NO345353B1

NO345353B1 - Dendrittiske celleblandinger og fremgangsmåter

Info

Publication number: NO345353B1
Application number: NO20075166A
Authority: NO
Inventors: Rebecca Pogue-Caley; Tamara Monesmith; Irina Tcherepanova; Lois Dinterman
Original assignee: Coimmune Inc
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2007-10-10
Publication date: 2020-12-21
Also published as: USRE46152E1; WO2006127150A2; KR20200072566A; US20150132844A1; IL185977A0; CN101155914B; EP1882031B1; JP5020935B2; CA2602434A1; KR20170086700A; ES2650569T3; KR20130061753A; JP2008535493A; KR20160045151A; US8501470B2; MX2007012221A; KR20070119727A; KR101368035B1; NO20075166L; KR20150032915A

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for fremstilling av dendrittiske celler og relaterte blandinger anvendelige ved behandling av sykdom.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

En rekke kliniske forsøk har bevist sikkerheten av dendrittiske cellevaksiner og mer enn 1000 pasienter har mottatt dendrittiske celle-vaksiner uten noen alvorlige ugunstige hendelser forbundet med behandlingen og kliniske responser i halvparten av pasientene (Ridgeway (2003) Cancer Invest 21:873-876). For eksempel viste et nyere studie at vaksinasjon ved anvendelse av dendrittiske celler lastet med fire melanom-peptider (gp100, melan-A/MART-1, tyrosin melanom antigen (MAGE-3), KLH og flu matriks resulterte i regresjon av metastasisk melanom etter fire bimånedlige vaksinasjoner (Banchereau et al.

(2001) Cancer Res 61:6451- 6458).

WO 2004/050855 A2 beskriver en rask en-trinnsfremgangsmåte for å generere en antigenlastet, dendrittisk cellevaksine fra forløpere. Sallusto og Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med.179:1109 beskriver en effektiv presentasjon av løselig antigen av dyrkede, humane dendrittiske celler som er vedlikehold av granulocytt/makrofagkolonistimulerende faktor pluss interleukin 4 og nedregulert av tumornekrosefaktor α. WO 97/29182 A1 beskriver en fremgangsmåte og sammensetninger for å tilveiebringe modne dendrittiske celler. Liu et al. (2002) Cancer Gene Therapy 9:202 beskriver adenovirusmedierte CD40-ligandgenspleisede dendrittiske celler som utvider økt CD8<+ >cytotoksisk T-celleaktivering og antitumorimmunitet.

En vanlig metode for fremstilling av dendrittiske celler (DC’er) er å oppsamle mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) fra et subjekt og deretter differensiere monocyttene, som er en liten del av PBMC’ene, til DC’er. Det ble vanlig antatt at monocytter, for å fungere som egnede forløpere for in vitro fremstilling av dendrittiske celler, enten måtte være frosset eller dyrkes raskt etter isolering fra et subjekt. Følgelig ble PBMC’ene eller monocyttene, i tidligere kliniske forsøk hvor dendrittiske celle-vaksiner ble fremstilt fra monocytter, enten dyrket ved omtrent 37<0>C eller frosset innen noen få timer etter oppsamling av PBMC’er fra en pasient. Imidlertid kan praktiske hensyn med hensyn til fremstilling begrense den utstrakte anvendelsen av vaksiner bearbeidet ved en fremgangsmåte som krever dyrking av eller frysing av nyisolerte PBMC’er eller monocytter. Differensiering av PBMC’er til DC’er tar omtrent én uke, krever et GMP anlegg og dyktige teknikere. Følgelig ville tilveiebringelse av fasiliteter og personale for fremstilling av DC-vaksiner ved eller nær hvert kliniske åsted hvor PBMC’er blir oppnådd fra en pasient sannsynlig være uoverkommelig med hensyn til kostnader.

En kommersielt levedyktig modell for fremstilling av DC-vaksiner er å tilveiebringe ett eller et relativt lite antall av anlegg som kan fremstille DC-vaksiner fra pasient PBMC’er eller monocytter oppsamlet ved et klinisk sete og deretter sendt til et produksjonssted. Imidlertid kan en slik modell ikke anvendes for vanlige DC produksjonsmetoder som krever ferske PBMC’er eller monocytter. Frysing av ferske monocytter krever ytterligere manipulasjoner ved oppsamlingsstedet etter leukaferese og er derfor ikke et ønskelig alternativ. Følgelig eksisterer det et behov å utvikle fremgangsmåter for fremstilling av DC-vaksiner ved anvendelse av PBMC’er eller monocytter som har blitt lagret under sending til et produksjonsanlegg. Foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller dette behovet og tilveiebringer også ytterligere fordeler.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnerne har funnet fremgangsmåter som tillater fremstilling av dendrittiske celler og dendrittiske celle-vaksiner fra monocytter som har blitt lagret ved 1-34<0>C i tidsperioder på 6-96 timer etter isolering fra et subjekt. Evnen til å fremstille DC’er fra lagrede monocytter tillater større fleksibilitet og sending av monocyttene fra oppsamlingsstedet til et produksjonsanlegg. I tillegg har oppfinnerne funnet at de dendrittiske celle-vaksinene fremstilt fra lagrede monocytter er fenotypisk bedre enn dendrittiske celler fremstilt fra ferske monocytter. For eksempel har de dendrittiske celle-vaksinene fremstilt fra lagrede monocytter økte nivåer av kostimulatoriske molekyler, slik som CD80, CD83 og CD86, så vel som høyere nivåer av MHC klasse I og MHC klasse II-molekyler sammenlignet med dendrittiske celler fremstilt fra ferske monocytter.

Følgelig beskrives det en fremgangsmåte for fremstilling av dendrittiske celler fra monocytter, omfattende:

a. tilveiebringe monocytter som har blitt inkubert ved en temperatur på 1<0>C -34<0>C i en periode på 6 til 96 timer fra det tidspunktet de blir isolert fra et subjekt; og

b. indusere differensiering av nevnte monocytter til dendrittiske celler.

Videre beskrives det at monocyttene blir oppnådd ved leukaferese for å oppsamle mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) som omfatter monocytter.

Foretrukket blir differensiering indusert ved å bringe monocyttene i kontakt med et dyrkningsmedium omfattende en effektiv mengde av en blanding som induserer differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler, slik som, men ikke begrenset til, GM-CSF; GM-CSF og IL-4: GM-CSF og IL-13; GM-CSF og IL-15; og IFNα. De umodne dendrittiske cellene kan deretter modnes for å fremstille modne dendrittiske celler.

De modne dendrittiske cellene fremstilt ved fremgangsmåtene som beskrevet er fenotypisk forskjellig fra tidligere kjente modne dendrittiske celler. For eksempel beskrives det moden monocytt-avledet dendrittisk celle, hvor steady state-forholdet av ALOX15-RNA til aktin-RNA eller GAPDH-RNA i cellen er mindre enn 1,0. Dette er et redusert forhold sammenlignet med forholdet av ALOX15 til Aktin eller GAPDH-RNA i modne dendrittiske celler fremstilt fra friske monocytter. Videre beskrives det en moden monocytt-avledet dendrittisk celle, hvor steady state-forholdet av CD52-RNA til aktin-RNA eller GAPDH i cellen er større enn 1,0. Videre beskrives det en moden monocytt-avledet dendrittisk celle, hvor steady state-forholdet av TLR1-RNA, TLR2-RNA, IL-1β-RNA eller CD69-RNA til aktin-RNA eller GAPDH-RNA i cellen er mindre enn 1,0.

Videre beskrives det en blanding omfattende moden monocytt-avledete dendrittiske celler, hvor de modne dendrittiske cellene har økte nivåer av én eller flere av CD80, CD83, CD86, MHC klasse I-molekyler eller MHC klasse II-molekyler sammenlignet med modne dendrittiske celler fremstilt fra friske monocytter. Videre beskrivers det moden monocytt-avledete dendrittiske celler som har endrede steady state-nivåer av ALOX15-RNA, CD52-RNA, TLR1-RNA, TLR2-RNA, IL-1β-RNA eller CD69-RNA.

De dendrittiske cellene fremstilt ved fremgangsmåtene som beskrevet er spesielt anvendelige for fremstilling av vaksiner. Følgelig tilveiebringes også relaterte dendrittiske celleblandinger og vaksiner. Videre beskrives det at vaksinen er autolog til subjektet. Fortrinnsvis er den dendrittiske celle-vaksinen lastet med antigen fra kreftcelle eller patogen til stede i subjektet.

Overraskende har oppfinnerne funnet at dendrittiske celle-vaksiner frosset med DMSO er stabile i nærvær av DMSO i minst to timer etter tining. Det beskrives følgelig anvendelse av en antigen-lastet dendrittisk celle for fremstilling av et frosset medikament for behandling eller forebygging av kreft eller patogen infeksjon, hvor medikamentet omfatter minst 2% DMSO og er klart for administrering ved tining. Videre beskrives det en fremgangsmåte for vaksinering av et subjekt, omfattende:

a. tine en frosset dendrittisk celle-vaksine omfattende minst 2% DMSO og b. administrere den tinte vaksinen til subjektet uten å endre ratio av celler til DMSO før administrering.

