RA y CD95.

Los CTL de Tscm se pueden expandir in vitro con DC PME-CD40L que presentan el(los) antígeno(s) de interés para producir una población de CTL de T^scm reactivos a un antígeno particular o conjunto de antígenos. La expansión de las células se puede realizar antes o después del aislamiento de las células T^scm de otras células, o tanto antes como después (para que las células Tscm se purifiquen o enriquezcan tanto antes de la etapa de expansión como después de la etapa de expansión). Los métodos para expandir las células T son conocidos en la técnica, tales como los métodos que hacen uso de IL-15 (véase, por ejemplo, Klebanoff et al. (2004) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 7: 1969-74) y IL-21 (véase, por ejemplo, Albrecht et al. (2011) Cancer Immunol. Immunother. 2: 235-48). En algunos métodos, los moduladores de la ruta de desarrollo celular como, por ejemplo, la rapamicina también se pueden utilizar para promover la formación de células T CD8+ en la memoria (véase, por ejemplo, Rao et al. (2010) Immunity 1: 67-78).

Las células T con receptores de antígeno particulares también pueden generarse utilizando métodos de modificación genética, por ejemplo, utilizando vectores lentivirales como se describe en Wang et al. ((2012) J. Immunother. 35: 689­ 701) y Terakura et al. ((2012) Blood 1: 72-82), o receptores de antígeno quimérico como se discute en Barrett et al. ((2014) Ann. Rev. Med. 65: 333-47). Desafortunadamente, las células transducidas lentivirales no son adecuadas para fines terapéuticos, y la integración proviral en el genoma de la célula transducida puede provocar leucemia; así, se prefieren métodos alternativos.

En un ensayo clínico, los pacientes con VIH fueron tratados con múltiples dosificaciones de AGS-004 y la respuesta inmunitaria anti-VIH se determinó después de la terapia (véase diagrama esquemático en la Figura 3). “AGS-004” se refiere a DC PME-CD40L que contienen “GNVR”, la carga útil del antígeno de ARN que codifica los antígenos Gag (G), Nef (N), Vpr (V) y Rev (R) (también llamados “GNVR DC”) (como se describe, por ejemplo, en el documento WO2006031870). Se encontró que AGS-004 aumentaba el número de células Tscm en pacientes tratados y estimulaba la respuesta inmunitaria (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 y el Ejemplo 5, y los datos mostrados en las Figuras).

Los CTL de T^scm se pueden detectar o identificar, por ejemplo, en cocultivos que contienen PBMC y DC PME-CD40L in vitro, así como en sangre u otros tejidos del paciente. Por ejemplo, la citometría de flujo multicolor detectó células Tscm entre PBMC de pacientes con VIH tratados con DC PME-CD40L que codifican antígenos VIH (DC GNVR). Se detectaron células T CDC+ y CD8+ proliferativos en PMBC recogidas de sujetos con VIH que recibieron AGS-004 después de la estimulación in vitro con DC PME-CD40L que codifican antígenos de VIH. Se analizaron los datos de carga viral y los datos de monitoreo inmunitario de pacientes con VIH para determinar la relación entre el tiempo hasta el rebrote viral después de la interrupción de la terapia antirretroviral (ART) y la respuesta de células T anti-GNVR. Los sujetos que reciben ART no tienen una carga viral de VIH detectable, pero una vez que se retira la terapia farmacológica, el virus generalmente se recuperará. Un retraso en el rebrote viral es indicativo de una respuesta inmunitaria anti-VIH.

El CFSE se puede utilizar junto con otros marcadores celulares para identificar los tipos de células que proliferan. La frecuencia de las células T CFSElo representa el porcentaje de células T que proliferan in vitro después de la reestimulación con GNVR DC. Los datos de un solo punto de tiempo para la frecuencia de las células T CFSElo se analizaron en la visita 9 y la visita 13 después del tratamiento con a GS-004, pero ninguno de los puntos de tiempo mostró una asociación entre el porcentaje de células T en proliferación y el tiempo extendido para el rebrote viral o la reducción en carga viral Sin embargo, sorprendentemente, los inventores descubrieron que había una asociación positiva entre la respuesta favorable a AGS-004 y los aumentos en las células Tscm para las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ (identificadas como células T proliferativas que expresan CD27, CD28 y CD45 RA; también designadas CD27+/^c D28+/C^d45RA+). Cuatro pacientes con células T^scm CD27+/CD28+/CD45RA+ CD4 proliferativas (Figura 2A) y células T^scm CD27+/CD28+/CD45RA+ CD8 (Figura 2C) mostraron un mayor tiempo de rebrote viral después de la interrupción del ART (ATI) y/o una carga viral reducida que El otro grupo de pacientes. Es decir, los cuatro pacientes con una respuesta favorable (por ejemplo, Un tiempo prolongado de rebrote viral y/o reducción de la carga viral) en comparación con los otros tres sujetos tuvieron una marcada diferencia en el cambio porcentual de CD27+/CD28+/CD45RA+ CD4 T^scm en proliferación células (Figura 2B) y células CD27+/CD28+/CD45RA+ CD8 T^scm (Figura 2D) medidas desde el valor de referencia (visita 3) y después de la administración de AGS-004 determinada como la respuesta media medida promediando la respuesta detectada en la visita 9 y la visita 13.

Por lo tanto, las células T^scm inducidas in vivo después del tratamiento con DC PME-CD40L están presentes in vitro para el aislamiento y la expansión en dirección descendente. Adicionalmente, la correlación entre las células Tscm y la respuesta favorable a AGS-004 hace que la frecuencia y/o el cambio en las células Tscm en un paciente sea un indicador útil de la respuesta inmunitaria en un paciente. De esta manera, la frecuencia y/o el cambio en las células T^scm en un paciente después de un tratamiento (por ejemplo, con DC PME-CD40L como en el ensayo clínico AGS-004) es una herramienta valiosa para evaluar el probable resultado clínico de un paciente. En algunos ejemplos, las células Tscm divulgadas en el presente documento tienen una expresión baja o nula de PD-1, un marcador asociado con la activación disfuncional de las células T CD4 y CD8. De esta manera, la expresión de PD-1 puede servir como un indicador de respuesta inmunitaria.

Al monitorizar la frecuencia y/o el cambio en las células Tscm en un paciente (y/o la expresión de PD-1 por esas células), es posible predecir o determinar si un tratamiento de un paciente ha sido o será eficaz para inducir una respuesta inmunitaria medida, por ejemplo, por una disminución de la carga viral o un tiempo prolongado de rebrote viral. De manera similar, al monitorear la frecuencia y/o el cambio en las células Tscm en un paciente, también es posible evaluar cuándo un tratamiento ha sido efectivo y/o cuando un paciente ha recibido suficientes dosis de un tratamiento (como, por ejemplo, AGS -004) para ser eficaz en inducir una respuesta inmunitaria. En algunos casos, un aumento de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 100% o 200% o más de células T^scm en un paciente indicará que el paciente ha tenido una respuesta inmunitaria suficiente que un tratamiento (por ejemplo, tratamiento con AGS-004) ha alcanzado un umbral de tratamiento y puede suspenderse adecuadamente. En algunos casos, dicho aumento en las células T^scm en un paciente con VIH indicará que la STI puede continuar; es decir, que no se requiere ART para un tratamiento efectivo. Por el contrario, si dicho aumento en las células Tscm no está presente, el tratamiento efectivo puede requerir que se finalice la STI y se reanude el ART. Dichas decisiones de tratamiento están dentro de la habilidad de un clínico con la guía de medidas conocidas de la salud del paciente y también mediante cambios en el nivel de células Tscm del paciente como se describe aquí. De esta manera, la presente divulgación proporciona métodos para determinar si un tratamiento ha sido efectivo y/o si un tratamiento particular se debe continuar o interrumpir.

En algunos ejemplos, los métodos para determinar o confirmar el tratamiento efectivo de un paciente para una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunitario comprenden obtener una parte alícuota de sangre del paciente; cuantificar el número de células Tscm presentes en la sangre del paciente; administrar un tratamiento a dicho paciente que comprende DC maduras autólogas preparadas in vitro; cuantificar el número de células T^scm presentes en la sangre del paciente; y confirmar que el número o la frecuencia de las células T^scm presentes en la sangre del paciente ha alcanzado un umbral de tratamiento, como, por ejemplo, un aumento en al menos 50%, 100%, 150% o 200% de las células T^scm presentes en el sangre del paciente, en el que el umbral de tratamiento indica que un tratamiento ha sido efectivo y puede suspenderse. Por el contrario, si el número o la frecuencia de las células T^scm en la sangre del paciente no ha alcanzado el umbral de tratamiento, se indican tratamientos adicionales, como, por ejemplo, dosis adicionales de AGS-004 y/o la necesidad de reanudar Anti- Terapia Retroviral (“ART”). También se pueden utilizar otros umbrales o medidas de tratamiento, tales como, por ejemplo, ensayos de ARN del VIH. En algunos ejemplos, el umbral de tratamiento es un aumento en las células T^scm que proliferan y/o en las células Tscm que tienen una expresión baja o nula de PD-1. De manera similar, en algunos ejemplos, un aumento en las células T y/o células Tscm que expresan PD-1 indica que una respuesta inmunitaria es defectuosa o ineficaz. Por ejemplo, en un ensayo clínico de AGS-004 en pacientes infectados con VIH, durante la fase de tratamiento de STI, se encontró un aumento en la población de células CD8+ CD38+ CD57- PD-1+ HLA-DR- después de 8 semanas de STI estar inversamente correlacionado con la duración de las STI. De esta manera, las células Tscm pueden servir como un indicador o medida de la respuesta inmunitaria de un paciente. En algunos ejemplos, el resultado deseado de un tratamiento es que se ha estimulado la respuesta inmunitaria de modo que se puede medir un aumento en las células Tscm (es decir, está por encima del nivel de detección, tales como al menos 10%, 20%, o 30% o más); En estos ejemplos, se determina que un tratamiento es efectivo si resulta en dicho aumento.

También se divulgan en el presente documento métodos para medir una respuesta inmunitaria en un paciente que tiene una enfermedad o trastorno, que comprende las etapas de: obtener una muestra de sangre del paciente para determinar la cantidad y/o frecuencia de células Tscm presentes en el mismo; administrar DC maduras autólogas preparadas in vitro a dicho paciente; obtener posteriormente una muestra de sangre del paciente para determinar la cantidad y/o frecuencia de células Tscm presentes en el mismo después del tratamiento; y comparar la cantidad y/o frecuencia de células Tscm presentes en el postratamiento de sangre del paciente con la cantidad anterior al tratamiento, en el que un aumento de células T^scm indica que se ha inducido una respuesta inmunitaria en el paciente.

En el presente documento también se describen métodos para hacer una recomendación para el tratamiento de un paciente, que comprenden las etapas de: cuantificar el número de células Tscm presentes en una muestra de sangre de un paciente para establecer una lectura de referencia; después de la administración a dicho paciente de un tratamiento que comprende DC maduras autólogas preparadas in vitro, cuantificando el número de células Tscm presentes en una muestra de sangre de dicho paciente para establecer una lectura posterior al tratamiento; comparar dicha lectura de referencia y dicha lectura posterior al tratamiento para determinar si la frecuencia o cantidad de células T^scm presentes en la muestra de sangre del paciente ha aumentado para alcanzar el umbral de tratamiento; y hacer una recomendación para continuar el tratamiento de dicho paciente si dicho umbral de tratamiento no se cumplió o se descontinuó o suspendió el tratamiento de dicho paciente si se cumplió el umbral de tratamiento.

En el presente documento también se divulgan métodos para evaluar si un tratamiento indujo una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende las etapas de: obtener una primera muestra de sangre de un paciente; marcar las células de dicha muestra para detectar la presencia de marcadores de superficie celular CD27, CD28 y CD45RA; contar el número de células en la muestra que son positivas para CD27, CD28 y CD45 RA; después de la administración a dicho paciente de un tratamiento, obtener una segunda muestra de sangre de dicho paciente; marcar las células de dicha segunda muestra para detectar la presencia de marcadores de superficie celular CD27, CD28 y CD45RA; contar el número de células en dicha segunda muestra que son positivas para CD27, CD28 y CD45 RA; y determinar si ha habido un aumento o disminución en el número o proporción de células que son positivas para CD27, CD28 y CD45RA en dicha primera y segunda muestra; en la que un aumento indica que se indujo una respuesta inmunitaria en el paciente. En algunos ejemplos de estos métodos, el tratamiento es la administración al paciente de DC maduras autólogas que se produjeron in vitro.

También se divulga en el presente documento es un método para estimular células efectoras inmunitarias, que comprende cultivar dichas células en presencia de DC PME-CD40L para producir células efectoras inmunitarias estimuladas. En otro ejemplo, la divulgación proporciona un método para mejorar la inmunidad en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dichas células efectoras inmunitarias estimuladas (células T^scm). La introducción o administración de células inmunes en un sujeto generalmente se conoce como terapia de transferencia adoptiva y está destinada a ayudar a estimular la respuesta inmunitaria del sujeto. La terapia de transferencia adoptiva es conocida en la técnica y se ha demostrado en varios estudios, tales como, por ejemplo, Cobbold et al. (2005) J. Exp. Med. 3: 379-86 y Schmitt et al. (2011) Transfusion 3: 591-99.

