KR20070119727A - 수지상 세포 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20070119727A
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레베카 포그-칼리
타마라 몬스미쓰
이리나 체레파노바
로이스 딘터만
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아르고스 쎄라퓨틱스 인코포레이티드
기린 파마 가부시끼가이샤
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Abstract

대상체로부터 단리된 시점으로부터 약 6 내지 96시간의 기간 동안 1℃ 내지 34℃의 온도에서 인큐베이션된 단핵구로부터 수지상 세포의 생산을 위한 방법이 제공된다. 이어서, 인큐베이션 기간 후, 단핵구는 수지상 세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 성숙 수지상 세포는 대상체로부터 단리된 시점으로부터 적어도 6시간 동안 1℃ 내지 34℃에서 유지되지 않은 단핵구로부터 제조된 성숙 수지상 세포에 비해 증가된 수준의 하나 이상의 CD80, CD83, CD86, MHC 클래스 I 분자, 또는 MHC 클래스 II 분자를 갖는다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 수지상 세포는 백신의 제조 및 T 세포의 자극을 위해 유용하다.
수지상 세포, 암, 백신, 성숙, 단핵구, T 세포

Description

수지상 세포 조성물 및 방법 {DENDRITIC CELL COMPOSITIONS AND METHODS}
본 발명은 질병 치료에 유용한 수지상 세포 및 관련 조성물의 생산 방법에 관한 것이다
수많은 임상 시험은 수지상 세포 백신의 안전성을 입증한 바 있고, 1000명 초과의 환자에게 수지상 세포 백신을 투여하였고, 환자의 1/2에서 치료 및 임상 반응에 관련된 심각한 이상 반응이 존재하지 않았다 (Ridgeway (2003) Cancer Invest 21:873-876). 예를 들어, 최근의 연구는 4개의 흑색종 펩티드 (gp1OO, melan-A/MART-1, 타이로신 흑색종 항원 (MAGE-3), KLH 및 플루 매트릭스 (flu matrix)가 부가된 수지상 세포를 사용한 백신 처리가 4회의 격월 백신 처리 후에 전이성 흑색종의 퇴행을 야기하였음을 보여주었다 (Banchereau et al. (2001) Cancer Res 61:6451-6458).
수지상 세포 (DC)를 제조하기 위한 일반적인 방법은 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 대상체로부터 수거한 후, PBMC의 작은 집단인 단핵구를 DC로 분화시키는 것이다. 단핵구는 수지상 세포의 시험관 내 제조를 위한 적합한 전구체로서 기능하기 위해서 대상체로부터 단리된 직후에 동결되거나 배양되어야 한다고 널리 생각 되고 있다. 따라서, 수지상 세포 백신을 단핵구로부터 제조한 기존의 임상 시험에서, PBMC 또는 단핵구는 환자로부터 PBMC를 수거한 지 수시간 내에 약 37℃에서 배양하거나 동결되었다. 그러나, 실제적인 제조 고려사항은 새로 단리된 PBMC 또는 단핵구의 배향 또는 동결을 필요로 하는 방법에 의해 처리되는 백신의 광범위한 사용을 제한할 수 있다. PBMC의 DC로의 분화는 약 1주가 소요되고, GMP 설비 및 숙련된 기술자를 필요로 한다. 따라서, PBMC가 환자로부터 얻어지는 각각의 임상 현장에서 또는 그 현장 근처에서 DC 백신을 제조하기 위해 설비 및 인력을 제공하는 것은 감당하지 못할 정도의 비용을 야기할 것이다.
DC 백신 제조를 위한 상업적으로 실행가능한 모델은 임상 현장에서 수거된 후 제조처로 수송될 수 있는 환자 PBMC 또는 단핵구로부터 DC 백신을 제조할 수 있는 하나 또는 비교적 작은 수의 설비를 제공하는 것이다. 그러나, 상기 모델은 신선한 PBMC 또는 단핵구를 필요로 하는 현재의 DC 생산 방법에 적용될 수 없다. 신선한 단핵구의 동결은 백혈구 성분 채집술 (leukophereis) 후에 수거지에서 추가의 조작을 필요로 하고, 따라서 바람직한 대안이 아니다. 따라서, 제조 설비로의 수송 동안 저장된 PBMC 또는 단핵구를 사용하여 DC 백신을 제조하는 방법을 개발할 필요성이 존재한다. 본 발명은 상기 필요성을 충족시키고, 또한 추가의 잇점을 제공한다.
<발명의 요지>
본 발명자들은 대상체로부터 단리 후에 1 내지 34℃에서 6 내지 96시간 동안 저장된 단핵구로부터 수지상 세포 및 수지상 세포 백신의 제조를 가능하게 하는 방 법을 밝혀내었다. 저장된 단핵구로부터 DC를 제조하는 능력은 보다 많은 융통성을 제공하고 수거지에서 제조 설비까지의 수송을 가능하게 한다. 또한, 본 발명자들은 저장된 단핵구로부터 제조된 수지상 세포 백신이 신선한 단핵구로부터 제조된 수지상 세포보다 그 표현형이 훨씬 더 우수함을 밝혀내었다. 예를 들어, 저장된 단핵구로부터 제조된 수지상 세포 백신은 신선한 단핵구로부터 제조된 수지상 세포에 비해 증가된 수준의 동시자극 분자, 예를 들어 CD80, CD83 및 CD86, 및 보다 높은 수준의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 갖는다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은
a. 대상체로부터 단리된 시점으로부터 6 내지 96시간의 기간 동안 1℃ 내지 34℃의 온도에서 인큐베이션된 단핵구를 제공하고;
b. 상기 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 유도하는 것
을 포함하는, 단핵구로부터 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 단핵구는 단핵구를 포함하는 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 수거하기 위한 백혈구 성분 채집술에 의해 얻어진다.
바람직하게는, 분화는 단핵구의 미성숙 수지상 세포로의 분화를 유도하는 유효량의 조성물, 예를 들어 GM-CSF; GM-CSF 및 IL-4: GM-CSF 및 IL-13; GM-CSF 및 IL-15; 및 IFNα (이로 제한되지 않음)를 포함하는 배양 배지와 단핵구를 접촉시켜 유도된다. 이어서, 미성숙 수지상 세포는 성숙되어 성숙 수지상 세포를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 성숙 수지상 세포는 선행 기술의 성숙 수지상 세포와는 표현형이 상이한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공하고, 여기서 세포 내의 ALOX15 RNA 대 액틴 RNA 또는 GAPDH RNA의 항정 상태(steady state) 비율은 1.0 미만이다. 이것은 신선한 단핵구로부터 제조된 성숙 수지상 세포 내의 ALOX15 대 액틴 또는 GAPDH RNA 비율에 비해 감소된 비율이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공하고, 여기서 세포 내의 CD52 RNA 대 액틴 RNA 또는 GAPDH의 항정 상태 비율은 1.0 초과이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공하고, 여기서 세포 내의 TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA 또는 CD69 RNA 대 액틴 RNA 또는 GAPDH RNA의 항정 상태 비율은 1.0 미만이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 성숙 수지상 세포는 신선한 단핵구로부터 제조된 성숙 수지상 세포에 비해 하나 이상의 CD80, CD83, CD86, MHC 클래스 I 분자, 또는 MHC 클래스 II 분자의 증가된 수준을 갖는다. 또한, 본 발명은 ALOX15 RNA, CD52 RNA, TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA 또는 CD69 RNA의 변경된 항정 상태 수준을 갖는 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 수지상 세포는 백신 제조에 특히 유용하다. 따라서, 관련 수지상 세포 조성물 및 백신도 제공되고, 바람직한 실시태양에서, 백신은 대상체에게 자가 유래성이다. 바람직하게는, 수지상 세포 백신에는 대상체에 존재하는 암세포 또는 병원체로부터의 항원이 부가된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 DMSO를 사용하여 동결된 수지상 세포 백신이 해동 후에 DMSO의 존재 하에 적어도 2시간 동안 안정한 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 암 또는 병원체 감염의 치료 또는 예방을 위한 동결된 의약의 제조를 위한 항원 부가된 수지상 세포의 용도를 제공하고, 여기서 의약은 적어도 2％ DMSO를 포함하고, 해동시에 바로 투여가능하도록 준비된 상태이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은
a. 적어도 2％ DMSO를 포함하는 동결된 수지상 세포 백신을 해동하고,
b. 해동된 백신을, 투여 전에 세포 대 DMSO의 비율을 변경시키지 않은 채로 대상체에게 투여하는 것
을 포함하는, 대상체의 백신처리 방법을 제공한다.
바람직하게는, DMSO의 농도는 약 10％이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 항원 부가된 수지상 세포를 제공하고, 여기서 상기 세포는 단핵구로부터 시험관 내에서 분화되고, 5％ 이상의 DMSO의 존재 하에 동결되고 해동된 후에 시험관 내에서 적어도 24시간 동안 생존할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항원 부가된 수지상 세포는 10％ 이상의 DMSO의 존재 하에 동결되고 해동된 후에 시험관 내에서 적어도 24시간 동안 생존할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 약 5-15％ DMSO를 포함하는 수지상 세포 백신을 제공하고, 여기서 상기 백신은 대상체에게 바로 투여가능하도록 준비된 상태이다.
도 1: 단핵구 (예를 들어, 백혈구 성분 채집 산물)의 온도 제어된 수송을 위 한 바람직한 수송 용기 및 패키징 물질의 도해.
도 2: RNA-형질감염된 DC는 기능성 동시자극 지지체를 제공한다. DC는 혼합 림프구 (MLR) 분석에서 PBMC로부터 INF-γ 생산을 자극하는 능력에 대해 시험하였다. 3개의 상이한 공여자로부터 제조된 해동된 DC는 각각의 공여자로부터의 이전에 동결된 PBMC와 페어링시켰다. 판독으로서 ELISPOT (INF-γ)을 사용하여 모든 페어형 조합을 시험하였다. 컬럼 1, 4 및 7은 자가 PBMC와 페어링된 DC를 나타낸다. 컬럼 2, 3, 5, 6, 8 및 9는 비-자가 PBMC와 페어링된 DC를 나타낸다. 컬럼 10-12는 단지 대조군으로서의 DC를 나타낸다. 컬럼 13-14는 단지 대조군으로서의 PBMC를 나타낸다.
도 3: 사이토킨 칵테일 (cocktail) 성숙 DC를 자가 T 세포로부터 Th1 사이토킨 생산을 자극하는 그들의 능력에 대해 동일한 공여자로부터의 미성숙 DC와 비교하였다. DC의 두 집단을 플루 매트릭스 단백질을 코딩하는 RNA로 형질감염시키고, 자가 PBMC로부터의 Flu-특이적 메모리 CTL을 자극하기 위해 사용하였다. ELISPOT 분석 (투입 PBMC의 함수로서의 스폿의 수/웰)의 결과가 나타난다. 4개 컬럼의 각각의 세트를 다음 순서로 배열한다: 미성숙 DC에 의해 Flu-특이적 T 메모리 세포에 의해 유발된 IFNγ 생산, 성숙 DC에 의해 Flu-특이적 T 메모리 세포에 의해 유발된 IFNγ 생산; 미성숙 DC에 의해 Flu-특이적 T 메모리 세포에 의해 유발된 IL-2 생산; 및 성숙 DC에 의해 Flu-특이적 T 메모리 세포에 의해 유발된 IL-2 생산.
도 4: 각각 2개의 상이한 건강한 공여자로부터 얻은 1일령 PBMC로부터 제조된 RNA-부가된 2개의 수지상 세포 제제의 2개의 바이알을 해동하였다. 각각의 공 여자로부터의 한 바이알을 즉시 알로 (allo) MLR 분석으로 시험하고, 각각의 제제로부터의 제2 바이알을 동일한 방법으로 분석하기 전에 40분 동안 실온에 유지시켰다. 상기 실험에 사용된 PBMC는 각각의 공여자로부터의 자가 세포 및 어디에도 관련되지 않은 공여자로부터의 PBMC의 제3의 샘플을 포함하였다. 상기 분석의 판독은 ELISPOT (INF-γ)이었다.
도 5: 동결 전 대 해동 후의 DC 기능성을 형질감염에 사용된 Flu mRNA 농도 감소의 함수로서 자가 PBMC로부터 메모리 Flu-특이적 반응을 자극하는 DC의 능력에 의해 평가하였다. 분석 판독은 ELISPOT (INF-γ)이었다.
도 6: GFP를 코딩하는 RNA를 사용한 전기천공 후에 DC에 의한 GFP 발현에 대한 유세포 측정 평가. 비형질감염 DC (파선).
도 7: 세포내 사이토킨 염색: GFP (음성 대조군, 좌측 패널) 또는 CMV pp65 (우측 패널)를 코딩하는 RNA로 형질감염된 DC를 사용한 자극 후에 CD4 및 CD8 T 세포 상의 IL-2/IFN-γ.
도 8: GFP (음성 대조군, 좌측 패널) 또는 CMV pp65 (우측 패널)를 코딩하는 RNA로 형질감염된 DC를 사용한 자극 후에 CD4 및 CD8 T 세포에서 CSFE 희석.
도 9: 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 6일 미성숙 수지상 세포 (iDC)의 표현형.
도 10: 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 7일 성숙 수지상 세포 (mDC)의 표현형.
본 개시 내용 전체에 걸쳐, 상이한 간행물, 특허 및 특허 출원 공개는 참고로 인용된다. 상기 간행물, 특허 및 특허 출원 공개는 본 발명이 속하는 기술 분야를 보다 상세하게 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 실행은 달리 나타내지 않으면 당업자에게 잘 알려져 있는 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용한다. 상기 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다 (예를 들어 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. eds. (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR: A Practical Approach (M. MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A Practical Approach (MJ. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane eds. (1988)); Using Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane eds. (1999)); 및 Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. (1987)] 참조).
<정의>
본원에서 사용되는 특정 용어는 다음 정의된 의미를 가질 수 있다.
본원 명세서 및 청구항에서 사용되는 단수 형태인 부정관사 및 정관사는 달리 분명하게 표시되지 않으면 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 다수의 세포와 그의 혼합물을 포함한다.
용어 "항원"은 당업계에 잘 이해되어 있고, 면역원성인 물질, 즉 면역원, 및 항원 에피토프를 포함한다. 임의의 항원의 사용도 본 발명에 사용하기 위해 고려되고, 따라서 자가-항원 (정상이거나 질병 관련성이거나 상관없이), 감염성 항원 (예를 들어, 미생물 항원, 바이러스 항원 등), 또는 몇몇 다른 외래 항원 (예를 들어, 음식 성분, 꽃가루 등)을 포함하고, 이로 제한되지 않음을 이해할 것이다. 용어 "항원" 또는 별법으로 "면역원"은 다중 면역원에 대한 면역 반응이 동시에 조절될 수 있도록 2 이상의 면역원의 집단에 적용된다. 또한, 상기 용어는 면역원 또는 항원의 임의의 다양한 상이한 제제를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 항원은 암세포 또는 병원체로부터 유래한다. 바람직하게는, 암세포는 신암 세포, 다발성 골수종 세포 또는 흑색종 세포이다. 바람직한 병원체는 HIV 및 HCV이다. 바람직한 실시태양에서, 항원은 암세포 또는 병원체로부터 단리되거나 유래된 RNA의 형태로 항원 제시 세포 (APC)에 전달된다. "로부터 유래된"은 비관련 또는 관련 서열에 대한 융합체를 포함하여 자연 발생하는 서열의 재조합 변이체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 임의의 세포 (예를 들어, 암세포 또는 병원체 세포)로부터 추출된 RNA의 RT-PCR 방법, 및 시험관 내 전사는 그 내용이 본원에 참고로 포함된, 동시 계류 중인 미국 특허 가출원 60/525,076, 및 PCT/US05/053271에 개시되어 있다.
"암"은 암세포가 세포 증식 조절의 유의한 상실이라는 특징을 갖는 비정상적인 성장 표현형을 보이도록 비교적 자율적인 성장을 보이는 세포의 비정상적인 존재를 의미한다. 암 세포는 양성 또는 악성일 수 있다. 다양한 실시태양에서, 암은 방광, 혈액, 뇌, 유방, 결장, 소화관, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 또는 피부의 세포에 영향을 준다. 본원에서 사용될 때 암세포의 정의는 원발 암세포뿐만 아니라 암세포로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이것은 전이된 암세포, 및 시험관 내 배양물 및 암세포로부터 유래된 세포주를 포함한다. 암은 고형 종양, 액상 종양, 혈액암, 신세포암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 고환암, 방광암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 신경모세포종, 아교모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 골수종, 림프종, 간암종, 선종, 육종, 암종, 모세포종 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 성분을 포함하지만, 다른 성분을 배제하지는 않음을 의미하고자 의도한 것이다. 조성물 및 방법을 규정할 때 사용되는 "주성분으로 하는"은 조합물에 대한 임의의 본질적으로 중요한 다른 성분을 배제함을 의미한다. 따라서, 본원에 규정된 성분을 주성분으로 하는 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물질 및 제약학상 허용되는 담체, 예를 들어 인산염 완충 염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "구성되는"은 본 발명의 조성물의 투여를 위한 다른 구성성분의 미량을 초과하는 성분 및 실질적인 방법 단계를 배제함을 의미한다. 상기 용어 각각에 의해 규정된 실시태양은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 사용되는 용어 "사이토킨"은 세포에 대한 다양한 효과, 예를 들어 성장 또는 증식 유도를 발휘하는 많은 인자 중의 어느 하나를 의미한다. 단독으로 또는 본 발명의 실시와 조합하여 사용될 수 있는 사이토킨의 비제한적인 예는 인터루킨-2 (IL-2), 줄기세포 인자 (SCF), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-11 (IL-11), 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-13 (IL-13), 인터루킨-15 (IL-15), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터루킨-1 베타 (IL-1β), 인터페론-γ (IFNγ), 종양 괴사 인자-α (TNFα), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), MIP-11, 백혈병 억제 인자 (LIF), c-kit 리간드, 트롬보포이에틴 (TPO) 및 flt3 리간드를 포함한다. 사이토킨은 여러 공급처, 예를 들어 젠자임 (Genzyme, 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코), 제넨테크 (Genentech, 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코), 암젠 (Amgen, 미국 캘리포니아주 싸우즌드 오크스), 알&디 시스템즈 (R&D systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스) 및 이뮤넥스 (Immunex, 미국 워싱턴주 시애틀)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 항상 분명하게 언급되는 것은 아니지만, 야생형 또는 정제된 사이토킨과 유사한 생물학적 활성을 갖는 분자 (예를 들어, 재조합 생산된 분자 또는 그의 뮤테인 (mutein))이 본 발명의 취지 및 범위 내에서 사용됨이 의도된다.
용어 "수지상 세포 (DC)"는 다양한 림프양 및 비-림프양 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 종류의 다양한 집단을 의미한다 [Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296]. 수지상 세포는 유기체에서 가장 효능있고 바람직한 APC를 구성한다. 수지상 세포는 단핵구로부터 분화될 수 있고, 단핵구와 구별되는 표현형을 갖는다. 예를 들어, 특정 분화 마커인 CD14 항원은 수지상 세포에서는 발견되지 않지만, 단핵구에서 관찰된다. 성숙 DC는 T 세포 활성화 및 증식에 필요한 모든 신호를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 성숙 수지상 세포는 포식세포 특성이 없지만, 단핵구 및 미성숙 수지상 세포는 세포를 강하게 포식한다. 미성숙 DC는 세포내 이입 (endocytosis), 포식작용, 거대 음세포 작용 (macropinocytosis) 또는 흡착 음세포 작용 및 수용체 매개 항원 흡입에 의해 항원을 포획할 수 있고, 표현형이 CD80- 또는 CD80low, CD83 또는 CD83low, CD86low이고, MHC 클래스 II 분자의 높은 세포내 농도를 갖는다. 성숙 DC는 불분명한 형태, 보다 낮은 세포내 이입 능력을 갖고, 표현형이 미성숙 DC와 달리 CD80high, CD83high, CD86high이다. 바람직하게는, 성숙 DC는 IL-12 p70 폴리펩티드 또는 단백질, 및/또는 유의하게 감소된 수준 (1백만개의 DC당 0 내지 500 pg/ml)의 IL-10을 분비한다. IL-10 및 IL-12 수준은 미성숙 DC로부터 DC 성숙의 유도 후에 36시간까지 수거한 배양 상등액의 ELISA에 의해 결정할 수 있다 [Wierda W.G. et al (2000) Blood 96:2917. Ajdary S et al (2000) Infection and Immunity 68:1760]. 검토를 위해 문헌 [Banchereau and Steinman (1998) Nature 392:245] 참조.
"유효량"은 유익하거나 목적하는 결과를 얻기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되고(되거나) mRNA가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 폴리뉴클레오티드가 적절한 진핵세포 숙주의 게놈 DNA로부터 유래할 경우, 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 발현에 필요한 조절 성분은 RNA 폴리머라제 결합을 위한 프로모터 서열 및 리보좀 결합을 위한 전사 개시 서열을 포함한다. 예를 들어, 세균 발현 벡터 또는 카세트는 프로모터 (예를 들어, lac 프로모터) 및 전사 개시를 위한 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열 및 출발 코돈 AUG를 포함한다 (Sambrook et al. (1989), 상기 문헌). 유사하게, 진핵세포 발현 벡터 또는 카세트는 일반적으로 RNA 폴리머라제 II를 위한 이종 또는 상동 프로모터, Kozak 서열, 출발 코돈 AUG, 리보좀 이탈을 위한 종결 코돈 및 하류의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 상기 벡터는 시판되는 것을 구입하거나 당업계에 공지된 방법에 기재된 서열로 만들 수 있다.
용어 "유전적으로 변형된"은 세포 또는 그의 자손체의 유전자형 또는 표현형을 변경시키는 외래 유전자 또는 핵산 서열을 포함하고(하거나) 발현함을 의미한다. 즉, 상기 용어는 세포의 내인성 뉴클레오티드에 대한 임의의 부가, 결실 또는 붕괴를 의미한다.