Foretrukket er konsentrasjonen av DMSO omtrent 10%.

Videre beskrives det en antigen-lastet dendrittisk celle, hvor nevnte celle er differensiert in vitro fra en monocytt og er i stand til å overleve in vitro i minst 24 timer etter frysing i nærvær av ≥5% DMSO og tining. Videre beskrives det at den antigen-lastede dendrittiske cellen er i stand til å overleve in vitro i minst 24 timer etter frysing i nærvær av ≥10% DMSO og tining.

Videre beskrives det en dendrittisk celle-vaksine, omfattende omtrent 5-15% DMSO, hvor nevnte vaksine er klar for administrering til et subjekt.

I et aspekt beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av dendrittiske celler fra monocytter. Fremgangsmåten omfatter anrikning av monocytter fra et leukafereseprodukt ved elutriering, idet før elutrieringen er monocyttene blitt inkubert uten dyrking ved en temperatur opprettholdt ved 1 ̊C - 14 ̊C i en periode på omtrent 6 til 96 timer etter tidspunktet for oppsamling av leukafereseproduktet fra et individ og indusering av differensieringen av nevnte monocytter til dendrittiske celler.

Monocyttene kan være humane monocytter. Inkubasjonstemperaturen kan bli opprettholdt ved 1 ̊C - 8 ̊C. Perioden for inkubering kan være 8 til 48 timer. Perioden for inkubering kan være 10 til 30 timer. Perioden for inkubering kan være 26 til 72 timer. Perioden for inkubering kan være 48 til 80 timer. Differensieringen kan bli indusert ved å bringe monocyttene i kontakt med et dyrkningsmedium omfattende en effektiv mengde av en blanding som induserer differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler, idet blandingen kan være GM-CSF og IL-4; GM-CSF og IL-13; GM-CSF og IL-15; eller IFNα. De anrikede monocyttene kan bli frosset og tint før dyrkingen.

Fremgangsmåten kan videre omfatte et trinn for modning av de umodne dendrittiske cellene til modne dendrittiske celler. Fremgangsmåten kan videre omfatte å laste ett eller flere antigen inn i nevnte modne dendrittiske celler. Trinnet kan omfatte (a) å bringe de umodne dendrittiske cellene i kontakt med PGE2, TNFα, IL-6 og IL-1β eller (b) signalering av nevnte umodne dendrittiske celler med IFN-γ, fulgt av signalering av de dendrittiske cellene med CD40L. Nevnte signalering med CD40L kan bli utført ved translasjon av et rekombinant CD40L-mRNA inne i de dendrittiske cellene. Trinnet kan omfatte å bringe de umodne dendrittiske cellene i kontakt med PGE2, TNFα og IFNγ for å fremstille modne dendrittiske celler. Trinnet kan ytterligere omfatte å transfektere nevnte modne dendrittiske celler med et RNA som koder for CD40L og/eller RNA som koder for ett eller flere antigener eller epitoper av interesse. RNA-et kan kode for ett eller flere kreftcelleantigener og/eller ett eller flere patogene antigener.

Fremgangsmåten kan videre omfatte å laste de dendrittiske cellene med ett eller flere antigener for å fremstille en antigenlastet dendrittisk celle. Antigenet kan være autologt til individet. Nevnte antigen kan bli lastet ved å transfektere nevnte dendrittiske celler med ett eller flere RNA-er som koder for nevnte antigen(er). De dendrittiske cellene kan bli transfektert med RNA-et ved elektroporering. Nevnte celler kan bli transfektert med omtrent 1-4 μg RNA pr.10<6 >dendrittiske celler.

Nevnte dendrittiske celler kan være umodne på tidspunktet for antigenlasting.

Fremgangsmåten kan videre omfatte å modne de nevnte antigenlastede umodne dendrittiske cellene til antigenlastede modne dendrittiske celler. Fremgangsmåte ifølge krav 17 til 23, hvor Antigenet kan være fra eller avledet fra én eller flere kreftceller eller patogener. Kreften kan være valgt fra gruppen bestående av nyrecellekreft, kronisk lymfocyttisk leukemi, multippelt myelom, melanom, prostatakreft, brystkreft, lungekreft, kolonkreft, magekreft og pankreaskreft. Nevnte patogen kan være HIV eller HCV.

Nevnte monocytter kan bli utsatt for sporadisk eller kontinuerlig bevegelse i løpet av inkubasjonsperioden. Nevnte monocytter kan bli utsatt sporadisk eller kontinuerlig bevegelse assosiert med varefrakt i løpet av inkubasjonsperioden. Nevnte bevegelse kan være assosiert med varefrakt.

I et annet aspekt beskrives det en antigenlastet dendrittisk celle tilveiebringbar som beskrevet ovenfor for anvendelse som et farmasøytikum, for eksempel som en vaksine. Nevnte celler har et stabilt tilstandsforhold mellom ALOX15 RNA, TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA og/eller CD69 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH RNA på mindre enn 1,0 og/eller et stabilt tilstandsforhold mellom CD52 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH på høyere enn 1,0.

I et annet aspekt beskrives det en antigenlastet dendrittisk celle tilveiebringbar som beskrevet ovenfor for anvendelse i behandling eller forebygging av kreft eller en sykdom forårsaket av et patogen. Nevnte celler har et stabilt tilstandsforhold mellom ALOX15 RNA, TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA og/eller CD69 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH RNA på mindre enn 1,0 og/eller et stabilt tilstandsforhold mellom CD52 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH på høyere enn 1,0.

I et annet aspekt beskrives det en blanding omfattende dendrittisk celle tilveiebringbar som beskrevet ovenfor. Nevnte celler har et stabilt tilstandsforhold mellom ALOX15 RNA, TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA og/eller CD69 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH RNA på mindre enn 1,0 og/eller et stabilt tilstandsforhold mellom CD52 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH på høyere enn 1,0.

De dendrittiske cellene i blandingen kan være antigenlastet. De dendrittiske cellene i blandingen kan være transfektert med mRNA som koder for CD40L. De modne dendrittiske cellene i blandingen kan ha økte nivåer av én eller flere av CD80, CD83, CD86, MHC klasse I-molekyler, eller MHC klasse II-molekyler sammenlignet med modne dendrittiske celler fremstilt fra ferske monocytter.

I et annet aspekt beskrives det en vaksine omfattende blandingen som beskrevet ovenfor.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1: Figur av en foretrukket forsendelseskasse og pakkingsmaterialer for temperaturkontrollert sending av monocytter (for eksempel, leukafereseprodukt).

Figur 2: RNA-transfekterte DC’er gir funksjonell kostimulatorisk støtte. DC’er ble testet for evnen til å stimulere INF-γ-produksjon fra PBMC i en blandet lymfocytt (MLR)-analyse. Tinte DC’er fremstilt fra 3 forskjellige donorer ble paret med tidligere frossede PBMC’er fra hver donor. Alle parvise kombinasjoner ble testet ved anvendelse av ELISPOT (INF-γ) som avlesning. Kolonnene 1, 4 og 7 representerer DC’er paret med autologe PBMC’er. Kolonnen 2, 3, 5, 6, 8 og 9 representerer DC’er paret med ikke-autologe PBMC’er. Kolonnene 10-12 representerer kontroller med kun DC. Kolonnene 13-14 representerer kontroller med kun PBMC.

Figur 3: Cytokin-cocktail modnede DC’er ble sammenlignet med umodne DC’er fra samme donor med hensyn til deres evne til å stimulere Th1 cytokinproduksjon fra autologe T-celler. Begge populasjonene av DC’er ble transfektert med RNA som koder for Flu matriks protein og anvendt til å stimulere Flu-spesifikk hukommelse CTL fra autologe PBMC’er. Resultatene av ELISPOT analysene (# spots/brønn som en funksjon av tilført PBMC) er vist. Hvert sett av fire kolonner er arrangert i følgende rekkefølge: IFNγ-produksjon fremkalt fra Fluspesifikke T hukommelsesceller ved umodne DC’er, IFNγ-produksjon fremkalt fra Flu-spesifikke T hukommelsesceller ved modne DC’er; IL-2-produksjon fremkalt fra Flu-spesifikke T hukommelsesceller ved umodne DC’er; og IL-2-produksjon fremkalt fra Flu-spesifikke T hukommelsesceller ved modne DC’er.

Figur 4: To medisinglass hver av to RNA-lastede dendrittiske celleblandinger fremstilt fra daggamle PBMC’er oppnådd fra 2 forskjellige friske donorer ble tint. Ett medisinglass fra hver donor ble umiddelbart testet i en allo MLR-analyse mens det andre medisinglasset fra hvert preparat ble tillat å forbli ved romtemperatur i 40 minutter før det ble analysert ved samme metode.

PBMC’ene anvendt i dette forsøket omfattet autologe celler fra hver donor så vel som en tredje prøve av PBMC’er fra en donor ubeslektet med begge. Avlesningen for denne analysen var ELISPOT (INF-γ).