Las composiciones descritas en el presente documento son útiles para elevar una respuesta inmunitaria en un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz de la población enriquecida de células, por ejemplo, células T^scm. Las células pueden ser alogénicas (heterólogas) o autólogas para el sujeto. Se pueden administrar a un sujeto para aumentar o inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto en un método que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de las poblaciones enriquecidas como se describe anteriormente. Las células efectoras educadas también se pueden utilizar para mejorar la inmunidad en un sujeto al suministrar al sujeto de una cantidad efectiva de estas células. Por ejemplo, las células Tscm pueden administrarse a un paciente infectado con VIH para aumentar la respuesta inmunitaria y/o ayudar a inhibir las infecciones oportunistas, o las células T^scm se pueden administrar a un paciente con cáncer para aumentar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas. En dichos ejemplos, una cantidad efectiva de células Tscm es aquella que aumenta cualquier medida de respuesta inmunitaria en una cantidad estadísticamente significativa.

La divulgación también proporciona métodos in vitro que implican células T^scm. Por ejemplo, las células dendríticas cargadas con un antígeno se pueden utilizar para producir y expandir células Tscm in vitro. Las células Tscm educadas in vitro (por ejemplo, Mediante el cocultivo con DC que presentan antígeno) se pueden introducir en un mamífero donde son citotóxicas contra las células objetivo que portan péptidos antigénicos correspondientes a los que las células T se activan para reconocer. Estas células objetivo son normalmente células cancerosas, o células infectadas que expresan péptidos antigénicos únicos en sus superficies MHC de clase I; de este modo, por ejemplo, las células objetivo pueden ser células infectadas con VIH o pueden ser células cancerosas.

Las células T^scm producidas por los métodos de esta invención pueden administrarse directamente al sujeto (por ejemplo, un paciente humano) para producir células T activas contra un inmunógeno seleccionado. Las células se administran de cualquier manera adecuada, por ejemplo, con portadores farmacéuticamente aceptables, que son bien conocidos en la técnica. Así, por ejemplo, las células pueden proporcionarse en una composición que también comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. De esta manera, se divulga aquí un medicamento que comprende células T^SCM para uso en el tratamiento de un paciente. De manera similar, las células T^SCM divulgadas en el presente documento son adecuadas para uso en la preparación de un medicamento para tratar a un paciente, tal como un paciente con cáncer o un paciente infectado con VIH. Existen métodos adecuados para administrar células en el contexto de la presente divulgación a un sujeto, y, aunque se puede utilizar más de una ruta para administrar una composición celular particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y efectiva que otra ruta. La administración puede ser por métodos conocidos en la técnica para suministrar con éxito una célula en contacto final con las células sanguíneas o de tejido de un sujeto. Las rutas de administración preferidas incluyen, pero sin limitación, administración intradérmica e intravenosa.

Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente descripción. Normalmente, se realizan controles de calidad (microbiología, ensayos clonogénicos, pruebas de viabilidad) y las células se infunden en el paciente del que derivaron y/o se aislaron, precedidas por la administración de difenhidramina e hidrocortisona. Véase, por ejemplo, Korbling et al. (1986) Blood 67: 529-532 y Haas et al. (1990) Exp. Hematol 18: 94-98. La dosificaciones de células (por ejemplo, células T^SCM) administradas a un sujeto es en una cantidad efectiva para lograr la respuesta terapéutica beneficiosa deseada en el sujeto a lo largo del tiempo, o para inhibir el crecimiento de células cancerosas, o para inhibir la infección (es decir, un cantidad”); Sin embargo, los expertos en la materia reconocen que el paciente puede beneficiarse de un aumento en cualquier medida de la respuesta inmunitaria, incluso si no se logra una cura completa.

Solo con fines ilustrativos, se puede practicar un método de terapia de transferencia adoptiva de la divulgación obteniendo y guardando muestras de sangre del paciente antes de la infusión para su posterior análisis y comparación. Generalmente, se pueden infundir al menos aproximadamente 10⁴ a 10⁶ y normalmente entre 1 x 10⁸ y 1 x 10¹⁰ células (por ejemplo, por vía intravenosa o intraperitoneal) en un paciente de 70 kg durante aproximadamente 60-120 minutos. Los signos vitales y la saturación de oxígeno por oximetría de pulso se pueden monitorear de cerca, y se pueden obtener muestras de sangre a intervalos después de la infusión (por ejemplo, 5 minutos y 1 hora) y guardarlas para su análisis. Las reinfusiones de células se pueden repetir aproximadamente cada mes para un total de 10-12 tratamientos en un período de un año, si se considera apropiado. Después del primer tratamiento, las infusiones se pueden realizar de forma ambulatoria a discreción del médico. Si la reinfusión se administra como tratamiento ambulatorio, el participante se monitoriza durante al menos 4 horas después del tratamiento.

Para la administración, las células de la presente divulgación se pueden administrar a una tasa determinada por las dosificaciones efectiva, el LD-50 del tipo de célula (u otra medida de toxicidad) y los efectos secundarios del tipo de célula a diferentes concentraciones, como se aplica a la masa y la salud general del sujeto. La administración se puede lograr a través de dosificaciones únicas o divididas. Las células de esta divulgación pueden complementar otros tratamientos para una afección mediante terapia convencional conocida, incluidos agentes citotóxicos, análogos de nucleótidos y modificadores de la respuesta biológica. De manera similar, los modificadores de respuesta biológica se agregan opcionalmente para el tratamiento; por ejemplo, las células se administran opcionalmente con un adyuvante o citoquina como GM-CSF, IL-12 o IL-2.

El agonista de IFN-yR utilizado en el proceso PME-CD40L puede ser IFN-y o un fragmento biológicamente activo del mismo. Preferiblemente, el IFN-^y es un IFN-^y de mamífero, lo más preferiblemente un IFN-^y humano. El ADNc y la secuencia de aminoácidos del iFN-y humano se muestran en las SEQ ID NO: 5 y 6 del documento WO2007117682, respectivamente. Preferiblemente, el IFN-y tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 6, o un fragmento de la misma. En un ejemplo, el IFN-yR comprende un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 del documento WO2007117682. Preferiblemente, el agonista de IFN-yR tiene al menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 del documento WO2007117682. Los métodos para probar la actividad de los agonistas de IFN-^yR son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Magro et al. (2004) Br. J. PharmacoL 142: 1281-92). Las DC inmaduras se pueden señalizar al agregar un agonista de IFN-yR al medio de cultivo, o al expresar el agonista de IFN-yR en la célula dendrítica. En algunos ejemplos, la DC se transfecta con un ARNm que codifica un agonista de IFN-^yR, tal como la SEQ ID NO: 6 del documento WO2007117682, o un fragmento biológicamente activo del mismo. La señalización se produciría luego de la traducción del ARNm dentro de la célula dendrítica. Lo más preferiblemente, el agonista de IFN-yR se agrega al medio de cultivo que contiene DC inmaduras. En un ejemplo preferido, el medio de cultivo adicionalmente comprende PGE² y/o GM-CSF más IL-4 o IL-13.

La segunda señal utilizada para producir DC PME-CD40L es una señal transitoria con un agonista de CD40. La señal puede considerarse transitoria si las DC están cargadas con un ARNm que codifica un agonista de CD40, o si el medio que contiene un agonista de CD40 se elimina de las DC. Por lo tanto, la expresión persistente de un polipéptido agonista de CD40, tal como la expresión constitutiva de CD40L a partir de un vector lentiviral, no se considera expresión transitoria. La señal del agonista de CD40 también puede considerarse transitoria si las DC están cargadas/transfectadas con ARN o con un vector de expresión que codifica un agonista de CD40, siempre que: 1) el promotor que impulsa la expresión del agonista de CD40 no sea constitutivo en las DC, o 2) el vector de expresión no se integra en el genoma de DC ni se replica en DC.

En algunos métodos, el agonista de CD40 es un polipéptido CD40L o un anticuerpo agonista de CD40. En general, los ligandos que se unen a CD40 pueden actuar como un agonista de CD40, por ejemplo, un agonista de CD40 puede ser un aptámero que se une a CD40. Preferiblemente, el agonista de CD40 se administra como ARNm que codifica CD40L. La administración de la segunda señal que comprende CD40L a las células por transfección de DC inmaduras o maduras con ARNm de CD40L produce las DC PME-CD40L modificadas que inducen respuestas inmunoestimuladoras en lugar de inmunosupresoras.

En algunos métodos utilizados para producir DC PME-CD40L, las células dendríticas transfectadas con ARNm de CD40L se cultivan en medio que contiene IFN-y (y opcionalmente PGE2) inmediatamente después de la transfección y, por lo tanto, antes de la traducción del ARNm de C^d40L para producir una eficaz cantidad de una señal CD40L. En esta situación, aunque se agrega IFN-y después de la transfección con ARNm de CD40L, las células dendríticas reciben la señal de IFN-^y antes de la señal que resulta de la traducción del ARNm de CD40L. Por lo tanto, el orden en que los agentes se entregan a las células es importante solo porque la señalización de CD40L debe ocurrir después de la señalización de IFN-^y. En estos métodos, la señalización de las DC puede ocurrir in vivo o ex vivo, o alternativamente, uno o más etapas de señalización pueden ocurrir ex vivo y las etapas restantes del método pueden ocurrir in vivo. Como se utiliza en el presente documento, el “Ligando CD40” (CD40L) abarca cualquier polipéptido o proteína que reconoce y activa específicamente el receptor CD40 y activa su actividad biológica. El término incluye formas transmembrana y soluble de CD40L. En ejemplos preferidos, el agonista de CD40 es un CD40L de mamífero, preferiblemente un CD40L humano. Un ADNc de CD40L humano y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2 del documento WO2007117682, respectivamente.

En algunos métodos utilizados para preparar DC PME-CD40L, el método comprende las etapas secuenciales de: (a) señalizar células dendríticas inmaduras (iDC) aisladas con una primera señal que comprende un agonista del receptor de interferón gamma (IFN-^yR) y un Agonista de TNF-aR, para producir células dendríticas señalizadas con agonista de IFN-yR; y (b) señalizar dichas células dendríticas señalizadas con agonista de IFN-^yR con una segunda señal transitoria que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido CD40L para producir células dendríticas maduras CD83+ CCR7+, en las que el polipéptido CD40L consiste esencialmente en residuos de aminoácidos 21-261 de la SEQ ID NO: 2 del documento WO2007117682 o un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con los restos de aminoácidos 21-261 de la SEQ ID NO: 2 del documento WO2007117682.

En algunos métodos utilizados para preparar DC PME-CD40L, el método comprende las etapas secuenciales de: (a) cultivar células dendríticas inmaduras (iDC) aisladas con un agonista del receptor de interferón gamma (IFN-^yR) en presencia de un TNF - agonista aR y PGE2 durante aproximadamente 12 a 30 horas para producir células dendríticas maduras CD83+; y (b) aproximadamente 12 a 30 horas después de iniciar la etapa (a), transfectar dichas células dendríticas maduras CD83+ (mDC) con ARNm que codifica un polipéptido CD40L que consiste en los residuos de aminoácidos 21-261 de la SEQ ID NO: 2 del documento WO2007117682 y un ARNm que codifica uno o más antígenos para producir células dendríticas maduras CD83+ CCR7+.

El ligando CD40 se clonó en 1993 y fue informado por Gauchat et al. (1993) FEBS Lett. 315: 259. Se han descrito formas solubles más cortas de la forma de 39 kDa de longitud completa asociada a células del ligando CD40 con pesos moleculares de 33 kDa y 18 kDa (Graf et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 1749; Ludewig et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26: 3137; Wykes et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 548). La forma soluble de 18 kDa generada a través de la división proteolítica intracelular carece de la cola citoplasmática, la región transmembrana y partes del dominio extracelular, pero conserva el dominio de unión a CD40 y conserva la capacidad de unirse al receptor CD40; por lo tanto, es un ejemplo de un agente de señalización del receptor CD40. Ver Graf et al. (1995) supra. Las patentes de los Estados Unidos números 5,981,724 y 5,962,406 también describen secuencias de ADN que codifican ligando CD40 humano (CD40L), incluidas formas solubles de CD40L.