용어 "단리된"은 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편이 자연 상태에서 정상적으로 회합하는 세포 성분 또는 다른 성분과 분리됨을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 있어서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 염색체에서 그와 정상적으로 회합하는 5' 및 3' 서열로부터 분리된 것이다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 비-자연 발생하는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편(들)은 그의 자연 발생 대응물과 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다. 또한, "농축된", "분리된" 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편(들)은 농도 또는 부피당 분자의 수가 그의 자연 발생 대응물보다 더 "농축되거나" 또는 덜 "분리된다"는 점에서 그의 자연 발생 대응물로부터 구별될 수 있다. 그의 1차 서열에서 또는 예를 들어 그의 글리코실화 패턴에서 자연 발생 대응물과 상이한 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 그의 단편(들)은 그의 1차 서열, 또는 별법으로 다른 특징, 예를 들어 그의 글리코실화 패턴에 의해 그의 자연 발생 대응물과 구분될 수 있기 때문에 그의 단리된 형태로 존재할 필요가 없다. 본원에 개시된 각각의 본 발명에 대해 명시적으로 언급하지 않더라도, 적절한 조건 하에 아래에 개시되는 각각의 조성물에 대한 상기 모든 실시태양이 본 발명에 의해 제공됨을 이해하여야 한다. 따라서, 비-자연 발생하는 폴리뉴클레오티드가 단리된 자연 발생하는 폴리뉴클레오티드와는 별개의 실시태양으로서 제공된다. 세균 세포에서 생산된 단백질은 자연에서 진핵세포에서 생산되는 진핵세포로부터 단리된 자연 발생 단백질과는 별개의 실시태양으로서 제공된다. 단리된 포유동물 세포는 신체 내에서 정상적으로 발견되는 것과 분리되거나, 신체로부터 제거된다. 예를 들어, 백혈구 성분 채집술에 의해 수거된 백혈구는 "단리된" 것이고, 시험관 내에서 단핵구로부터 분화된 수지상 세포는 "단리된" 것이다.
용어 "주조직 적합 복합체" 또는 "MHC"는 T 세포에 대한 항원 제시 및 신속한 이식 거부를 위해 필요한 세포-표면 분자를 코딩하는 유전자의 복합체를 의미한다. 인간에서, MHC는 "인간 백혈구 항원" 또는 "HLA" 복합체로도 알려져 있다. MHC에 의해 코딩되는 단백질은 "MHC 분자"로서 알려져 있고, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 분류된다. 클래스 I MHC 분자는 β2-마이크로글로불린에 비공유 연결된, MHC에서 코딩되는 α 사슬로 이루어진 막 이종이량체 (heterodimeric) 단백질을 포함한다. 클래스 I MHC 분자는 거의 모든 유핵세포에서 발현되고, CD8+ T 세포에 대한 항원 제시 기능을 수행하는 것으로 밝혀졌다. 클래스 I 분자는 인간에서 HLA-A, B 및 C를 포함한다. 클래스 II MHC 분자도 비공유 회합된 α 및 β 사슬로 이루어진 막 이종이량체 단백질을 포함한다. 클래스 II MHC 분자는 CD4+ T 세포에서 기능하는 것으로 알려져 있고, 인간에서 HLA-DP, DQ, 및 DR을 포함한다.
단핵구는 GM-CSF 및 IL-4에 반응하여 미성숙 수지상 세포로 분화할 수 있는 CD14+ 말초혈 단핵 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 "병원체"는 임의의 질병 유발 유기체 또는 바이러스, 및 또한 그의 약화된 유도체를 의미한다.
"제약 조성물"은 활성 물질 (예를 들어, 항원 부가된 DC)과, 조성물을 시험관 내에서, 생체 내에서 또는 생체 외에서 진단 또는 치료에 유용하게 만드는 불활성 또는 활성 담체의 조합물을 포함하는 의미이다.
본원에 사용되는 용어 "제약학상 허용되는 담체"는 임의의 표준 제약 담체, 예를 들어 열 불활성화 혈청 + 10％ DMSO + 5％ 덱스트로스, 인산염 완충 염수 용액, 물 및 에멀젼, 예를 들어 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 상이한 종류의 습윤제를 포함한다. 조성물은 또한 항원보강제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 항원보강제의 예에 대해서는 문헌 [Remington's Pharm. Sci. 18th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990)]을 참조한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 그들의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 기지 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 예를 들어 단일가닥, 이중가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 천연 핵산 분자 이외에, 본 발명의 핵산 분자는 또한 변형된 핵산 분자를 포함할 수 있다.
용어 "펩티드"는 2 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 펩티드 모방체 (peptidomimetic)의 화합물을 의미하기 위해 그의 가장 넓은 의미로 사용된다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시태양에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글라이신 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체를 포함하여 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 의미한다. 3개 이상의 아미노산의 펩티드는 펩티드 사슬이 짧을 경우 통상 올리고펩티드로 언급된다. 펩티드 사슬이 긴 경우에는, 펩티드는 통상 폴리펩티드 또는 단백질로 언급된다.
본원에 사용되는 "대상체"는 인간 및 다른 영장류, 설치류, 개 및 고양이를 포함하고, 이로 제한되지 않는 포유동물을 의미한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본 발명자들은 미성숙 수지상 세포, 성숙 수지상 세포 및 항원 부가된 수지상 세포를 환자로부터 단핵구를 수거한 후에 1℃ 내지 34℃에서 약 6 내지 96시간 동안 저장된 단핵구로부터 생성시킬 수 있음을 밝혀내었다. 상기 결과는 수지상 세포를 유의한 시간 동안 주변 온도에서 저장된 단핵구가 아니라 새로 단리된 단핵구로부터 제조하는 것이 중요하다고 통상 생각되었기 때문에 놀라운 것이다. 또한, 본 발명 전에 수행된 임상 시험에 사용된 단핵구-유래 DC 백신은 환자로부터 수거한 후에 6시간 미만의 시간 동안 단핵구를 배양하거나, 또는 수거 직후에 PBMC를 동결하고 PBMC를 후속 해동 및 단핵구 배양을 위해 저장함으로써 제조되었다.
본 발명자들은 수지상 세포 및 수지상 세포 백신을 1℃ 내지 34℃에서 약 6 내지 96시간 동안 저장된 단핵구로부터 제조할 수 있음을 밝혀내었을 뿐만 아니라, 놀랍게도 상기 방법으로 제조된 수지상 세포가 신선한 단핵구로 제조된 수지상 세포보다 표현형이 훨씬 우수함을 밝혀내었다. 상기 제조 방법 및 상기 방법에 의해 생성된 수지상 세포 백신의 특성은 백신 효능, 광범위한 지역에 걸친 성공적인 상업화 및 용이한 투여에 특히 관련된다. 먼저, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 성숙 수지상 세포는 선행 기술의 방법에 의해 생산된 DC에 비해 증가된 수준의 CD80, CD83 및 CD86 동시자극 분자, 및 증가된 수준의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 보이고, 이들은 모두 DC 성숙 및 효능의 지표이다. 또한, 본 발명의 성숙 DC는 항원 특이적 방식으로 메모리 T 세포로부터 IL-2 생산을 유도할 수 있다.
두번째로, 환자 PBMC가 수거되는 각각의 현장 근처에서 수지상 세포 제조 방법을 확립하는 것은 상업적으로 실행할 수 없을 것이다. 따라서, 자가 수지상 세포 백신의 성공적인 광범위한 상업화는 PBMC, 또는 PBMC로부터 단리된 단핵구를 미성숙 및 성숙 수지상 세포로의 분화 및 백신의 제조를 위한 중앙 제조 설비로 수송하는 능력에 의해 결정될 것이다. 그러나, 본 발명 이전에는, PBMC는 환자로부터 제거된 직후에 동결되거나 배양되어야 한다고 널리 생각되었다. 본 발명의 방법은 철야 또는 이보다 긴 이송에 의해 수송된 PBMC 또는 PBMC로부터 단리된 단핵구의 처리를 가능하게 함으로써 상기 문제를 해결한다.
세번째로, 항원 부가된 수지상 세포는 일반적으로 DMSO에 동결되고, 저장된 후, 환자에게 투여 전에 해동, 세척 및 DMSO-비함유 제약학상 허용되는 담체 중에 재현탁된다. 세척 단계는 DMSO가 비동결 또는 해동된 DC에 대한 유해한 효과를 갖는다고 생각되었기 때문에 DC 백신 임상 시험 전에 포함되었다. 놀랍게도, 본 발명자들은 DMSO가 수지상 세포에 대한 현저하게 유해한 효과를 갖지 않는다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 투여 전에 해동된 DC 백신을 세척하고 재현탁시킬 필요가 없다. 상기 단계를 생략하면, 투여 용이성이 우수해지고, 추가 처리에 의한 오염의 위험 및 DC에 대한 유해한 효과가 감소하게 된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은
a. 대상체로부터 제거된 시점으로부터 약 6 내지 96시간의 기간 동안 1℃ 내지 34℃의 온도에서 인큐베이션된 단핵구를 제공하고;
b. 상기 인큐베이션된 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 유도하는 것
을 포함하는, 단핵구로부터 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에 사용되는 "단핵구"는 수지상 세포로의 분화능을 갖는 CD14+ 백혈구를 의미한다. 단핵구는 임의의 포유동물로부터 유래할 수 있고, 바람직하게는 인간 단핵구이다. 단핵구는 제공되어 혈액, 혈액 분획 (예를 들어, 백혈구 (WBC), 백혈구 연층, 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 등 (이로 제한되지 않음))과 같은 조성물 및 단핵구에 대해 추가로 농축된 조성물에서 인큐베이션될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 단핵구는 다른 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 예를 들어 백혈구 성분 채집 산물과 함께 제공된다. 다른 실시태양에서, 단핵구는 PBMC로부터 농축되거나, 말초혈로부터 직접 단리된다. 단핵구 또는 단핵구를 포함하는 PBMC를 단리하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 바람직한 실시태양에서, 단핵구는 백혈구 성분 채집술에 의해 다른 PBMC와 함께 수거된다. 백혈구 성분 채집술의 방법은 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 단핵구를 포함하는 PBMC는 병원, 의원, 의사 사무실 등에서 백혈구 성분 채집술에 의해 대상체로부터 수거된다. 백혈구 성분 채집술은 백혈구를 대상체의 혈액으로부터 제거하고, 나머지는 대상체에게 다시 수혈하는 방법이다. 백혈구 성분 채집 산물은 일반적으로 PBMC에 대해 농축된 혈액 분획이고, 낮은 수준의 오염성 적혈구, 과립구 및 혈소판을 갖는다. 백혈구 성분 채집술을 수행하기 위한 방법 및 장비는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 백혈구 성분 채집술에 대한 상세한 정보에 대해서는 gambrobct.com/Products_&_Services/ 참조). 백혈구 성분 채집술 장치의 예는 감브로 비씨티 (GAMBRO BCT)에 의해 제조된 코베스펙트라 (COBESpectra™) 및 박스터 펜월 (Baxter Fenwal)에 의해 제조된 CS3000 플러스 (Plus) 혈액 세포 분리기 (Blood Cell Separator)를 포함한다.
단핵구는 1℃ 내지 34℃ 인큐베이션 기간 동안 또는 상기 기간 후에 혈액 또는 혈액 분획 (예를 들어, PBMC)으로부터 농축될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단핵구 농축"은 방법 개시시에 존재하는 다른 세포 종류에 대해 단핵구의 비율을 증가시키는 방법을 의미한다. PBMC, 혈액 또는 다른 혈액 분획으로부터 단핵구를 농축하는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 분급분리 (elutriation), FACS, 패닝 (panning), 자성 분류 (magnetic sorting), 저밀도 피콜 (Ficoll) 구배 원심분리 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 단핵구는 분급분리에 의해 PBMC로부터 농축된다. 하나의 다른 실시태양에서, 단핵구는 세포 배양 동안 플라스틱에 부착된 단핵구의 선택에 의해 6 내지 96시간의 인큐베이션 기간 후에 PBMC로부터 농축된다. 다른 실시태양에서, 단핵구는 면역자성 (immunomagnetic) 선택에 의해 농축된다. 면역자성 선택은 단핵구에 결합하는 양성 선택일 수 있거나, 단핵구가 아닌 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 등)에 결합하는 음성 선택일 수 있다.
대상체에서 일단 단리된 후에, 단핵구 (예를 들어, 정제된 단핵구, 농축된 단핵구, 단핵구를 포함하는 PBMC 등)는 대상체로부터 단리된 시점으로부터 약 6 내지 96시간의 기간 동안 1℃ 내지 34℃의 온도에서 인큐베이션된다. 본원에서 사용될 때, 단핵구 또는 단핵구를 포함하는 PBMC가 대상체로부터 단리된 시점은 세포를 대상체로부터 제거하는 과정이 종료된 시점을 의미한다. 예를 들어, PBMC가 4시간의 백혈구 성분 채집술 과정에 걸쳐 환자로부터 단리되는 경우에, 단리 시점은 백혈구 성분 채집술에 의한 PBMC 수거가 종료된 시점일 것이다.
바람직하게는, 단핵구는 6 내지 96시간 동안 3℃ 내지 34℃, 또는 4℃ 내지 32℃ 또는 5℃ 내지 3O℃의 온도에서, 보다 바람직하게는 6℃ 내지 28℃의 온도에서, 훨씬 더 바람직하게는 6℃ 내지 27℃, 8℃ 내지 26℃ 또는 약 14℃ 내지 24℃의 온도에서 인큐베이션된다. 바람직한 하한 온도 범위는 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 1O℃, 11℃, 12℃, 13℃ 및 14℃이다. 바람직한 상한 온도 범위는 2O℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 3O℃, 31℃, 32℃, 33℃ 및 34℃이다. 바람직하게는, 인큐베이션 기간은 8 내지 72시간, 보다 바람직하게는 10 내지 48시간, 훨씬 더 바람직하게는 12 내지 24시간, 가장 바람직하게는, 15 내지 22시간이다. 인큐베이션 시간의 다른 바람직한 범위는 8 내지 48시간, 10 내지 30시간, 26 내지 72시간, 및 48 내지 80시간을 포함한다. 인큐베이션 시간의 바람직한 하한은 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 36 및 48시간으로부터 선택될 수 있다. 인큐베이션 시간의 바람직한 상한은 24, 26, 28, 30, 36, 48, 60, 72, 84 및 96시간으로부터 선택될 수 있다.
임의의 형태의 단핵구 (예를 들어, 혈액, 혈액 분획, PBMC 내의 단핵구, 정제된 단핵구 등)는 1℃ 내지 34℃의 인큐베이션 기간 동안 임상 현장으로부터 수지상 세포 제조지로 수송될 수 있다. 바람직하게는, 단핵구는 온도 제어된 용기로 수송된다. 인큐베이션 기간 동안 단핵구의 온도를 1℃ 내지 34℃로 유지하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 단핵구는 1℃ 내지 34℃에서 인큐베이터 또는 실내에서 인큐베이션될 수 있다. 바람직하게는, 단핵구는 인큐베이션 기간 동안 일부 움직임 (가끔의 또는 연속적인)이 발생한다. 움직임은 수송 관련 움직임일 수 있다. 다른 실시태양에서, 세포는 인큐베이션 동안 부드럽게 진동하거나 또는 회전될 수 있다. 이론에 매이기를 원하지 않지만, 움직임은 정치 동안 압축과 관련된 세포 손상을 방지할 수 있는 것으로 생각된다.
1℃ 내지 34℃에서 6 내지 96시간의 인큐베이션 기간 동안, 단핵구는 배양하지 않으면서 인큐베이션된다. "배양하지 않으면서"는 6 내지 96시간의 인큐베이션 기간 동안 단핵구가 포유동물 세포 배양 배지 (생리학적으로 적절한 농도 (예를 들어, 약 1X)의 배양 배지, 예를 들어 RPMI, DMEM, X-VIVO 15, AIM-V, 스템스판(StemSpan) H2000, 등을 포함하고, 이로 제한되지 않음)에서 약 36 내지 38℃의 온도에서 배양되지 않음을 의미한다. 반대로, 본 발명의 방법에 의해 처리되는 단핵구는 바람직하게는 혈액 또는 혈액 분획 (예를 들어, 혈청, 혈장, 백혈구 성분 채집 산물 (예를 들어, PBMC), 백혈구 연층 등), 염수 또는 생물학적 버퍼, 예를 들어 인산염 완충 염수 (PBS) 중에서 1℃ 내지 34℃에서 인큐베이션된다. 가장 바람직하게는, 단핵구를 포함하는 백혈구 성분 채집 산물은 백혈구 성분 채집술 수거 용기 (예를 들어, 혈액 수거 백)에서 1℃ 내지 34℃에서 인큐베이션된다. 백혈구 성분 채집 산물은 인큐베이션 기간 시작 시에 또는 인큐베이션 기간 동안 다른 용기에 이송될 수 있지만, 오염 가능성을 증가시킬 수 있는 불필요한 이송을 방지하는 것이 바람직하다.
1℃ 내지 34℃에서 6 내지 96시간의 인큐베이션 동안 또는 후에, 단핵구는 분화 단계 전에 농축될 수 있다. 조작은 1℃ 내지 34℃에서 수행된다면 인큐베이션 기간 동안 단핵구 또는 PBMC 등에 대해 수행될 수 있다. 특히, PBMC는 추가로 정제될 수 있거나, 단핵구는 상기 인큐베이션 기간 동안 PBMC로부터 농축될 수 있다. 상기 조작은 원심분리, 분급분리, 접선 유동 여과, 피콜 밀도 구배, 희석 피콜 밀도 구배 원심분리, 희석 퍼콜 (Percoll) 밀도 구배 원심분리, 항체 패닝, 자성 세포 분류, 양성 또는 음성 면역자성 선택 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 단핵구는 용기 (바람직하게는 플라스틱 용기)에서의 배양 및 부착 단핵구에 대한 선택에 의해 인큐베이션 기간 후에 PBMC로부터 농축될 수 있다.
1℃ 내지 34℃의 온도에서 약 6 내지 96시간의 기간 동안의 인큐베이션 및 임의로 단핵구의 추가 농축 단계 후에, 단핵구는 수지상 세포로의 분화를 위해 유도된다. 일반적으로, 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화된 후, 미성숙 수지상 세포는 성숙 수지상 세포로 분화될 수 있다. 단핵구의 수지상 세포로의 분화 및 수지상 세포의 성숙을 위한 다양한 방법이 당업자에게 알려져 있다.
한 실시태양에서, 단핵구는 단핵구의 미성숙 또는 성숙 수지상 세포로의 분화를 유도하는 조성물을 포함하는 배지 내에서 배양된다 . 단핵구의 미성숙 수지상 세포로의 분화를 유도하는 조성물은 당업자에게 알려져 있다. 상기 조성물은 GM-CSF + IL-4; GM-CSF + IL-13; GM-CSF + IL-15; IFNα; 및 GM-CSF + TNFα를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 분화를 유도하는 조성물은 GM-CSF + IL-4이다. GM-CSF 및 IL-4의 농도는 약 400 내지 2000 U/ml의 각각의 사이토킨일 수 있다. 바람직하게는, GM-CSF 및 IL-4의 농도는 500 내지 1000 단위/ml의 각각의 사이토킨이다. 한 실시태양에서, 단핵구는 GM-CSF 및 IL-4와 약 4-7일 동안, 가장 바람직하게는 약 5-6일 동안 접촉하고, 이 동안 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화된다.
단핵구의 미성숙 수지상 세포로의 분화 이후, 미성숙 수지상 세포는 성숙 수지상 세포로 성숙시킬 수 있다. 수지상 세포의 성숙 방법은 당업자에게 알려져 있다. 한 실시태양에서, 미성숙 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4 및 성숙 칵테일 (PGE2, TNFα, IL-6 및 IL-1β)을 포함하는 배지와 접촉하여 성숙된다 [예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Jonuliet et al. (1997) Eur J Immunol 27:3135-3142] 참조].
다른 성숙 방법에서, 미성숙 수지상 세포를 IFN-γ를 포함하는 제1 신호, 이어서 CD40L을 포함하는 제2 신호로 신호 전달 처리한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 미성숙 수지상 세포는 바람직하게는 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 PGE2, IFN-γ 및 CD40L과 접촉한다. 바람직한 실시태양에서, CD40L과의 접촉은 수지상 세포 내에서 재조합 CD40L mRNA의 번역시에 수행된다. 바람직하게는, 수지상 세포는 CD40L 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 mRNA로 일시 형질감염된다.
가장 바람직하게는, 미성숙 수지상 세포는 바람직하게는 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 PGE2, TNFα 및 IFNγ와 접촉하여 성숙 수지상 세포를 생성시킨다. 수지상 세포의 성숙은 CD40L을 코딩하는 RNA를 사용한 형질감염, 바람직하게는 일시 형질감염에 의해 추가로 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 수지상 세포는 CD40L을 코딩하는 RNA 및/또는 목적하는 하나 이상의 항원 또는 에피토프를 코딩하는 RNA로 형질감염된다. 상기 성숙 방법은 그 내용이 본원에 참고로 포함된 U.S. 특허 출원 11/246,387에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 수지상 세포에는 하나 이상의 항원이 부가된다. 항원 부가된 수지상 세포는 백신으로서 및 T 세포의 시험관 내 자극에 유용하다. 항원은 미성숙 또는 성숙 수지상 세포 내로 부가된다. 항원이 미성숙 수지상 세포 내로 부가될 경우, 미성숙 수지상 세포는 부가 공정 자체에 의해, 또는 본원에 기재된 다른 성숙 방법 또는 당업자에게 알려진 다른 성숙 방법에 의해 성숙될 수 있다. 항원(들)은 항원 자체 (예를 들어, 단백질, 펩티드, 에피토프, 세포 용해물, 바이러스 입자 등)로서 부가될 수 있거나 또는 항원(들)을 코딩하는 핵산(들)로서 부가될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 항원을 코딩하는 핵산으로서 부가된다. 보다 바람직하게는, 핵산은 RNA이고, 가장 바람직하게는 mRNA이다. 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 항원을 코딩하는 mRNA는 CD40L을 코딩하는 mRNA와 동시 형질감염된다. 바람직하게는, 항원은 대상체에게 자가 유래성이고, 대상체에게 투여하기 위한 항원 부가된 자가 DC 백신의 제조에 사용된다. 수지상 세포에 펩티드 및 단백질 항원, 세포, 세포 또는 조직 용해물, 바이러스 또는 바이러스 입자, 핵산 등을 부가하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
바람직한 실시태양에서, 항원은 핵산, 바람직하게는 mRNA를 사용한 수지상 세포 (성숙 또는 미성숙)의 전기천공에 의해 부가된다. 바람직하게는, 수지상 세포는 106 수지상 세포 당 약 0.25 내지 4 마이크로그램의 RNA, 가장 바람직하게는 약 2 ㎍의 RNA로 형질감염된다. 한 실시태양에서, 1백만개의 DC당 1 마이크로그램의 종양 RNA를 형질감염마다 사용한다. 다른 실시태양에서, 병원체 (예를 들어, HIV)로부터의 4개의 별개의 항원을 코딩하는, 각각 0.25 내지 1.0 ㎍의 4개의 RNA가 106 수지상 세포 당 사용된다.