Figur 5: Funksjonaliteten av DC’er før frysning versus etter tining ble bedømt ved evnen av DC’ene til å stimulere en hukommelse Flu-spesifikk respons fra autolog PBMC som en funksjon av avtagende Flu mRNA-konsentrasjon anvendt for transfeksjon. Avlesningen ved forsøket var ELISPOT (INF-γ).

Figur 6: Strømningscytometri-bedømmelse av GFP-ekspresjon ved DC’er etter elektroporering med RNA som koder for GFP. Utransfektert (stiplet linje).

Figur 7: Intracellulær cytokin merking: IL-2/IFN-γ i CD4 og CD8 T-celler etter stimulering med DC transfektert med RNA som koder for GFP (negativ kontroll, venstre paneler) eller CMV pp65 (høyre paneler).

Figur 8: CSFE-fortynning i CD4 og CD8 T-celler etter stimulering med DC’er transfektert med RNA som koder for GFP (negativ kontroll, venstre paneler) eller CMV pp65 (høyre paneler).

Figur 9: Fenotyper fra dag 6 umodne dendrittiske celler (iDC’er) fremstilt fra daggammelt leukaferese-produkt.

Figur 10: Fenotyper av dag 7 modne dendrittiske celler (mDC’er) fremstilt fra daggammelt leukaferese-produkt.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Gjennom hele denne beskrivelsen er forskjellige publikasjoner, patenter og publiserte patentspesifikasjoner referert ved en identifiserende henvisning.

Beskrivelsene av disse publikasjonene, patentene og publiserte patentspesifikasjonene inntas herved ved referanse i foreliggende beskrivelse for å mer fullstendig beskrive teknikkens stand for området til hvilket foreliggende oppfinnelse tilhører.

Utøvelse av foreliggende oppfinnelse anvender, hvis ikke annet er angitt, konvensjonelle teknikker for molekylærbiologi (omfattende rekombinante teknikker), mikrobiologi, cellebiologi, biokjemi og immunologi, som er innenfor kunnskap på området. Slike teknikker er forklart fullstendig i litteraturen. Se, f.eks. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ed. (1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. eds. (1987)); seriene Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR: A Practical Approach (M.

MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames og G.R. Taylor eds. (1995)); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow og Lane eds. (1988)); Using Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow og Lane eds. (1999)); og Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. (1987)).

Definisjoner

Som anvendt her kan visse betegnelser ha de følgende definerte betydningene.

Som anvendt i beskrivelsen og kravene, omfatter entallsformen ”et,” ”en” og ”den” flertallsreferanser dersom ikke sammenhengen klart tilsier noe annet. For eksempel omfatter betegnelsen ”en celle” en rekke celler, inkludert blandinger derav.

Betegnelsen ”antigen” er vel forstått på området og omfatter substanser som er immunogene, dvs. immunogener, så vel som antigene epitoper. Det vil forstås at anvendelse av hvilket som helst antigen er omfattet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse og omfatter følgelig, men er ikke begrenset til, et selvantigen (hva enten normalt eller sykdomsrelatert), et infeksiøst antigen (f.eks. et mikrobielt antigen, viralt antigen, osv.) eller et eller annet annet fremmed antigen (f.eks. en matkomponent, pollen, osv.). Betegnelsen ”antigen” eller alternativt, ”immunogen” gjelder for samlinger av mer enn ett immunogen, slik at immunresponser mot multiple immunogener kan moduleres samtidig. Videre omfatter betegnelsen hvilke som helst av en rekke forskjellige formuleringer av immunogen eller antigen. I foretrukne utførelsesformer er antigenet fra en kreftcelle eller et patogen. Fortrinnsvis er kreftcellen en nyrekreft celle, en multippelt myelom celle eller en melanomcelle. Foretrukne patogener er HIV og HCV. I foretrukne utførelsesformer blir antigenet levert til den antigenpresenterende cellen (APC) i form av RNA isolert eller avledet fra en kreftcelle eller et patogen. ”Avledet fra” omfatter, men er ikke begrenset rekombinante varianter av naturlig forekommende sekvenser, omfattende fusjoner med ubeslektede eller beslektede sekvenser. Metoder for RT-PCR for RNA ekstrahert fra hvilken som helst celle (f.eks. kreftcelle eller patogen celle) og in vitro-transkripsjon er beskrevet i samtidige U.S. provisional patent application nr.

60/525,076 og PCT/US05/053271.

Med ”kreft” menes unormal tilstedeværelse av celler som fremviser relativt autonom vekst, slik at en kreftcelle oppviser en avvikende vekst fenotype karakterisert ved et betydelig tap av kontroll av celleproliferasjon. Kankrøse celler kan være godartete eller ondartete. I forskjellige utførelsesformer angriper kreften celler i blæren, blod, hjerne, bryst, kolon, fordøyelseskanalen, lunge, ovarier, bukspyttkjertel, prostatakjertel eller hud. Definisjonen av en kreftcelle, som anvendt her, omfatter ikke bare en primær kreftcelle, men også hvilken som helst celle avledet fra en kreftcelle. Dette omfatter metastaserte kreftceller og in vitrokulturer og cellelinjer avledet fra kreftceller. Kreft omfatter, men er ikke begrenset til, faste tumorer, flytende tumorer, hematologiske maligniteter, nyrecelle kreft, melanom, brystkreft, prostatakreft, testikkelkreft, blærekreft, ovarial kreft, cervikal cancer, magekreft, spiserørskreft, pankreaskreft, lungekreft, nevroblastom, glioblastom, retinoblastom, leukemier, myelomer, lymfomer, hepatom, adenomer, sarkomer, karsinomer, blastomer, osv.

Som anvendt her betyr betegnelsen ”omfattende” at blandingene og fremgangsmåtene omfatter de angitte elementene, men utelukker ikke andre. ”Bestående hovedsakelig av” når anvendt for å definere blandinger og fremgangsmåter, skal bety å utelukke andre elementer av hvilken som helst essensiell betydning for kombinasjonen. Følgelig ville en blanding bestående hovedsakelig av elementene som definert her ikke utelukke spor av kontaminanter fra isolering og rensningsmetoden og farmasøytisk akseptable bærere, slik som fosfatbufret saltoppløsning, konserveringsmidler og lignende. ”Bestående av” skal bety å utelukke mer enn sporelementer av andre bestanddeler og vesentlige metodetrinn for administrering av blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse. Utførelsesformer definert ved hver av disse overgangsbetegnelsene er innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Som anvendt her refererer betegnelsen ”cytokin” til hvilken som helst av de tallrike faktorene som utøver en rekke effekter på celler, for eksempel induserer vekst eller proliferasjon. Ikkebegrensende eksempler på cytokiner som kan anvendes alene eller i kombinasjon ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse omfatter, interleukin-2 (IL-2), stamcellefaktor (SCF), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-15 (IL-15), granulocytt-koloni stimulerende faktor (G-CSF), granulocytt makrofag-koloni stimulerende faktor (GM-CSF), interleukin-1 beta (IL-1β), interferon-γ (IFNγ), tumornekrosefaktor-α (TNFα), prostaglandin E2 (PGE2), MIP-11, leukemi hemmende faktor (LIF), c-kit ligand, trombopoietin (TPO) og flt3 ligand.

Cytokiner er kommersielt tilgjengelige fra mange leverandører slik som for eksempel Genzyme (Framingham, MA), Genentech (South San Francisco, CA), Amgen (Thousand Oaks, CA), R&D Systems (Minneapolis, MN) og Immunex (Seattle, WA). Det er ment, selv om ikke alltid eksplisitt angitt, at molekyler som har lignende biologisk aktivitet som villtype eller rensede cytokiner (f.eks. rekombinant fremstilt eller muteiner derav) skal anvendes innenfor idéen og omfanget av oppfinnelsen.

Betegnelsen ”dendrittiske celler (DC’er)” angir en ulik populasjon av morfologisk lignende celletyper funnet i en rekke lymfoide og ikke-lymfoide vev, Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol.9:271-296. Dendrittiske celler utgjør de mest potente og foretrukne APC’er i organismen. Dendrittiske celler kan differensieres fra monocytter og har en fenotype forskjellig fra monocytter. For eksempel er en spesiell differensiering-markør, CD14-antigen, ikke funnet i dendrittiske celler men innehas av monocytter. Det er vist at modne DC’er kan gi alle signalene nødvendig for T-celleaktivering og proliferasjon. Likeså er modne dendrittiske celler ikke fagocyttiske, mens monocytter og umodne dendrittiske celler er sterkt fagocyttiske celler. Umodne DC’er er i stand til å oppfange antigener ved endocytose, fagocytose, makropinocytose eller adsorptiv pinocytose og reseptormediert antigenopptak og er fenotypisk CD80ˉ eller CD80<lav>, CD83ˉ eller CD83<lav>, CD86<lav >og har høye intracellulære konsentrasjoner av MHC klasse II-molekyler. Modne DC’er har en skjult morfologi, en lavere kapasitet for endocytose og er fenotypisk CD80<høy>, CD83<høy >CD86<høy >sammenlignet med umodne DC’er. Foretrukket utskiller de modne DC’ene IL-12 p70 polypeptid eller protein og/eller utskiller betydelig reduserte nivåer (0 til 500 pg/ml pr. million DC’er) av IL-10. IL-10 og IL-12 nivåer kan bestemmes ved ELISA av kultursupernatanter oppsamlet ved opptil 36 timer etter induksjon av DC-modning fra umodne DC’er. Wierda W.G. et al (2000) Blood 96: 2917. Ajdary S et al (2000) Infection and Immunity 68: 1760. Se Banchereau og Steinman (1998) Nature 392:245 for en oversikt.