El marco de lectura abierto para CD40L está representado por los nucleótidos 40 a 822 de la SEQ ID NO.1 del documento WO2007117682, mientras que el codón de parada TGA está en la posición 823 a 825. En cualquiera de las secuencias de polinucleótidos CD40L utilizadas para producir DC PME-CD40L, se puede utilizar una secuencia que contiene una mutación silenciosa; por ejemplo, una variante debida a la degeneración de codones del codón 102 en la secuencia CD40L (nucleótidos 343 a 345 de la SEQ ID NO: 1 del documento WO2007117682) cambia el codón “AAA” a un codón “AAG”, ambos códigos para Lys. También son útiles en los métodos para producir DC maduras los CD40L truncados (residuos 47 a 261 de la SeQ ID NO: 2 del documento WO2007117682, codificados por los residuos de nucleótidos 178 a 825 de la SEQ ID NO: 1 del documento WO2007117682) y fragmentos CD40L codificados por los nucleótidos 43 a 825 de dicho SEQ ID NO: 1, 181 a 825 de dicho SEQ ID NO: 1, 193 a 825 de dicho SEQ ID NO: 1, 376 a 825 de dicho SEQ ID NO: 1, 379 a 825 de dicho SEQ ID NO: 1 y 400 a 825 de dicha SEQ ID NO: 1 de WO2007117682. En algunos métodos de maduración, el polipéptido CD40L es un polipéptido que comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 del documento WO2007117682. Sin embargo, cualquier fragmento de polipéptido del CD40L de longitud completa (o ADN o ARN que lo codifica) se puede utilizar en los métodos si el polipéptido actúa como un ligando CD40 al unirse específicamente a CD40 y producir actividad biológica.

En algunos métodos de maduración de DC, el polipéptido CD40L está codificado por un ARNm que comprende un polinucleótido que codifica CD40L y que además comprende una secuencia 3' no traducida conocida en la técnica, tal como el receptor CD40 UTR 3', la región no traducida del exón final de la beta-actina UTR 3' humana, el elemento funcional mínimo de la beta-actina UTR 3' humana y el gen del rotavirus simio 6 UTR 3'. El ARNm también puede, o alternativamente, comprender una secuencia 5' no traducida conocida en la técnica, tal como e1Hsp70 UTR 5' humano, el VEGF UTR 5' de ratón, el elemento funcional mínimo del VEGF UTR 5' de ratón, el virus de necrosis del bazo Región LTR RU5, y la secuencia líder 5' del virus de ataque químico del tabaco. Preferiblemente, estos ARN están cubiertos y poliadenilados.

El receptor CD40 también se puede activar mediante el uso de anticuerpos agonistas de CD40, fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes de los mismos, que son conocidos en la técnica. Los anticuerpos agonistas de CD40 pueden adquirirse de proveedores comerciales como Mabtech (Nacka, Suecia). La literatura también proporciona ejemplos de anticuerpos agonistas de CD40 y fragmentos de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Osada et al. (2002) 25(2): 176 and Ledbetter et al. (1997) Crit. Reviews in Immunol. 17: 427. El CD40L modificado también se puede utilizar en métodos de maduración de células dendríticas; por ejemplo, CD40L incluye polipéptidos que han sido alterados por adición, sustracción o sustitución, de forma conservadora o no conservativa, de cualquier número de aminoácidos, siempre que la proteína resultante se una a CD40 en la superficie de las DC.

Las etapas de los métodos descritos en el presente documento se pueden practicar in vivo o ex vivo, según sea apropiado. Cuando se practica ex vivo, el método se puede practicar en un sistema abierto o cerrado. Los métodos y sistemas para cultivar y enriquecer poblaciones de células son conocidos en la técnica. Véanse los ejemplos 1 y 2 de la publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0072347; véase también la Publicación de Patente de Estados Unidos No. 2003/0235908, que describe sistemas cerrados para la expansión celular.

Los métodos de preparación de DC maduras pueden modificarse adicionalmente poniendo en contacto la célula con una cantidad eficaz de una citoquina o molécula coestimuladora, por ejemplo, GM-CSF, IL-4 y PGE2. En los ejemplos en los que las DC inmaduras se señalan con un agonista de TNFaR seguido de señalización con el agonista de CD40, las cantidades efectivas de IL-1p y/o IL-6 se excluyen específicamente del cultivo.

El método utilizado para producir DC PME-CD40L también puede incluir el suministro a las DC inmaduras o maduras de una cantidad efectiva de un antígeno que luego serán procesadas y presentadas por las DC maduras. Los antígenos pueden ser de origen natural o de forma recombinante. Los antígenos se pueden suministrar a las células como polipéptidos o proteínas o como ácidos nucleicos que los codifican utilizando métodos conocidos en la técnica. En algunos métodos, uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antígenos se introducen en los iDC, DC señalizadas o DC maduras CCR7+ mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, como la electroporación. Más preferiblemente, el polinucleótido es un ARNm. En ejemplos preferidos, el antígeno o el ARNm que codifica el antígeno se introduce junto con un ARNm que codifica un agonista de CD40 o sustancialmente concurrente con la señalización de agonista de CD40.

En los métodos en los que el antígeno se administra como un polinucleótido o gen que codifica el antígeno, la expresión del gen da como resultado la producción de antígeno en el individuo que se está tratando (cuando se suministra in vivo) o en el sistema de cultivo celular (cuando se administra in vitro); las técnicas para hacerlo son conocidas en el arte. Preferiblemente, un ARNm que codifica el antígeno se introduce en la DC, y se puede cotransfectar con un ARNm que codifica un polipéptido CD40L.

Aquellos expertos en la técnica conocen métodos para cargar células dendríticas con antígenos. En un ejemplo, las células dendríticas se cultivan en medio que contiene el antígeno. Las DC luego toman y procesan el antígeno sobre la superficie celular en asociación con las moléculas de MHC. Preferiblemente, las DC se cargan con antígeno mediante transfección con un ácido nucleico que codifica el antígeno, por ejemplo, un ARNm. Los expertos en la materia conocen métodos para transfectar DC.

Un antígeno puede ser un único antígeno conocido o puede ser una colección de antígenos. Una colección de antígenos puede provenir de una fuente particular, como por ejemplo células cancerosas de un paciente o células infectadas por VIH, o puede provenir de varias fuentes, como por ejemplo células infectadas por VIH de varios pacientes diferentes. Los antígenos para utilizar en métodos de producción de DC PME-CD40L incluyen, pero no se limitan a, antígenos de: patógenos, lisados patógenos, extractos de patógenos, polipéptidos patógenos, partículas virales, bacterias, proteínas, polipéptidos, células cancerosas, lisados de células cancerosas, extractos celulares de cáncer y polipéptidos específicos de células cancerosas. Por ejemplo, los antígenos que se pueden utilizar para producir DC PME-CD40L incluyen antígenos bien conocidos como MART-1; Las DC PME-CD40L resultantes que presentan MART-1 se pueden utilizar para expandir las poblaciones de CTL T^scm reactivas a MART-1 (véase, por ejemplo, los datos mostrados en la Figura 1 y discutidos en el Ejemplo 2).

Por lo tanto, los métodos descritos en el presente documento comprenden adicionalmente introducir en los iDC, DC señalizadas o DC maduras CCR7+ uno o más antígenos o uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antígenos para producir un DC madura CCR7+ cargado de antígeno. El antígeno o el polinucleótido que codifica el antígeno (por ejemplo, ARNm) se puede introducir: antes de dicha primera señal; posterior a dicha primera señal y antes de dicha segunda señal; o posterior a dicha segunda señal o sustancialmente concurrente con dicha segunda señal, o durante más de uno de estos intervalos. El ARNm que codifica uno o más antígenos se puede transfectar en células al mismo tiempo que otro ARNm, tal como ARNm que codifica CD40L, o en un momento diferente.

El antígeno se puede suministrar en su forma “natural” ya que ninguna intervención humana estuvo involucrada en la preparación del antígeno o en inducirlo a entrar en el ambiente en el que se encuentra con la DC. Alternativa o adicionalmente, el antígeno puede comprender una preparación cruda, por ejemplo del tipo que se administra comúnmente en una inyección de alergia convencional o el antígeno puede comprender un lisado tumoral. El antígeno puede estar alternativamente sustancialmente purificado, por ejemplo, al menos aproximadamente 90% purificado o aislado.

Un antígeno que es un péptido se puede generar, por ejemplo, por división proteolítica de proteínas aisladas utilizando métodos conocidos en la técnica, o se puede sintetizar químicamente, por ejemplo, en un sintetizador automatizado disponible comercialmente. Además, se pueden emplear técnicas recombinantes para crear un ácido nucleico que codifique el péptido de interés, y para expresar ese péptido bajo las condiciones deseadas.

El antígeno puede tener alternativamente una estructura que es distinta de cualquier compuesto de origen natural. En ciertos ejemplos de la divulgación, el antígeno es un “antígeno modificado” que tiene una estructura que es sustancialmente idéntica a la de un antígeno de origen natural pero que incluye una o más desviaciones de la estructura exacta del compuesto natural. Por ejemplo, cuando el antígeno de origen natural es una proteína o un antígeno polipeptídico, un antígeno modificado en comparación con esa proteína o antígeno polipeptídico puede tener una secuencia de aminoácidos que difiere de la del antígeno de origen natural en la adición, sustitución o supresión de uno o más aminoácidos, y/o podría incluir uno o más aminoácidos que difieren del aminoácido correspondiente en el antígeno de origen natural por la adición, sustitución o supresión de uno o más restos químicos unidos covalentemente al amino ácido. En algunos casos, los antígenos de origen natural y modificados comparten al menos una región de al menos 5 aminoácidos que son al menos aproximadamente 75% idénticos. Los antígenos también pueden modificarse al ligar una porción de secuencia de un primer polipéptido (por ejemplo, un primer antígeno) a una porción de secuencia de un segundo polipéptidos (por ejemplo, un segundo antígeno, una secuencia señal, un dominio transmembrana, una fracción de purificación, etc.) por medio de un enlace peptídico. Los expertos en la materia apreciarán la diversidad de dichas proteínas de fusión para su uso de acuerdo con la presente descripción.

La cantidad de antígeno a emplear en cualquier composición o aplicación particular dependerá de la naturaleza del antígeno particular y de la aplicación para la que se esté utilizando, como apreciarán fácilmente aquellos expertos en la técnica, y un experto en la técnica puede ajustarlo para proporcionar la cantidad de expresión necesaria.

Cuando el antígeno es un fragmento, se puede generar, por ejemplo, por división proteolítica de proteínas aisladas. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de agentes de división que incluyen, pero no se limitan a, pepsina, bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, etc. Alternativamente, los péptidos se pueden sintetizar químicamente, preferiblemente en un sintetizador automático tal como está disponible en la técnica (véase, por ejemplo, Stewart et al., (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed., Pierce Chemical Co.). También, se pueden emplear técnicas recombinantes para crear un ácido nucleico que codifique el péptido de interés y para expresar ese péptido en las condiciones deseadas (por ejemplo, en una célula anfitriona o en un sistema de expresión in vitro del que se pueda purificar fácilmente).

En realizaciones preferidas, el antígeno es de una célula cancerosa o un patógeno. La célula cancerosa puede ser cualquier tipo de célula cancerosa, que incluye una célula cancerosa renal (por ejemplo, de carcinoma de células renales), una célula de mieloma múltiple o una célula de melanoma. Los patógenos preferidos incluyen VIH y VHC. En realizaciones preferidas, el antígeno se administra a las DC en forma de ARN aislado o derivado de una célula cancerosa o un patógeno o una célula infectada con el patógeno (por ejemplo, una célula infectada con VIH). Los métodos para RT-PCR de ARN extraído de cualquier célula (por ejemplo, una célula cancerosa o una célula patógena), y la transcripción in vitro se describen en WO2006031870 (Nicolette et al.) y Pub. US 20070248578 (Tcherepanova et al.).

Cuando tanto la citoquina como el antígeno se deben suministrar a un individuo, se pueden proporcionar juntos o por separado. Cuando se administran como polipéptidos o proteínas, se pueden administrar en un dispositivo de encapsulación común o mediante asociación física (por ejemplo, mediante enlace covalente). De manera similar, los compuestos pueden proporcionarse juntos cuando se proporcionan polinucleótidos que codifican ambos; por ejemplo, se pueden proporcionar genes para ambos como parte de la misma molécula de ácido nucleico. En algunos ejemplos, esta molécula de ácido nucleico se puede preparar de modo que ambos factores se expresen a partir de un único polinucleótido contiguo, por ejemplo, como una proteína de fusión en la que la citoquina y el antígeno están ligados covalentemente entre sí a través de un enlace peptídico. Alternativa o adicionalmente, los genes pueden estar vinculados a las mismas secuencias de control o equivalentes, de modo que ambos genes se expresen dentro del individuo en respuesta a los mismos estímulos. En la técnica se conoce una amplia variedad de diferentes secuencias de control activas en diferentes células anfitrionas bajo diferentes condiciones. Se pueden utilizar estas secuencias de control, incluidas las secuencias de control constitutivas, las secuencias de control inducibles y las secuencias de control reprimibles, aunque las secuencias inducibles o reprimibles a menudo se prefieren para aplicaciones en las que se desea un control adicional sobre el momento de la expresión génica.