항원은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시태양에서, 항원 또는 항원(들)은 대상체에게 자가 유래성이다. 대상체에게 자가 유래성이라는 것은 항원이 대상체로부터 얻어지거나 유래함을 의미한다. 비제한적인 예로서, 항원은 대상체로부터 얻은 암세포 또는 종양 조직으로부터 유래할 수 있다. 암 항원은 추출물에 존재하거나, 정제되거나, 증폭되거나, 시험관 내에서 번역되거나 등에 상관없이 암세포, 암세포 또는 조직 용해물, 암세포 또는 조직으로부터의 추출물, 암세포 또는 조직의 정제 또는 클로닝된 성분, 총 RNA 또는 총 mRNA, 또는 상기 세포 또는 조직으로부터 선택된 RNA 또는 mRNA로서 수지상 세포 내로 부가될 수 있다. 별법으로, 항원은 대상체에 존재하는 병원체 또는 병원체-감염된 세포로부터 얻거나 유래할 수 있다.
본 발명의 방법은 암 및 병원체 감염의 치료 또는 예방에 특히 유용하다. 바람직한 실시태양에서, 암은 신세포 암종, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 폐암, 결장암, 췌장암, 위암 또는 전립선암이다.
용어 병원체는 질병의 병인에 관련되는 임의의 바이러스 또는 유기체 및 그의 약화된 유도체를 의미한다. 상기 병원체는 세균, 원생동물, 진균 및 바이러스 병원체, 예를 들어 헬리코박터 (Helicobacter), 예를 들어 헬리코박터 파일로리 (pylori), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (Shigella), 엔테로박터 (Enterobacter), 캄필로박터 (Campylobacter), 다양한 미코박테리아 (mycobacteria), 예를 들어 미코박테리움 레프래 (Mycobacterium leprae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 블루셀라 (Brucella) 종, 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 스타필로코커스 (Staphyloccus), (예를 들어, 에스. 아우레우스 (S. aureus)), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 클로스트리둠 (Clostridum), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 플라스모듐 (Plasmodium), 레이슈마니아 (Leishmania), 트리파노소마 (Trypanosoma), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 인간 T-림프구 친화성 바이러스 (HTLV), 헤르페스바이러스 (예를 들어, 제1형 단순 헤르페스 바이러스, 제2형 단순 헤르페스, 코로나바이러스, 수두대상포진 바이러스, 및 엡스타인바 바이러스 (EBV)), 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 회색질척수염 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 및 풍진 바이러스를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 병원체는 바이러스 병원체, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 병원체, 가장 바람직하게는 HIV 또는 HCV이다.
성숙 또는 미성숙이거나, 항원 부가되거나 되지 않거나 관계 없이 수지상 세포는 동해방지제를 포함하는 조성물에 동결될 수 있다. 많은 동해방지제는 당업자에게 공지되어 있다. 동해방지제의 예는 디메틸술폭시드 (DMSO), 글리세롤, 에탄올, 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트, 프로판-디올, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-소르비톨, D-락토스, i-이노시톨, 콜린 클로라이드, 아미노산, 알부민 (바람직하게는 인간 혈청 알부민), 폴리비닐 피롤리돈, 덱스트란, 수크로스, 피콜, 무기염 및 히드로시에틸 전분을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시태양에서, 동해방지제는 DMSO이다. 바람직하게는, DMSO의 농도는 2-20％, 보다 바람직하게는 5-15％, 가장 바람직하게는 약 10％이다. 또한, 동결 배지는 탄수화물로부터 유래된 하나 이상의 폴리올 화합물, 예를 들어 글루코스, 덱스트로스, 수크로스 등을, 바람직하게는 2-30％, 보다 바람직하게는 5-10％, 가장 바람직하게는 5％의 덱스트로스를 포함할 수 있다. 수지상 세포를 동결하는 방법은 당업자에게 알려져 있다 [예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 20040253574 참조]. 바람직하게는, 동해방지제는 디메틸술폭시드 (DMSO)이다. 바람직한 실시태양에서, DMSO의 농도는 5％ 내지 20％이다. 가장 바람직하게는, 조성물 중 DMSO의 농도는 약 10％이다.
놀랍게도, 본 발명의 방법에 의해 제조된 수지상 세포 및 수지상 세포 백신은 5％-20％ DMSO의 존재 하에 동결하고 해동시킨 후에 적어도 24시간 동안 시험관 내에서 생존할 수 있다. 본 발명의 항원 부가된 수지상 세포는 DMSO에 저항성이기 때문에, 수지상 세포 백신의 투여 전에 세포를 세척할 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 해동된 수지상 세포 백신은 해동 후에 임의의 시점에서 대상체에게 바로 투여가능하도록 준비된 상태이다. 세척 단계가 제거됨으로써, 오염 위험이 감소되고, 수지상 세포를 손상시킬 수 있는 추가의 조작을 피할 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 2％ 내지 20％ DMSO를 포함하는 동결된 수지상 세포 백신을 해동시키고, 투여 전에 수지상 세포 대 DMSO의 비율을 변경시키지 않은 채로 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 항원 부가된 수지상 세포 백신의 투여 방법을 제공한다. 바람직하게는, 백신 내의 DMSO의 농도는 약 5-20％, 보다 바람직하게는 10％이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 암 또는 병원체 감염의 치료 또는 예방을 위한, 적어도 2％ DMSO를 포함하고 해동시에 바로 투여가능하도록 준비된 상태인 동결된 의약의 제조를 위한 항원 부가된 수지상 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 방법은 증가된 기능성 및 증가된 수준의 성숙 마커를 갖는 신규한 수지상 세포의 생산을 가능하게 한다. 예를 들어, 한 측면에서 본 발명은 신선한 단핵구로부터 제조된 성숙 수지상 세포에 비해 증가된 수준의 하나 이상의 CD80, CD83, CD86, MHC 클래스 I 분자, 또는 MHC 클래스 II 분자를 갖는 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 메모리 T 세포로부터 항원-특이적 IL-2 생산을 유도할 수 있는 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공한다. IL-2의 측정 방법은 당업계에 알려져 있다. 세포 표면 마커, 및 메모리 T 세포에 특징적이고 다른 종류의 T 세포로부터 그를 구분시키는 다른 분자의 발현은 그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Immunobiology, 6th Edition, Eds. Janeway et al., Garland Science Publishing, New York, NY, 2005]의 Figure 10.35에 개시되어 있다. 예를 들어, 메모리 T 세포는 높은 수준의 CD44, CD45RO, CD45RA, Bc1-2, IFNγ, CD 127 및 Ly6C; 중등도 수준의 CD122 및 CXCR4; 낮은 수준의 FasL을 발현하고, CD69 및 CD25 음성이다.
본원에 개시된 바와 같이, 항정 상태 RNA 수준의 마이크로어레이 분석은 신선한 단핵구로부터 생산된 수지상 세포에 비해 1일령 단핵구로부터 생산된 수지상 세포 사이의 변경된 유전자 발현을 보여준다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 세포 내의 ALOX15 RNA 대 β-액틴 RNA 또는 GAPDH RNA의 항정 상태 비율이 1.0 미만인 성숙 단핵구-유래 수지상 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 비율은 0.2 내지 0.7, 보다 바람직하게는 0.4 내지 0.5, 가장 바람직하게는 약 0.45이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 세포 내의 CD52 RNA 대 β-액틴 RNA 또는 GAPDH의 항정 상태 비율이 1.0 초과인 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 비율은 1.2 내지 5.0, 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.2, 또는 1.8 내지 1.9이고, 가장 바람직하게는 비율은 1.86이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 세포 내의 TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA 또는 CD69 RNA 대 β-액틴 RNA 또는 GAPDH RNA의 항정 상태 비율이 1.0 미만인 성숙 단핵구 유래 수지상 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 비율은 0.2 내지 0.9, 보다 바람직하게는 0.5 내지 0.8이다.
인간 ALOX15 mRNA (서열 1) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 2-12의 아피메트릭스 (Affymetrix) 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 IL-1β mRNA (서열 13) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 14-24의 아피메트릭스 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 TLR1 mRNA (서열 25) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 26-36의 아피메트릭스 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 TLR2 mRNA (서열 37) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 38-48의 아피메트릭스 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 CD69 mRNA (서열 49) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 50-60의 아피메트릭스 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 CD52 mRNA (서열 61) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 62-77의 아피메트릭스 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 GAPDH mRNA (서열 78) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 79-98의 아피메트릭스 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 인간 β-액틴 mRNA (서열 99) 및 그의 대립유전자 변이체는 서열 100-119의 아피메트릭스 프로브를 사용하여 검출할 수 있다.
RNA 항정 상태 발현 수준은 마이크로어레이, 바람직하게는 아피메트릭스 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이를 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 혼성화는 상기 문단에 나열된 유전자 특이적 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 수지상 세포로부터 추출된 RNA 샘플은 제조자의 지시 (Genechip(등록상표) Expression Analysis Technical Manual, 2004)에 따라 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 (아피메트릭스, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)에 적용될 수 있다. 간단히 설명하면, 젠칩 (Genechip)(등록상표) 폴리-A RNA 조절 키트 (아피메트릭스)로 스파이킹 (spiking)한 3 마이크로그램의 총 RNA를 수퍼스크립트(Superscript)™ II 역전사효소를 사용하여 제1 가닥 cDNA로 전환시킨다. 제2 가닥 cDNA 합성 후에, 각각의 전사체의 선형 증폭을 위한 시험관 내 전사 및 비오티닐화 CTP 및 UTP의 도입을 수행한다. cRNA 산물을 약 100개의 뉴클레오티드로 단편화시키고, 16시간 동안 마이크로어레이에 혼성화시킨다. 마이크로어레이를 이어서 낮은 (6xSSPE) 엄격성 및 높은 (10O mM MES, 0.1M NaCl) 엄격성에서 세척하고, 스트렙타비딘-피코에리트린으로 염색한다.
형광을 비오티닐화 항-스트렙타비딘 및 추가 분취량의 스트렙타비딘-피코에리트린 염색을 첨가하여 증폭시킨다. 젠칩(등록상표) 스캐너 (Scanner) 3000 (아피메트릭스)를 사용하여 570 nm에서 여기 후에 3 ㎛ 해상도에서 형광 신호를 수집한다. 두개의 순차적인 스캔으로부터의 평균 신호를 목적하는 각각의 마이크로어레이 특징에 대해 계산한다. 스캐닝된 이미지는 젠칩(등록상표) 작동 소프트웨어 (Operating Software) v1.1 (아피메트릭스)로 분석하였다. 바람직하게는, 폴리-A RNA 조절 키트 (아피메트릭스)에 포함된 4개의 대조군 RNA의 높은 선형 상관관계 (R2>0.95)가 표지 과정의 성공에 대한 대조군으로서 확인된다.
모든 유전자, 또는 단지 목적하는 유전자 (예를 들어, ALOX15, IL-1β, TLR1, TLR2, CD69 및/또는 CD52, 및 β-액틴 및/또는 GAPDH)에 대한 프로필 데이타를 컴퓨터 프로그램 젠스프링(GeneSpring)™에 입력하여 정규화시킨다. 3개의 단계는 아피메트릭스 어레이에 대해 젠스프링™에 의해 제시된 표준 방법에 따른 정규화 단계에서 수행한다.
1) 데이타 변환 (0.01 미만의 모든 값은 0.01로 설정함)
2) 50번째 백분위수(percentile)로의 정규화.
3) 정중으로의 정규화.
이어서, 목적하는 항정 상태 mRNA (ALOX15, IL-1β, TLR1, TLR2, CD69 또는 CD52 mRNA) 대 항정 상태 GAPDH 또는 β-액틴 mRNA의 비율은 목적하는 mRNA의 정규화된 발현을 GAPDH 또는 β-액틴 mRNA의 정규화된 발현으로 나누어 결정할 수 있다.
본 발명의 항원 부가된 수지상 세포는 질병의 치료 또는 예방시의 백신으로서 T 세포의 활성화를 위해 유용하고, 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항원 부가된 수지상 세포는 항원에 대해 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이들 세포는 미래의 감염 또는 질병을 에방하거나 진행되고 있는 질병, 예를 들어 병원체 감염 또는 암 (이로 제한되지 않음)의 치료를 위해 면역계를 활성화시키는 백신으로서 사용될 수 있다. 항원 부가된 수지상 세포는 적합한 담체, 예를 들어 생리학적 버퍼 또는 다른 주사가능 액체와 함께 백신 또는 제약 조성물로서 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 백신 또는 제약 조성물은 면역 반응 유도에 충분한 치료 유효량으로 투여될 것이다.
바람직하게는, 수지상 세포에는 그로부터 수지상 세포가 유래하고 동일한 대상체에게 투여되는, 대상체에게 자가 유래성인 항원이 부가된다 [예를 들어, 항원 부가된 수지상 세포 및 특히 RNA 부가된 수지상 세포의 제조 및 용도를 기재하고 있는 U.S. 5,853,719 (그 내용이 본원에 참고로 포함됨) 참조]. 별법으로, 수지상 세포에는 DC 요법의 의도하는 수여자에게 자가 유래성이 아닌 항원이 부가될 수 있다. 상기 항원의 예는 공지의 치료 표적인 항원, 예를 들어 텔로머라제, 전립선 특이적 항원, 및 다른 종양 마커, 또는 병원체로부터의 공지의 항원을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
단핵구 또는 단핵구를 포함하는 PBMC 의 수거 방법
단핵구 및 단핵구를 포함하는 PBMC를 대상체로부터 수거하는 다양한 방법이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, PBMC의 수거를 위한 백혈구 성분 채집술 및 단핵구의 정제를 위한 분급분리에 대한 상세한 정보에 대해서는 gambrobct.com/Products_&_Services/ 참조. 바람직한 실시태양에서, 백혈구 성분 채집 산물 및 혈장은 감브로 비씨티 코베 스펙트라 (감브로 비씨티, 미국 콜로라도주 레이크우드) 상에서 AutoPBSC (자동 말초혈액 줄기세포 (Automated Peripheral Blood Stem Cell)) 과정을 사용하여 별개의 멸균된 1회용 단일 용도 혈구 성분 채집술 (cytopheresis) 백에 수거된다.
백혈구 성분 채집술에 대한 한 대안적인 방법에서, PBMC는 헤파린 처리 주사기에서 혈액의 수거, PBS 중에서의 희석, 히스토파크 (Histopaque) 1077 (시그마 (Sigma)) 상에 적층, PBMC의 원심분리 및 계면에서의 회수에 의해 얻는다 [Woodhead et al. (2000) International Immunol 12:1051-1061 참조]. PBMC의 수거, 정제 또는 분획화를 위한 추가의 방법은 당업자에게 알려져 있다.
백혈구 성분 채집 산물 또는 다른 혈액 산물의 수거 후에, 그 내부에 포함된 단핵구는 1 내지 34℃에서 6 내지 96시간 동안 인큐베이션한다. 한 실시태양에서, 백혈구 성분 채집 산물은 백에 수거된 후, 1 내지 34℃, 바람직하게는 약 6℃ 내지 28℃, 가장 바람직하게는 8 내지 26℃에서 유지된 온도-모니터링되는 수송 용기를 통해 백신 제조 설비로 이송된다. 미국 특허 4,102,807에 기재된 것과 같은 온도 변화의 방지를 돕는 겔 팩 (gel pack)이 수송 용기에 포함될 수 있다. 예를 들어, 단핵구는 도 1에 도시된 바와 같이 단열 용기 (예를 들어, 써모세이프(ThermoSafe)™ 모델 E65 폴리우레탄 포움 단연 용기)에 써모세이프™ U-tek 겔 팩 및 겔 매트 (gel matrix)로 포장된다. 예를 들어, 도 1에 도시된 포장 과정에서, -1℃의 온도로 조정된 16온스 U-tek 겔 매트가 E65 용기의 바닥에 평평하게 펼쳐진다. 2개의 16 온스 U-tek 겔 매트 (-1℃)를 접어 제1 겔 매트와 E65 용기의 짧은 벽 사이에 배치한다. 이어서, 2개의 16온스 U-tek 겔 (+18℃로 조정)을 이전의 겔 매트 옆에 수직으로 배치한다. 써모세이프™ INF3000 이식 용기를 겔 사이에 배치한다. 백혈구 성분 채집 백을 밀봉된 내부 백 (STP711) 내에 배치한다. 내부 백의 온도를 기록하는 장치를 사용하여 수송 동안 온도를 모니터링할 수 있다. 상기 장치는 써모세이프™ 데이카로거 (DataLogger)이다. 내부 백을 밀봉된 외부 백 (STP710) 내에 배치한 후, 백을 INF3000 용기 내에 배치한다. 16온스 U-tek 겔 (+18℃)을 닫힌 INF300 용기 상에 놓고, 크라프트 (Kraft) 종이 및 이어서 4" 포움 마개로 마무리한다. 이어서, 상자를 테이프로 밀봉하고 수송 준비 상태로 대기한다.
1-34℃에서의 인큐베이션 기간 동안 또는 그 후에, 백혈구 성분 채집 산물을 수지상 세포 전구체 (단핵구)를 포함하는 단핵 세포 분획을 분리 및 농축하기 위해 50 ml 원뿔형 튜브에서 실온에서 예를 들어 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 추가로 처리 또는 정제할 수 있다. 바람직하게는, 인산염 완충 염수 (PBS)를 사용하여 수회 세척한 후에, 세포 농도 및 세포 생존성을 결정할 수 있다.
단핵구의 농축
단핵구의 농축 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 밀도 구배 원심분리 (예를 들어, 희석 피콜 밀도 구배 원심분리, 희석 퍼콜 (Percoll) 밀도 구배 원심분리 등), 분급분리, 플라스틱에 대한 부착, 접선 유동 여과, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 면역학적 세포 분리 기술 (단핵구를 선택하거나 비-단핵구 (예를 들어, 백혈구, 대식세포, 과립구 등)를 제거하기 위한 항체 패닝, 차별 용해, 자성 세포 분류 등), 플라스틱 마이크로담체 비드로 코팅된 플라스틱 백에서의 배양 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다 [예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [O'Doherty et al. (1993) J Exp Med 178:1067-1076; Young et al. (1990) J Exp Med 171:1315-1332; Freudenthal et al. (1990) PNAS 87:7698-7702; Bernhard et al. (1995) Cancer Res 55:1099-1104; Caux et al. (1992) Nature 360:258-261; Read et al. (2003) "Evaluation of a Closed Automated System to Isolate Peripheral Blood Monocytes for Dendritic Dell (DC) Immunotherapy", Ninth annual meeting of the ISCT; Mu et al. (2003) Scand J Immunol 58:578-586; Maffei et al. (2000) Transfusion 40:1419-1420; mitenyibiotec.com; Meyer-Wentrup et al. (2003) J Hematother Stem Cell Res 12:289-299; 및 WO 2004/000444 참조]. 예를 들어, 자성 세포 분류는 양성 선택 (CD14+ 세포) 또는 음성 선택 (즉, 단핵구가 아닌 세포, 예를 들어, CD3+, CD19+ 및 CD2+ 세포의 제거)에 의해 단핵구를 농축하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 단핵구는 대상체의 백혈구 성분 채집 산물로부터 단핵구를 단리하는 자동화 방법인 분급분리에 의해 백혈구 성분 채집 산물로부터 농축된다. 백혈구 성분 채집술의 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 분급분리는 감브로 비씨티 엘루트라(Elutra)™ 세포 분리 시스템 (Cell Separation System) (감브로 비씨티)으로 수행할 수 있다. 분급분리 버퍼는 1000 mL의 5％ 인간 알부민 혈청 (HSA)을 행크 균형잡힌 염 용액 (Hank's Balanced Salts Solution (HBSS))의 4L 백에 첨가하여 제조할 수 있다. 세포는 제조자의 프로토콜에 따라 분급분리에 의해 분획화될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 제조자 (감브로 (Gambro))의 프로토콜의 변형된 형태를 분급분리를 위해 사용하고, 여기서 최종 로터 오프 (rotor off) 분획은 제5 분획이 아니라 제4 분획이다. 차별 분석을 사용한 CBC를 순도 및 회수를 확인하기 위해 단핵구 분획에 대해 수행할 수 있다. 별법으로, 단핵구 순도는 CD14를 사용한 면역표현형 검사 (immunophenotyping)로 수행할 수 있다. 이어서, 농축된 단핵구는 수지상 세포로 분화될 수 있거나, 또는 동결되어 추후 사용을 위해 저장될 수 있다. 한 실시태양에서, 세포는 25 ml 또는 50 ml 동결 백에 동결된다. 동결 백의 예는 크리오사이트 (Cryocyte)™ 동결 백, 오리겐 (Origen)™ 동결 백 (크리오스토어 (Cryostore)) 및 폴 (Pall)™ 동결 백을 포함한다. 바람직하게는, 각각의 동결 백은 약 10-12％ DMSO 및 10-20％ 열 불활성화된 여과된 혈장, 최종 농도 약 107 내지 507 mg/L의 CaCl2 및 최종 농도 약 44 내지 241 mg/L의 MgSO4를 포함하는 배양 배지 (예를 들어, AIM V, X-VIVO, RPMI 등) 중의 15 mL의 3 x 109개 이하의 세포를 포함한다. 세포는 속도 제어된 동결기를 사용하여 동결된 후, 냉동 저장될 수 있다.