En ”effektiv mengde” er en mengde tilstrekkelig til å bevirke fordelaktige eller ønskede resultater. En effektiv mengde kan administreres i én eller flere administreringer, påføringer eller doser.

Som anvendt her refererer ”ekspresjon” til prosessene ved hvilke polynukleotider blir transkribert til mRNA og/eller mRNA blir translatert til peptider, polypeptider eller proteiner. Dersom polynukleotidet er avledet fra genomisk DNA fra en passende eukaryot vert, kan ekspresjon omfatte spleising av mRNA.

Regulatoriske elementer nødvendig for ekspresjon omfatter promotersekvenser for å binde RNA polymerase og transkripsjonsinitiering-sekvenser for ribosombinding. For eksempel omfatter en bakteriell ekspresjonsvektor eller kassett en promoter (f.eks. lac-promoter) og for transkripsjonsinitiering Shine-Dalgarno-sekvensen og startkodonet AUG (Sambrook et al. (1989) supra). Tilsvarende omfatter en eukaryot ekspresjonsvektor eller kassett typisk en heterolog eller homolog promoter for RNA polymerase II, en Kozak-sekvens, startkodonet AUG, et termineringskodon for løsrivelse av ribosomet og et nedstrøms polyadenyleringssignal. Slike vektorer kan oppnås kommersielt eller settes sammen av sekvensene beskrevet ved metoder kjent på området.

Betegnelsen ”genetisk modifisert” betyr inneholdende og/eller som uttrykker et fremmed gen eller nukleinsyresekvens som i sin tur modifiserer genotypen eller fenotypen av cellen eller dens avkom. Med andre ord refererer den til hvilken som helst addisjon, delesjon eller forstyrrelse av en celles endogene nukleotider.

Betegnelsen ”isolert” betyr atskilt fra bestanddeler, cellulære og forøvrig, til hvilke polynukleotidet, peptidet, polypeptidet, proteinet, antistoffet eller fragmenter derav, normalt er forbundet med naturlig. Med hensyn til et polynukleotid, for eksempel, er et isolert polynukleotid ett som er atskilt fra 5’ og 3’-sekvensene med hvilke det normalt er forbundet i kromosomet. Hvilket er innlysende for fagfolk på området, krever et ikke-naturlig forekommende polynukleotid, peptid, polypeptid, protein, antistoff eller fragment(er) derav, ”isolering” for å skille det fra dets naturlig forekommende motstykke. I tillegg er et ”konsentrert”, ”separert” eller ”fortynnet” polynukleotid, peptid, polypeptid, protein, antistoff eller fragment(er) derav, atskillbart fra dets naturlig forekommende motstykke ved at konsentrasjonen eller antallet av molekyler pr. volum er større enn ”konsentrert” eller mindre enn ”separert” enn det for dets naturlig forekommende motstykke. Et polynukleotid, peptid, polypeptid, protein, antistoff eller fragment(er) derav, som skiller seg fra det naturlig forekommende motstykket i dets primære sekvens eller for eksempel ved dets glykosyleringsmønster, trenger ikke være til stede i dets isolerte form siden det er atskillbart fra dets naturlig forekommende motstykke ved dets primære sekvens eller alternativt, ved en annen egenskap slik som dets glykosyleringsmønster. Selv om det ikke er eksplisitt angitt for hver av oppfinnelsene beskrevet her, skal det skal forstås at alle de ovennevnte utførelsesformene for hver av blandingene beskrevet nedenfor og under passende betingelser, tilveiebringes ved foreliggende oppfinnelse. Følgelig tilveiebringes et ikke-naturlig forekommende polynukleotid som en atskilt utførelsesform fra det isolerte naturlig forekommende polynukleotidet. Et protein produsert i en bakteriecelle tilveiebringes som en utførelsesform atskilt fra det naturlig forekommende proteinet isolert fra en eukaryot celle i hvilken det blir produsert naturlig. En isolert pattedyrcelle er separert fra der hvor den normalt blir funnet i kroppen eller er fjernet fra kroppen. For eksempel er leukocytter oppsamlet ved leukoferese ”isolert” og dendrittiske celler differensiert fra monocytter in vitro er ”isolert”.

Betegnelsene ”major histocompatibility complex” eller ”MHC” angir et kompleks av gener som koder for celleoverflatemolekyler som er nødvendige for antigenpresentasjon til T-celler og for rask transplantatavstøtning. Hos mennesker er MHC også kjent som ”humant leukocytt antigen” eller ”HLA”-komplekset.

Proteinene kodet for av MHC er kjent som ”MHC-molekyler” og er klassifisert i Klasse I og Klasse II MHC-molekyler. Klasse I MHC-molekyler omfatter membran heterodimere proteiner bestående av en α-kjede kodet for i MHC ikke-kovalent bundet med β2-mikroglobulinet. Klasse I MHC-molekyler blir uttrykt av nesten alle celler med kjerne og er vist å fungere ved antigenpresentasjon for CD8<+ >T-celler. Klasse I molekyler omfatter HLA-A, B og C hos mennesker. Klasse II MHC-molekyler omfatter også membran heterodimere proteiner bestående av ikkekovalent assosierte α og-β kjeder. Klasse II MHC-molekyler er kjent å fungere i CD4<+ >T-celler og omfatter, hos mennesker, HLA-DP, DQ og DR.

Ved monocytter menes CD14<+ >mononukleære celler fra perifert blod som er i stand til å differensiere til umodne dendrittiske celler som respons på GM-CSF og IL-4.

”Patogen”, som anvendt her, refererer til hvilken som helst sykdomsforårsakende organisme eller virus og også til svekkede derivater derav.

En ”farmasøytiske blanding” skal omfatte kombinasjonen av et aktivt middel (slik som et antigen-lastet DC) med en bærer, inert eller aktiv, som gjør blandingen egnet for diagnostisk eller terapeutisk anvendelse in vitro, in vivo eller ex vivo.

Som anvendt her omfatter betegnelsen ”farmasøytisk akseptabel bærer” hvilken som helst av standard farmasøytiske bærere, slik som varmeinaktivert serum pluss 10% DMSO pluss 5% dekstrose, fosfatbufret saltoppløsning, vann og emulsjoner, slik som en olje/vann eller vann/olje-emulsjon og forskjellige typer av fuktemidler. Blandingene kan også omfatte adjuvanser, stabiliseringsmidler og konserveringsmidler. For eksempler på bærere, stabiliseringsmidler og adjuvantia, se Remington’s Pharm. Sci.18<th >Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990)).

Betegnelsene ”polynukleotid” og ”nukleinsyremolekyl” blir anvendt om hverandre for å referere til polymere former av nukleotider av hvilken som helst lengde. Polynukleotidene kan inneholde deoksyribonukleotider, ribonukleotider og/eller analoger derav. Nukleotider kan ha hvilken som helst tredimensjonal struktur og kan utføre hvilken som helst funksjon, kjent eller ukjent. Betegnelsen ”polynukleotid” omfatter for eksempel enkeltrådet, dobbeltrådet og trippelheliksmolekyler, et gen eller genfragment, eksoner, introner, mRNA, tRNA, rRNA, ribozymer, cDNA, rekombinante polynukleotider, forgrenede polynukleotider, plasmider, vektorer, isolert DNA med hvilken som helst sekvens, isolert RNA med hvilken som helst sekvens, nukleinsyreprober og primere. I tillegg til et nativt nukleinsyremolekyl, kan et nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse også omfatte modifiserte nukleinsyremolekyler.

Betegnelsen ”peptid” blir anvendt i dens videste forstand for å referere til en forbindelse med to eller flere subenheter av aminosyrer, aminosyreanaloger eller peptidomimetika. Subenhetene kan være bundet ved peptidbindinger. I en annen utførelsesform, kan subenheten kan være bundet ved andre bindinger, f.eks. ester, eter, osv. Som anvendt her refererer betegnelsen ”aminosyre” til enten naturlige og/eller ikke naturlige eller syntetiske aminosyrer, omfattende glysin og både de D og L optiske isomerene, aminosyreanaloger og peptidomimetika. Et peptid med tre eller flere aminosyrer blir vanligvis betegnet et oligopeptid dersom peptidkjeden er kort. Hvis peptidkjeden er lang, blir peptidet vanligvis betegnet et polypeptid eller et protein.

Som anvendt her refererer ”subjekt” til et pattedyr, omfattende, men ikke begrenset til, mennesker og andre primater, gnagere, hunder og katter.

Foretrukket er subjektet et menneske.