Los expertos en la materia aprecian que la administración de citoquina y/o antígeno puede combinarse opcionalmente con la administración de cualquier otro factor modulador deseado del sistema inmunitario tal como, por ejemplo, un adyuvante u otro compuesto inmunomodulador. En algunos ejemplos, las células T^scm de la descripción se administran a un paciente en terapia de transferencia adoptiva autóloga o alogénica que también está siendo tratada con una terapia anti-PD-1, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1. Los anticuerpos anti-PD-1 y el uso de los mismos son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Hamid et al. (2013) New England J. Med. 369: 2. Por lo tanto, se proporcionan métodos para tratar a un paciente que comprenden las etapas de administrar células T^scm y administrar un anticuerpo anti-PD-1.

Las células dendríticas pueden transfectarse con ácidos nucleicos (que incluye antígenos que codifican ARN) por métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, precipitación con fosfato de calcio, microinyección o electroporación. Los ácidos nucleicos se pueden agregar solos o en combinación con un vehículo adecuado, por ejemplo, un portador farmacéuticamente aceptable tal como solución salina tamponada con fosfato. Alternativa o adicionalmente, el ácido nucleico se puede incorporar en un vector de expresión o inserción para su incorporación en las células. Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonación en el que un polinucleótido se puede ligar operativamente son conocidos en la técnica. Dichos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y están disponibles comercialmente de fuentes como Stratagene (La Jolla, CA) y Promega Biotech (Madison, WI). Con el fin de optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro, puede ser necesario eliminar, agregar o alterar porciones no traducidas 5' y/o 3' para eliminar codones de iniciación de traducción alternativos adicionales, potencialmente inapropiados u otras secuencias que puedan interferir o reducir la expresión, ya sea a nivel de transcripción o traducción. Alternativamente, los sitios de unión de ribosomas de consenso se pueden insertar inmediatamente 5' del codón de inicio para mejorar la expresión. Ejemplos de vectores son virus, tales como baculovirus y retrovirus, bacteriófagos, adenovirus, virus adenoasociados, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos y otros vehículos normalmente utilizados en la técnica que se han descrito para la expresión en una variedad de anfitriones eucariotas y procariotas, y se puede utilizar para terapia génica, así como para la expresión simple de proteínas. Se puede utilizar cualquier vector o método de suministro adecuado y un experto en la técnica puede seleccionarlo fácilmente.

Los polinucleótidos se insertan en vectores utilizando métodos y reactivos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, enzimas de restricción, ligadores de ácido nucleico sintético y oligonucleótidos; se pueden incluir otras secuencias funcionales en el vector y/o asociarse con el polinucleótidos según sea necesario, incluyendo, por ejemplo, genes marcadores seleccionables, secuencias potenciadoras, secuencias promotoras, codones de inicio y parada, señales de terminación de la transcripción, señales de procesamiento de ARN, orígenes de replicación, múltiples sitios de clonación y promotores de ARN T7 y SP6 para la transcripción in vitro de ARN sentido y antisentido. Se conocen y están disponibles otros medios y secuencias funcionales en la técnica y también se pueden utilizar.

En algunos métodos de maduración de DC PME-CD40L, CD40L se suministra a la célula como ARNm. El ARN puede obtener al insertar primero un polinucleótido de ADN en una célula anfitriona adecuada o mediante transcripción in vitro. Si se utiliza una célula anfitriona, el ADN se puede insertar en la célula mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, mediante el uso de un vehículo de suministro de genes apropiado (por ejemplo, liposoma, plásmido o vector) o mediante electroporación. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN; el ARN se puede aislar luego utilizando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se establece en Sambrook, ed. ((2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Por ejemplo, el ARNm se puede aislar utilizando varias enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con Sambrook (2001), supra, o extraído por resinas de unión a ácidos nucleicos u otros productos disponibles en el mercado siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

En los métodos preferidos de maduración de DC, el casete de expresión CD40L contiene un promotor adecuado para la transcripción in vitro, tal como el promotor T7 o el promotor SP6. Preferiblemente, el agonista de ARNm de CD40L o CD40 transcrito in vitro está optimizado para la estabilidad y la eficacia de la traducción, tal como, por ejemplo, como se demuestra mediante la SEQ iD NO: 13 del documento WO2007117682, que representa un ARNm de c D40L optimizado en el que los codones ATG en el 5' La región no traducida se ha modificado para evitar el inicio incorrecto de la traducción.

La estabilidad del ARNm y/o la eficiencia traduccional también se pueden aumentar incluyendo UTR 3' y/o UTR 5' en el ARNm. Los ejemplos preferidos de UTR 3' incluyen los del gen CD40 humano, beta-actina y rotavirus 6. Los ejemplos preferidos de UTR 5' incluyen los de CD40L y los potenciadores traduccionales en los UTR 5' de Hsp70, VEGF, virus de necrosis del bazo RU5 y virus de grabado de tabaco. Por ejemplo, la expresión de CD40L normalmente está regulada en parte por la inestabilidad del ARNm UTR 3' mediada, y por lo tanto, una gran parte del CD40L UTR 3' no está incluida en el ARNm CD40L actual. CD40L normalmente no se expresa en DC, pero el receptor CD40 se expresa en DC y su expresión no parece estar regulada después de la transcripción, particularmente al nivel de estabilidad del ARNm, por lo que incluye el receptor CD40 UTR 3' o un fragmento activo del mismo en el extremo 3' o región del ARNm de CD40L se obtendría la secuencia no traducida de ARN 3' similar a los mensajes de CD40 que ocurren naturalmente sin impartir ninguna actividad reguladora no deseada. Los beneficios y desventajas de otros UTR de 5' y 3' también se conocen en la técnica, y un experto en la misma puede seleccionar los UTR apropiados para su uso en un tipo o situación celular particular.

Se necesitan polipéptidos y proteínas para realizar métodos de maduración de DC; muchos están disponibles comercialmente, y otros se pueden obtener mediante síntesis química utilizando un sintetizador de péptidos automatizado disponible comercialmente, como los fabricados por Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., Modelo 430A o 431A, Foster City, CA, EE. UU. La proteína o polipéptido sintetizado puede precipitarse y purificarse adicionalmente, por ejemplo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Alternativamente, las proteínas y polipéptidos se pueden obtener por cualquier método conocido, que incluye cualquier método recombinante.

Es bien sabido por aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer modificaciones a cualquier péptido para proporcionarle propiedades alteradas. Los péptidos que se pueden utilizar en los métodos de la divulgación incluyen péptidos que comprenden aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen aminoácidos D y L, análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.

Algunos métodos requieren el uso de anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Pueden ser derivados de anticuerpos o variantes de anticuerpos, tales como, por ejemplo, anticuerpos lineales. Pueden ser quiméricos, humanizados o totalmente humanos. El uso de una proteína o un polipéptido experto en la técnica puede generar adicionalmente anticuerpos que se unen específicamente al receptor. También se puede utilizar un fragmento funcional o derivado de un anticuerpo que incluye Fab, Fab', Fab2, Fab'2 y regiones variables de cadena única. Los anticuerpos se pueden producir en cultivos celulares, en fagos o en varios animales, que incluyen, pero no se limitan a, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsters, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios, etc. Siempre que el fragmento o derivado conserve la especificidad de unión para la proteína o fragmento de la misma, se puede utilizar. Los anticuerpos pueden analizarse para determinar la especificidad de la unión comparando la unión al antígeno apropiado con la unión al antígeno irrelevante o la mezcla de antígeno en un conjunto dado de condiciones. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferiblemente 10 veces más que al antígeno irrelevante o la mezcla de antígeno, entonces se considera que es específico. En la técnica se conocen técnicas para fabricar dichos anticuerpos de forma parcial a totalmente humana, y se pueden utilizar dichas técnicas.

Se conocen varios métodos para cuantificar la expresión de un gen de interés (por ejemplo, CD40L y/o IL-12p35) e incluyen, entre otros, ensayos de hibridación (análisis de transferencia Northern) y ensayos de hibridación basados en PCR. Al ensayar una alteración en el nivel de ARNm tal como ARNm de IL-12 p35 o ARNm de CD40L, el ácido nucleico contenido en una muestra se puede extraer primero utilizando métodos conocidos en la técnica; Kits comerciales están disponibles. El ARNm contenido en la muestra de ácido nucleico extraído se puede detectar por hibridación (por ejemplo, análisis de transferencia Northern) y/o procedimientos de amplificación utilizando sondas y/o cebadores de ácido nucleico, respectivamente, de acuerdo con los procedimientos estándar conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico que tienen al menos 10 nucleótidos y que exhiben complementariedad de secuencia u homología con el ácido nucleico a detectar se pueden utilizar como sondas de hibridación o cebadores en métodos de diagnóstico. En la técnica se sabe que no se necesita una sonda “perfectamente adaptada” para una hibridación específica. Los cambios menores en la secuencia de la sonda logrados por sustitución, supresión o inserción de un pequeño número de bases no afectan la especificidad de hibridación. En general, se puede tolerar hasta un 20% de mal emparejamiento de pares de bases (cuando está alineado de manera óptima). Por ejemplo, una sonda útil para detectar ARNm de CD40L es al menos aproximadamente un 80% idéntica a la región homóloga de tamaño comparable contenida en una secuencia previamente identificada, por ejemplo, véase la SEQ ID NOS: 1 o 3 del documento WO2007117682. Alternativamente, la sonda es al menos 85% o incluso al menos 90% idéntica a la secuencia génica correspondiente después del alineamiento de la región homóloga. El tamaño total del fragmento, así como el tamaño de los tramos complementarios, dependerán del uso o aplicación prevista del segmento particular de ácido nucleico. Los fragmentos más pequeños del gen generalmente encontrarán uso en ejemplos de hibridación, en los que la longitud de la región complementaria puede variar, tal como entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 nucleótidos, o incluso la longitud completa de acuerdo con las secuencias complementarias de interés para la detección.

Las sondas de nucleótidos que tienen secuencias complementarias a una secuencia objetivo de un nucleótido en tramos mayores de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud aumentarán la estabilidad y selectividad del híbrido entre la sonda y el nucleótido objetivo, mejorando así la especificidad de las moléculas híbridas particulares obtenidas. Un experto en la materia puede diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan tramos complementarios de más de aproximadamente 25 y aún más preferiblemente de más de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o incluso más, donde se desee. Dichos fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, mediante la aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, como la tecnología PCRTM con dos oligonucleótidos de cebado (por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,603,102) o mediante la introducción de secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante.

En ciertos ejemplos, será ventajoso emplear secuencias de ácido nucleico de la presente descripción en combinación con un medio apropiado, tal como un marcador, para detectar la hibridación y, por lo tanto, secuencias complementarias. Se conoce una amplia variedad de medios indicadores apropiados en la técnica, que incluyen ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros, tales como avidina/biotina, que son capaces de dar una señal detectable. También se puede utilizar una etiqueta fluorescente o una etiqueta enzimática, tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa. En el caso de las etiquetas enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos en la técnica que se pueden emplear para proporcionar un medio visible al ojo humano o espectrofotométricamente, para identificar la hibridación específica con muestras que contienen ácido nucleico complementario.

Como se sabe en la técnica, las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de diferente “rigurosidad”. Las condiciones relevantes incluyen temperatura, fuerza iónica, tiempo de incubación, la presencia de solutos adicionales en la mezcla de reacción, tal como formamida, y el procedimiento de lavado. Las condiciones de mayor rigurosidad son aquellas condiciones tales como una temperatura más alta y una concentración de iones de sodio más baja, que requieren una complementariedad mínima más alta entre los elementos de hibridación para que se forme un complejo de hibridación estable. Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas en la técnica. Un experto en la materia también puede utilizar, detectar y cuantificar la cantidad o nivel de expresión de ARNm utilizando PCR cuantitativa o análisis de alto rendimiento, tales como el análisis en serie de la expresión génica (SAGE) como se describe en Velculescu et al. (1995) Science 270: 484-487. También se conocen otras técnicas en el arte.

Los procedimientos generales para la PCR son conocidos en la técnica y se enseñan en MacPherson et al. ((2006) PCR: The Basics, Second Edition (Taylor & Francis Group, New York, N^y )). Sin embargo, las condiciones de PCR utilizadas para cada reacción de aplicación se determinan empíricamente. Varios parámetros influyen en el éxito de una reacción, incluidos el tiempo y la temperatura de hibridación, el tiempo de extensión, la concentración de Mg2+ ATP, el pH y la concentración relativa de cebadores, plantillas y desoxirribonucleótidos; El ajuste de estos parámetros para lograr el resultado deseado es conocido por aquellos expertos en la técnica.

Después de la amplificación, los fragmentos de ADN resultantes se pueden detectar mediante electroforesis en gel de agarosa seguido de visualización con tinción con bromuro de etidio e iluminación ultravioleta. Se puede verificar una amplificación específica de genes de interés expresados diferencialmente demostrando que el fragmento de ADN amplificado tiene el tamaño predicho, exhibe el patrón de digestión de restricción predicado y/o se hibrida con la secuencia de ADN clonada correcta. Los expertos en la materia conocen otros métodos para detectar la expresión génica. Véase, por ejemplo, la Solicitud PCT Internacional No. WO 97/10365, Patentes de Estados Unidos Nos. Nos.