다른 실시태양에서, PBMC의 인큐베이션 및 피콜 밀도 구배에 의한 정제 후에, PBMC를 AIM-V(등록상표) 배지에 재현탁시키고, T150 cm2 플라스크에 2.0 x 108 세포/플라스크로 씨딩한다. 불충분한 수의 PBMC가 얻어질 경우, PBMC를 동결하여 제2의 백혈구 성분 채집술 산물과 합한다. 단핵구는 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 1 내지 2시간 동안 멸균 조직 배양 플라스틱 플라스크에 부착시켜 PBMC의 단핵 세포 집단으로부터 선택한다. 비-부착 및 반부착 세포를 제거한다. 잔류하는 비-부착 세포, 반부착 세포 및 잔류 배지를 제거하기 위해 플라스크에 PBS를 첨가한다. 잔류하는 부착 세포의 주종은 단핵구이고, 농축된 단핵구의 집단을 나타낸다.
단핵구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 방법
단핵구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 다양한 방법이 당업자에게 알려져 있다 [그 내용이 본원에 참고로 포함된 U.S. 6,607,722, WO 97/29182, 문헌 [Romani, et al. (1994) J. Exp. Med. 180:83-93; Sallusto and Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179:1109 및 Reddy et al. (1997) Blood 90:3640-3646] 참조]. 대부분의 상기 방법은 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 유도하는 사이토킨의 존재 하에 단핵구를 배양하는 것을 수반한다. 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 다른 방법의 예는 물리적 진탕 (예를 들어, 전단)에 대한 노출, 세포 DNA 성분과의 광부가물을 형성할 수 있는 광활성화제의 존재 하의 조사 및/또는 DNA 결합제 처리, 이어서 질병 효과기 물질, 예를 들어 미생물, 진균, 바이러스, 및 악성 세포와 함께 실시하는 인큐베이션을 포함하고, 이로 제한되지 않는다 [그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,607,722 참조].
한 실시태양에서, 단핵구는 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 유도하는 조성물을 포함하는 배지 내에서의 배양에 의해 수지상 세포로 분화된다. 단핵구, 미성숙 및 성숙 수지상 세포의 배양을 위해 적합한 배지는 AIM-V, X-VIVO-15, RPMI, DMEM 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 유도하는 조성물은 당업계에 알려져 있고, GM-CSF + IL-4; GM-CSF + IL-13; 및 IFNα를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
바람직한 실시태양에서, 농축된 단핵구는 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 배양에 의해 수지상 세포로 분화된다 (예를 들어, WO97/29182; 문헌 [Sallusto and Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179:1109; 및 Romani et al. (1994) J. Exp. Med. 180:83-93] 참조). 간단히 설명하면, 바람직하게는 1 x 106 세포/ml 농도의 농축된 단핵구를 800 U/ml GM-CSF 및 500 U/ml IL-4의 존재 하에 약 4-7일, 바람직하게는 6일 동안 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 AIM V 배지, X-VIVO 15 배지 또는 다른 적합한 배지에서 배양하여 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시킨다. 사이토킨 농도는 변경될 수 있다. 예를 들어, GM-CSF의 바람직한 농도는 500 내지 1500 U/ml, 보다 바람직하게는 700 내지 1000 U/ml, 가장 바람직하게는 800 U/ml이다. IL-4의 바람직한 농도는 400-1500 U/ml, 보다 바람직하게는 450 내지 1000 U/ml, 가장 바람직하게는 500 U/ml이다. IL-13 또는 IL-15는 IL-4 대신에 또는 그에 추가하여 사용될 수 있다. IFNα는 GM-CSF + IL-4, IL-13 또는 IL-15 대신에 사용될 수 있다. 단핵구가 수지상 세포로 분화함에 따라, 이들은 점차적으로 CD14를 발현하지 않고, 미성숙 상태의 수지상 세포의 표현형에 일치하게 CD80을 발현하게 된다.
미성숙 수지상 세포의 성숙 수지상 세포로의 성숙 방법
미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙시키는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 항원 흡수 및/또는 성숙을 유도하는 조성물과의 접촉을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하는 조성물은 단핵구 조건화 배지; PBMC 조건화 배지; 고정된 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (판소르빈 (Pansorbin)™); 지질다당질 (LPS); 다른 세균 세포 산물, 예를 들어 모노포스포릴리피드 A (MPL), 지질타이코산 등; 포스포릴콜린; 칼슘 이온운반체; 포르볼 에스테르, 예를 들어 PMA; 열 충격 단백질; 뉴클레오티드, 예를 들어 ATP 등; 지질펩티드; Toll-유사 수용체 4; Toll-유사 수용체에 대한 인공 리간드; 이중가닥 RNA, 예를 들어 폴리-I:C 등; 면역자극성 DNA 서열; 성숙 칵테일 (TNF-α, IL-6, IL-1B 및 PGE2); GM-CSF, IL-4 및 성숙 칵테일 (TNFα, IL-6, IL-1β 및 PGE2), GM-CSF, IL-4, PGE2 및 IFNγ의 순차적인 신호 전달, 이어서 CD40L을 사용한 신호 전달 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다 [예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Cisco et al. (2004) J Immunol 172:7162-7168; Jonluit et al. (1997) Eur J Immunol 27:3135-3142]; 미국 특허 출원 공개 20040203143; PCT 출원 PCT/US2005/036304 및 미국 특허 출원 11/246,387 참조).
한 실시태양에서, TNFα, IL-6, IL-1β 및 PGE2를 포함하는 성숙 칵테일을 미성숙 수지상 세포의 배양액에 첨가한다. 이어서, 세포를 철야 (약 12시간 이상) 배양하여 성숙 수지상 세포를 생성시킨다.
하나의 다른 실시태양에서, 미성숙 수지상 세포는 바람직하게는 CD40L을 코딩하는 mRNA, 및 임의로 하나 이상의 항원을 코딩하는 mRNA를 사용한 전기천공에 의해 형질감염시킨 후, 성숙 수지상 세포를 생성시키기 위해 IFNγ 및 임의로 PGE2의 존재 하에 철야 (약 12시간 이상) 배양시킨다. 인간 CD40L cDNA 및 단백질은 각각 서열 120 및 서열 121에 제시되어 있다. 다른 CD40L mRNA는 당업자에게 알려져 있다.
바람직한 실시태양에서, AIM V 배지 내의 성숙 제제는 TNF-α (10 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml), 및 PGE2 (1 ㎍/ml)의 최종 농도가 되도록 미성숙 DC에 직접 첨가된다. 이어서, 세포를 철야 (약 12시간 이상) 배양하여 성숙 수지상 세포를 생성시킬 수 있다. 성숙은 배양 배지에 첨가되거나, 또는 보다 바람직하게는 세포 내에서 발현된 CD40 리간드 (CD40L)에 세포를 노출시켜 임의로 추가로 증가시킬 수 있다. CD40L은 구성적으로 또는 일시적으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 성숙 수지상 세포는 CD40L을 코딩하는 mRNA, 및 임의로 목적하는 하나 이상의 항원을 코딩하는 mRNA로 형질감염된다.
항원
임의의 항원이 미성숙 또는 성숙 수지상 세포에 부가될 수 있다. 이어서, 항원은 성숙 DC에 의해 처리되어 제시될 것이다. 항원의 예는 바이러스 입자, 세균, 또는 다른 병원체, 단백질, 및 그의 단편, 폴리펩티드, 병원체 용해물, 병원체 추출물, 병원체 핵산, 암세포, 암세포 단백질 및 그의 단편, 암세포 용해물, 암세포 추출물 및 암세포 핵산을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 항원은 자연 발생하거나, 화학적으로 처리되거나 또는 재조합 생산될 수 있다. 항원은 폴리펩티드, 단백질로서 또는 핵산으로서 당업계에 알려진 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있다.
항원은 항원 제조 또는 항원이 수지상 세포를 만나는 환경 내로 항원의 도입시에 인간의 개입이 관련되지 않기 때문에 그의 "천연" 형태로 전달될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항원은 예를 들어 통상적인 알레르기 샷 (shot) 또는 종양 용해물로 통상 투여되는 종류의 조질 제제를 포함할 수 있다. 항원은 별법으로 실질적으로 정제된, 예를 들어 적어도 약 90％ 순도일 수 있다.
항원이 펩티드인 경우, 항원은 예를 들어 단리된 단백질의 단백질 분해 절단에 의해 생성될 수 있다. 펩신, 브롬화시안, 트립신, 키모트립신 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 다양한 절단제를 사용할 수 있다. 별법으로, 펩티드는 바람직하게는 당업계에서 이용가능한 자동화 합성기에서 화학적으로 합성하거나, 또는 재조합 방식으로 발현될 수 있다. 또한, 재조합 기술을 사용하여 목적하는 펩티드를 코딩하는 핵산을 생성시키고, 목적하는 조건 하에 펩티드를 발현시킬 수 있다. 별법으로, 항원 코딩 핵산은 정제될 수 있거나 또는 세포, 조직 또는 바이러스로부터 유도될 수 있다.
항원은 임의의 자연 발생 화합물과 구별되는 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 항원은 자연 발생 항원과 실질적으로 동일한 구조를 갖지만 자연 발생 화합물의 정밀 구조의 하나 이상의 변형을 포함한다는 점에서 "변형 항원"이다.
예를 들어, 자연 발생 항원이 단백질 또는 폴리펩티드 항원인 경우, 단백질 또는 폴리펩티드 항원에 비해 변형 항원은 하나 이상의 아미노산의 부가, 치환 또는 결실에 의해 자연 발생 항원과 상이한 아미노산 서열을 갖고(갖거나) 아미노산에 공유 연결된 하나 이상의 화학적 잔기의 부가, 치환 또는 결실에 의해 자연 발생 항원의 대응하는 아미노산과 상이한 하나 이상의 아미노산을 포함할 것이다. 한 측면에서, 자연 발생 및 변형 항원은 적어도 75％ 동일한 적어도 5개의 아미노산의 적어도 하나의 영역을 공유한다. 당업자는 동일성 정도를 결정하기 위해 두개의 아미노산 서열을 비교할 때, 동일한 아미노산의 스트레치 (stretch) (즉, 적어도 2개의 영역) 사이의 공간이 항상 정확하게 보존될 필요는 없음을 이해할 것이다. 자연 발생 및 변형된 단백질 또는 폴리펩티드 항원은 적어도 5개의 아미노산의 적어도 하나의 영역의 아미노산 서열에서 적어도 약 80％ 동일성, 별법으로 85％, 90％, 95％, 또는 99％ 초과의 동일성을 보일 수 있다. 종종, 아미노산 서열의 훨씬 더 긴 영역 (예를 들어, 10, 20, 50, 또는 100개 또는 그보다 많은 아미노산)이 목적하는 수준의 동일성을 보이는 것이 유용할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 항원은 유전자의 발현이 처리되는 개체 (생체 내로 전달될 때) 또는 세포 배양 시스템 (시험관 내에서 전달될 때)에서 항원을 생산시키도록 폴리뉴클레오티드 또는 항원을 코딩하는 유전자로서 전달된다. 발현가능 유전자 또는 mRNA를 포함하는 핵산을 생성시키고 상기 핵산을 발현가능 유전자에 의해 코딩되는 임의의 단백질이 생산되는 발현 시스템 내로 도입하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있고, 아래에서 간단히 설명되다. 바람직하게는, 항원은 mRNA로서 전달된다. (예를 들어, 암세포, 병원체 세포 또는 병원체-감염된 세포)로부터 얻은 RNA 또는 mRNA는 수지상 세포 내로 직접 부가될 수 있다. 별법으로, RNA 또는 mRNA는 부가 전에 증폭될 수 있다. 한 실시태양에서, 총 또는 표적 mRNA는 cDNA 발현 구성체를 제조하기 위해 센스 프로모터를 포함하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭될 수 있다. 이어서, 발현 구성체로부터 시험관 내에서 전사된 RNA를 사용하여 세포에 부가시킬 수 있다. RNA의 단리, 증폭, 시험관 내 전사 및 RNA 또는 다른 핵산의 수지상 세포 내로의 부가 방법은 당업자에게 알려져 있다 [예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 PCT/US04/39539 및 U.S. 가출원 60/522,310 참조].
본 발명의 한 실시태양에서, 항원은 하나 이상의 HIV 단백질 또는 그의 단편이다. 비제한적인 예로서, HIV 감염된 환자로부터의 혈장은 HIV RNA의 단리를 위한 공급원으로서 기능할 수 있다. 한 실시태양에서, 혈장의 일부는 원심분리되고, 상등액을 수거하여 0.22 ㎛ 필터로 여과하고, 수지상 세포 백신의 제조에 사용할 때까지 -2O℃에서 저장한다. 혈장에 존재하는 HIV RNA는 수지상 세포 내로 부가하기 위한 충분한 양의 증폭된 HIV RNA를 제공하기 위해 RT-PCR 및 시험관 내 전사 반응에 의해 증폭된다. 간단히 설명하면, 바이러스 RNA는 역전사효소, 적절한 반응 버퍼 및 무작위 헥사머 또는 표적 역 프라이머를 사용하여 단일가닥 (ss) DNA로 역전사된다. 이어서, 단일가닥 cDNA는 복합 프라이머를 사용한 1차 PCR 반응에서 이중가닥 DNA로 PCR에 의해 증폭된다. 1차 PCR 반응에서 증폭된 영역(들)의 동일성은 상기 영역에 인접한 표적 서열에 상보성인 특정 프라이머의 선택에 의해 결정된다. 1차 PCR 반응 산물은 퀴아퀵 (QIAquick)(등록상표) PCR 정제 키트를 사용하여 정제된 후, 제2회 또는 이중 (nested) PCR 증폭에서 주형으로서 기능한다. 상기 증폭 라운드에서, 5' 프라이머(들)은 RNA 폴리머라제 결합 부위 (예를 들어, T7 프로모터)를 갖는 오버행 (overhang)을 포함하고, 3' 프라이머는 폴리 T 스트레치를 갖는 오버행을 포함한다. 이중 라운드의 PCR에서 오버행 영역에 의해 도입된 변형은 PCR 산물의 시험관 내 전사 및 수지상 세포 내로의 전달 시의 성공적인 번역을 가능하게 한다. 시험관 내에서 전사된 RNA의 정제는 퀴아겐 알엔이지 (Qiagen RNeasy)(등록상표) 키트를 사용하여 수행하고, RNA를 뉴클레아제 미함유 물로 용출시킨다. 필요한 경우, 에탄올 침전을 수행하여 RNA를 농축시킨다. RNA는 뉴클레아제 미함유 물에 재현탁시키고, 0.8/0.2 ㎛ 폴리에테르술폰 (PES) 필터에 통과시킨 후, 0.5 ml의 안전 잠금 폴리프로필렌 튜브 내로 분배하고, DC 내로 부가되거나 형질감염 전에 해동시까지 ≤-150℃에서 냉동보존한다.
다른 바람직한 실시태양에서, RNA 또는 mRNA는 하나 이상의 암세포로부터 추출된다. RNA 또는 mRNA는 직접 수지상 세포 내로 부가되거나, 또는 PCT/US04/39539에 기재된 방법을 사용하여 RT-PCR 및 시험관 내 전사에 의해 먼저 증폭될 수 있다.
수지상 세포의 항원 부가
수지상 세포는 미성숙 수지상 세포, 성숙 수지상 세포로서, 또는 미성숙 수지상 세포로부터 성숙 수지상 세포로의 분화 동안 하나 이상의 항원이 부가될 수 있다. 수지상 세포는 항원, 예를 들어 단백질, 펩티드, 바이러스, 세포, 세포 용해물 등을 섭취할 수 있다. 따라서, 항원 부가는 단순히 수지상 세포를 항원 또는 항원을 코딩하는 핵산과 접촉함으로써 수행할 수 있다. 핵산 형질감염, 엑소좀, 바이러스 벡터, 미세입자 전달 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는 수지상 세포를 부가하기 위한 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있다 [예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Mitchell et al. (2000) Curr Opin Mol Ther 2:176-181; Zitovogel et al. (1998) Nature 4:594-600; Jenne et al., (2001) Trends Immunol 22:102-106], 및 미국 특허 출원 공개 2005/0158856 참조]. 하나 이상의 항원이 직접 수지상 세포에 부가되거나, 또는 하나 이상의 항원을 코딩하는 핵산이 수지상 세포 내로 부가 (형질감염)될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 수지상 세포에는 하나 이상의 항원을 코딩하는 핵산이 부가된다. 바람직하게는, 핵산은 mRNA이다.
핵산을 수지상 세포 내에 형질감염시키는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 수동 형질감염, 지질-매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염 (예를 들어, DOTAP), 양이온성 펩티드 매개 형질감염, 전기천공을 포함하고, 이로 제한되지 않는다 [그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Nair et al. (1998) Nat Biotechnology 16:364-369; Van Tendeloo et al. (2001) Blood 98:49-56; Saeboe-Larssen et al. (2002) J Immunol Methods 259:191-203; Boczkowski et al (2000) Cancer Res 60:1028-1034; Gilboa et al. Immunol Rev (2004) 199:251-263]; U.S. 특허 가출원 60/583,579; 및 미국 특허 출원 10/177,390 참조].
펩티드 펄싱 ( pulsing )에 의한 부가 수지상 세포
수지상 세포에 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 세포 또는 조직 추출물 및 다른 종로의 항원을 부가하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 바람직한 실시태양에서, 미성숙 수지상 세포에는 하나 이상의 항원이 부가된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 세포 또는 조직 추출물은 단순히 미성숙 수지상 세포를 배양 배지에서 인큐베이션함으로써 부가된다.
전기천공에 의한 항원 부가 및 사이토킨 칵테일을 사용한 미성숙 수지상 세포의 성숙
본 발명의 한 실시태양에서, 미성숙 수지상 세포는 세포를 떼어내기 위해 배양 플라스크를 가볍게 두드려 회수한다. 이어서, 현탁액 중의 세포를 원뿔형 튜브에 이송한다. PBS를 배양 플라스크에 첨가하여 잔류하는 부유 세포 및 잔여 배지를 제거하고, 이를 원뿔형 플라스크에 첨가한다. 몇몇 미성숙 수지상 세포는 플라스크에 부착된 상태로 유지될 수 있다. 상기 세포의 이탈은 PBS를 첨가하고 플라스크를 2℃ 내지 실온의 임의의 장소에서 인큐베이션함으로써 촉진시킨다. 인큐베이션 기간 종료시에, 플라스크를 두드리고, 이탈된 세포를 원뿔형 튜브에 첨가한다. 이어서, 총 세포 현탁액을 펠렛화시키고, PBS로 세척하고, 냉각된 비아스팬 (ViaSpan)(등록상표)에 4x1O7/ml로 0.5 ml에 재현탁시키고, 빙상에 놓는다. DC를 항원(들)을 코딩하는 mRNA에 대해 2㎍/106 세포로 mRNA와 혼합하고, 4 mm 갭 전기천공 큐벳 (cuvette)에 넣고, 275-350 V, 100-300 Ω 및 150 ㎌, 바람직하게는 325V, 200Ω의 펄스에서 전기천공시킨다. 전기천공 직후에, DC를 X-VIVO 15 배지로 세척하고, GM-CSF (800 U/ml), IL-4 (500 U/ml) 및 PGE2 (1 ㎍/ml), TNF-α (10 ng/ml), IL-1β (1O ng/ml) 및 IL-6 (1OO ng/ml)로 보충된 X-VIVO 15 중에 1x1O6/ml로 재현탁시킨다. 이어서, 미성숙 수지상 세포를 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 철야 인큐베이션하여 성숙 수지상 세포를 안정적으로 생성시킨다. 이어서, 성숙 수지상 세포를 PBS로 세척한다.
전기천공에 의한 항원 부가 및 CD40L 을 사용한 성숙
본 발명의 한 실시태양에서, 미성숙 수지상 세포는 CD40L 및 IFN-γ를 사용하여 성숙된다. 바람직하게는, 미성숙 DC는 상기한 바와 같이 전기천공에 의해 4 ㎍ CD40L mRNA/106 세포 및 하나 이상의 항원을 코딩하는 mRNA (2 ㎍/106 세포)로 형질감염시킨 후, GM-CSF (800-1000 U/ml), IL-4 (500-1000 U/ml), IFN-γ (500-1OOO U/ml) 또는 TNF-α (10 ng/ml) 및 PGE2 (1 ㎍/ml)로 보충된 X-VIVO 15에서 철야 배양하여 안정한 성숙 수지상 세포를 생성시킨다. 상기 방법에 의해 성숙된 수지상 세포는 상기한 사이토킨 칵테일에 의해 성숙된 수지상 세포에 비해 보다 높은 수준의 IL-12 (T 세포 성장 인자), 및 최소의 IL-10을 분비한다.
성숙 수지상 세포의 전기천공에 의한 항원 부가
성숙 수지상 세포에는 당업자에게 알려진 방법에 의해 항원이 부가될 수 있다. 본 발명의 한 비제한적인 실시태양에서, 단핵구의 미성숙 수지상 세포로의 분화 개시 후 제6일에, AIM V 배지 중의 성숙 제제를 미성숙 DC에 직접 첨가하여 TNF-α (10 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) 및 PGE2 (1 ㎍/ml)의 최종 농도를 얻는다. 이어서, 세포를 철야 배양하여 성숙 수지상 세포를 생성시킨다. 이어서, DC를 수거하여 1 ㎍의 항원 코딩 RNA 및 임의로 4 ㎍의 CD40L RNA/106 세포로 동시 전기천공한다. 전기천공 후에, 세포를 GM-CSF (800 U/mL) 및 IL-4 (500 U/mL)로 보충된 AIM V 배지에서 1 x 106 세포로 4시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 동결하지 않은 상태로 대상체에게 투여하기 위해 제제화하거나 동결을 위해 제제화할 수 있다. 동결을 위해, 세포는 바람직하게는 열 불활성화된 자가 혈장, 10％ DMSO 및 5％ 덱스트로스에 2 x 107 세포/mL로 제제화된다. 냉동 바이알에 1.4 x 107 세포/바이알의 총수가 되도록 0.7 mL를 충전한다. 이어서, 바이알을 -85℃에서 최소 4시간 동안 알콜 상자에서 동결시키고, 보관을 위해 냉동 동결기에 이송한다. 이어서, 동결된 수지상 세포 백신을 해동하고, 세척 또는 재제제화를 수행하지 않고 대상체에게 투여할 수 있다.