Oppfinnerne har funnet at umodne dendrittiske celler, modne dendrittiske celler og antigen-lastede dendrittiske celler kan produseres fra monocytter lagret ved 1<0>C - 34<0>C i omtrent 6 til 96 timer etter oppsamling av monocyttene fra en pasient. Disse resultatene er overraskende, ettersom det var vanlig antatt at det var kritisk å fremstille dendrittiske celler fra nyisolerte monocytter, heller enn fra monocytter som hadde blitt lagret ved omgivelsestemperaturer i et betydelig tidsrom. Videre har monocytt-avledete DC-vaksiner anvendt i kliniske forsøk utført før foreliggende oppfinnelse blitt fremstilt ved dyrking av monocytter innen mindre enn 6 timer etter oppsamling fra en pasient eller ved frysing av PBMC’er kort tid etter oppsamling og lagring av PBMC’ene for påfølgende tining og dyrking av monocytter.

Ikke bare har oppfinnerne funnet at det er mulig å fremstille dendrittiske celler og dendrittiske celle-vaksiner fra monocytter som er lagret ved 1<0>C - 34<0>C i omtrent 6 til 96 timer, de har også overraskende funnet at dendrittiske celler fremstilt ved denne metoden er fenotypisk bedre enn de dendrittiske cellene fremstilt fra friske monocytter. Fremgangsmåten for fremstilling og egenskapene av dendrittiske celle-vaksiner fremstilt ved disse fremgangsmåtene er spesielt relevant for vaksine potens, vellykket kommersialisering over et omfattende område og enkel administrering. For det først uttrykker de modne dendrittiske cellene fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, sammenlignet med DC’er fremstilt ved tidligere kjente metoder, økte nivåer av CD80, CD83 og CD86 koostimulatoriske molekyler, så vel som økte nivåer av MHC klasse I og MHC klasse II-molekyler, som alle er indikative for modenhet og potens av DC. I tillegg er modne DC’er ifølge oppfinnelsen i stand til å indusere IL-2-produksjon fra hukommelse T-celler på en antigenspesifikk måte.

For det andre ville det ikke være kommersielt gjennomførbart å etablere anlegg for produksjon av dendrittiske celler i nærheten av hvert sted hvor PBMC’er fra pasienter ville bli oppsamlet. Derfor vil vellykket omfattende kommersialisering av en autolog dendrittisk celle-vaksine avhenge av evnen til å sende PBMC’er eller monocytter isolert fra PBMC’er til sentraliserte produksjonsanlegg for differensiering til umodne og modne dendrittiske celler og fremstilling av vaksiner. Imidlertid var det, før foreliggende oppfinnelse, vanlig antatt at PBMC’er må bli frosset eller dyrkes kort tid etter fjerning fra en pasient. Metodene ifølge oppfinnelsen løser dette problemet ved å tillate prosessering av PBMC’er eller monocytter isolert fra PBMC’er som har blitt sendt over natten eller ved lengre levering.

For det tredje blir antigen-lastede dendrittiske celler typisk frosset i DMSO og lagret inntil tining, vasking og resuspendering i en DMSO-fri farmasøytisk akseptabel bærer før administrering til en pasient. Vasketrinnet ble omfattet i tidligere DC vaksine kliniske forsøk fordi det ble antatt at DMSO har skadelige effekter på ikke frosne eller tinte DC’er. Overraskende har oppfinnerne funnet at DMSO ikke har noen bemerkelsesverdig skadelig effekt på dendrittiske celler. Følgelig er det ikke behov for å vaske og resuspendere den tinte DC-vaksinen før administrering. Utelatelse av dette trinnet forenkler administrering og reduserer både risiko for kontaminering og for ugunstige effekter av DC’ene på grunn av ytterligere manipulasjoner.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen, i ett aspekt, en fremgangsmåte for fremstilling av dendrittiske celler fra monocytter, omfattende:

a. tilveiebringe monocytter som har blitt inkubert ved en temperatur på 1<0>C -34<0>C i en periode på omtrent 6 til 96 timer fra det tidspunktet de blir fjernet fra et subjekt; og

b. indusere differensiering av de inkuberte monocyttene til dendrittiske celler.

Som anvendt her refererer ”monocytt” til en CD14<+ >leukocytt som har kapasitet til å differensiere til en dendrittisk celle. Monocytten kan være fra hvilket som helst pattedyr og er foretrukket en human monocytt. Monocyttene kan tilveiebringes og inkuberes i blandinger slik som, men ikke begrenset til, blod, blodfraksjoner (f.eks. hvite blodceller (WBC), buffy coats, mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er), osv. så vel som i blandinger ytterligere anriket for monocytter. I en foretrukket utførelsesform blir monocyttene gitt sammen med andre mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er), for eksempel som et leukaferese-produkt. I en annen utførelsesform blir monocyttene anriket fra PBMC’er eller isolert direkte fra perifert blod. Metoder for isolering av monocytter eller PBMC’er inneholdende monocytter er kjent for fagfolk på området. I foretrukne utførelsesformer blir monocyttene oppsamlet sammen med andre PBMC’er ved leukaferese. Metoder for leukaferese er kjent på området. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir PBMC’er omfattende monocytter oppsamlet fra et subjekt ved leukaferese ved et sykehus, klinikk, legekontor osv. Leukaferese er en metode ved hvilken de hvite blodcellene fjernes fra et subjekts blod, hvor det resterende deretter blir inngytt til subjektet. Leukaferese produktet er typisk en blodfraksjon anriket for PBMC’er, med lave nivåer av kontaminerende røde blodceller, granulocytter og blodplater. Metoder og utstyr for utføring av leukaferese er velkjent på området. Se for eksempel gambrobct.com/Products_&_Services/ for detaljert informasjon om leukaferese. Eksempler på leukafereseapparater omfatter COBESpectra™ fremstilt av GAMBRO BCT og CS3000 Pluss Blood Cell Separator fremstilt ved Baxter Fenwal.

Monocytter kan anrikes fra blod eller blodfraksjoner (f.eks. PBMC’er), under eller etter inkuberingsperioden ved 1<0>C - 34<0>C. Som anvendt her betyr ”anrikning av monocytter” en metode som øker proporsjonen av monocytter med hensyn til andre celletyper som var til stede ved starten av metoden. Metoder for anrikning av monocytter fra PBMC’er, blod eller andre blodfraksjoner er kjent for fagfolk på området og omfatter, men er ikke begrenset til elutriering, FACS, panning, magnetisk sortering, lav tetthet Ficoll gradient-sentrifugering og lignende.

Fortrinnsvis blir monocytter anriket fra PBMC’er ved elutriering. I én alternativ utførelsesform blir monocytter anriket fra PBMC’er etter den 6-96 timers inkuberingsperioden ved seleksjon for monocytter som adhererer til plast under celledyrking. I en annen utførelsesform blir monocytter anriket ved immunomagnetisk seleksjon. Den immunomagnetiske seleksjonen kan være positiv seleksjon for å binde monocytter eller kan være negativ seleksjon, for å binde celler som ikke er monocytter (f.eks. T-celler, B-celler, osv.)

Straks de er isolert fra et subjekt blir monocytter (f.eks. rensede monocytter, anrikede monocytter, PBMC’er omfattende monocytter, osv.) inkubert ved en temperatur på 1<0>C - 34<0>C i en periode på omtrent 6 til 96 timer fra det tidspunktet de blir isolert fra et subjekt. Som anvendt her angir tidspunktet ved hvilket monocytter eller PBMC’er inneholdende monocytter blir isolert fra et subjekt tidspunktet for fullførelse av fremgangsmåten for fjerning av cellene fra subjektet. Når for eksempel PBMC’er blir isolert fra en pasient i løpet av en fire timers leukaferese-prosedyre, ville tidspunktet for isolering være tiden ved hvilken oppsamling av PBMC’er ved leukaferese avsluttes.

Foretrukket blir monocyttene inkubert i 6 til 96 timer ved en temperatur på 3<0>C - 34<0>C eller 4<0>C - 32<0>C eller 5<0>C - 30<0>C, mer foretrukket ved en temperatur på 6<0>C - 28<0>C, enda mer foretrukket ved en temperatur på 6<0>C - 27<0>C, 8<0>C - 26<0>C eller ca.14<0>C - 24<0>C. Foretrukne nedre temperaturområder er 6<0>C, 7<0>C, 8<0>C, 9<0>C, 10<0>C, 11<0>C, 12<0>C, 13<0>C og 14<0>C. Foretrukne øvre temperaturområder er 20<0>C, 21<0>C, 22<0>C, 23<0>C, 24<0>C, 25<0>C, 26<0>C, 27<0>C, 28<0>C, 29<0>C, 30<0>C, 31<0>C, 32<0>C, 33<0>C og 34<0>C. Foretrukket er perioden for inkubering 8 til 72 timer, mer foretrukket 10 til 48 timer, enda mer foretrukket 12 til 24 timer og mest foretrukket, 15 til 22 timer. Andre foretrukne områder for inkuberingstid omfatter 8 til 48 timer, 10 til 30 timer, 26 til 72 timer og 48 til 80 timer. Foretrukne nedre grenser for inkuberingstid kan velges fra 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 36 og 48 timer. Foretrukne øvre grenser for inkuberingstid kan velges fra 24, 26, 28, 30, 36, 48, 60, 72, 84 og 96 timer.