5,405,783, 5,412,087 y 5,445,934, 5,405,783; 5,412,087; 5,445,934; 5,578,832; y 5,631,734.

Una variedad de técnicas están disponibles en el arte para el análisis de proteínas e incluyen, pero no se limitan a radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunoradiométricos ligados a enzimas), inmunoensayos “intercalados”, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos in situ (utilizando, por ejemplo, oro coloidal, etiquetas de enzimas o radioisótopos), análisis de transferencia Western, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos inmunofluorescentes y PAGE-SDS.

Adecuadamente, una cantidad efectiva de una citoquina y/o molécula coestimuladora se administra a las células o al paciente, in vitro o in vivo. Estos agentes pueden administrarse como polipéptidos, proteínas o, alternativamente, como los polinucleótidos o genes que los codifican. Las citoquinas, las moléculas coestimuladoras y las quimiocinas pueden proporcionarse como preparaciones impuras (por ejemplo, aislados de células que expresan un gen de citoquina, ya sea endógeno o exógeno a la célula) o en forma “purificada”. Las preparaciones purificadas son preferiblemente al menos aproximadamente 90% puras, o alternativamente, al menos aproximadamente 95% puras, o aún más, al menos aproximadamente 99% puras. Alternativamente, se pueden proporcionar genes que codifican las citoquinas o agentes inductores, de modo que la expresión génica dé como resultado la producción de citoquinas o agentes inductores, ya sea en el individuo que está siendo tratado o en otro sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de transcripción/traducción in vitro o una célula anfitriona) a partir de la cual se puede obtener citoquina o agente inductor expresado para la administración al individuo.

La inmunogenicidad de las células T producidas por los métodos descritos en el presente documento puede determinarse mediante metodologías bien conocidas, que incluyen pero no se limitan a lo siguiente:

Ensayo de lisis de liberación de 51Cr. Se puede comparar la lisis de objetivos marcados con 51Cr impulsada por péptido por células T específicas de antígeno. Las composiciones “más activas” mostrarán una mayor lisis de los objetivos en función del tiempo. La cinética de la lisis, así como la lisis objetivo global en un punto de tiempo fijo (por ejemplo, 4 horas) se puede utilizar para evaluar el rendimiento, por ejemplo, como se discute en Ware et al. (1983) J. Immunol.

131: 1312.

Ensayo de liberación de citoquinas. El análisis de los tipos y cantidades de citoquinas secretadas por las células T al ponerse en contacto con APC modificadas puede ser una medida de la actividad funcional. Las citoquinas pueden medirse mediante ensayos ELISA o ELISPOT para determinar la velocidad y la cantidad total de producción de citoquinas, por ejemplo, como se discute en Fujihashi et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:181; Tanquay and Killion (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13: 259.

Educación in vitro de células T. Las células T se pueden probar para determinar la actividad lítica, la liberación de citoquinas, la policlonalidad y la reactividad cruzada con el epítopo antigénico, por ejemplo, como se discutió en Parkhurst et al. (1996) Immunol. 157: 2539.

Modelos animales transgénicos. La inmunogenicidad se puede evaluar in vivo vacunando ratones transgénicos HLA con las composiciones de la divulgación y determinando la naturaleza y magnitud de la respuesta inmunitaria inducida. Alternativamente, el modelo de ratón hu-PBL-SCID permite la reconstitución de un sistema inmunitario humano en un ratón mediante transferencia adoptiva de PBL humano. Estos animales pueden vacunarse con las composiciones y analizarse para la respuesta inmunitaria como se mencionó previamente en Shirai et al. (1995) J. Immunol. 154:2733; Mosier et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2443.

Ensayos de proliferación. Las células T proliferarán en respuesta a las composiciones reactivas. La proliferación se puede controlar cuantitativamente midiendo, por ejemplo, la absorción de 3H-timidina, por ejemplo, como se discute en Caruso et al. (1997) Citometry 27:71.

Modelos de primates. Se puede utilizar un sistema modelo de primates no humanos (chimpancés) para monitorizar las inmunogenicidades in vivo de ligandos restringidos por HLA. Se ha demostrado que los chimpancés comparten especificidades de ligando MHC superpuestas con moléculas de MHC humano, lo que permite probar ligandos restringidos por HLA para determinar la inmunogenicidad in vivo relativa, por ejemplo, como se discutió en Bertoni et al. (1998) Immunol. 161: 4447.

Monitoreo de eventos de transducción de señales TCR. Varios eventos de transducción de señales intracelulares (por ejemplo, Fosforilación) están asociados con la participación exitosa de TCR por parte de los complejos MHC-ligando. El análisis cualitativo y cuantitativo de estos eventos se ha correlacionado con las capacidades relativas de las composiciones para activar las células efectoras a través de la participación de TCR, por ejemplo, como se discutió en Salazar et al. (2000) Tnt. J. Cancer 85: 829; Isakov et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 375).

Como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones, la forma singular “un”, “una” y “el” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “una célula” incluye una pluralidad de células, incluidas sus mezclas.

Como se utiliza en el presente documento, el término “que comprende” pretende significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros. “que consiste esencialmente en” cuando se utiliza para definir composiciones y métodos, significará excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente en los elementos como se define en el presente documento no excluiría trazas de contaminantes del método de aislamiento y purificación y Los portadores farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes y similares. Los polipéptidos o proteínas que “consisten esencialmente en 'una secuencia de aminoácidos dada se definen aquí para que no contengan más de tres, preferiblemente no más de dos, y lo más preferiblemente no más de un aminoácido adicional en el extremo amino y/o carboxi de la proteína o polipéptido. Los ácidos nucleicos o polinucleótidos que “consisten esencialmente en” una secuencia de ácido nucleico dada se definen en el presente documento para contener no más de diez, preferiblemente no más de seis, más preferiblemente no más de tres, y lo más preferiblemente no más de un nucleótido adicional en los terminales 5' o 3' de la secuencia de ácido nucleico. “Que consiste en” significará excluir más que elementos traza de otros ingredientes y pasos sustanciales del método para administrar las composiciones de esta divulgación. Los ejemplos definidos por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de Esta divulgación.

Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, que incluyen rangos, son aproximaciones que varían (+) o (-) en incrementos de 0.1. Se debe entender, aunque no siempre se indica explícitamente, que los reactivos descritos en este documento son solo de ejemplo y que sus equivalentes son conocidos en la técnica.

El término “antígeno” se entiende bien en la técnica e incluye cualquier sustancia que sea inmunogénica, es decir, un inmunógeno. Se apreciará que el uso de cualquier antígeno está previsto para su uso en la presente divulgación y, por lo tanto, incluye, pero no se limita a un autoantígeno (ya sea normal o relacionado con la enfermedad), un antígeno de un agente infeccioso (por ejemplo, un antígeno microbiano, antígeno viral, etc.) o algún otro antígeno extraño (por ejemplo, un componente alimenticio, polen, etc.). El término “antígeno” o “inmunógeno” se aplica a colecciones de más de un inmunógeno, de modo que las respuestas inmunitarias a múltiples inmunógenos se pueden modular simultáneamente. Más aún, el término incluye cualquiera de una variedad de formulaciones diferentes de inmunógeno o antígeno.

Un antígeno “nativo” o “natural” o “de tipo silvestre” es un polipéptido, proteína o un fragmento de la misma que contiene un epítopo, que se ha aislado de una fuente biológica natural, y que puede unirse específicamente a un antígeno receptor cuando se presenta en un sujeto como un complejo MHC/péptido, en particular un receptor de antígeno de células T (TCR).

El término “antígeno asociado a tumor”, “antígeno tumoral” o “TAA” se refiere a un antígeno que está asociado con un tumor. Ejemplos de TAA bien conocidos incluyen gp100, MART y MAGE. Otros antígenos tumorales pueden ser específicos de un tumor particular en un paciente particular.

Los términos “complejo principal de histocompatibilidad” o “MHC” se refieren a un complejo de genes que codifican moléculas de la superficie celular que se requieren para la presentación del antígeno a las células T y para el rápido rechazo del injerto. En humanos, el MHC también se conoce como el “antígeno leucocitario humano” o complejo “HLA”. Las proteínas codificadas por el MHC se conocen como “moléculas MHC” y se clasifican en moléculas MHC de clase I y clase II. Las moléculas de MHC de clase I son expresadas por casi todas las células nucleadas y se ha demostrado que funcionan en la presentación del antígeno a las células T CD8+. Las moléculas de clase I incluyen HLA-A, B y C en humanos. Se sabe que las moléculas MHC de clase II funcionan en células T CD4+ y, en humanos, incluyen HLA-DP, -DQ y -DR.

El término “células presentadoras de antígenos (APC)” se refiere a una clase de células capaces de presentar uno o más antígenos en forma de complejo péptido-MHC reconocible por células efectoras específicas del sistema inmunitario, y de ese modo inducir una respuesta inmunitaria celular efectiva contra el antígeno o antígenos que se presentan. Las APC pueden ser células enteras intactas, tales como macrófagos, células B, células endoteliales, células T activadas y células dendríticas; u otras moléculas, de origen natural o sintéticas, tales como las moléculas de MHC Clase I purificadas complejadas con p2-microglobulina. Si bien muchos tipos de células pueden ser capaces de presentar antígenos en su superficie celular para el reconocimiento de células T, solo las células dendríticas tienen la capacidad de presentar antígenos en una cantidad eficiente para activar las células T nulitratadas para las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL).

El término “células dendríticas” (en el presente documento también denominado “DC”) se refiere a una población diversa de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides (véase, por ejemplo, Steinman (1991) Ann Rev. Immunol.9: 271-296). Las células dendríticas constituyen las APC más potentes y preferidas en el organismo. Las DC pueden diferenciarse de los monocitos pero son fenotípicamente distintas de los monocitos; por ejemplo, el antígeno DC 14 no se encuentra en las células dendríticas pero está poseído por los monocitos. También, las células dendríticas maduras no son fagocíticas, mientras que los monocitos son células fuertemente fagocíticas. Se ha demostrado que las DC maduras pueden proporcionar todas las señales necesarias para la activación y proliferación de las células T.

El término “células efectoras inmunitarias” se refiere a células capaces de unirse a un antígeno y que median una respuesta inmunitaria. Estas células incluyen, pero no se limitan a, células T, células B, monocitos, macrófagos, células NK y linfocitos T citotóxicos (CTL), por ejemplo estirpes CTL, clones CTL y CTL de infiltrados tumorales, inflamatorios u otros.

Una célula efectora inmunitaria “nulitratada” es una célula efectora inmunitaria que nunca ha sido expuesta a un antígeno capaz de activar esa célula. La activación de células efectoras inmunitarias nulitratadas requiere tanto el reconocimiento del complejo péptido: MHC como el suministro simultáneo de una señal coestimuladora por un APC profesional para proliferar y diferenciarse en células T efectoras armadas específicas de antígeno.

Como se utiliza en este documento, el término “célula efectora inmunitaria específica de antígeno educada” es una célula efectora inmunitaria como se definió anteriormente que previamente ha encontrado un antígeno. A diferencia de su contraparte ingenua, la activación de una célula efectora inmunitaria específica de antígeno educada no requiere una señal coestimuladora; El reconocimiento del complejo péptido: MHC es suficiente.

“Respuesta inmunitaria” se refiere en general a las respuestas específicas de antígeno de los linfocitos a sustancias extrañas. Se dice que cualquier sustancia que puede provocar una respuesta inmunitaria es “inmunogénica” y se conoce como “inmunógeno”. Una respuesta inmunitaria de esta divulgación puede ser humoral (mediante actividad de anticuerpos) o mediada por células (mediante activación de células T).

“Activado”, cuando se utiliza en referencia a una célula T, implica que la célula ya no está en fase Go, y comienza a producir una o más de citotoxinas, citoquinas y otras características de proteínas asociadas con membrana relacionadas con el tipo de célula. (por ejemplo, CD8+ o c D4+), y es capaz de reconocer y unir cualquier célula diana que muestre el complejo péptido/MHC particular en su superficie y liberar sus moléculas efectoras.

Como se utiliza en este documento, la frase “inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto” o inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto se entiende en la técnica y se refiere a un aumento de al menos aproximadamente 2 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 5 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 10 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 100 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 500 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 1000 veces o más en una respuesta inmunitaria a un antígeno que puede detectarse o medirse, después de introducir el antígeno en el sujeto, en relación con la respuesta inmunitaria (si existe) antes de la introducción del antígeno en el sujeto. En algunos ejemplos, se considera que un tratamiento indujo una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto si la respuesta inmunitaria aumenta al menos en un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más en comparación con la respuesta inmunitaria exhibida por el sujeto al antígeno antes del tratamiento. Una respuesta inmunitaria a un antígeno incluye, pero no se limita a la producción de un anticuerpo específico de antígeno o un aumento en la producción de anticuerpos específicos de antígeno; un aumento o disminución en la cantidad o frecuencia de un tipo de célula inmunitaria identificable; y la producción de una célula inmune que expresa en su superficie una molécula que se une específicamente a un antígeno. Los métodos para determinar si se ha inducido una respuesta inmunitaria a un antígeno dado son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo específico de antígeno se puede detectar utilizando cualquiera de una variedad de inmunoensayos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, ELISA, en el que, por ejemplo, la unión de un anticuerpo en una muestra a un antígeno inmovilizado se detecta con un segundo anticuerpo marcado de forma detectable (por ejemplo, anticuerpo Ig anti-humano de ratón marcado con enzima). Los aumentos en los tipos de células inmunes en respuesta a un tratamiento se muestran en los ejemplos de trabajo descritos en este documento, como los discutidos en el Ejemplo 5.