성숙을 평가하기 위한 DC 의 유세포 측정 분석
바람직한 방법에서, 106개의 DC를 수거하여 냉각된 PBS/1％ FCS에 재현탁시킨다. MHC 분자 (HLA-ABC, HLA-DR), 동시자극 분자 (CD80, CD86), 성숙 마커 (CD83) 및 단핵구 마커 (CD14)에 특이적인 피코에리트린 (PE) 또는 FITC 컨쥬게이팅된 항체를 96웰 플레이트 (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences))에서 웰당 1x105개의 DC와 혼합하고, 4℃에서 최소 15분 동안 인큐베이션한다. 이소형 일치 항체를 대조군으로 사용하였다. 철저히 세척한 후에, 형광 분석을 셀퀘스트 (CellQuest) 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 팩스칼리버 (FACScalibur) 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)로 수행하였다.
백신 제제
수지상 세포 백신의 제제화 방법은 당업자에게 알려져 있다. 바람직한 실시태양에서, 성숙 수지상 세포를 세척하고, 열 불활성화된 혈장 (바람직하게는 자가 혈장) 및 10％ 덱스트로스에 4 x 107 세포/ml의 농도로 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 열 불활성화된 혈장과 20％ DMSO의 혼합물로 1:1로 희석하여 열 불활성화된 혈장 중의 5％ 덱스트로스, 10％ DMSO의 최종 농도를 얻는다. 표적 최종 충전 제제는 동결보존에 적합한 용기 중의 1.4 x 107 세포/0.7 ml이다. 이어서, 수지상 세포를 환자에게 투여하거나 또는 바람직하게는 -85℃에서 동결시키고, 바람직하게는 ≤-150℃의 온도에서 냉동 동결기 (바람직하게는 오염을 방지하도록 디자인된 무수 액체 질소 동결기)에 저장한다. 이어서, 동결된 백신은 환자 투여 (바람직하게는 피내 주사에 의해)를 위해 임상 현장으로 수송될 수 있다. 해동시에, 백신은 추가의 처리 없이 환자에게 직접 투여될 수 있다.
투여에 적합한 다른 제제는 항산화제, 버퍼, 정균제, 및 제제를 의도하는 수여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있는 수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 비후제, 안정화제, 보존제, 면역자극제, 사이토킨 및 항원보강제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 성숙 수지상 세포는 열 불활성화된 자가 혈장 및 10％ 덱스트로스 중에 4 x 107 세포/ml의 최종 농도로 현탁된다. 이어서, 상기 세포는 열 불활성화된 자가 혈장과 20％ DMSO의 혼합물로 1:1 희석되어 5％ 덱스트로스 및 10％ DMSO를 포함하는 열 불활성화된 자가 혈장 중에서 2 x 107 세포/ml의 최종 농도를 얻는다. 최종 충전 제제는 동결보존에 적합한 용기 중의 1.4 x 107 세포/0.7 ml이다. 이어서, 백신은 동결되고, ≤-150℃에서 무수 액체 질소 동결기에 저장한다. 백신은 세척 및 재현탁의 필요없이 해동 후에 바로 투여가능하도록 준비된 상태이다.
투여 방법
예를 들어, 주사 (예를 들어, 피하, 피내, 정맥내, 림프내, 관절내, 근내, 복강내), 연속 주입, 이식체로부터의 지속 방출 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 수지상 세포 백신을 투여할 수 있다. DC 백신은 일반적으로 2 내지 4주의 간격으로 투여되어 왔다. 수지상 세포 백신은 생리학상 허용되는 담체, 버퍼, 희석제, 항원보강제, 면역조절제 등과 함께 투여될 수 있다. 바람직하게는, 수지상 세포 백신은 투여되는 환자에게 자가 유래성이거나 HLA 일치성이다.
대상체에게 투여되는 세포 (예를 들어, 활성화된 T 세포, 또는 수지상 세포)의 투여량은 시간에 걸쳐 대상체에서 목적하는 유익한 치료 반응을 달성하거나 암세포 성장을 억제하거나 감염을 억제하는데 효과적인 유효량이다. 바람직한 투여량은 약 107 세포이다. 생물학적 반응 조절제가 본 발명의 DC 또는 활성화된 T 세포에 의한 치료에 임의로 부가된다. 예를 들어, 세포는 임의로 항원보강제, 또는 사이토킨, 예를 들어 GM-CSF, IL-12 또는 IL-2와 함께 투여된다.
항원 부가된 수지상 세포 또는 교육된 ( educated ) T 세포의 면역원성 평가 방법
본 발명의 방법에 의해 생산된 항원 부가된 수지상 세포 또는 교육된 T 세포의 면역원성은 다음을 포함하여 이로 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다:
51 Cr -방출 용해 분석. 항원-특이적 T 세포에 의한 펩티드-펄싱된 51Cr-표지된 표적의 용해를 비교할 수 있다. "보다 활성의" 조성물은 시간의 함수로서 보다 큰 표적 용해를 보일 것이다. 용해의 동역학 및 고정된 시점 (예를 들어, 4시간)에서의 전체적인 표적 용해를 사용하여 성능을 평가할 수 있다 [Ware, C.F. et al. (1983) J. Immunol. 131:1312].
사이토킨-방출 분석. 변형된 APC와 접촉시에 T 세포에 의해 분비된 사이토킨의 종류 및 양에 대한 분석은 기능적 활성의 측정일 수 있다. 사이토킨은 사이토킨 생산의 속도 및 총량을 결정하기 위해 ELISA 또는 ELISPOT 분석에 의해 측정할 수 있다 [Fujihashi, K. et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:181; Tanquay, S. and Killion, J.J. (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13:259].
시험관 내 T 세포 교육. 본 발명의 조성물은 정상 공여자 또는 환자-유래 PBMC로부터 반응성 T 세포 집단을 유도하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 상기 시스템에서, 유도된 T 세포는 용해 활성, 사이토킨-방출, 폴리클로날성, 및 항원 에피토프에 대한 교차 반응성에 대해 시험될 수 있다 [Parkhurst, M.R. et al. (1996) J. Immunol. 157:2539].
증식 분석. T 세포는 반응성 조성물에 반응하여 증식할 것이다. 증식은 예를 들어 3H-티미딘 흡입을 측정함으로써 정량적으로 모니터링할 수 있다 [Caruso, A. et al. (1997) Cytometry 27:71].
트랜스제닉 ( transgenic ) 동물 모델. 면역원성은 HLA 트랜스제닉 마우스를 본 발명의 조성물로 백신처리하고 유도된 면역 반응의 특성 및 규모를 결정하여 생체 내에서 평가할 수 있다. 별법으로, hu-PBL-SCID 마우스 모델은 인간 PBL의 이입 전달에 의해 마우스에서 인간 면역계의 재구성을 가능하게 한다는 것이 입증되었다. 상기 동물은 문헌 [Shirai, M. et al. (1995) J. Immunol. 154:2733; Mosier, D.E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2443]에 언급된 바와 같이 조성물로 면역처리하고 면역 반응에 대해 분석할 수 있다.
영장류 모델. 비-인간 영장류 (침팬지) 모델 시스템을 사용하여 HLA-제한 리간드의 생체 내 면역원성을 모니터링할 수 있다. 침팬지는 인간 MHC 분자와 중첩되는 MHC-리간드 특이성을 공유하여 생체 내 면역원성에 대해 HLA-제한 리간드를 시험할 수 있도록 한다 [Bertoni, R. et al. (1998) J. Immunol. 161:4447].
TCR 신호 전달 사건의 모니터링. 복수개의 세포내 신호 전달 사건 (예를 들어, 인산화)은 MHC-리간드 복합체에 의한 성공적인 TCR 개입 (engagement)과 관련된다. 상기 사건에 대한 정량적 및 정성적 분석은 TCR 개입을 통해 효과기 세포를 활성화시키는 조성물의 상대적인 능력과 관련되었다 [Salazar, E. et al. (2000) Int. J. Cancer 85:829; Isakov, N. et al. (1995) J. Exp. Med. 181:375].
면역 세포의 단리 및 특성화 방법
세포 단리 또는 세포 정제 동안 세포의 검출을 위한 면역분석은 임의의 복수의 형태, 예를 들어, 문헌 [Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Fla.; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam; Harlow and Lane, 상기 문헌; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, Fla.; Price and Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; 및 Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY]에서 검토된 것으로 수행할 수 있다.
세포는 유세포 측정 방법, 예를 들어 FACS 분석에 의해 단리 및 특성화될 수 있다. 광범위한 유동 세포 측정 방법이 알려져 있다. 형광 활성화된 유세포 측정에 대한 일반적인 검토에 대해서는 예를 들어 문헌 [Abbas et al. (1991) Cellular and Molecular immunology W.B. Saunders Company, particularly chapter 3, 및 Kuby (1992) Immunology W.H. Freeman and Company, particularly chapter 6]을 참조한다. FACS 기기는 예를 들어 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson)으로부터 입수할 수 있다.
세포 항원을 표지하기 위해 사용될 수 있는 표지제는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단백질, 또는 다른 중합체, 예를 들어 친화도 매트릭스, 탄수화물 또는 지질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 검출은 임의의 공지의 방법, 예를 들어 면역블로팅, 웨스턴 블롯 분석, 방사성 또는 생물 발광 마커의 추적, 모세관 전기영동, 또는 크기, 전하 또는 친화도를 기초로 하여 분자를 추적하는 다른 방법에 의해 수행된다.
다음 실시예는 예시하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
1일령 백혈구 성분 채집술로 제조된 수지상 세포
말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 백혈구 성분 채집술에 의해 4명의 인간 공여자로부터 수거하고, 8℃ 내지 26℃의 온도에서 유지된 온도-모니터링되는 수송 용기에서 수지상 세포 제조 설비로 철야 수송하였다. 수송일에, 백혈구 성분 채집 산물을 50 ml 원뿔형 튜브 (800 x g)에서 20분 동안 실온 (약 19-22℃)에서 피콜 밀도 구배 원심분리에 적용하여 수지상 세포 전구체 (단핵구)를 포함하는 단핵 세포 분획을 분리하고 농축하였다. 인산염 완충 염수 (PBS)를 사용한 2회의 세척 단계 후에, 세포 농도 및 세포 생존성을 결정하였다. PBS를 사용한 제3의 원심분리/세척 단계 후에, 단핵 세포를 스템스판™ H2000 배지 (스템셀 테크놀로지스, 인크. (StemCell Technologies, Inc.))에 재현탁시키고, 플라스크당 2.0 x 108 세포로 T150 cm2 플라스크에 씨딩하였다. 이어서, 단핵구를 멸균 조직 배양 플라스틱 플라스크에 1-2시간 동안 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 부착시켜 단핵 세포 집단으로부터 분리하였다. 비-부착 및 반부착 세포 (주로 림프구)를 버렸다. 주로 단핵구인 잔류하는 부착 세포를 GM-CSF (800 U/ml) 및 IL-4 (500 U/ml) 함유 스템스판™ H2000 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 6일 동안 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에 서 인큐베이션하여 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다.
미성숙 수지상 세포-풍부 집단을 세포를 떼어내기 위해 배양 플라스크를 가볍게 두드려 회수하였다. 현탁액 중의 세포를 원뿔형 튜브에 이송하였다. 추가의 PBS를 플라스크에 첨가하여 잔류하는 부유 세포 및 잔여 배지를 제거하고, 이를 원뿔형 튜브 내의 세포 현탁액에 첨가하였다. 잔류하는 부착 세포의 이탈은 PBS를 첨가하고 플라스크를 2-8℃에서 약 10분 동안 인큐베이션함으로써 완료하였다. 상기 세포를 인큐베이션하면서, 원뿔형 튜브 내의 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시켰다. 인큐베이션 기간 종료 시에, 플라스크를 부드럽게 두드리고, 내용물을 원뿔형 튜브 내의 세포 현탁액에 첨가하였다. 총 세포 현탁액을 펠렛화시키고, PBS에 재현탁시키고, 샘플을 세포 농도, 세포 생존성 및 면역표현형 검사를 위해 제거하였다. 다음 4개 세트의 세포 마커를 유세포 측정으로 조사하였다: 단핵구 계열 (lineage) 마커 (CD3, CD14, CD19, 및 CD56), 수지상 세포 존재의 지표 (CD11c), 항원 제시 세포 마커 (HLA-DR), 및 성숙 수지상 세포 마커 (CD83). 미성숙 수지상 세포-농축된 제제는 무의미한 수준의 계열 마커 및 CD83, 및 높은 수준의 CD11c 및 HLA-DR을 발현하였다.
미성숙 수지상 세포를 HEPES 버퍼, L-글루타민이 존재하고 페놀 레드가 없는 OPTI-MEM(등록상표) I 환원 혈청 배지 (GIBCO™)로 1회 세척하였다. 이어서, 수지상 세포를 106개의 수지상 세포 당 약 2 ㎍의 RNA의 비율에서 전기천공에 의해 증폭된 종양 RNA로 형질감염시켰다. 전기천공은 500 μs 동안 500 V의 펄스로 5 x 107 세포/ml를 포함하는 600 ㎕의 세포 현탁액을 포함하는 4 mm 갭 큐벳에서 수행하였다. 전기천공 후에, 형질감염된 세포를 IL-4 (500 U/ml) 및 GM-CSF (800 LVmI)로 보충된, 스템스판 H2000™ 배지 (혈청 무첨가 배양 배지)를 포함하는 T150 플라스크 (플라스크당 1 큐벳)에 이송하였다. 형질감염된 세포를 2-3시간 동안 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 인큐베이션하여 세포를 전기천공으로부터 회수하였다.
미성숙 전기천공된 수지상 세포를 IL-4 (500 U/ml) 및 GM-CSF (800 U/ml) 및 성숙 칵테일 (5 ng/ml의 IL-1β, 150 ng/ml의 IL-6, 5 ng/ml의 TNF-α 및 1 ㎍/ml의 PGE2)로 보충된 스템스판 H2000™ 배지에서 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 20-24시간 동안 성숙시켰다. 모든 사이토킨, 및 PGE2를 1％ HSA가 존재하는 PBS 중에서 재구성하거나 희석 (PGE2의 경우)하였다. 희석 단계 전에, PGE2를 에탄올 중에서 재구성하였다. 이어서, 성숙 수지상 세포를 세포 해리 버퍼 (트립신 미함유)에 첨가하기 전에 PBS로 세정한 후, 세포 해리 버퍼를 제거하기 위해 PBS로 3회 세척하였다. 샘플을 세포 농도, 생존성 및 면역표현형 검사를 위해 수거하였다. 미성숙 및 성숙 수지상 세포의 면역표현형 검사 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure 112007079161544-PCT00001
형질감염된 성숙 수지상 세포를 최종 농도 2 x 107 세포/ml로 자가 혈장에 현탁시켰다. 이어서, 세포를 80％ 혈장과 20％ DMSO의 혼합물로 1:1로 희석하여 10％ DMSO가 존재하는 90％ 혈장 중의 3 x 106 또는 1 x 107 세포/ml의 최종 농도를 얻은 후, 속도 제어 동결을 사용하여 냉동 바이알에 동결시키고 ≤-15O℃에서 저장하였다.
실시예 2
1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 수지상 세포 백신은
10％ DMSO에서 해동한 후 적어도 2시간 동안 생존성을 유지한다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 동결된 수지상 세포 백신을 37℃에서 해동하고, 20-25℃ 또는 2-8℃에서 2시간 동안 유지시켰다. 생존성은 해동 직후 및 2시간 동안 30분의 간격으로 결정하였다. 37℃에서 해동 직후 생존성은 92％이었다. 결과를 표 2에 나타내었고, 백신은 적어도 2시간 동안 10％ DMSO에서 해동 및 저장될 수 있음을 확인하였다.
해동후 시간 (분) 생존성 (％)
해동후 20-25℃ 해동후 2-8℃
30 91 88
60 89 86
90 89 80
120 87 83
실시예 3
환자로부터 단핵 세포의 단리 및 단핵구의 미성숙 수지상 세포로의 분화
말초혈 단핵 세포 및 혈장을 환자 또는 자원자로부터 백혈구 성분 채집술로 실온에서 임상 현장에서 수거하였다. 백혈구 성분 채집 산물 (PBMC) 및 혈청을 6℃ 내지 28℃의 온도 범위에서 유지된 온도 제어된 용기로 철야 수송하였다. 백혈구 성분 채집술을 시행한 1일 후에, 단핵구 (수지상 세포 전구체) 및 백혈구를 포함하는 단핵 세포 분획을 분리 및 농축하기 위해 PBMC를 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 50 ml 원뿔형 튜브에 실온에서 정제하였다. 단핵 세포를 인산염 완충 염수 (PBS)로 수회 세척하고, 세포 농도를 결정하였다. PBS를 사용한 최종 원심분리/세척 단계 후에, 단핵 세포를 AIM-V 배지에 재현탁시키고, T150 cm2 플라스크에 플라스크당 2.0 x 108 세포로 씨딩하였다. 이어서, 단핵구를 1 내지 2시간 동안 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 멸균 조직 배양 플라스크에 대한 부착에 의해 단핵 세포 집단으로부터 선택하였다. 비부착 및 반부착 세포를 PBS로 부드럽게 세척하여 제거하였다. 주로 단핵구인 잔류하는 부착 세포를 1000 U/ml GM-CSF 및 1000 U/ml IL-4 함유 X-VIVO 15 배양 배지에서 배양하였다. 세포를 6일 동안 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 인큐베이션하여 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다.
시험관 내 배양 후에, 미성숙 수지상 세포-풍부 집단을 세포를 떼어내기 위해 플라스크를 부드럽게 두드려 회수하였다. 현탁액 중의 세포를 원뿔형 튜브에 이송하였다. PBS를 플라스크에 첨가하여 잔류하는 부유 세포 및 잔여 배지를 제거하고, 이를 동일한 원뿔형 튜브 내의 세포 현탁액에 첨가하였다. 잔류하는 부착 미성숙 수지상 세포의 이탈은 PBS 중에서 2-8℃에서 인큐베이션함으로써 촉진시켰다. 인큐베이션 기간 종료 시에, 플라스크를 부드럽게 두드리고, 내용물을 동일한 원뿔형 튜브 내의 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 총 세포 현탁액을 펠렛화시키고, PBS에 재현탁시키고, 샘플을 세포 농도를 결정하기 위해 제거하였다.
미성숙 수지상 세포를 세척하고, 비아스팬에 재현탁시키고, 106 수지상 세포 당 2 ㎍의 항원 코딩 mRNA로 형질감염시켰다. 전기천공은 0.4 ml의 세포 현탁액 (4 x 107 세포/ml)을 포함하는 4 mm 갭 큐벳에서 300V, 100Ω 및 150 ㎌의 펄스로 수행하였다. 전기천공 후에, 형질감염된 세포를 X-VIVO 15 배지로 희석하고, 원심분리하여 GM-CSF (800 U/ml), IL-4 (500 U/ml), IL-1β (10 ng/ml), IL-6 (150 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) 및 PGE2 (1 ㎍/ml)로 보충된 X-VIVO 15 배지 (혈청 무첨가)에 재현탁시켰다. 세포를 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 철야 인큐베이션하여 성숙시켰다.
형질감염된 성숙 수지상 세포를 최종 농도 4 x 107 세포/ml로 열 불활성화된 자가 혈장 및 10％ 덱스트로스에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 20％ DMSO의 혼합물로 1:1로 희석하여 10％ DMSO 및 5％ 덱스트로스를 포함하는 열 불활성화된 자가 혈장 중의 2 x 107 세포/ml의 최종 농도를 얻은 후, 멸균 동결 바이알에 ≤150 ℃에서 동결하였다.
실시예 4
6℃ 내지 28℃에서 철야 인큐베이션된 단핵구로부터 제조된 수지상 세포의
물리적 및 기능적 특성 분석
본 실시예에서의 데이타는 1일령 성분채집 산물로부터 RNA 형질감염된 수지상 세포를 생산하는 기능성 및 유용성을 지지한다. 수지상 세포를 실시예 3에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 하기 데이타는 수지상 세포가 하나의 1일령 성분채집 산물로부터 적절한 수율로 재현가능하게 제조될 수 있고 생성되는 세포가 (1) 전통적인 성숙 표현형을 보이고, (2) RNA로 효율적으로 형질감염될 수 있고, (3) 높은 해동 후 생존성으로서 냉동보존될 수 있음을 보여준다.
DC 의 면역표현형. 성숙 DC의 특성을 최종 세포 제제에 존재하거나 존재하지 않는 분자 마커에 대한 FACS 염색에 의해 심도있게 분석하였다. HLA-DR, CD83, CD86, CD80, CD1a, 및 CD209는 높은 발현을 보여야 하고, CD14, CD56, CD19 및 CD3은 낮은 발현을 보여야 한다. 표 3 (하기)은 상이한 건강한 공여자로부터 얻은 PBMC로부터 수지상 세포 백신을 생산하는 11회의 연속 실행으로부터 수집된 결과 (양성 세포 비율에 대한 평균 및 표준편차)를 보여준다.
1일령 단핵구로부터 제조된 DC에서 세포 표면 마커의 발현
마커 ％ 양성 세포 (평균) ％ 양성 세포 표준편차
HLA-DR 99.08 1.21
CD83 91.46 4.97
CD14 0.87 0.89
CD56 6.45 6.85
CD19 1.57 0.71
CD3 2.33 0.66
CD86 98.87 1.66
CD80 83.73 25.50
CD1a 56.15 19.45
CD209 95.73 4.81
상기 데이타는 현미경 사진 (미제시)과 함께 본 발명의 방법에 의해 생산된 DC가 전통적인 DC 표현형 및 형태를 보임을 입증한다. 또한, 비교적 낮은 표준편차는 방법의 재현성을 나타낸다.
수율, 표현형 및 생존성. 수지상 세포 방법을 철저히 시험하였고, 고품질의 RNA-형질감염된 성숙 수지상 세포를 재현가능하게 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 표 4는 총 증폭된 종양 세포주 RNA를 항원 부가물 (payload)로서, 정상 공여자 수지상 세포를 비히클로서 사용한 11회의 백신 실행의 결과를 보여준다.