Monocytter i hvilken som helst form (f.eks. monocytter i blod, blodfraksjoner, PBMC’er, rensede monocytter, osv.) kan sendes fra et klinisk åsted til et område for produksjon av dendrittiske celler under inkuberingsperioden ved 1<0>C - 34<0>C. Fortrinnsvis blir monocyttene sendt i en temperaturkontrollert beholder. Metoder for å opprettholde temperaturen av monocyttene på mellom 1<0>C - 34<0>C under inkuberingsperioden er kjent for fagfolk på området. For eksempel kan monocyttene inkuberes i en inkubator eller et rom ved 1<0>C — 34<0>C.

Foretrukket blir monocyttene underlagt en eller annen bevegelse (enten leilighetsvis eller kontinuerlig) under inkuberingsperioden. Bevegelsen kan være bevegelsen forbundet med sending. I en annen utførelsesform kan cellene bli forsiktig vugget eller rotert under inkubering. Selv om det ikke er ønskelig å være bundet av noen teori, er det antatt at bevegelsen kan forhindre celleskade forbundet med sammenpressing under befesting.

I løpet av den 6-96 timers lange inkuberingsperioden ved 1<0>C - 34<0>C, blir monocyttene inkubert uten dyrkning. Med ”uten dyrking”, menes at under den 6 til 96 timers lange inkuberingsperioden, blir monocyttene ikke dyrket i et dyrkningsmedium for pattedyrceller (omfattende, men ikke begrenset til, fysiologisk passende konsentrasjoner (f.eks. omtrent IX) av dyrkningsmedier slik som RPMI, DMEM, X-VIVO 15, AIM-V, StemSpan H2000 og lignende) ved en temperatur på ca.36-38<0>C. Monocytter prosessert ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen blir heller inkubert ved 1<0>C - 34<0>C, fortrinnsvis i blod eller blodfraksjoner (f.eks. serum, plasma, leukaferese produkt (f.eks. PBMC’er), buffy coat, osv.) saltoppløsning eller biologiske buffere slik som fosfatbuffer saltoppløsning (PBS). Mest foretrukket blir leukaferese produktet inneholdende monocytter inkubert ved 1<0>C — 34<0>C i leukaferese oppsamlingsbeholderen (f.eks. en blodoppsamlingspose). Selv om leukaferese produktet kan overføres til en annen beholder i starten eller i løpet av inkuberingsperioden, er det foretrukket å unngå unødvendige overføringer, hvilket kunne øke sannsynligheten for kontaminering.

Under eller etter den 6-96 timer lange inkuberingen ved 1<0>C - 34<0>C, kan monocyttene anrikes før differensieringstrinnet. Manipulasjoner kan utføres på monocyttene eller PBMC’er, osv., under perioden for inkubering, så lenge manipulasjonene blir utført ved 1<0>C - 34<0>C. Spesielt kan PBMC’er blir ytterligere renset eller monocytter kan bli anriket fra PBMC’er under denne perioden med inkubering. Slike manipulasjoner omfatter, men er ikke begrenset til, sentrifugering, elutriering, tangential flow filtrering, Ficoll tetthetsgradient, fortynnet Ficoll tetthetsgradient sentrifugering, fortynnet Percoll tetthetsgradient sentrifugering, antistoff panning, magnetisk cellesortering, positiv eller negativ immunmagnetisk seleksjon og lignende. I én utførelsesform kan monocytter anrikes fra PBMC’er etter inkuberingsperioden ved dyrking i en beholder (fortrinnsvis en plastbeholder) og seleksjon for adherente monocytter.

Etter inkubering ved en temperatur på 1<0>C — 34<0>C i en periode på omtrent 6 til 96 timer og et eventuelt trinn med ytterligere anrikning av monocyttene, blir monocyttene indusert for å differensiere til dendrittiske celler. Typisk blir monocytter differensiert til umodne dendrittiske celler og deretter kan de umodne dendrittiske cellene modnes til modne dendrittiske celler. En rekke metoder for differensiering av monocytter til dendrittiske celler og for modning av de dendrittiske cellene er kjent for fagfolk på området.

I én utførelsesform blir monocytter dyrket i et medium omfattende en sammensetning som induserer differensiering av monocytter til umodne eller modne dendrittiske celler. Sammensetninger som induserer differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området. Slike sammensetninger omfatter, men er ikke begrenset til, GM-CSF IL-4; GM-CSF IL-13; GM-CSF IL-15; IFNα; og GM-CSF TNFα. Foretrukket er sammensetningen som induserer differensiering GM-CSF IL-4.

Konsentrasjonene av GM-CSF og IL-4 kan være i området fra ca.400 til 2000 U/ml av hvert cytokin. Konsentrasjonen av GM-CSF og IL-4 er foretrukket 500 til 1000 enheter/ml av hvert cytokin. I én utførelsesform blir monocyttene bragt i kontakt med GM-CSF og IL-4 i ca.4-7 dager, mest foretrukket i ca.5-6 dager, under hvilket tidsrom monocyttene differensierer til umodne dendrittiske celler.

Etter differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler, kan de umodne dendrittiske cellene modnes til modne dendrittiske celler. Metoder for modning av dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området. I én utførelsesform blir den umodne dendrittiske cellen modnet ved kontakt med et medium omfattende GM-CSF, IL-4 og en modnings-blanding (PGE2, TNFα, IL-6 og IL-1β). Se for eksempel Jonuliet et al. (1997) Eur J Immunol 27:3135-3142.

I en alternativ metode for modning, blir umodne dendrittiske celler signalisert med et første signal, omfattende IFN-γ, fulgt av et andre signal omfattende CD40L. For eksempel blir i én utførelsesform, umodne dendrittiske celler bragt i kontakt med PGE2, IFN-γ og CD40L, fortrinnsvis i nærvær av GM-CSF og IL-4. I en foretrukket utførelsesform blir kontakten med CD40L utført ved translasjon av et rekombinant CD40L mRNA inne i de dendrittiske cellene.

Fortrinnsvis blir den dendrittiske cellen transient transfektert med et mRNA som koder for CD40L eller et aktivt fragment derav.

Mest foretrukket blir umodne dendrittiske celler bragt i kontakt med PGE2, TNFα og IFNγ, fortrinnsvis i nærvær av GM-CSF og IL-4, for å produsere modne dendrittiske celler. Modenheten av de dendrittiske cellene kan ytterligere økes ved transfeksjon, fortrinnsvis transient transfeksjon, med et RNA som koder for CD40L. Fortrinnsvis blir de dendrittiske cellene transfektert med et RNA som koder for CD40L og/eller RNA som koder for ett eller flere antigener eller epitoper av interesse. De ovennevnte metodene for modning er beskrevet i U.S. søknad 11/246,387.

I foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er de dendrittiske cellene lastet med ett eller flere antigener. Antigen-lastede dendrittiske celler er anvendelige som vaksiner og for in vitro-stimulering av T-celler. Antigener kan bli lastet inn i umodne eller modne dendrittiske celler. Hvis antigener blir lastet inn i umodne dendrittiske celler, kan de umodne dendrittiske cellene deretter modnes ved prosessen med lasting i seg selv eller ved andre modningsmetoder beskrevet her eller alternative modningsmetoder kjent for fagfolk på området.

Antigenet(antigenene) kan bli lastet som antigenet i seg selv (f.eks. proteiner, peptider, epitoper, cellelysater, virale partikler, osv.) eller kan lastes som en nukleinsyre® som koder for antigen(er). Fortrinnsvis blir antigenet lastet som en nukleinsyre som koder for antigenet. Mer foretrukket er nukleinsyren et RNA, mest foretrukket et mRNA. I en foretrukket utførelsesform blir mRNA som koder for ett eller flere antigener ko-transfektert med mRNA som koder for CD40L. Fortrinnsvis er antigenet autologt til subjektet og blir anvendt for å fremstille en antigen lastet autolog DC-vaksine for administrering til subjektet. Metoder for lasting av dendrittiske celler med peptid og protein-antigener, celler, celle eller vevslysater, virus eller virale partikler, nukleinsyrer og lignende er kjent for fagfolk på området.

I en foretrukket utførelsesform blir antigenet lastet ved elektroporering av en dendrittisk celle (moden eller umoden) med en nukleinsyre, fortrinnsvis et mRNA. Fortrinnsvis blir de dendrittiske cellene transfektert med omtrent 0,25 til 4 mikrogram RNA pr.10<6 >dendrittiske celler, mest foretrukket med ca.2 μg RNA pr.

10<6 >dendrittiske celler. I én utførelsesform blir 1 mikrogram tumor-RNA pr. million DC anvendt pr. transfeksjon. I en annen utførelsesform blir 0,25 til 1,0 μg hver av fire RNA’er som koder for fire separate antigener fra en patogen (f.eks. HIV) anvendt pr.10<6 >dendrittiske celler.