Como se utiliza en el presente documento, el término “citoquina” se refiere a cualquiera de los numerosos factores que ejercen una variedad de efectos sobre las células, por ejemplo, induciendo el crecimiento o la proliferación. Los ejemplos no limitantes de citoquinas que se pueden utilizar solos o en combinación en la práctica de la presente divulgación incluyen interleuquina-2 (IL-2), factor de células madre (SCF), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-6 (IL -6), interleuquina-12 (IL-12), G-CS^f , factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), interleuquina-1 alfa (IL-1a), interleuquina-IL (IL-1L), MIP- 11, factor inhibidor de leucemia (LIF), ligando c-kit, trombopoyetina (TPO), IL-15 y 1L-17. Un ejemplo de la presente descripción incluye condiciones de cultivo en las que se excluye del medio una cantidad efectiva de IL-1p y/o IL-6. Las citoquinas están disponibles comercialmente y pueden ser citoquinas purificadas “naturales” o pueden producirse de manera recombinante.

Los términos “polinucleótido”, “ácido nucleico” y “molécula de ácido nucleico” se utilizan indistintamente para referirse a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. El término “polinucleótido” incluye, por ejemplo, un gen o fragmento de gen, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Además de una molécula de ácido nucleico nativa, una molécula de ácido nucleico de la presente descripción también puede comprender moléculas de ácido nucleico modificadas. Como se utiliza en el presente documento, el ARNm se refiere a un ARN que puede traducirse en una célula dendrítica. Tales ARNm normalmente están cubiertos y tienen un sitio de unión a ribosomas (secuencia de Kozak) y un codón de iniciación traduccional. Como se utiliza en el presente documento, un ARN correspondiente a una secuencia de ADNc se refiere a una secuencia de ARN que tiene la misma secuencia que la secuencia de ADNc, excepto que los nucleótidos son ribonucleótidos en lugar de desoxirribonucleótidos, ya que la base de timina (T) en el ADN se reemplaza por base uracilo (U) en ARN.

El término “péptido” se utiliza en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más aminoácidos de subunidades, análogos de aminoácidos o peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar unidas por enlaces peptídicos. En otro ejemplo, la subunidad puede estar unida por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Como se utiliza en el presente documento, el término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen glicina y tanto D como L isómeros ópticos, análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Un péptido de tres o más aminoácidos se denomina comúnmente oligopéptido si la cadena peptídica es relativamente corta, mientras que si la cadena peptídica es larga, el péptido se denomina comúnmente polipéptido o proteína.

Una “alteración conservadora” a un polipéptido o proteína es una que da como resultado un aminoácido alternativo de densidad de carga, hidrofilia o hidrofobicidad, tamaño y/o configuración similares (por ejemplo, Val para Ile). En comparación, una “alteración no conservativa” es aquella que da como resultado un aminoácido alternativo de diferente densidad de carga, hidrofilia o hidrofobicidad, tamaño y/o configuración (por ejemplo, Val para Phe). Los medios para realizar tales modificaciones son bien conocidos en la técnica.

El término “genéticamente modificado” significa que contiene y/o expresa un gen extraño o una secuencia de ácido nucleico que a su vez modifica el genotipo o fenotipo de la célula o su progenie. En otras palabras, se refiere a cualquier adición, eliminación o interrupción de los nucleótidos endógenos de una célula.

Como se utiliza en el presente documento, “expresión” se refiere a los procesos mediante los cuales los polinucleótidos se transcriben en ARNm y el ARNm se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido se deriva del ADN genómico de un anfitrión eucariota apropiado, la expresión puede incluir el empalme del ARNm. Los elementos reguladores requeridos para la expresión son conocidos en la técnica e incluyen secuencias promotoras para unir polimerasa de ARN y secuencias de iniciación de la transcripción para la unión de ribosomas. Los vectores apropiados para la expresión bacteriana y/o eucariota son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

“Bajo control transcripcional” es un término entendido en la técnica e indica que la transcripción de una secuencia de polinucleótidos (generalmente una secuencia de ADN) depende de que esté ligado operativamente a un elemento que contribuya al inicio de, o promueva, la transcripción. “Ligado operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los elementos están en una disposición que les permite funcionar.

Un “vehículo de suministro de genes” se define como cualquier molécula que puede transportar polinucleótidos insertados en una célula anfitriona. Los ejemplos de vehículos de suministro de genes incluyen liposomas, polímeros biocompatibles, que incluyen polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipéptidos; polisacáridos; lipopolisacáridos; envolturas virales artificiales; partículas de metal; y bacterias, o virus, tales como baculovirus, adenovirus y retrovirus, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos y otros vehículos de recombinación normalmente utilizados en la técnica que se han descrito para la expresión en una variedad de anfitriones eucariotas y procariotas, y se pueden utilizar tanto para terapia génica como para expresión simple de proteínas.

“Suministro de genes”, “transferencia de genes”, “transfección” y similares como se utilizan en el presente documento, son términos que se refieren a la introducción de un polinucleótido exógeno en una célula anfitriona, independientemente del método utilizado para la introducción. La transfección se refiere al suministro de cualquier ácido nucleico al interior de una célula y puede incluir una variedad de técnicas tales como: electroporación; complejos de suministro de ácido nucleico a base de proteínas, a base de lípidos y a base de iones catiónicos; vectores virales; suministro de “pistola de genes”; y varias otras técnicas conocidas en el arte. El polinucleótido introducido puede mantenerse de forma estable en la célula anfitriona o puede expresarse transitoriamente. En ejemplos preferidos, se introduce un ARNm en una DC y se expresa de forma transitoria. El mantenimiento estable generalmente requiere que el polinucleótido introducido contenga un origen de replicación compatible con la célula anfitriona o se integre en un replicón de la célula anfitriona tal como un replicón extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Varios vectores son capaces de mediar la transferencia de genes a células de mamíferos y son conocidos en la técnica.

La secuencia de un polinucleótido o una porción del mismo (o un polipéptido o una porción del mismo) tiene un cierto porcentaje de “identidad de secuencia” con otra secuencia (por ejemplo, 80%, 85%, 90% o 95%) cuando ese porcentaje de bases o aminoácidos es el mismo cuando las dos secuencias se alinean y comparan. La alineación adecuada y el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias se pueden determinar utilizando uno de los programas de alineación BLAST conocidos y disponibles públicamente con parámetros predeterminados.

El término “aislado” significa separado de los constituyentes, celulares y de otro tipo, con los que el polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmentos de los mismos, están normalmente asociados en la naturaleza. Por ejemplo, con respecto a un polinucleótido, un polinucleótido aislado es uno que está separado de las secuencias 5' y 3' con las que normalmente está asociado en el cromosoma. Una célula de mamífero, como la célula dendrítica, se aísla de un organismo si se extrae del sitio anatómico en el que se encuentra en un organismo. Además, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento (s) “concentrado”, “separado” o “diluido” se distingue de su contraparte de origen natural en que la concentración o el número de moléculas por volumen es mayor que “concentrado” o menor que “separado” que el de su contraparte de origen natural.

“Célula anfitriona”, “célula objetivo” o “célula receptora” pretenden incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda ser o haya sido receptor de vectores o la incorporación de moléculas de ácido nucleico, polinucleótidos y/o proteínas exógenas. También está destinado a incluir la progenie de una sola célula. En algunos casos, una célula de progenie puede no ser completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN genómico o total) a la célula madre original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Las células pueden ser procariotas o eucariotas, e incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, células de levadura, células animales y células de mamífero, por ejemplo, de murino, ratas, simios o humanas.

Un “sujeto” o “paciente” es un mamífero; En muchos ejemplos, un paciente es un paciente humano. Un sujeto o paciente también puede ser cualquier otro mamífero, incluido un mono o simio, o cualquier animal doméstico tal como un perro, gato, caballo, etc.

Por “cáncer” se entiende la presencia anormal de células que exhiben un crecimiento relativamente autónomo, de modo que una célula cancerosa exhibe un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular (es decir, es neoplásico). Las células cancerosas pueden ser benignas o malignas. En varios ejemplos, el cáncer afecta las células de la vejiga, sangre, cerebro, mama, colon, tracto digestivo, pulmón, ovarios, páncreas, próstata o piel. La definición de una célula cancerosa, tal como se utiliza en el presente documento, incluye no solo una célula cancerosa primaria, sino también cualquier célula derivada de un ancestro de células cancerosas, incluidas células cancerosas metastatizadas, cultivos in vitro y estirpes celulares derivadas de células cancerosas. El cáncer incluye, pero no se limita a, tumores sólidos, tumores líquidos, neoplasias hematológicas, cáncer de células renales, melanoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, neuroblastoma, glioblastoma, retinoblastoma, leucemias, mielomas, linfomas, hepatoma, adenomas, sarcomas, carcinomas, blastomas, etc. Cuando se refiere a un tipo de cáncer que normalmente se manifiesta como un tumor sólido, un tumor “clínicamente detectable” es uno que es detectable sobre la base de la masa tumoral; por ejemplo, mediante procedimientos tales como tomografía computarizada, formación de imágenes de resonancia magnética (MRI), rayos X, ultrasonido o palpación. Los hallazgos bioquímicos o inmunológicos por sí solos pueden ser insuficientes para cumplir con esta definición.

El término “cultivo” se refiere al mantenimiento in vitro, diferenciación y/o propagación de células o en medios adecuados.

Por “enriquecido” se entiende una composición que comprende células presentes en un mayor porcentaje de células totales que las que se encuentran en otra composición, como, por ejemplo, los tejidos donde están presentes en un organismo o un grupo o mezcla de células en el que estuvieron previamente presentes. Por ejemplo, en los cultivos enriquecidos y las preparaciones de células T^scm hechas por los métodos de la invención, las células T^scm están presentes en un mayor porcentaje del total de células en comparación con su porcentaje en un cultivo in vitro en el que se produjeron o cultivaron. Las células Tscm que están en una composición 'enriquecida' están presentes como más del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% de las células en esa composición. De manera similar, por “purificado” o “aislado” se pretende que un tipo de célula (por ejemplo, células T^scm) esté presente en más del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95 % o 99% de las células en esa composición. Por el contrario, por “agotado” se pretende que la frecuencia de ese tipo de célula se reduzca en una composición particular o grupo de células, por ejemplo, en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80% o 90% o más, o 100%. Por “enriquecer” o “enriquecimiento”, como se utiliza en el presente documento, se pretende que las células se “enriquezcan” utilizando selección positiva para eliminarlas selectiva o preferiblemente de una población o grupo de células, o que las células se “enriquezcan” utilizando selección negativa para selectiva o preferencialmente eliminar otras células de una población inicial o grupo de células para que los tipos de células deseados permanezcan atrás. La selección positiva y/o negativa se puede lograr fácilmente utilizando materiales y técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, las células que expresan un marcador de superficie celular particular se pueden separar de otras células utilizando anticuerpos monoclonales que se unen al marcador y se acoplan a columnas o perlas magnéticas; la separación se realiza fácilmente de acuerdo con técnicas estándar y/o instrucciones del fabricante o proveedor.

Por “marcador de superficie celular” (a veces en el presente documento denominado “marcador” o “marcador celular”) se entiende una molécula expresada en la superficie de una célula que puede detectarse, por ejemplo, utilizando anticuerpos marcados u otros medios conocidos en el art. Un marcador de superficie celular puede comprender una proteína, glicoproteína o grupo de proteínas y/o glicoproteínas. En algunos casos, se sabe que un marcador de superficie celular se correlaciona con o es indicativo de un tipo de célula particular o una o más funciones de la célula. Ciertas poblaciones celulares pueden identificarse mediante la expresión de un conjunto particular o combinación de marcadores, o algún subconjunto de los mismos.