11회의 일관 실행 (consistency run) 시에 생성된 DC 백신 생성물에 대한 방출 시험 결과의 요약
일관 실행 MatDC 표현형 해동후 생존성 투여량
CD14 CD83 HLA-DR
1 1.5％ 86.6％ 99.7％ 81％ 5
2 0.7％ 95.0％ 100.0％ N/A 2
3 2.9％ 94.8％ 99.9％ 93％ 22
4 0.3％ 89.6％ 96.1％ 88％ 15
5 2.0％ 81.2％ 97.7％ 64％ 17
6 0.5％ 92.7％ 100.0％ 88％ 34
7 0.1％ 85.8％ 98.7％ 84％ 20
8 0.6％ 95.2％ 99.5％ 85％ 12
9 0.5％ 93.0％ 99.8％ 83％ 18
10 0.3％ 96.4％ 99.8％ 90％ 38
11 0.2％ 95.6％ 98.6％ 88％ 12
11회 실행에 대한 평균±SD 0.9％± 0.9％ 91.4％± 5.0％ 99.0％± 1.2％ 84％± 8％ 17.7％± 10.8％
RNA -형질감염된 성숙 DC 는 CCR7 을 발현하고, 이동성이다. 상기한 성숙 DC 마커 이외에, 생체 내에서 DC의 림프절 이동에 중요한 CCR7 발현을 평가하였다. 상기 연구에서, CCR7-특이적 항체를 사용한 FACS 분석을 사용하여, 실제 규모의 GMP 공정 (일관 실행 3, 4, 6, 7, 8, 및 10)을 사용하여 생산된 해동된 RNA-형질감염된 DC를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타낸다:
CCR7+ 수지상 세포의 비율
IgG 이소형 대조군 CCR7 항체
실행 #3 0.37* 41.9
실행 #4 0.12 44.6
실행 #6 0.14 42.42
실행 #7 0.65 42.96
실행 #8 0.17 26.94
실행 #10 0.13 32.76
*: ％ 양성 세포
성숙 후에 DC 상의 CCR7의 물리적 존재를 입증하는 것에 추가하여, DC가 또한 이동 능력을 갖는다는 것을 콜라겐 겔 매트릭스 자발 이동 분석을 사용하여 입증하였고, 이것은 발현된 CCR7이 기능성도 갖는다는 것을 나타낸다 (데이타 미제시).
RNA -형질감염된 DC 는 기능성 동시자극 지지체를 제공한다. 상기한 실험은 제조된 DC가 모든 중요한 동시자극 마커를 발현함을 보여주고, 하기 실험은 상기 분자가 기능성임을 입증한다. 이를 위해, 알로 혼합 림프구 (MLR) 분석에서 DC가 PBMC로부터 인터페론 감마 (IFN-γ) 생산을 자극하는 능력을, 각각의 공여자로부터 이전에 동결된 PBMC와 함께 3명의 상이한 공여자로부터 제조한 해동된 DC를 사용하여 결정하였다. DC가 그의 HLA-일치된 자가 PBMC로부터 INF-γ 생산을 자극하지 않지만 비-자가 PBMC와 혼합될 때는 자극할 것으로 예상되었다. 판독으로서 ELISPOT (INF-γ)를 사용하여 모든 페어형 조합물을 시험하였다. 그 데이타를 도 2에 제시한다. 본 실험의 결과는 예상된 바와 같이 단지 미스매치된 DC/PBMC 조합물만이 기능성 MHC 및 동시자극 분자의 발현을 필요로 하는 특성인 INF-γ 생산을 유도함을 입증한다.
성숙 DC 는 추가의 기능성을 갖는다. 상기 실험에서, 형질감염 후 및 동결 전에 DC를 성숙시키기 위해 사용된 사이토킨 칵테일은 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2를 포함한다. 성숙 DC가 미성숙 DC보다 우수함을 입증하기 위해, 상기 2개의 집단 (동일한 공여자로부터의)이 자가 T 세포로부터 TH1 사이토킨 생산을 자극하는 능력을 조사하였다. DC의 두 집단을 플루 매트릭스 단백질을 코딩하는 RNA로 형질감염시키고, 자가 PBMC로부터 Flu-특이적 메모리 CTL을 자극하기 위해 사용하였다. 하기 도 3은 ELISPOT 분석 (투입 PBMC의 함수로서의 스폿의 수/웰)의 결과를 보여준다. Flu-특이적 메모리 T 세포로부터 INF -γ 생산을 유도하는 능력에서 미성숙 및 성숙 DC 사이에 통계학적 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 성숙 DC만이 상기 세포로부터 IL-2 생산을 유도할 수 있었다. IL-2 유도는 (1) 유도된 IL-2 분비가 자가분성 항원-특이적 CTL 증식을 유지하고, (2) INF-γ 및 IL-2의 낮은 생산이 HIV 환자에서 사망율 증가 위험과 밀접한 관계가 있는 것으로 밝혀졌고, 최근 연구에서 INF-γ 또는 IL-2의 분비 결여는 T 세포 기능의 손상 및 중추적인 기억 반응의 유지 불능을 야기하기 때문에 중요한 것으로 간주된다. 단순화를 위해, 음성 대조군은 그래프에 표시하지 않았다. PBMC 단독 (즉, DC 부재)으로부터 관찰된 평균 스폿 수는 9.7 (INF-γ) 및 1.3 (IL-2)이었다. 상기 실험을 3명의 독립적인 공여자의 PBMC로 제조된 백신을 사용하여 반복하였고, 그 결과는 정성적으로 동일하였다. 따라서, 성숙 DC는 미성숙 DC에 비해 추가의 우수한 기능성을 갖는다.
해동 후 RNA -형질감염된 DC 는 안정하다. 임상 프로토콜은 해동시에 수지상 세포 백신의 즉각적인 주사를 요구할 수 있지만, 투여를 지연시킬 수 있는 예상치 못한 상황이 발생할 수 있다. DC가 해동되었지만 즉시 주사되지 않을 경우에 생존가능하고 기능성임을 입증하기 위해, 다음 실험을 수행하였다. 2명의 상이한 건강한 공여자에 대응하는 각각 2개의 수지상 세포 제제의 2개의 바이알을 해동시켰다. 각각의 공여자로부터의 한 바이알을 즉시 알로 MLR 분석으로 시험하고, 각각의 제제로부터의 제2 바이알은 동일한 방법으로 분석하기 전에 40분 동안 실온에서 유지시켰다. 상기 실험에 사용된 PBMC는 각각의 공여자로부터의 자가 세포 및 어디에도 관련되지 않은 공여자로부터의 PBMC의 제3의 샘플을 포함하였다. 상기 분석의 판독은 ELISPOT (INF-γ)이었다. 본 실험의 결과를 도 4에 나타내었고, 해동 직후에 분석한 DC와 실온에서 40분 동안 유지한 DC 사이에 평가가능한 기능상의 차이는 존재하지 않음을 보여준다. 상기 기능성 분석에 추가하여, 해동 후 및 40분 유지 후에 해동 후의 세포 생존성을 트리판 염료 배제에 의해 결정하고, 동일한 결과를 얻었다 (데이타 미제시).
동결-해동은 DC 기능에 영향을 주지 않는다. DC 기능이 동결-해동 과정에 의해 유해한 영향을 받는지를 평가하기 위해서, 해동 전 및 해동 후의 DC의 기능성을 비교하였다. 기능성은 DC가 형질감염에 사용된 Flu mRNA 농도 감소의 함수로서 자가 PBMC로부터 메모리 Flu-특이적 반응을 자극하는 능력에 의해 평가하였다. 분석 판독은 ELISPOT (INF-γ)이었다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었고, 동결-해동 과정은 상기 분석에서 DC의 기능성에 영향을 주지 않음을 보여준다. 일정량의 GFP mRNA (0.5 ㎍)를 혼합하여 형질감염 효율을 모니터링하였다. 해동 후 샘플은 24시간 동안 동결된 후에 해동된 것이었다.
mRNA 를 사용한 DC 의 전기천공 후의 단백질 발현. 제1 단계로서, 본 발명자들은 mRNA를 사용한 DC의 형질감염이 mRNA-코딩 단백질의 적절한 발현을 유도하는 지를 평가하였다. DC의 제조를 위해, 건강한 자원자로부터 백혈구 성분 채집술로 얻은 PBMC (신선한 또는 동결된)를 시험관 내에서 2시간 인큐베이션한 후에 플라스틱 플라스크에 부착시켜 단핵구에 대해 농축시켰다. 세척 후에, 부착 세포를 6일 동안 재조합 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자 (rGM-CSF) 및 인터루킨-4 (rIL-4)로 보충된 X-VIVO 15 배지에서 배양하여 미성숙 DC (iDC)를 생성시켰다. 이어서, iDC를 바이러스 또는 대조군 단백질을 코딩하는 RNA로 전기천공시키고 (300 V, 150 ㎌, 100 Ω), IL-1β, IL-4, IL-6, GM-CSF, TNF-α 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 보충된 X-VIVO 15 배지에서 24시간 동안 성숙을 유도하였다. 형질감염 후에 단백질의 발현을 시험하기 위해서, DC를 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 RNA로 전기천공하고, 발현을 유세포 측정으로 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 1일령 단핵구로부터 생산된 성숙 DC의 큰 분획은 형질감염 후 4일까지 높은 수준의 GFP를 발현하고, 이것은 상기 방법이 DC에서 장기간의 단백질 발현을 촉진할 때 효율적임을 입증한다.
다음으로, CMV pp65 단백질을 코딩하는 mRNA의 전기천공에 의해 형질감염된 자가 DC가 CMV-감염 개체로부터의 PBMC에서 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도하는 능력을 결정하였다. CMV-감염 대상체는 pp65 단백질로부터 유도된 잘 규정된 면역우세 펩티드로 복수의 혈액 공여자로부터의 PBMC를 자극하고 CD4 및 CD8 T 세포에서 IL-2/IFN-γ 분비 및 세포 증식을 측정하여 확인하였다. 양성 CMV-특이적 T 세포 반응이 검출되고 정보 제공 후에 백혈구 성분 채집술 시행에 동의한 대상체를 추가 연구를 위해 선택하였다.
상기 개체로부터의 DC는 상기한 바와 같이 제조하였다. 이어서, CMV pp65 단백질을 코딩하는 RNA로 형질감염된 성숙 DC를 16시간 (ICS) 또는 6일 (증식) 동안 자가 PBMC와 함께 1/40 비율로 인큐베이션하였다. 자극 후, CMV-특이적 CD4 및 CD8 T 세포의 IL-2 및 IFN-γ 분비 (도 7) 및 증식 (도 8)을 유세포 측정으로 평가하였다. CMV pp65 RNA로 전기천공된 DC는 CMV-감염된 대상체로부터 높은 IFN-γ 및 IL-2 발현 및 CD8 T 세포의 증식을 선택적으로 유도하였다. 그러나, 상기 프로토콜은 CD4 T 세포에서 검출된 낮은 수준의 사이토킨 분비 및 증식에서 알 수 있는 바와 같이 최소의 CD4 T 세포 활성화를 유도한다 (도 7 및 8, 하부 패널).
실시예 5
500 U/ml 또는 1000 U/ml IL-4를 사용한 단핵구의 수지상 세포로의 분화의 비교
6℃ 내지 28℃의 온도에서 유지시킨 1일령 백혈구 성분 채집술로부터의 PBMC를 세척하고, 2시간 부착 단계를 위해 AIM-V 배지에 ~2xlO8/플라스크로 씨딩하였다. 2시간 후에, 비-부착 세포를 제거하고, 부착 세포를 세척하여 1000 U/ml GM-CSF 및 500 U/ml 또는 1000 U/ml IL-4로 보충된 X-VIVO 15에 재현탁시키고, 37℃에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 또한, 1000 U/ml GM-CSF 및 500 U/ml IL-4로 보충된 X-VFVO 15에서의 배양을 위해, 배지를 변경하지 않고 6일 동안 배양한 것과 3일에서의 배지 변경 효과를 비교하였다. 구체적으로 설명하면, 3일에 배지를 현탁액 중의 세포와 함께 제거하고, 플라스크를 X-VIVO 배지로 부드럽게 세척하여 느슨하게 부착된 세포를 수거하고; 배지 및 세척액을 1300 rpm에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화시켰다. 세포를 1000 U/ml GM-CSF 및 500 U/ml IL-4로 보충된 신선한 X-VIVO 15 배지에 재현탁시키고, 배지 및 세포를 부착 세포를 계속 포함하는 플라스크에 다시 넣고, 플라스크를 37℃에서 추가로 3일 동안 인큐베이션하였다.
모든 플라스크를 전기천공을 위해 개별적으로 수거하였다. 6일 DC를 2 ㎍ GFP mRNA/106 세포 (20 ㎍ GFP mRNA/5x106 세포)로 형질감염시키고, X-VIVO 15에 재현탁시키고, 1x1O6/ml로 씨딩하고, 800 U/ml GM-CSF 및 500 U/ml IL-4로 보충하고, 사이토킨 칵테일 (TNFα - 1O ng/ml; IL-1β - 1O ng/ml; IL-6 - 100 ng/ml; PGE2 - 1 ㎍/ml)로 성숙시켰다. DC를 37℃에서 5％ CO2에서 철야 인큐베이션하였다. 미성숙 DC의 표현형을 6일에 (미성숙 DC; 도 9) 및 형질감염 24시간 후에 (성숙 DC; 도 10) 분석하였다. 형질감염 직후 및 형질감염 24시간 후에 각각의 배양 조건에 대한 수율 (％ Rec) 및 생존성 (％ V)을 표 6A-C에 나타내었다.
1000 U/ml IL-4
DC 수율 6일 ％ Rec ％ V Tn 당 DC Tn 0시간 후 DC ％ Rec ％ V Tn 24시간 후 DC ％ Rec ％ V
F1 3.76x107 21 97 5x106 2.08x106 42 81 1.03x106 21 84
F2 3.88x107 22 94 5x106 2.41x106 48 84 8.80x105 18 91
F3 4.44x107 25 96 5x106 2.06x106 41 83 8.10x105 16 84
취합 2x107 1.04x107 52 80 7.40x106 37 94
취합 2x107 1.11x107 56 93 7.50x106 38 93
500 U/ml IL-4
DC 수율 6일 ％ Rec ％ V Tn 당 DC Tn 0시간 후 DC ％ Rec ％ V Tn 24시간 후 DC ％ Rec ％ V
F1 4.16x107 23 97 5x106 2.81x106 59 77 1.19x106 24 87
F2 4.23x107 24 97 5x106 2.43x106 49 84 1.32x106 26 85
F3 3.87x107 22 96 5x106 3.26x106 65 84 1.52x106 30 89
500 U/ml IL-4, 3일에 배지 변경
DC 수율 6일 ％ Rec ％ V Tn 당 DC Tn 0시간 후 DC ％ Rec ％ V Tn 24시간 후 DC ％ Rec ％ V
F1 2.81x107 16 94 5x106 1.79x106 36 62 9.6x105 19 82
F2 2.82x107 16 93 5x106 2.37x106 47 69 9.0x105 18 83
F3 2.06x107 11 85 5x106 2.15x106 43 71 1.07x106 21 84
실시예 6
분급분리에 의한 단핵구의 농축 및 미성숙 및 성숙 DC로의 분화
온도 제어된 (6℃ 내지 28℃) 용기로 철야 수송에 의해 수거지로부터 제조 설비로 수송된 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 단핵구를 단리하기 위해 자동화 방법으로서 엘루트라™ 세포 분리 시스템 (감브로 비씨티)에서 역류 원심분리로도 알려진 분급분리를 수행하였다. 분급분리 버퍼는 100O mL의 5％ 인간 알부민 혈청 (HSA, 박스터 헬쓰케어 (Baxter Healthcare), 미국 캘리포니아주 웨스트레이크)을 행크 균형잡힌 염 용액 (캄브렉스 바이오사이언스 (Cambrex BioScience), 미국 메릴랜드주 워커스빌)의 4L 백에 첨가하여 제조하였다. 상기 분급분리 버퍼를 성분채집술과 동일한 부피로 1일령 성분채집 산물에 첨가하였다. 엘루트라™ 세포 분리 시스템 (감브로 비씨티)을 분급분리 버퍼로 프라이밍하고, 성분채집 산물을 부가하였다. 분급분리 과정을 수행한 후에, 단핵구를 로터 오프 분획으로부터 수거하였다. 단핵구를 동결 저장하였다.
동결된 분급분리된 단핵구를 해동시킨 후, 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 생성시키기 위해 5일 동안 플라스크에서 800 U/mL GM-CSF (버렉스 래보래토리즈 (Berlex Laboratories), 미국 캘리포니아주 리치몬드) 및 500 U/mL IL-4 (알&디 시스템즈)가 존재하는 X-VIVO 15 (캄브렉스 바이오사이언스) 중에서 1백만개의 세포/mL로 분화시켰다. iDC를 수거하고, 전기천공을 사용하여 증폭된 RCC 종양 RNA로 항원 부가하였다. 세포를 800 U/ml GM-CSF, 500 U/ml IL-4 및 성숙 사이토킨 (TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 PGE2)과 함께 배양하고, 배양 24시간 후에 수거하였다. 성숙 수지상 세포 (mDC)에 대한 세포수 및 생존성을 비셀 (ViCell) (베크만 쿨터 인크. (Beckman Coulter Inc.), 미국 캘리포니아주 풀러톤)에 의해 트리판 블루 배제를 사용하여 결정하였다. 생성되는 mDC의 표현형을 결정하였다. 플라스크에서 배양된 세포는 99％ CD83+ 및 0.2％ CD14+이었다. mDC의 수율은 플라스크에 배양된 CD14+ 세포의 34％이었다.
실시예 7
신선한 대 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 DC의
동시자극 분자의 발현 비교
말초 혈액을 백혈구 성분 채집술에 의해 각각 다른 일자에 3명의 건강한 인간 공여자로부터 수거하고, 수거한 지 30분 내에 몬트리올 대학 (University of Montreal)에 수송하였다. 20 mL의 백혈구 성분 채집 산물을 제거하고, 자가 혈장을 원심분리에 의해 제조하였다. 백혈구 성분 채집 산물 부피를 2개의 동일 부분으로 나누었다. 한 부분은 "신선한" 단핵구를 생성시키기 위해 즉시 처리하고, 제2 부분은 "1일령 성분채집술"로부터 세포를 생성시키기 위해 20 mL 분취액으로서 5개의 50 mL 원뿔형 튜브에 저장하였다. 튜브를 상자 내의 플라스틱 용기에 넣고, 16 내지 2O℃에서 24시간 동안 흔들리는 플랫폼에서 경사지게 저장하였다. 인큐베이션 기간 후에, PBMC를 피콜 밀도 구배를 사용하여 분리하였다.
수지상 세포 전구체 (단핵구)를 포함하는 단핵 세포 분획을 피콜 밀도 구배를 사용하여 신선한 및 1일령 성분채집 산물 모두로부터 분리하였다. 백혈구 성분 채집 산물을 50 mL 원뿔형 튜브 내의 피콜 상에 적층시키고, 튜브를 20분 동안 실온에서 원심분리하였다 (800Xg). 세포를 인산염 완충 염수 (PBS)로 4회 세척하고, 세포 농도 및 세포 생존성을 결정하기 위해서 계수하였다. 고도로 정제된 단핵구 집단을 얻기 위해, 단핵 분획을 CD14 마이크로비드 (밀테니이 (Miltenyi))를 사용하여 추가로 정제하였다. 1x109 세포를 PBS, 0.5％ BSA, 및 2 mM EDTA (밀테니이 버퍼)를 포함하는 8 mL의 버퍼에 재현탁시켰다. 2 mL의 CD14 마이크로비드를 1x109 세포를 포함하는 50 mL 튜브에 첨가하고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 100 mL의 동일한 버퍼로 세척하고, 300Xg에서 원심분리하고, 20 mL의 밀테니이 버퍼에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 자기장 하에 위치하는 4개의 LS 컬럼 (밀테니이 콰드로맥스(Quadromax)™)에 적용하였다. 비중 유동을 사용하여 세포를 적용한 후에, 컬럼을 3 mL의 밀테니이 버퍼로 3회 세척하였다. 단핵구를 5 mL의 밀테니이 버퍼를 사용하여 자기장의 부재 하에 2회 용출시키고, 300Xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 용출물 및 유동 통과 분획의 순도를 CD3, CD19, CD16, CD56, CD14, 및 CD209에 특이적인 항체를 사용한 유세포 측정으로 결정하였다. 용출물 분획은 88-98％ 단핵구 및 2％ 미만의 작은 세포를 함유하였다. 비부착 분획은 단지 작은 비율 (2％)의 단핵구를 함유하였다. 이때, 총 RNA를 정제된 단핵구 (5천만개)의 일부로부터 추출하였다.
성숙 분화된 DC를 제조하기 위해, 5천만개의 단핵구를 T150 cm2 플라스크 내에서 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 X-VIVO 배지에 37℃에서 5일 동안 씨딩하였다. 종양 괴사 인자, 인터페론 감마, 및 프로스타글란딘 E2 를 포함하는 사이토킨 칵테일 (TIP)을 5일에 세포에 첨가하였다. 세포를 배양 6일에 수거하고, 이때의 세포를 "TIP-DC"로 명명하였다. 수지상 세포-풍부 집단을 세포를 떼어내기 위해 플라스크를 부드럽게 두드리고, 추가의 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척하고, 잔류하는 부착 세포를 PBS 중에서 2-8℃에서 약 10분 동안 인큐베이션함으로써 이탈시켜 수거하였다. 총 세포 현탁액을 펠렛화시키고, PBS 중에 재현탁시켜 세포 농도, 세포 생존성 및 면역표현형을 분석하였다. 다음 세트의 세포 마커를 유세포 측정으로 조사하였다: 단핵구 계열 마커 (CD3, CD14, CD19, CD16, 및 CD56), 수지상 세포 존재의 표지 (CD11c, CD1a, 및 CD209), 항원 제시 세포 마커 (HLA-II), 이동 마커 (CD38 및 CCR7) 및 성숙 수지상 세포에 대한 마커 (CD83 및 CD86).