Antigenet kan være fra hvilken som helst kilde. Imidlertid er, i foretrukne utførelsesformer, antigenet eller antigenene autologt til subjektet. Med autologt til subjektet menes det at antigenet blir oppnådd eller avledet fra subjektet. Som ikke-begrensende eksempler, kan antigenene være fra kreftceller eller tumorvev oppnådd fra et subjekt. Kreft-antigenene kunne bli lastet inn i dendrittiske celler som kreftceller, kreftcelle eller vevslysater, ekstrakter fra kreftceller eller vev, rensede eller klonede komponenter av kreftceller eller vev, totalt RNA eller totalt mRNA eller selektert RNA eller mRNA fra slike celler eller vev, hva enten til stede i ekstrakter, renset, amplifisert, in vitro translatert og lignende. Alternativt kan antigenet oppnås eller avledes fra en patogen eller patogen-infiserte celler til stede i et subjekt.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er spesielt anvendelige for behandling eller forebygging av kreft og patogen infeksjon. I foretrukne utførelsesformer er kreften er nyrecelle karsinom, melanom, brystkreft, kronisk lymfocytisk leukemi, multippelt myelom, lungekreft, kolonkreft, pankreaskreft, magekreft eller prostatakreft.

Betegnelsen patogen refererer til hvilket som helst virus eller organisme som er involvert i etiologien av en sykdom og også til svekkede derivater derav. Slike patogener omfatter, men er ikke begrenset til, bakterielle, protozo, fungale og virale patogener slik som Helicobacter, slik som Helicobacter pylori, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Campylobacter, forskjellige mykobakterier, slik som Mycobakterium leprae, Bacillus antracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis, Brucella-arter, Leptospira interrogans, Staphyloccus, (f.eks. S. aureus), Streptococcus, Clostridum, Candida albicans, Plasmodium, Leishmania, Trypanosoma, human immunsvikt-virus (HIV), hepatitt C virus (HCV), humant papilloma virus (HPV), cytomegalovirus (CMV), humant T-lymfotrofisk virus (HTLV), herpesvirus (f.eks. herpes simplex virus type 1, herpes simplex virus type 2, coronavirus, varicella-zoster virus og Epstein-Barr virus (EBV)), papillomavirus, influensavirus, hepatitt B-virus, poliomyelitt-virus, meslingevirus, kusmavirus og røde hunder-virus. Fortrinnsvis er patogenet et viralt patogen, mer foretrukket et retroviralt patogen og mest foretrukket HIV eller HCV.

Dendrittiske celler, hva endet de er modne eller umodne, antigen-lastede eller ikke, kan fryses i en blanding omfattende en cryoprotektant. En rekke cryoprotektanter er kjent for fagfolk på området. Eksempler på cryoprotektanter omfatter, men er ikke begrenset til, dimtheylsulfoksid (DMSO), glyserol, etanol, metanol, acetamid, glyserol-monoacetat, propan-diol, polyetylenglykol, etylenglykol, i-erytritol, D-ribitol, D-mannitol, D-sorbitol, D-laktose, i-inositol, cholin klorid, aminosyrer, albumin (fortrinnsvis humant serumalbumin), polyvinyl pyrrolidon, dekstran, sukrose, Ficoll, uorganiske salter og hydroksyetyl-stivelse. I en foretrukket utførelsesform er cryoprotektanten DMSO. Fortrinnsvis er konsentrasjonen av DMSO 2-20%, mer foretrukket 5-15% og mest foretrukket omtrent 10%. Likeså kan frysemediet inneholde én eller flere polyolforbindelser avledet fra karbohydrater, slik som glukose, dekstrose, sukrose, osv., fortrinnsvis i en konsentrasjon på fra 2-30%, mer foretrukket fra 5-10%, mest foretrukket 5% dekstrose. Metoder for frysing av dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området. Se for eksempel U.S. patentsøknad 20040253574. Foretrukket er cryoprotektanten dimetylsulfoksid (DMSO). I foretrukne utførelsesformer er konsentrasjonen av DMSO 5% til 20%. Mest foretrukket er konsentrasjonen av DMSO i blandingen omtrent 10%.

Overraskende kan dendrittiske celler og dendrittiske celle-vaksiner fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen overleve in vitro i minst 24 timer etter tining etter frysing i nærvær av 5%-20% DMSO og tining. Fordi de antigen-lastede dendrittiske cellene ifølge oppfinnelsen er resistente mot DMSO, er det ikke nødvendig å vaske cellen før administrering av den dendrittiske celle-vaksinen. Følgelig er de tinte dendrittiske celle-vaksinene ifølge oppfinnelsen klar for administrering til et subjekt ved hvilket som helst tidspunkt etter tining. Eliminering av vasketrinnet reduserer risikoen for kontaminering og unngår ytterligere manipulasjoner som kan skade de dendrittiske cellene. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen i én utførelsesform en fremgangsmåte for administrering av en antigen-lastet dendrittisk celle-vaksine, omfattende tining av en frosset dendrittisk celle-vaksine omfattende minst 2% til 20% DMSO og administrering av vaksinen til et subjekt uten endring av forholdet av dendrittiske celler til DMSO før administrering. Fortrinnsvis er konsentrasjonen av DMSO i vaksinen omtrent 5-20% og mer foretrukket 10%.

I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av en antigen-lastet dendrittisk celle for fremstilling av et frosset medikament for behandling eller forebygging av kreft eller patogen infeksjon, hvor medikamentet omfatter minst 2% DMSO og er klar for administrering ved tining.

Fremgangmåtene ifølge oppfinnelsen tillater fremstilling av nye dendrittiske celler med økt funksjonalitet og økte nivåer av modenhets-markører. For eksempel tilveiebringer oppfinnelsen i ett aspekt modne monocytt-avledete dendrittiske celler, hvor de modne dendrittiske cellene har økte nivåer av én eller flere av CD80, CD83, CD86, MHC klasse I-molekyler eller MHC klasse II-molekyler sammenlignet med modne dendrittiske celler fremstilt fra ferske monocytter.

I enda en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en moden monocytt-avledet dendrittisk celle, hvor den dendrittiske cellen kan fremkalle antigen-spesifikk IL-2 produksjon fra en hukommelses T-celle. Metoder for å måle IL-2 er kjent på området. Celleoverflatemarkører og ekspresjon av andre molekyler som er karakteristisk for hukommelses-T-celler og som skiller dem fra andre typer av T-celler, er beskrevet i Figur 10.35 i Immunobiology, 6<th >Utgave, Eds. Janeway et al., Garland Science Publishing, New York, NY, 2005. For eksempel utrykker hukommelses-T-celler høye nivåer av CD44, CD45RO, CD45RA, Bcl-2, IFNγ, CD 127 og Ly6C; moderate nivåer av CD 122 og CXCR4; lave nivåer av FasL og er CD69 og CD25-negative.

Som beskrevet her viser mikromatrise-analyse av steady state RNA-nivåer endret genekspresjon mellom dendrittiske celler produsert fra daggamle monocytter sammenlignet med dendrittiske celler produsert fra friske monocytter. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen, i én utførelsesform, en moden monocyttavledet dendrittisk celle, hvor steady state-forholdet av ALOX15 RNA til enten βaktin-RNA eller GAPDH-RNA i cellen er mindre enn 1,0. Fortrinnsvis er forholdet mellom 0,2 til 0,7, mer foretrukket mellom 0,4 til 0,5 og mest foretrukket ca.0,45.

I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en moden monocyttavledet dendrittisk celle, hvor steady state-forholdet av CD52 RNA til β-aktin RNA eller GAPDH i cellen er større enn 1,0. Fortrinnsvis er forholdet mellom 1,2 til 5,0, mer foretrukket mellom 1,5 til 2,2 eller mellom 1,8 til 1,9 og mest foretrukket er forholdet 1,86.

I enda en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en moden monocytt-avledet dendrittisk celle, hvor steady state-forholdet av TLR1-RNA, TLR2-RNA, IL-1β-RNA eller CD69-RNA til β-aktin RNA eller GAPDH-RNA i cellen er mindre enn 1,0. Fortrinnsvis er forholdet mellom 0,2 til 0,9 og mer foretrukket mellom 0,5 til 0,8.

Det humane ALOX15 mRNA (SEKV ID NR:1) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR:2-12. Det humane IL-1β-mRNA (SEKV ID NR: 13) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR:14-24. Det humane TLR1-mRNA (SEKV ID NR:25) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR:26-36. Det humane TLR2-mRNA (SEKV ID NR:37) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR:38-48. Det humane CD69-mRNA (SEKV ID NR:49) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR:50-60. Det humane CD52-mRNA (SEKV ID NR:61) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR:62-77. Det humane GAPDH-mRNA (SEKV ID NR:78) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR:79-98. Det humane β-aktin-mRNA (SEKV ID NR: 99) og alleliske varianter derav kan detekteres ved anvendelse av Affymetrix-probene ifølge SEKV ID NR: 100-119.

RNA steady state-ekspresjonsnivåer kan detekteres ved mikromatrise, fortrinnsvis ved anvendelse av Affymetrix Human Genom U133 Plus 2.0 Array. Alternativt kan hybridisering utføres ved anvendelse av de genspesifikke probene listet opp i avsnittet ovenfor. Fortrinnsvis kan RNA-prøver ekstrahert fra dendrittiske celler anvendes for Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) i henhold til fabrikantens instruksjon (Genechip<® >Expression Analysis Technical Manual, 2004). I korthet blir tre mikrogram av totalt RNA spiket med Genechip<® >PoIy-A RNA Control Kit (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) omdannet til første tråd cDNA ved anvendelse av Superscript™ II revers transkriptase.