Por “expresión positiva” o “positivo para” con referencia a un marcador de superficie celular como se utiliza en el presente documento se pretende generalmente que el marcador se exprese a niveles detectables en una célula o en un grupo de células o población de células. En algunos casos, “expresión positiva” o “positivo para” se utiliza para referirse a células que expresan un marcador de superficie celular particular a niveles significativamente superiores a los niveles de fondo o niveles “negativos”, que pueden evaluarse en comparación con otras células u otros grupos o poblaciones de células, o puede ser un nivel seleccionado de expresión identificado como de fondo o negativo. Un experto en la materia está familiarizado con las técnicas para detectar la expresión de un marcador y para determinar el nivel o niveles de expresión que distinguen la expresión “positiva” del fondo o la expresión negativa. Las células que tienen “expresión positiva” o son “positivas para” un marcador particular pueden exhibir una expresión de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500% más que la expresión de fondo, o al menos 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces o 100 veces o más que el fondo o la expresión “negativa”. En algunos ejemplos, el marcador se expresa intracelularmente pero la expresión es detectable utilizando técnicas conocidas en el arte. Generalmente, la expresión de un marcador se detecta con fracciones que se unen al marcador (por ejemplo, anticuerpos) que están acoplados a una etiqueta fluorescente u otra etiqueta que se puede medir utilizando un dispositivo FACs de acuerdo con las instrucciones del fabricante o del proveedor, por ejemplo, como se demuestra por los experimentos descritos en los ejemplos de trabajo en este documento.

Una “composición farmacéutica” pretende incluir la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, haciendo que la composición sea adecuada para uso diagnóstico o terapéutico in vitro o in vivo. El término “portador farmacéuticamente aceptable” abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizantes y conservantes. Para ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes, véase Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990)).

Una “cantidad efectiva” es una cantidad suficiente para producir cualquier resultado beneficioso o deseado, tal como una respuesta inmunitaria mejorada, tratamiento, prevención o mejora de una afección médica (enfermedad, infección, etc.). Se puede administrar una cantidad efectiva en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones. Las dosificaciones adecuadas variarán según el peso corporal, la edad, la salud, la enfermedad o la afección a tratar y ruta de administración; Los métodos para determinar una cantidad efectiva son conocidos en la técnica. En algunos ejemplos, una “cantidad efectiva” de tratamientos con AGS-004 es la cantidad de dosis de AGS-004 necesarias para que un paciente en particular exhiba un resultado deseado, como una disminución en la carga viral del VIH después de una ARTI (también conocida como ITA o STI) ), o para aumentar la frecuencia de Tscm en la sangre del paciente (por ejemplo, como se describe en otra parte de este documento), o para exhibir un retraso en el rebrote viral del VlH después de ARTI, o para cumplir con los criterios para permanecer sin reanudar el ART después de ARTI. Estos criterios pueden variar, pero en algunos casos un paciente debe reiniciarse con ART si hay dos pruebas consecutivas que demuestren que el número de células T CD4+ del paciente está por debajo de 350 células/ml. En otros casos, además de los criterios de recuento de células T CD4+, un paciente también debe cumplir con los criterios de carga viral de menos de 10,000 copias/ml o reiniciarse con ART. Los expertos en la materia entienden que cualquier respuesta inmunitaria positiva puede proporcionar un beneficio a un paciente (por ejemplo, Un paciente con VIH o un paciente con cáncer), incluso si el paciente no está completamente curado de la infección por VIH o cáncer. Por ejemplo, al fortalecer la respuesta inmunitaria del paciente para que otros tratamientos puedan ser más efectivos de lo que hubieran sido de otra manera.

Como se utiliza en este documento, “señalización” significa poner en contacto una célula dendrítica inmadura o madura con un agonista de receptor de IFN-y, un agonista de receptor de TNF-a, un polipéptido CD40L u otro agonista de CD40. En un ejemplo, dichos agonistas se proporcionan externamente (por ejemplo, en el medio de cultivo celular). En otro ejemplo, el agonista de polipéptido se proporciona mediante la transfección de una célula dendrítica inmadura o madura con un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Alternativamente, se podría proporcionar un agonista de aptámero de ácido nucleico en el medio o por transfección. En los casos en que los polipéptidos se proporcionan transfectando una célula dendrítica con un ácido nucleico que codifica el polipéptido, la señalización se efectúa tras la traducción de un ARNm que codifica el polipéptido, en lugar de tras la transfección con el ácido nucleico. Como se utiliza en el presente documento, el término “células dendríticas maduras” significa células dendríticas que demuestran una expresión elevada de la superficie celular de la molécula coestimuladora CD83, en comparación con las DC inmaduras (iDC).

Como se utiliza en el presente documento, por el término “diferencia significativa” se pretende que un aumento o disminución en un parámetro medido sea estadísticamente significativo según se determina utilizando una prueba estadística apropiada. Dichos métodos son conocidos en la técnica y el experto en la materia selecciona fácilmente la prueba adecuada.

A lo largo de esta divulgación, se hace referencia a varias publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas mediante una cita de identificación. Las divulgaciones de estas publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas se incorporan específicamente por referencia en la presente divulgación para describir más completamente el estado del arte al que pertenece esta divulgación.

La práctica de la presente divulgación emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (que incluye técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y explicadas en la literatura. De acuerdo con la descripción anterior, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, los diversos aspectos de esta invención.

Ejemplos experimentales

Ejemplo 1 - proceso de maduración y evaluación de DC PME-CD40l

Las DC PME-CD40L se prepararon esencialmente como se describe en Calderhead et al. ((2008) J. Immunother. 31: 731-41). Brevemente, el CD40L se clonó a partir de células T activadas que habían sido estimuladas con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA); La RT-PCR se realizó en el ARN total de las células T utilizando cebadores CD40L específicos de gen para amplificar y clonar CD40L. Los PBMC humanos se aislaron de colecciones de leucaféresis de voluntarios sanos mediante centrifugación de densidad Ficoll-histopaque. Las PBMC se resuspendieron en medio de cultivo y se dejaron adherir a matraces de plástico; las células no adherentes se eliminaron y las células restantes se cultivaron en medio suplementado con GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (1000 U/ml) durante 5-6 días a 37 ° C, 5% de CO2. Las DC se cosecharon, se lavaron en PBS, se volvieron a suspender en medio Viaspan® enfriado (DuPont Pharma®) y se colocaron en hielo. Las DC se mezclaron con ARNm de CD40L y ARNm que codifica el antígeno y se electroporaron. Inmediatamente después de la electroporación, las DC se lavaron y se volvieron a suspender en un medio que se complementó con g M-CSF e IL-4. Las Dc se cultivaron durante 4 o 24 horas a 37 ° C en placas de baja adherencia con estímulos de maduración adicionales como se describe a continuación.

Las DC inmaduras se maduraron fenotípicamente en el día 5 de cultivo mediante la adición de TNF-a, IFN-y y PGE2. El día 6, las DC se cosecharon y se electroporaron con antígeno y ARNm de CD40L como se describió anteriormente, y se cultivaron en medios que contenían GM-CSF e IL-4 durante 4 horas antes de la cosecha o formulación para la producción de la vacuna.

Para el análisis de citometría de flujo, se recogieron DC y se volvieron a suspender en PBS frío/1% de FCS, luego se mezclaron con ficoeritrina (PE) o anticuerpos conjugados con FITC específicos para CD1a, CD209, antígeno leucocitario humano (HLA) -ABC, HLA-DR, CD80, CD86, CD38, CD40, CD25, CD123, CD83, CCR6, CCR7, CD70 y CD14; Se utilizaron anticuerpos con isotipo compatible como controles. Después de un lavado completo, el análisis de fluorescencia se realizó con un citómetro de flujo FACScalibur (BD Biosciences™) y el software CellQuest (BD Biosciences™). La quimiotaxis de las DC se midió mediante la migración a través de un filtro de policarbonato de tamaño de poro de 8 pm. IL-10 e IL-12 en los sobrenadantes de DC se determinaron utilizando ELISA.

Para la inducción de CTL, las DC maduras electroporadas con ARNm se cultivaron conjuntamente con células T purificadas con CD8+. Durante los primeros tres días, las células se cultivaron en medios suplementados con IL-2 e IL-7; el día 4, los medios se complementaron con IL-2. El día 7, las células CD8+ se cosecharon y se reestimularon con DC en medios complementados con IL-2 e IL-7. Los ensayos CTL se realizaron 3 días después de la segunda o tercera estimulación.

Ejemplo 2 - Uso de DC PME-CD40L para inducir CTL T^scm

Las DC PME-CD40L que expresan el antígeno tumoral MART-1 se utilizaron para expandir una población de CTL T^scm in vitro. Las DC PME-CD40L se produjeron y transfectaron con ARNm que codifica el antígeno MART-1 y se cocultivaron con PBMC aisladas del mismo paciente. Los datos que se muestran en la Figura 1 ilustran la capacidad de estas DC PME-CD40L para cebar y/o expandir una población de CTL Tscm y también demuestran que las CTL Tscm se pueden identificar en cocultivos de células T DC y PME-CD40L. Los CTL de Tscm se identificaron como se muestra en la Figura 1 mediante citometría de flujo multicolor como células que son fenotípicamente CD8+/CD95+/CD28+/CCR7+/CD45RA+. Pruebas posteriores de estas células revelaron que una proporción de los CTL MART-1+ Tscm eran multifuncionales, con un 1.8% que expresa de TNF-a, un 3.2% que expresa CD107a y un 1.5% que expresa IFN-^y.

Ejemplo 3: células T^scm como marcadores de respuesta inmunitaria en sujetos VIH

Como parte de un ensayo clínico (diagramado esquemáticamente en la Figura 3), los pacientes humanos con VIH fueron tratados con DC PME-CD40L que codifican antígenos de VIH (“AGS-004”) preparados como los documentos WO2006042177 (Healey et al.); WO2007117682 (Tcherepanova et al.); DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305; Calderhead et al. (2008) J. Immunother. 31: 731-4; y WO 2006031870 (Nicolette et al.). En este ensayo clínico, las DC PME-CD40L contenían “GNVR”, la carga útil del antígeno de ARN que codifica los antígenos GAG (G), Nef (N), VPR (V) y Rev (R). Los pacientes fueron tratados con múltiples dosis de AGS-004 y la respuesta inmunitaria anti-VIH se determinó después de la terapia mediante el monitoreo de la carga viral y la respuesta inmunitaria.

Se extrajeron extracciones de sangre longitudinales antes de la dosificación de AGS-004 en la visita 2 o visita 3, después de dos dosis (visita 6) y cuatro dosis (Visita 8) de AGS-004 administradas durante la terapia antirretroviral (“a Rt ”), y en dos momentos durante la Interrupción del Tratamiento Estructurado (“STI”), en la visita 9 y la visita 13. Se recogieron extracciones de sangre en la visita 13 después de dos dosificaciones adicionales de AGS-004 durante la STI. Se recogieron PBMC de los sujetos y se estimularon in vitro con DC PME-CD40L autólogas que codifican antígenos de VIH del sujeto. La citometría de flujo multicolor se usó para determinar la capacidad de proliferación y el fenotipo de las células T CD4 y CD8 específicas de VIH estimuladas y para identificar el estado de activación de las células T específicas de VIH. La proliferación de células T se midió por dilución de colorante CFSE en combinación con citometría de flujo multicolor. De esta manera, CFSE era un marcador de proliferación, mientras que CD27, CD8, CD28, CCR7, CD3, CD45RA y CD4 eran marcadores fenotípicos (véase Figura 4). Se determinaron números absolutos de células T respondedoras AGS-004 (células/ml) utilizando tubos Trucount. Los pacientes que exhibían células Tscm proliferantes (véase Figura 5) fueron seleccionados para la comparación de esta respuesta con el análisis de carga viral.

Se evaluó la carga viral y la respuesta inmunitaria de los pacientes para determinar la relación entre el tiempo hasta el rebrote viral después de la interrupción de la terapia antirretroviral (ART) y la respuesta de las células T anti-GNVR. Los pacientes en tratamiento antirretroviral no tienen una carga viral de VIH detectable, pero cuando se retira la terapia farmacológica, el virus se recuperará. Un retraso en el rebrote viral y/o una cantidad reducida de carga viral después de una ART en un paciente es indicativo de una respuesta inmunitaria anti-VIH en ese paciente.

“Rebrote viral” se define aquí como el tiempo de detección del virus en el plasma de un paciente medido por ensayos estándar tales como, por ejemplo, la Prueba de MONITOR VIH-1 AMPLICOR® de Roche COBAS® (v1.5, que tiene una sensibilidad de 50 copias de ARN del VIH/ml) y el ensayo Abbott RealTime VIH-1 (que tiene una sensibilidad de 40 copias de ARN del VIH/ml). Se produce un retraso en el rebrote viral cuando el tiempo para detectar virus es mayor en un paciente en comparación con otros pacientes y/o en comparación con el tiempo esperado de rebrote viral en ausencia de un tratamiento efectivo. Por lo general, en ausencia de cualquier tratamiento eficaz contra el VIH, el rebrote viral ocurriría dentro de las dos semanas posteriores a la interrupción del ART.

Para los pacientes para los que se muestran datos en la Figura 2, los días para la carga viral detectable (virus detectable en el plasma) se muestran en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1: Días para la carga viral detectable

Para algunos pacientes, criterios adicionales distinguen un resultado clínico deseado. Por ejemplo, el paciente 011-005 tuvo casi los mismos días de carga viral detectable que el paciente 021-002; sin embargo, el paciente 011-005 se considera un buen “controlador” del VIH porque su carga viral era mucho más baja y después de 12 semanas de interrupción del ART el paciente solo tenía 1690 copias de ARN del VIH/mL y pudo continuar sin ART durante seis meses adicionales. En contraste, el paciente 021-002 tenía una carga viral que se recuperó a niveles mucho más altos (nunca por debajo de 54.600 copias/mL) y tuvo que reanudar el ART después del período de evaluación de 12 semanas (véase, por ejemplo, Figura 6).