2천만개의 TIP-DC를 600 ㎕의 비아스팬™에 재현탁시키고, CD40L RNA로 4 ㎍의 RNA/1백만개의 수지상 세포로 전기천공하였다. 전기천공은 4 mm 갭 큐벳에서 300V의 펄스로 300 μs 동안 수행하였다. 전기천공 후에, 세포를 IL-4 및 GM-CSF로 보충된 X-VIVO 배지 (혈청 무첨가 배양 배지)를 포함하는 T75 플라스크 (플라스크당 하나의 큐벳)에 도입하였다. 형질감염된 세포를 4시간 동안 37℃, 5％ CO2, ≥75％ 습도에서 인큐베이션하여 세포를 전기천공으로부터 회수하였다. 상기 세포를 추가로 성숙시키고 "PME-CD40L DC"로 명명하였다. RNA를 생성된 PME-CD40L DC의 일부로부터 단리하였다.
PME-CD40L DC를 속도 조절 동결을 사용하여 냉동 바이알에서 10％ DMSO로 90％ 자가 혈장에 동결시키고, ≤85℃에서 저장하였다. 상기한 바와 같이 제조된 동결된 수지상 세포 백신을 37℃에서 해동하고, 20-25℃에서 30분 동안 유지시켰다. 생존성은 해동 직후 및 30분까지 10분 간격으로 결정하였다. 해동 후 PME-CD40L DC를 단핵구 계열 마커 (CD14), 수지상 세포 마커 (CD11c, CD1a, 및 CD209), 항원 제시 세포 마커 (HLA-II), 이동 마커 (CD38 및 CCR7) 및 성숙 수지상 세포에 대한 마커 (CD80, CD83 및 CD86)에 특이적인 항체를 사용한 유세포 측정에 의해 분석하였다.
결과
단핵구의 생성
3명의 공여자로부터의 데이타는 CD14 비드를 사용한 양성 선택이 88-98％의 순수한 단핵구 집단을 생성시킴을 보여준다 (표 7). 최대량의 작은 세포 오염은 2％이다 (표 7). 비부착 (유동 통과) 분획은 3명 모두의 공여자에서 2％ 이하의 단핵구 (큰 세포)를 포함하였다 (데이타 미제시). 따라서, 비부착 분획에서 단핵구의 유의한 상실이 존재하지 않는다. 용출물에 존재하는 작은 세포 집단 오염은 1차적으로 T 세포로 구성되고, 이는 높은 CD3 발현 및 보다 낮은 CD19, 16 또는 56 마커의 발현으로 입증된다 (데이타 미제시). 신선한 백혈구 성분 채집 산물과 1일령 백혈구 성분 채집 산물의 용출물 분획에서 CD83, CD86, CD11c, HLA-I 또는 HLA-II 마커의 발현에 가시적인 차이가 존재하지 않았다.
단핵구 요약
공여자 단핵구 분획 ％ 큰 세포 ％ 작은 세포 ％ CD14+
1 신선 용출물 97-98 <1-1.5 99
1 1일령 용출물 88-89 0.8-1.5 99
2 신선 용출물 98-99 0.9-1.4 99
2 1일령 용출물 94-98 1-2 98
3 신선 용출물 97-98 <1 99
3 1일령 용출물 89-90 <1 97
TIP - DC
단핵구는 초기에 순도가 높았고 (90％), 3명의 모든 공여자로부터의 TIP-DC에 큰 세포의 비율이 98-99％이었기 때문에 분화 과정 동안 더욱 개선되었고, 따라서, 작은 세포의 비율은 2％ 미만이었다 (데이타 미제시). 유세포 측정을 사용한 TIP-DC의 표현형 분석을 통해, 신선한 백혈구 성분 채집 산물과 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 생성된 TIP-DC 사이에 CD83 발현의 차이가 존재함이 밝혀졌다. 양성 세포의 비율은 조사 시에 마커에 대해 양성인 세포의 수를 의미한다. 표면 성숙 마커 CD83을 발현하는 DC의 비율은 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 것보다 신선한 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 3명의 모든 공여자로부터의 TIP-DC에서 더 낮았다 (표 8). 신선한 백혈구 성분 채집 산물 및 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 생성된 TIP-DC에서 임의의 다른 마커에 대한 다른 차이는 존재하지 않았다.
TIP-DC의 요약
공여자 백혈구 성분 채집 산물 ％ CD83+ ％ CD86+
1 신선 26 90
1일령 59 81
2 신선 40 74
1일령 51 85
3 신선 57 98
1일령 87 98
PME - CD40L DC
형질감염 4시간 후
형질감염 후 DC (PME-CD40L DC)를 형질감염 4시간 후에 CD154 (CD40L)의 발현에 대해 분석하였다. 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터의 PME-CD40L DC는 신선한 백혈구 성분 채집 산물로부터 생성된 PME-CD40L DC보다 형질감염 4시간 후에 공여자 1 및 2에서 보다 많은 CD40L을 발현하였다 (표 9). 또한, 공여자 1 및 2에서 신선한 성분 채집 산물과 1일령 성분채집 산물로부터 생성된 PME-CD40L DC 사이에 CD40L의 평균 형광 강도 (MFI)의 차이가 존재하였다 (표 9).
해동 후 PME - CD40L DC
PME-CD40L DC를 해동 후에 다양한 DC 마커의 발현에 대해 분석하였다. 신선한 백혈구 성분 채집 산물 대 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 생성된 해동 후 PME-CD40L DC의 표현형에 차이가 존재하였다. 신선한 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 PME-CD40L DC에서 CD40L 발현의 평균 형광 강도는 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 제조된 DC보다 더 낮았다 (표 9).
또한, 두 공여자에서 형질감염 효율 (CD40L 발현의 양성 비율의)이 신선한 백혈구 성분 채집 산물로부터 생성된 DC에서 더 낮음을 시사하는 경향이 존재하였다 (표 9).
PME-CD40L DC에서 CD154 발현의 요약
공여자 백혈구 성분 채집 산물 PME-CD40L DC ％ CD154+ CD154 MFI
1 신선 전기천공 4시간 후 35 26
1일령 전기천공 4시간 후 63 51
2 신선 전기천공 4시간 후 40 41
1일령 전기천공 4시간 후 50 60
3 신선 전기천공 4시간 후 58 61
1일령 전기천공 4시간 후 52 35
1 신선 해동 후 21 31
1일령 해동 후 38 50
2 신선 해동 후 16 39
1일령 해동 후 30 44
3 신선 해동 후 60 56
1일령 해동 후 56 64
유세포 측정에 의해 측정된 양성 세포 비율은 3 케이스 중 2 케이스에서 백혈구 성분 채집 산물의 1일령 부분으로부터 생성된 수지상 세포에서 보다 많은 세포가 CD83 항체로 양성 염색됨을 보여주었다 (표 10).
해동 후 PME-CD40L DC의 표현형
공여자 백혈구 성분 채집 산물 ％ CD83+ ％ CD86+ ％ CD80+
1 신선 50 97 95
1일령 86 99 99
2 신선 57 97 98
1일령 71 99 94
3 신선 90 98 97
1일령 89 99 97
CD80, CD83 및 CD86에 대한 양성 세포 비율의 차이가 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 생성된 DC에서 항상 더 높지는 않지만 (공여자 3, 표 10), 특이적 항체로 염색된 1일령 백혈구 성분 채집 산물로부터 생성된 세포의 평균 형광 강도는 모든 공여자에서 더 높다 (표 11). CD80, CD86 및 CD83에 추가하여, HLA-I 및 HLA-II가 동일한 결과를 보였다 (표 11). 평균 형광 강도 신호는 세포 당 보다 높은 단백질 수준의 발현과 밀접한 관련이 있고, CD80, CD83, CD86, HLA-I 및 HLA-II 분자의 발현은 성숙 DC에서 상향조절된다. 따라서, 상기 세포의 표현형은 3명의 모든 공여자에서 1일령 부분으로부터 얻은 수지상 세포의 보다 성숙한 상태를 반영한다. 상기 변화는 DC의 성숙 상태를 반영한다. 양성 세포 비율 및 평균 형광 강도 측정으로 얻은 데이타를 함께 고려하여, 본 발명자들은 백혈구 성분 채집술의 1일령 부분으로부터 생성된 세포가 보다 성숙한 표현형을 보인다고 결론지었다.
해동 후 PME-CD40L DC의 MFI
공여자 백혈구 성분 채집 산물 CD83 MFI CD86 MFI CD80 MFI HLA-I MFI HLA-II MFI
1 신선 55 97 48 330 145
1일령 73 282 71 904 338
2 신선 43 66 47 249 115
1일령 55 123 55 383 214
3 신선 27 104 38 630 175
1일령 53 219 57 974 182
실시예 8
신선한 단핵구 대 1일령 단핵구에서의 유전자 발현에 대한 마이크로어레이 분석
및 그로부터 제조한 수지상 세포
신선한 단핵구 및 1일령 단핵구 (백혈구 성분 채집술 후에 24시간 동안 16 내지 20℃에서 인큐베이션한 단핵구)로부터의 RNA 샘플, 및 실시예 8에 기재된 바와 같이 신선한 단핵구 및 1일령 단핵구로부터 제조된 DC로부터의 RNA를 제조자의 지시 (Genechip(등록상표) Expression Analysis Technical Manual, 2004)에 따라 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 (아피메트릭스)에 적용하였다. 간단히 설명하면, 젠칩(등록상표) 폴리-A RNA 조절 키트 (아피메트릭스)로 스파이킹한 3 마이크로그램의 총 RNA를 수퍼스크립트™ II 역전사효소를 사용하여 제1 가닥 cDNA로 전환시켰다. 제2 가닥 cDNA 합성 후에, 각각의 전사체의 선형 증폭을 위한 시험관 내 전사 및 비오티닐화 CTP 및 UTP의 도입을 수행하였다. cRNA 산물을 약 100개의 뉴클레오티드로 단편화시키고, 16시간 동안 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 마이크로어레이를 이어서 낮은 (6xSSPE) 엄격성 및 높은 (10O mM MES, 0.1M NaCl) 엄격성에서 세척하고, 스트렙타비딘-피코에리트린으로 염색하였다.
형광을 비오티닐화 항-스트렙타비딘 및 추가 분취량의 스트렙타비딘-피코에리트린 염색을 첨가하여 증폭시켰다. 젠칩(등록상표) 스캐너 3000 (아피메트릭스)를 사용하여 570 nm에서 여기 후에 3 ㎛ 해상도에서 형광 신호를 수집하였다. 두개의 순차적인 스캔으로부터의 평균 신호를 각각의 마이크로어레이 특징에 대해 계산하였다. 스캐닝된 이미지는 젠칩(등록상표) 작동 소프트웨어 v1.1 (아피메트릭스)로 분석하였다. 폴리-A RNA 조절 키트 (아피메트릭스)에 포함된 4개의 대조군 RNA의 높은 선형 상관관계 (R2>0.95)가 표지 과정의 성공을 보장하기 위해 확인되었다.
모든 프로필 데이타를 컴퓨터 프로그램 젠스프링™에 입력하고, 샘플 종류 (즉, 단핵구 샘플은 단핵구로, 수지상 샘플은 수지상으로)에 따라 정규화시켰다. 3개의 단계는 아피메트릭스 어레이에 대해 젠스프링에 의해 제시된 표준 방법에 따른 정규화 단계에서 수행하였다.
4) 데이타 변환 (0.01 미만의 모든 값은 0.01로 설정함)
5) 50번째 백분위수로의 정규화.
6) 정중으로의 정규화.
데이타를 먼저 상실 스폿을 갖는 플래그 (flag)에 대해 필터링하였다. 이어서, 데이타를 신뢰 수준이 p.05 또는 p.1인, 무작위 예측 모델이 없는 일원 분산 분석 (one way anova)으로 분석하였다. 생성된 필터링된 유전자의 목록을 변경 배수, 발현 수준, 또는 신뢰도에 대해 분석하였다. 이것은 평균으로서 또는 개개의 샘플로서 샘플을 사용하여 수행하였다. 신선한 및 1일령 단핵구 또는 수지상 세포 사이의 발현 수준을 분산 분석 전 또는 후에 비교하였다. 유전자 목록을 서로 비교하고, 복수의 목록에서 중복되는 유전자를 그들의 신뢰도를 위해 선택하였다. 1일령 단핵구로부터 제조된 수지상 세포 대 신선한 단핵구로부터 제조된 수지상 세포에서 변경된 항정 상태 RNA 수준을 갖는 유전자를 표 12A에 나열하였다. 상기 유전자에 대한 설명은 표 12B에 나열하였다. 1일령 단핵구 대 신선한 단핵구에서 변경된 항정 상태 RNA 수준을 갖는 유전자는 표 13A에 나열하였다. 상기 유전자에 대한 설명은 표 13B에 나열하였다. 상기 결과는 신선한 단핵구의 표현형이 1일령 단핵구와 상이하고, 신선한 단핵구로부터 제조된 수지상 세포의 표현형이 1일령 단핵구로부터 제조된 수지상 세포와 상이함을 보여주었다.
Figure 112007079161544-PCT00002
Figure 112007079161544-PCT00003
표 12A에 나열된 유전자의 설명
유전자 부호 설명
ALOX15 아라키도네이트 15-리폭시게나제 전자 수송, 지질 대사, 염증 반응, 류코트리엔 생합성, 류코트리엔 대사
CDNA FLJ37485 fis 클론 BRAWH2014379
KRT17; PC; K17; PC2; PCHC1 케라틴 17 표피 발생
KCNJ2 칼슘 내부 정류 채널, 서브패밀리 J, 멤버 2 이온 수송
YWHAZ 티로신 3-모노옥시게나제/트립토판 5-모노옥시게나제 활성화 단백질, 제타 폴리펩티드 단백질 도메인 특이적 결합
IL1B 인터루킨 1, 베타 면역 반응, 염증 반응
PTX3 펜트락신 관련 유전자, IL-1에 의해 신속하게 유도됨 염증 반응
FYN SRC, FGR, YES에 관련된 FYN 종양유전자 단백질 아미노산 인산화, 단백질 아미노산 인산화 세포내 신호 전달 캐스케이드 단백질 키나제 캐스케이드 단백질 아미노산 인산화 칼슘 이온 수송
GALNT3 UDP-N-아세틸-알파-D-갈락토사민-폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제 3 (GalNAc-T3) 탄수화물 대사
FLJ20073 멸균 알파 모티프 도메인 함유 9 결합
CDK6 시클린 의존성 키나제 6 유사 세포 주기의 세포 주기 G1기를 통한 진행의 조절, 단백질 아미노산 인산화 세포 증식
CD69 CD69 항원 (p60, 조기 T-세포 활성화 항원) 방어 반응, 세포 표면 수용체 연관 신호 전달
TRL1 Toll 유사 수용체 1 염증 반응, 면역 반응
RTL2 Toll 유사 수용체 2 세포자멸 유도, 염증 반응, 신호 전달, 면역 반응
ENO3 에놀라제 3 (베타, 근육) 해당작용
CD52 CD52 항원 (CAMPATH-1 항원) 형질막에 대한 통합
TRPS1 모발 비지절 증후군 1 골격 발생 전사 전사 조절, RNA 폴리머라제 II 프로모터 로부터 DNA 의존성 전사 NLS 함유 기질의 핵 내로의 도입
FLJ21069, RSNL2 레스틴-라인 2
TNS 텐신1 세포내 신호 전달 캐스케이드
CPEB1 세포질 폴리아데닐화 성분 결합 단백질 1 mRNA 처리
RAB9P40 kelch 모티프를 갖는 Rab9 효과기 단백질 수용체 매개 세포내 이입, 세포외 유출 동안 베지클 결합
PIR 피린 (철 결합 핵 단백질) 전사 보조인자 활성 철 이온 결합, 금속 이온 결합
CALM2 칼모듈린 2 (포스포릴라제 키나제, 델타) G-단백질 커플링된 수용체 단백질 신호 전달 경로
ABCG2 ATP-결합 카세트, 서브패밀리 G (WHITE), 멤버 2 약물 수송에 대한 수송 반응
A2M 알파-2 마크로글로불린 세포내 단백질 수송 단백질 호모올리고머화
CDNA FLJ13750 fis, 클론 PLACE 3000331
APEX2 APEX 뉴클레아제 (퓨린 제거/피리미딘 제거 엔도뉴클레아제) 2 DNA 손상 자극에 대한 DNA 수복 반응
THBD 트롬보모듈린 트랜스멤브레인 수용체 활성, 칼슘 이온 결합, 당 결합, 수용체 활성, 칼슘 이온 결합 수용체 활성
DNASE1L3 DNASE1L3 DNA 이화, 세포자멸, DNA 대사
PKIB 단백질 키나제 (cAMP 의존성, 이화) 억제제 베타 단백질 키나제 활성의 음성 조절
PTGER3 프로스타글란딘 E 수용체 3 (서브타입 EP3) 전사, DNA 의존성, 신호 전달, 세포 사멸, G-단백질 커플링된 수용체 단백질 신호전달 경로
CAMTA1 칼모듈린 결합 전사 활성화제 1 WNT 수용체 신호전달 경로
PLS3 플라스틴 3 (T 이소형) 액틴 결합 칼슘 이온 결합 액틴 결합
TREM1 골수세포 상에서 발현된 촉발 수용체 1 체액성 면역 반응 세포내 신호전달 캐스케이드
TMEPAI 트랜스멤브레인, 전립선 안드로겐 유도 RNA 막에 대한 통합
CHI3L1 키티나제-3 유사 1 (연골 당단백질-39) 탄수화물 대사 키틴 이화
Figure 112007079161544-PCT00004
표 13A에 나열된 유전자의 설명
유전자 부호 설명
ADM 아드레노메듈린 cAMP 생합성, 프로게스테론 생합성, 신호전달, 세포-세포 신호전달, 임신, 배설
Est 전사된 로커스
PPARD 퍼옥시좀 증식 활성화된 수용체, 델타 전사 조절자
CIAS1 한냉 자가염증 증후군 1 세포자멸, 세포자멸의 유도, 염증 반응, 신호전달
SLC6A6 용질 캐리어 패밀리 6 멤버 6 아미노산 대사, 형질막에 대한 통합
Est 전사된 로커스
WTAP 윌름즈 종양 1 관련 단백질
가설상 단백질
APAF1 세포자멸 펩티다제 활성화 인자 세포자멸의 조절
CCR2 케모킨 (C-C 모티프) 수용체 2 화학주성, 염증 반응, 세포 방어 반응, 신호전달
SLC35A5 용질 캐리어 패밀리 35, 멤버 A5 탄수화물 수송, 뉴클레오티드-당 수송
RPE 리불로스-5-포스페이트-3- 에피머라제 탄수화물 대사
TRPS1 모발 비지절 증후군 I 전사 인자 활성
OXR1 산화 저항 1 산화 스트레스에 대한 반응
TRIM14 3부 (tripartite) 모티프 함유 14 구획 특정 (compartment specification)
MRF2 AT 풍부 상호작용 도메인 5B (MRF1-유사) 전사, 전사의 음성 조절, DNA 의존성 전사 조절, DNA 의존성
TNFSF10 종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리, 멤버 10 세포자멸, 세포자멸의 유도, 염증 반응, 신호전달, 세포-세포 신호전달
DKFZp434L142 가설상 단백질 DKFZp434L142
LOC115294 (PCMTD1) 단백질-L-이소아스파르테이트 (D-아스파르테이트) O-메틸트랜스퍼라제 도메인 함유 1 단백질 변형
LOC201895 가설상 단백질 LOC201895 단백질 결합
PAG1 당스핑고지질 마이크로도메인 1 에 회합된 인단백질 T세포 활성화의 음성 조절, 세포내 신호 전달 캐스케이드, T세포 활성화의 조절
DMXL1 단백질 결합
CX3CR1 케모킨 (C-X3-C 모티프) 수용체 1 화학주성, 세포 방어 반응, 세포 부착, 신호전달
수지상 세포 유전자를 신선한 및 1일령 단핵구로부터 제조된 DC 사이에서 일정하게 유지된 것으로 밝혀진 2개의 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 추가로 정규화하였다. 각각의 유전자의 평균 발현 (정규화됨)을 GAPDH (글리세르알데히드-3-인산염 데히드로게나제) 또는 β-액틴의 평균 발현 (정규화됨)으로 나누어 하우스키핑 유전자에 대한 발현 비율을 생성하였다. 6개의 유전자에 대한 결과를 표 14에 나타낸다. "DCdo"는 1일령 단핵구로부터 제조된 DC를 의미한다. "DCf"는 신선한 단핵구로부터 제조된 DC를 의미한다.
1일령 또는 신선한 단핵구로부터 제조된 DC에서 특정 RNA 대 GAPDH 또는 β-액틴의 항정 상태 RNA 발현 비율
유전자 유전자:GAPDH DCdo 유전자:GAPDH DCf 유전자:액틴 DCdo 유전자:액틴 DCf
ALOX15 0.45 1.5 0.45 1.52
IL1β 0.58 1.38 0.57 1.37
TLR1 0.68 1.49 0.68 1.48
TLR2 0.67 1.34 0.66 1.33
CD69 0.66 1.61 0.65 1.60
CD52 1.86 0.74 1.85 0.74
두 후보 유전자의 단핵구에서의 발현에 대한 추가의 확인을 표 15에 나타낸 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR (QPCR)에 의해 수행하였다. RT-PCR을 위한 올리고(dT) 프라이머 및 수퍼스크립트™ III 제1 가닥 합성 시스템을 제조자 (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드)의 지시에 따라 사용하여 각각의 총 RNA (젠칩 분석에 사용된 것과 동일)로부터 제1 가닥 cDNA를 생성시켰다. QPCR은 에이비아이 프리즘 (ABI Prism)(등록상표) 7900HT 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)을 제조자의 지시(에이비아이 프리즘(등록상표) 7900HT 서열 검출 시스템 사용자 가이드)에 따라 사용하여 수행하였다. 타크맨 (TaqMan)(등록상표) 유전자 발현 분석 (Gene Expression Assays) 또는 커스텀 (Custom) 타크맨(등록상표) 유전자 발현 분석 (어플라이드 바이오시스템즈)을 타크맨(등록상표) 프로브로서 사용하였다. PCR 반응은 앱설루트 (ABsolute)™ QPCR ROX 믹스 (에이비겐 (ABgene), 영국 서레이)를 사용하여 3회 수행하였다. 상대 cDNA 농도의 정량은 에이비아이 프리즘 7700 서열 검출 시스템 사용자 불레틴 (Detection System User Bulletin) #2 (어플라이드 바이오시스템즈)에 기재된 바와 같은 상대적인 표준 곡선 방법을 사용하여 수행하였다. 젠칩 분석에서 각각의 유전자의 대부분의 발현을 보인 한 cDNA를 사용하여 상대적인 표준 곡선을 작성하였다. 모든 데이타는 내부 GAPDH 발현에 상대적인 발현으로 나타내었다. APAF-1 및 CDCA2 효과기 단백질 2는 각각 GAPDH에 비해 신선한 단핵구와 1일령 단핵구 사이에 적어도 2.5배 및 3배 감소하는 것으로 나타났다 .