La frecuencia de las células T CFSElo en un paciente representa el porcentaje de células T que proliferan in vitro después de la reestimulación con las DC que se transfectaron con ARN que codifica los antígenos virales GNVR. Los datos de puntos de tiempo únicos para la frecuencia de las células T CFSElo se analizaron para cada paciente en la visita 9 y la visita 13 después del tratamiento con AGS-004, pero ninguno de los datos de puntos de tiempo mostró una asociación entre el porcentaje de células T en proliferación y el tiempo extendido para el rebrote viral en el paciente. Sin embargo, el análisis del porcentaje acumulado de células T proliferativas se midió tanto en la visita 9 (después de 4 dosis AGS-004) como en la visita 13 (después de 2 dosis adicionales AGS-004) reveló una asociación positiva entre los aumentos en el porcentaje de células T proliferativas que se muestran la expresión de los marcadores CD27+/CD28+/CD45RA+ y un retraso en el rebrote viral y/o la disminución de la carga viral.

Este fenotipo proliferativo de células T (es decir, que expresa CD27, CD28 y CD45RA) describe células Tscm para las poblaciones de células T CD4 y CD8. Como se muestra en la Figura 2A, B, C y D, cuatro pacientes con proliferación de células T^scm CD27+/CD28+/CD45RA+ CD4 (Figura 2A) y CD27+/CD28+/CD45RA+ CD8 T^scm (Figura 2C) mostraron un tiempo más largo para el rebrote viral y/o la disminución de la carga viral después de la interrupción de ART (ATI) que otros tres pacientes que mostraron un tiempo rápido de rebrote viral. Estos cuatro pacientes que exhibieron un tiempo prolongado de rebrote viral y/o disminución de la carga viral también mostraron una marcada diferencia en el cambio porcentual de las células T^scm CD27+/CD28+/CD45RA+ CD4 proliferantes (Figura 2B) y las células CD27+/CD28+/CD45RA+ CD8 Tscm (Figura 2D) medido desde el valor de referencia (visita 3) y después de la administración de AGS-004 determinado como la respuesta media medida promediando la respuesta detectada en la visita 9 y la visita 13. El porcentaje de cambio desde la visita 3 se determinó dividiendo el porcentaje promedio de células en la región de células T CD4 (Figura 2B) o CD8 (Figura 2D) CD27+/CD28+/CD45RA+ determinada en la visita 9 y visita 13 por el porcentaje de células en la célula T ^c D4 o CD8 CD27+/CD28+/CD45RA+ determinada en la visita 3 (valor de referencia).

Como se muestra en los experimentos discutidos anteriormente para los cuales también se muestran datos, por ejemplo, en la Figura 2 y las Figuras 4 a 11, las respuestas inmunitarias a AGS-004 podrían detectarse en los subconjuntos de células Tscm CD4 y CD8 antes y durante interrupción de la terapia antirretroviral (ART). Una proporción de estos sujetos exhibió un tiempo prolongado de rebrote viral después de la administración de AGS-004 durante la interrupción de ART.

Estos experimentos indican que las células Tscm inducidas por AGS-004 juegan un papel en la inducción de una respuesta anti-VIH en pacientes que pueden retrasar el rebrote viral durante la interrupción de ART y sirven como un indicador de la respuesta inmunitaria de un paciente. Además, los pacientes que tienen células con una mayor expresión de PD-1, un marcador asociado con la activación disfuncional de las células CD4 y CD8-T, tienen más probabilidades de exhibir tiempos más cortos de rebrote viral. Por lo tanto, la disminución de la expresión de PD-1 puede ser un indicador de una respuesta inmunitaria exitosa al VIH. Estos experimentos indican que la intervención inmunoterapéutica AGS-004 puede revertir la inducción del agotamiento de las células T, lo que lleva al control de la replicación viral al inducir inmunidad a largo plazo.

Ejemplo 4 -Asociación de fenotipos de células PD-1 con respuesta inmunitaria en pacientes con VIH con infección crónica

La infección por VIH induce una desregulación inmune de los compartimentos de células T CD4 y CD8. Los grupos de células T antivirales en pacientes con infección crónica se caracterizan por un fenotipo de activación agotado, que no puede controlar la replicación del virus. El ART puede suprimir la replicación del VIH, lo que lleva a la estabilización del número de células T CD4 y mejora la función inmune. Sin embargo, el virus latente no se elimina y los grupos de células T residuales no superan este estado de agotamiento de las células T. Durante la replicación viral no controlada, la expresión de la muerte celular programada-1 (PD-1) en las células T activadas se asocia con el agotamiento de las células T y un control viral deficiente. AGS-004 es una célula dendrítica (DC) personalizada cargada con ARN que codifica Gag, Nef, Vpr y el Rev. AGS-004-001 es un ensayo de fase 2 diseñado para evaluar la eficacia y seguridad de AGS-004 durante una interrupción del tratamiento estructurado ART (ARTI) de 12 semanas en sujetos con infección crónica por VIH-1. Esta intervención inmunoterapéutica está destinada a revertir la inducción del agotamiento de las células T que conduce al control de la replicación viral al inducir inmunidad a largo plazo.

Se extrajeron extracciones de sangre longitudinales antes de la dosificación de AGS-004, después de cuatro dosificaciones de AGS-004 administradas durante ART, y después de dos dosificaciones durante ARTI. El fenotipo de las células T CD4 y CD8 específicas del VIH y su capacidad de proliferación se determinaron mediante citometría de flujo multicolor para determinar el estado de activación de las células T específicas del VIH. Las mediciones de la carga viral se realizaron durante estos mismos marcos de tiempo. Se determinaron las asociaciones entre la proliferación de células T, el estado de activación de las células T y el control viral.

Se detectaron cambios positivos en la magnitud de la proliferación de células T a antígenos virales después de la administración de AGS-004 en sujetos con un tiempo prolongado de rebrote viral durante ARTI. Las células T CD4 y CD8 activadas que carecen de PD-1 se incrementaron después de la administración de AGS-004 en sujetos con un tiempo prolongado de rebrote viral versus sujetos con un tiempo más rápido de rebrote viral medido durante la STI. Adicionalmente, los sujetos que mostraron un rápido rebrote viral tuvieron un mayor número de células T efectoras CD4+/PD-1+ CD4 y CD8 agotadas en comparación con los sujetos con un tiempo prolongado de rebrote viral.

Ejemplo 5 Inmunogenicidad de la terapia con células dendríticas AGS-004 en pacientes tratados durante la infección aguda por VIH

Mejorar la inmunidad específica del VIH-1 sin la activación de las células T CD4 puede eliminar las células infectadas productivamente, un aspecto clave de las estrategias de erradicación del VIH. AGS-004 consiste en células dendríticas autólogas maduras (DC PME-CD40L) coelectroporadas con ARN transcrito in vitro que codifica proteínas de VIH Gag, Nef, Rev y Vpr (“GNVR”) amplificadas a partir de plasma pre-ART de los participantes. En el presente documento, estas células también se denominan GNVR DC o “vacuna AGS-004 DC”.

Se realizó un ensayo clínico con pacientes con VIH que iniciaron la terapia antirretroviral (“ART”) dentro de los 45 días de la infección aguda por VIH y tenían ARN del VIH <50 copias/ml durante más de 6 meses. En este caso, el AHI se definió como EIA negativa o indeterminada o una prueba negativa de ARN del VIH dentro de los 40 días posteriores al ARN del VIH detectable en plasma. Se administraron dosis mensuales de AGS-004 en ART y se evaluaron las respuestas inmunitarias (“ IR”) después de 3-4 dosis de AGS-004, en la semana 12 o 16 del ensayo. Aquí, una respuesta inmunitaria positiva se definió como un aumento en el número de células CTL CD28+/CD45RACD8+ que era dos veces o mayor en comparación con el nivel de referencia y también era 3 desviaciones estándar o más por encima de un control negativo. Los pacientes que mostraron un aumento en la respuesta inmunitaria después de tres dosis de AGS-004 fueron elegibles para la interrupción voluntaria del tratamiento analítico con dosificaciones mensuales continuas de AGS-004; Todos los pacientes que se muestran en la Tabla 2 cumplieron los criterios para una respuesta inmunitaria (IR). ART se reinició si el recuento de CD4 de un paciente cayó por debajo de 350 células/mm3 o mostró una disminución de más del 20% en el recuento o porcentaje absoluto de ^c D4, o si se confirmó que el ARN del VIH era igual o superior a 10,000 copias/ml. La frecuencia de la infección de células T CD4+ en reposo se midió mediante ensayos cuantitativos de crecimiento viral al inicio del estudio y después de tres dosificaciones de AGS-004 (en la semana 10). Se recogieron PBMC de pacientes antes y después del tratamiento con AGS-004 y se cultivaron in vitro con la vacuna autóloga AGS-004 DC. Después de la estimulación in vitro, las células se prepararon para citometría de flujo multicolor y se evaluaron para la expresión de marcadores de superficie que incluyen CD28, CD45RA, CD27 y CCR7 (véase Figura 12). Los subconjuntos de CTL antigenreactivo del VIH se identificaron y evaluaron para su función, por ejemplo, para la producción de citoquinas (por ejemplo, IFN-gamma, TNF-alfa e IL-2); expresión de marcadores citolíticos (por ejemplo, Granzyme b, CD107); y proliferación (por ejemplo, como se muestra por tinción con BrdU).

Las características demográficas y clínicas de estos pacientes se muestran en la Tabla 2 a continuación (SCA es ensayo de copia única para VIH; RCI es infección de células en reposo). La Tabla 3 muestra la respuesta antigénica que cumple con los criterios de positividad; como se indica en la tabla, dos pacientes recibieron AGS-004 con solo tres de Gag, Nef, Vpr y Rev.

En este ensayo, todos los participantes cumplieron los criterios de respuesta inmunitaria positiva y ATI (Interrupción del Tratamiento Antirretroviral). La mediana de duración de la ATI fue de 58 días, con un rango de 36 a 147 días, y un paciente permaneció en ATI después de 268 días. El valor de referencia SCA (Ensayo de Copia Única para VIH) fue inferior a 1 c/ml en todos los pacientes. Solo un paciente (54-100) tuvo una disminución de más de 2 veces en la frecuencia de RCI en la semana 10, pero mantuvo la ATI durante 90 días.

Las Figuras 13 a 18 muestran respuestas inmunitarias multifuncionales (“MIF”) y trayectorias de carga viral para los pacientes antes, durante y después de la ATI con AGS-004. Las Figuras muestran números absolutos de CD28+/CD45RA- CTL para cada marcador, así como trayectorias de carga viral. La respuesta específica de antígeno para cada MIF se determinó restando el número absoluto de CTL en la respuesta de GFP de control más 3 veces la SD de las respuestas de antígeno de GNVR en la semana 0 y la semana 12. Un asterisco sobre una barra en el gráfico de barras indica una respuesta de CTL que cumplieron con los criterios de positividad, definidos en estos experimentos como un aumento de al menos 2 veces en el número absoluto de CTL para un antígeno dado (prueba) determinado después de la dosificación en comparación con el número de CTL para dicho antígeno por dosificación (es decir, en la semana 0).

Este ensayo clínico demostró que la terapia con AGS-004 DC era segura, bien tolerada y condujo a un aumento de las respuestas inmunitarias específicas del VIH. El participante con una disminución de más de dos veces en la frecuencia de RCI en la semana 10 se sometió a ATI durante 90 días. Estos resultados indican que la terapia DC podría agotar la infección persistente por VIH en pacientes suprimidos de ART después de la administración de la terapia anti-latencia.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para obtener una población autóloga de células enriquecidas para células Tscm adecuadas para introducción en un paciente humano que comprende las etapas de:

a) preparar DC maduras PME-CD40L a partir de una fuente de tejido aislado de un paciente humano;

b) cultivar PBMC obtenidas de dicho paciente in vitro con dichas DC maduras PME-CD40L en un cocultivo durante un tiempo suficiente para inducir un aumento en el número de células Tscm en dicho cocultivo;

c) enriquecer dichas células Tscm a partir de dicho cocultivo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dichas DC maduras PME-CD40L se ubican con un antígeno.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dichas DC se ubican con dicho antígeno mediante transfección con ARN que codifica dicho antígeno.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicho ARN se prepara a partir de células de un paciente infectado con VIH.

5. El método de la reivindicación 3, en el que dicho antígeno se prepara a partir de células de cáncer de un paciente con cáncer.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dichas células Tscm son CD8+, CD95+, CD28+, CCR7+, y CD45RA+.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células Tscm son CD27+, CD28+, y CD45RA+.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dichas células Tscm se enriquecen como células positivas para CD27, CD28, y CD45RA.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente combinar dichas células Tscm con un portador farmacéuticamente aceptable.