프라이머
유전자 타크맨(등록상표) 유전자 발현 분석 ID
GAPDH Hs99999905_m1
CDC42 효과기 단백질 2 Hs00198943_m1
APAF1 Hs00185508_m1
실시예 10
공여자로부터 단리한 시점으로부터 23, 48 또는 71시간 동안 실온에서
인큐베이션한 PBMC로부터 제조된 수지상 세포의 비교
방법:
2명의 공여자로부터 '건강한 공여자' 백혈구 성분 채집 산물을 철야 수송 후에 수령하였다. 각각의 산물의 약 1/3을 다음과 같이 성분채집 산물 수거 후의 특정 시간에서 DC 생성을 위해 처리하였다. 백혈구 성분채집 산물 (즉, PBMC)을 피콜-히스토파크 밀도 구배 원심분리 및 하기하는 부착 단계 전에 23, 48 또는 71시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 실온 인큐베이션 기간 후에, PBMC의 생존성 및 B 세포, T 세포, 단핵구 및 NK 세포의 비율을 결정하였다. 결과를 표 16에 나타낸다.
배양 0일에 세포 생성물의 특성 분석
공여자 1 공여자 2
23시간 48시간 71시간 23시간 48시간 71시간
PBMC 생존성 (％) 97 99 97 98 99 97
％ B 세포 4 3.8 4.4 5.15 4.55 5.45
％ T 세포 38.9 35.5 27.4 49.3 42.7 46.4
％ 단핵구 41.9 37.7 41.2 29.5 24.4 28.7
％ NF 세포 6.4 11.3 10.9 4.7 2.54 5.7
DC 산물의 생산
PBMC를 피콜-히스토파크 밀도 원심분리에 의해 제조하고, 실온에서 PBS로 4회 세척하였다. 2x 108 PBMC를 30 ml AIM-V 배지 (인비트로겐)에 재현탁시키고, 150 cm3 플라스틱 플라스크에 2시간 동안 37℃에서 부착시켰다. 비부착 세포를 제거하고, 잔류하는 세포를 1000 U/ml GM-CSF (류킨 (Leukine)) 및 1000 U/ml IL-4 (알&디 시스템즈)로 보충된 X-VIVO 15 배지에서 5일 동안 37℃, 5％ CO2에서 배양하였다. 미성숙 DC를 TNF-α (10 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) 및 PGE2 (1 ㎍/ml)를 첨가하여 초기에 성숙시켰다. 철야 배양한 후에, TIP-DC 중간 산물을 배지를 제거하고 차가운 PBS로 세척하여 수거하였다. 세포의 성숙 집단 생성을 확인하기 위해 TIP-DC의 표현형을 결정하였다. 항원 부가된, 충분히 성숙한 DC를 생성시키기 위해, TIP-DC를 전기천공하고, 세포 0.5 ml를 를 4x1O7/ml로 냉각된 비아스팬에 재현탁시키고, 빙상에 배치하였다. DC를 모델 항원-코딩 항원 부가물로서의 증폭된 총 종양 신세포 암종 mRNA (1 ㎍/106 세포) + 4 ㎍/106 CD40L mRNA와 혼합하고, 4 mm 갭 전기천공 큐벳에 넣고, 바이오라드 젠펄사 엑스셀 (Biorad GenePulsar Xcell) 시스템을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 직후에, DC를 X-VIVO 15 배지로 세척하고, 최종적으로 GM-CSF (800 U/ml) 및 IL-4 (500 U/ml)로 보충된 20 ml의 X-VIVO 15에 1x106/ml로 재현탁시키고, 저부착 T75 플라스크에서 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포수 및 생존성은 제조자가 권고한 바와 같이 요오드화 프로피듐 및 CalTag 계수 비드를 사용하여 결정하였다. 피콜 후 PBMC 샘플, 6일 TIP-DC, 전기천공 및 배양 4시간 후에 수거한 DC (PME-CD40L DC), 및 해동후 최종 생성물 모두에 대해 세포수 및 생존성 분석을 수행하였다. 결과를 표 17에 나타낸다.
PME-CD40L DC 생성 동안 DC의 회수 및 수율
씨딩된 PBMC의 수 /플라스크 6일에 회수된 도입 PBMC의 비율/생존성 전기천공 4시간 후의 회수/생존성 ％ 동결/해동 후 최종 생성물의 회수/생존성 ％
공여자 1
23시간 2x108 27％/96％ 생존가능 60％/93％ 생존가능 78％/86％ 생존가능
48시간 2x108 17％/98％ 생존가능 58％/95％ 생존가능 85％/94％ 생존가능
72시간 2x108 9％/97％ 생존가능 50％/96％ 생존가능 71％/93％ 생존가능
공여자 2
19시간 2x108 6.6％/95％ 생존가능 68％/95％ 생존가능 68.9％/91％ 생존가능
41시간 2x108 12％/96％ 생존가능 62％/93％ 생존가능 78.5％/89％ 생존가능
66시간 2x108 3.1％/97％ 생존가능 41％/91％ 생존가능 86.3％/90％ 생존가능
PBMC 및 DC 산물의 표현형 분석
모든 항체는 비디 바이오사이언시스 제품이고, 제조자가 권장한 희석액으로 사용하였다. PBMC: 3x1O5 세포를 각각 항체 중에서 30분 동안 4℃에서 CD19-PE, CD14-PE 및 CD3-PE, 또는 일치된 이소형 컨쥬게이팅된 대조군으로 염색하였다. 인큐베이션 후에, 염색된 세포를 차가운 1％ FBS/PBS로 3회 세척하고, 셀퀘스트 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 팩스칼리버 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)로 형광 분석을 수행하기 위해 PBS에 재현탁시켰다. 획득 3분 전에, 요오드화 프로피듐 (1 ㎍/ml)을 게이팅을 위해 생존성 염료로서 각각의 샘플에 첨가하였다. DC: 1x106 세포 (TIP-DC 및 PME-CD40L DC)를 냉각된 PBS/1％ FBS에 재현탁시켰다. MHC 분자 (HLA-ABC, HLA-DR), 또는 동시자극 분자 (CD80, CD86), 또는 성숙 마커 (CD83) 또는 단핵구/DC 계열 마커 (CD14, CD209)에 특이적인 PE 또는 FITC 컨쥬게이팅된 항체를 1x105 DC와 혼합하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이소형 일치 항체를 대조군으로 사용하였다. 철저히 세척한 후에, 세포를 상기한 바와 같이 유세포 측정에 적용하였다. 세포내 CD40L을 다음과 같이 결정하였다: 2 x 105 PME-CD40L DC를 최소 10분 내지 2시간 동안 4℃에서 250 ㎕의 사이토픽스 (Cytofix)/사이토펌 (Cytoperm) 용액 (비디 바이오사이언시스)에 재현탁시켰다. 세포를 2 ml 염색 버퍼 (PBS, BSA, NaN3 및 EDTA)로 2회 세척하고, 0.5 ml 염색 버퍼에 재현탁시켜 4℃에서 철야 저장하였다. 세포를 2.0 ml 펌 (Perm)/와시 (Wash) 용액 (비디 바이오사이언시스)에 15분 동안 재현탁시키고, 원심분리한 후, 1OO ㎕ 펌/와시 용액에 재현탁시켰다. 20 ㎕의 마우스 항-인간 CD40L APC 또는 마우스 IgG1 APC를 각각의 DC 제제에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 암소에서 인큐베이션하였다. 세포를 1 ml 펌/와시 용액으로 세척하고, 유동 세포 측정 분석 전에 염색 버퍼에 재현탁시켰다. 결과를 표 18에 나타낸다.
중간체 TIP-DC 및 최종 PME-CD40L DC 산물의 표현형
6일 TIP-DC (％) 공여자 1 공여자 2
23시간 48시간 71시간 23시간 48시간 71시간
CD14 4.1 1.23 0.62 0.16 1.38 0.89
CD80 96.92 97.9 98.3 99.4 99.5 87.8
CD83 84.19 88 93 92.2 88.5 62.1
CD86 99.31 99.6 98.4 99.8 99.9 99.4
HLA-I 95.65 94.6 96.1 95.6 97.4 82.6
HLA-II 99.55 99.7 98.5 99.8 99.8 96.9
최종 PME-CD40L 산물 (％)
CD14 1.19 1.36 1.3 0.43 0.66 1.08
CD209 97.98 97.60 98.23 89.9 98.2 96.3
본원에 설명된 특정 실시태양은 단지 예시하고자 한 것으로서 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 실시태양에서 사용될 수 있다. 당업계의 숙련인은 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 과정에 대한 많은 균등한 과정을 이해하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 균등물은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주되고, 청구항에 포함된다.
본원 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 관련되는 당업계의 숙련인의 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원, 특히 그의 관련 부분은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본원에 개시되고 특허 청구되는 모든 조성물 및/또는 방법은 본원 개시내용에 비추어 과도한 실험을 수행하지 않고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시태양의 측면에서 설명되었지만, 본 발명의 조성물 및/또는 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계로 또는 단계의 순서로 그에 대한 변형을 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 적용할 수 있음을 당업자는 쉽게 이해할 것이다. 보다 특히, 화학적으로 및 생리학적으로 관련되는 특정 물질을 본원에 기재된 물질 대신에 사용하여 동일하거나 유사한 결과를 얻음을 이해할 것이다. 당업계의 숙련인에게 자명한 상기 모든 유사한 치환체 및 변형은 첨부되는 청구의 범위에 규정되는 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 포함되는 것이다.
2개의 독립적인 실험으로부터의 표 16의 데이타는 환자로부터 수거 후에 72시간 이하 동안 유지된 성분채집 산물이 회수된 백혈구 서브세트에서 유의하게 편중되지 않으면서 생존성이 높은 PBMC 집단을 생성시킬 수 있음을 알 수 있다. 플라스크에 PBMC를 각각의 시점에 씨딩하고 배양하여 성숙 DC (TIP-DC)를 생성시키면 높은 빈도의 생존성 세포를 얻을 수 있지만, 연장된 기간 동안 유지된, 성분채집 산물을 사용한 DC의 총 회수율은 감소한다 (표 17). 그럼에도 불구하고, 증폭된 총 종양 RNA 및 CD40L RNA를 사용한 전기천공에 의해 충분한 DC를 추가의 처리를 위해 생성시킬 수 있다. 가장 중요하게는, 표 17 및 18은 상이한 출발 산물로부터 생성된 TIP-DC가 동등하게 전기천공, 및 회수가 가능하고, 최종 생성물인 PME-CD40L DC로 충분히 성숙됨을 보여준다. 상기 연구로부터 생성된 PME-CD40L DC는 '백신'으로 제제화되어 동결되고, DC 제조에 대한 어떠한 유해한 영향도 없이 해동될 수 있다. 결론적으로, 수거 후 72시간 이하 동안 유지된 성분채집 산물은 임상 적용을 위한 DC 백신의 집중적인 제조를 위한 실행가능한 원료이다.
SEQUENCE LISTING <110> ARGOS THERAPEUTICS, INC. KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA Caley, Rebecca Monesmith, Tamara Tcherepanova, Irina Dinterman, Lois <120> DENDRITIC CELL COMPOSITIONS AND METHODS <130> ARG035WO <140> not yet assigned <141> 2006-04-07 <150> 60/669,468 <151> 2005-04-08 <160> 121 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2707 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (15)..(2003) <223> ALOX-15 Coding Sequence <400> 1 catctttgag caagatgggt ctctaccgca tccgcgtgtc cactggggcc tcgctctatg 60 ccggttccaa caaccaggtg cagctgtggc tggtcggcca gcacggggag gcggcgctcg 120 ggaagcgact gtggcccgca cggggcaagg agacagaact caaggtggaa gtaccggagt 180 atctggggcc gctgctgttt gtgaaactgc gcaaacggca cctccttaag gacgacgcct 240 ggttctgcaa ctggatctct gtgcagggcc ccggagccgg ggacgaggtc aggttccctt 300 gttaccgctg ggtggagggc aacggcgtcc tgagcctgcc tgaaggcacc ggccgcactg 360 tgggcgagga ccctcagggc ctgttccaga aacaccggga agaagagctg gaagagagaa 420 ggaagttgta ccggtgggga aactggaagg acgggttaat tctgaatatg gctggggcca 480 aactatatga cctccctgtg gatgagcgat 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cttccttcct cctttcctat 2220 cttccttcct ctctctcttc ctctttcttc attcagatct atatggcaaa tagccacaat 2280 tatataaatc atttcaagac tagaataggg ggatataata catattactc cacacctttt 2340 atgaatcaaa tatgattttt ttgttgttgt taagacagag tctcactttg acacccaggc 2400 tggagtgcag tggtgccatc accacggctc actgcagcct cagcgtcctg ggctcaaatg 2460 atcctcccac ctcagcctcc tgagtagctg ggactacagg ctcatgccat catgcccagc 2520 taatattttt ttattttcgt ggagacgggg cctcactatg ttgcctaggc tggaaatagg 2580 attttgaacc caaattgagt ttaacaataa taaaaagttg ttttacgcta aagatggaaa 2640 agaactagga ctgaactatt ttaaataaaa tattggcaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaa 2707 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 ccctagaggg gcaccttttc atggt 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 tagaggggca ccttttcatg gtctc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 tttactctag aggcatcacc tggga 25 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ctgtatactt taaatcatct ctagattact tatgataccc aatacaatgt 3000 aaatactatg taaatagttg tactgtcttt ttatttatat tattattgtt attttttatt 3060 ttcaaaattt ttaaaacata cttttgatcc acagttggtt gacttcatgg atgcagaacc 3120 catggatata gagggccaac tgtaatctgt agcaactggc ttagttcatt aggaaacagc 3180 acaaatgaac ttaagattct caatgactgt gtcattcttt cttcctgcta agagactcct 3240 ctgtggccac aaaaggcatt ctctgtccta cctagctgtc acttctctgt gcagctgatc 3300 tcaagagcaa caaggcaaag tatttggggc actccccaaa acttgttgct attcctagaa 3360 aaaagtgctg tgtatttcct attaaacttt acaggatgag aaaaaaaaaa aaaaaaa 3417 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 gtttcttaca gtgagcggga tgcct 25 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 39 gagaacctta tggtccagga gctgg 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 ataagcggga cttcattcct ggcaa 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 107 tttaatagtc attccaaata tgaga 25 <210> 108 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 108 agtcattcca aatatgagat gcatt 25 <210> 109 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 109 tgttacagga agtcccttgc catcc 25 <210> 110 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 110 tacaggaagt cccttgccat cctaa 25 <210> 111 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 111 tcccttgcca tcctaaaagc caccc 25 <210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 112 cttctctcta aggagaatgg cccag 25 <210> 113 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 113 gaggtgatag cattgctttc gtgta 25 <210> 114 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260

Claims (56)

  1. a. 대상체로부터 단리된 시점으로부터 약 6시간 내지 96시간의 기간 동안 1℃ 내지 34℃의 온도에서 인큐베이션된 단핵구를 제공하는 단계, 및
    b. 상기 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 유도하는 단계
    를 포함하는, 단핵구로부터의 수지상 세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단핵구가 인간 단핵구인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인큐베이션 온도가 6℃ 내지 28℃인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 인큐베이션 온도가 8℃ 내지 26℃인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 인큐베이션 기간이 8시간 내지 48시간인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 인큐베이션 기간이 10시간 내지 30시간인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 인큐베이션 기간이 26시간 내지 72시간인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 인큐베이션 기간이 48시간 내지 80시간인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 분화가, 단핵구를 단핵구의 미성숙 수지상 세포로의 분화 유도 유효량의 조성물을 포함하는 배양 배지와 접촉시켜서 유도되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 조성물이 GM-CSF 및 IL-4, GM-CSF 및 IL-13, GM-CSF 및 IL- 15, 또는 IFNα인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 단핵구가 인큐베이션 기간 전체 동안 또는 인큐베이션 기간 중 일부 동안 말초혈 단핵 세포 (PBMC)와 함께 존재하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, PBMC가 백혈구 성분 채집술에 의해 대상체로부터 단리된 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 단핵구가 인큐베이션 기간 동안 또는 그 후에 PBMC로부터 농축되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단핵구가 분급분리(elutriation), 희석 피콜(Ficoll) 구배 원심분리, 희석 퍼콜(Percoll) 밀도 구배 원심분리 또는 자성 비드 분류에 의해 PBMC로부터 농축되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 단핵구를 플라스틱에 부착시켜서, 인큐베이션 기간 후에 단핵구가 PBMC로부터 농축되는 것인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 1종 이상의 항원을 상기 성숙 수지상 세포에 부가하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 단계가 미성숙 수지상 세포를 PGE2, TNFα, IL-6 및 IL-1β와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 단계가 상기 미성숙 수지상 세포에게 IFN-γ로 신호를 전달한 후에 수지상 세포에게 CD40L로 신호를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, CD40L을 사용한 신호전달이 수지상 세포 내에서 재조합 CD40L mRNA의 번역시에 이루어지는 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 단계가 미성숙 수지상 세포를 PGE2, TNFα 및 IFNγ와 접촉시켜서 성숙 수지상 세포를 생산하는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포를 CD40L을 코딩하는 RNA 및/또는 1종 이상의 관심 항원 또는 에피토프를 코딩하는 RNA로 형질감염시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, RNA가 1종 이상의 암세포 항원을 코딩하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, RNA가 1종 이상의 병원체 항원을 코딩하는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 수지상 세포에 1종 이상의 항원을 부가하여 항원 부가된 수지상 세포를 생성시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항원이 대상체에 자가 유래성인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 항원이 상기 수지상 세포를 상기 항원(들)을 코딩하는 1종 이상의 RNA로 형질감염시켜서 부가되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 수지상 세포가 전기천공에 의해 RNA로 형질감염되는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 세포가 106개 수지상 세포 당 약 1 ㎍ 내지 4 ㎍의 RNA로 형질감염되는 것인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 수지상 세포가 항원 부가시에 미성숙 상태인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항원 부가된 미성숙 수지상 세포를 항원 부가된 성숙 수지상 세포로 성숙시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 항원이 1종 이상의 암세포 또는 병원체로부터 단리되거나 유래된 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 암이 신세포암, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 전립선암, 유방암, 폐암, 결장암, 위암 및 췌장암으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 병원체가 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 C형 간염 바이러스 (HCV)인 방법.
  35. a) 2％ 이상의 DMSO를 포함하는 동결된 수지상 세포 백신을 해동시키는 단계, 및
    b) 상기 해동된 백신을, 투여 전에 세포 대 DMSO의 비율을 변경시키지 않은 채로 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체로의 수지상 세포 백신 투여 방법.
  36. 제44항에 있어서, 동결된 백신 중 DMSO의 농도가 약 10％인 방법.
  37. 제44항에 있어서, 수지상 세포가 제16항의 방법에 의해 제조된 것인 방법.
  38. 2％ 이상의 DMSO를 포함하고 해동시에 바로 투여가능한, 암 또는 병원체 감염 치료 또는 예방용의 동결된 의약의 제조에 있어서 항원 부가된 수지상 세포의 용도.
  39. 제38항에 있어서, 의약이 10％ 이상의 DMSO를 포함하는 것인 용도.
  40. 제16항의 방법에 의해 제조된 수지상 세포를 포함하는 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 수지상 세포가 항원 부가된 것인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 수지상 세포가 CD40L을 코딩하는 mRNA로 형질감염된 것인 조성물.
  43. 제40항에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포가, 신선한 단핵구로부터 제조된 성숙 수지상 세포에 비해 CD80, CD83, CD86, MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자 중 1종 이상의 수준이 증가된 것인 조성물.
  44. 신선한 단핵구로부터 제조된 성숙 수지상 세포에 비해 CD80, CD83, CD86, MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 II 분자 중 1종 이상의 수준이 증가된 단핵구 유래 성숙 수지상 세포를 포함하는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 성숙 수지상 세포가 CD40L을 코딩하는 mRNA에 의해 일시적으로 형질감염된 것인 조성물.
  46. 세포 내 ALOX15 RNA 대 β-액틴 RNA 또는 GAPDH RNA의 항정 상태(steady state) 비율이 1.0 미만인 단핵구 유래 성숙 수지상 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 비율이 0.2 내지 0.7인 수지상 세포.
  48. 제47항에 있어서, 상기 비율이 0.4 내지 0.5인 수지상 세포.
  49. 세포 내 CD52 RNA 대 β-액틴 RNA 또는 GAPDH의 항정 상태 비율이 1.0 초과인 단핵구 유래 성숙 수지상 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 비율이 1.2 내지 5.0인 수지상 세포.
  51. 제50항에 있어서, 상기 비율이 1.5 내지 2.2인 수지상 세포.
  52. 제51항에 있어서, 상기 비율이 1.8 내지 1.9인 수지상 세포.
  53. 세포 내 TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA 또는 CD69 RNA 대 β-액틴 RNA 또는 GAPDH RNA의 항정 상태 비율이 1.0 미만인 단핵구 유래 성숙 수지상 세포.
  54. 제53항에 있어서, 상기 비율이 0.2 내지 0.9인 수지상 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 비율이 0.5 내지 0.8인 수지상 세포.
  56. 제40항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 백신.
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