Andre-tråd cDNA-syntese blir fulgt av in vitro transkripsjon for lineær amplifisering av hvert transkript og innføring av biotinylerte CTP og UTP. cRNA-produktene blir fragmentert til omkring 100 nukleotider og hybridisert i 16 timer til mikromatrisene. Mikromatrisene blir deretter vasket ved lav (6xSSPE) og høy (100mM MES, 0,1M NaCl) stringens og merket med streptavidin-fykoerytrin.

Fluorescens blir amplifisert ved tilsetning av biotinylert anti-streptavidin og en ytterligere alikvot av streptavidin-fykoerytrin merking. GeneChip<® >Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) blir anvendt for å oppsamle fluorescenssignal ved 3 μm resolusjon etter eksitasjon ved 570 nm. Det gjennomsnittlige signalet fra to sekvensielle scanninger blir beregnet for hvert mikromatrise-trekk av interesse. Scannede bilder ble analysert med Genechip<® >Operating Software v1.1 (Affymetrix, Santa Clara, Calif). Foretrukket blir høy lineær korrelasjon (R<2>>0,95) av 4 kontroll-RNA’er inkludert i PoIy-A RNA Control Kit (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) bekreftet som en kontroll for godt resultat for merkingsprosessen.

Profildata for alle genene eller kun genene av interesse (f.eks. ALOX15, IL-1β, TLR1, TLR2, CD69 og/eller CD52, så vel som β-aktin og/eller GAPDH) blir innført inn i dataprogrammet GeneSpring™ og normalisert. Tre trinn blir utført i normaliseringstrinnet i henhold til standardmetoden forslått av GeneSpring™ for Affymetrix matriser.

1) data transformasjon (alle verdier mindre enn 0,01 ble satt til 0,01)

2) Normalisering til den 50. percentil.

3) Normalisering til medianen.

Forholdet av steady state-mRNA av interesse (ALOX15, IL-1β, TLR1, TLR2, CD69 eller CD52 mRNA) til steady state-GAPDH eller β-Aktin-mRNA kan deretter bestemmes ved å dividere den normaliserte ekspresjonen av mRNA av interesse med den normaliserte ekspresjonen av GAPDH eller β-aktin-mRNA.

De antigen-lastede dendrittiske cellene ifølge oppfinnelsen er anvendelige som vaksiner for behandling eller forebygging av sykdom eller for aktivering av T-celler, som deretter kan anvendes ved behandling. For eksempel kan antigenlastede dendrittiske celler anvendes for å fremkalle en immunrespons mot et antigen. De kan anvendes som vaksiner for å forhindre fremtidig infeksjon eller sykdom, eller for å aktivere immunsystemet for å behandle pågående sykdom, slik som, men ikke begrenset til patogen infeksjon eller kreft. De antigen-lastede dendrittiske cellene kan formuleres for anvendelse som vaksiner eller farmasøytiske blandinger med egnede bærere slik som fysiologiske buffere eller andre injiserbare væsker. Vaksinene eller de farmasøytiske blandingene ville administreres i terapeutisk effektive mengder tilstrekkelig til å fremkalle en immunrespons.

Fortrinnsvis er de dendrittiske cellene lastet med et antigen autologt til subjektet fra hvilket den dendrittiske cellen er avledet og administrert til samme subjekt. Se for eksempel U.S. 5,853,719, som beskriver fremstilling og anvendelser av antigen-lastede dendrittiske celler og spesielt RNA-lastede dendrittiske celler. Alternativt kan den dendrittiske cellen være lastet med et antigen som ikke er autologt til den tilsiktede mottageren av DC-behandlingen. Eksempler på slike antigener omfatter, men er ikke begrenset til antigener som er kjente terapeutisk mål, slik som telomerase, prostataspesifikt antigen og andre tumormarkører eller kjente antigener fra en patogen.

Metoder for oppsamling av monocytter eller PBMC’er omfattende monocytter

En rekke metoder for oppsamling av monocytter og PBMC’er omfattende monocytter fra et subjekt er kjent for fagfolk på området. Se for eksempel gambrobct.com/Products_&_Services/ for detaljert informasjon om leukaferese for oppsamling av PBMC’er og elutriering for rensing av monocytter. I en foretrukket utførelsesform blir et leukaferese-produkt og plasma oppsamlet i separate sterile, engangs, cytoferese poser med enkel anvendelse, oppsamlet ved anvendelse av AutoPBSC (Automatisert Perifert Blod Stamcelle) prosedyren i et Gambro BCT COBE Spectra (Gambro BCT, Lakewood, CO).

I én alternativ metode til leukaferese, blir PBMC’er oppnådd ved å oppsamle blod i en heparinisert sprøyte, fortynning i PBS, legges over Histopaque 1077 (Sigma), sentrifugering og utvinning av PBMC’er ved grenseflaten. Se Woodhead et al. (2000) International Immunol 12:1051-1061. Ytterligere metoder for oppsamling, rensing eller fraksjonering av PBMC’er er kjent for fagfolk på området.

Etter oppsamling av leukaferese-produktet eller annet blodprodukt, blir monocytter inneholdt deri inkubert ved 1-34<0>C i 6-96 timer. I én utførelsesform blir leukaferese-produktet oppsamlet i en pose og deretter transportert til vaksine produksjonsanlegget i en temperaturovervåket forsendelseskasse holdt ved 1-34<0>C, fortrinnsvis ved ca. 6-28<0>C og mest foretrukket ved 8-26<0>C. Gel pakker, slik som de beskrevet i U.S. patent 4,102807, som bidrar til avverging av temperaturendringer, kan omfattes i forsendelseskassen. For eksempel kan monocyttene sendes i en isolert beholder (f.eks. ThermoSafe™ modell E65 polyuretanskum-isolert beholder) og pakkes med ThermoSafe™ U-tek gel pakker og gelmatter som vist i Figur 1. For eksempel i pakkingsprosedyren vist i Figur 1, blir en 500 g U-tek gel matte regulert til en temperatur på -1<0>C lagt flat i bunnen av E65-beholderen. To 500 g U-tek gel matter (-1<0>C) blir foldet og plassert mellom den første gelmatten og tverrveggen i E65-beholderen. To 500 g U-tek gel (regulert til 18<0>C) blir deretter plassert vertikalt ved siden av de foregående gelmattene. En ThermoSafe™ INF3000 transplantat beholder blir plassert mellom gelene. Leukaferese posene blir plassert i en forseglet indre pose (STP711). En anordning som registrerer temperaturen av den indre posen kan anvendes for å overvåke temperaturen under sending. En slik anordning er ThermoSafe™ DataLogger. Den indre posen blir plassert i en forseglet ytre pose (STP710) og deretter blir posene plassert i INF3000 beholderen. En 500 g U-tek gel (+18<0>C) blir plassert på toppen av den lukkede INF300 beholderen, dekket med Kraftpapir og deretter en 4” skum propp. Boksen blir deretter forseglet med tape og er klar for sending.

Under eller etter inkuberingsperioden ved 1-34<0>C, kan leukaferese produktet bli ytterligere prosessert eller renset, for eksempel ved Ficoll tetthetsgradient sentrifugering ved romtemperatur i 50 ml koniske rør for å separere og konsentrere mononukleær celle-fraksjonen som omfatter dendrittisk celle-forløpere (monocytter). Fortrinnsvis kan, etter mangfoldige vasketrinn med fosfatbufret saltoppløsning (PBS), cellekonsentrasjon og celleviabilitet bestemmes.

Anrikning av monocytter

Metoder for anrikning av monocytter er kjent for fagfolk på området og omfatter, men er ikke begrenset til, tetthetsgradient sentrifugering (for eksempel, fortynnet Ficoll tetthetsgradient sentrifugering, fortynnet Percoll tetthetsgradient sentrifugering, osv.), elutriering, adherens til plast, tangential flow filtrering, fluorescens-aktivert celle-sortering (FACS), immunologisk celle separeringsteknikker (antistoff panning for å selektere monocytter eller for å fjerne ikke-monocytter (f.eks. leukocytter, makrofager, granulocytter, osv.), differensiell lysis, magnetisk celle-sortering, osv.), dyrking i plast dyrkningsposer belagt med plast mikrobærerkuler, osv. Se for eksempel O’Doherty et al. (1993) J Exp Med 178:1067-1076; Young et al. (1990) J Exp Med 171:1315-1332; Freudenthal et al. (1990) PNAS 87:7698-7702; Bernhard et al. (1995) Cancer Res 55:1099-1104; Caux et al. (1992) Nature 360:258-261; Read et al. (2003) “Evaluation of a Closed Automated System to Isolate Peripheral Blood Monocytes for Dendritic Dell (DC) Immunotherapy”, Ninth annual meeting of the ISCT; Mu et al. (2003) Scand J Immunol 58:578-586; Maffei et al. (2000) Transfusion 40:1419-1420; mitenyibiotec.com; Meyer-Wentrup et al. (2003) J Hematother Stem Cell Res 12:289-299; og WO 2004/000444. For eksempel kan magnetisk celle-sortering anvendes for å anrike form monocytter ved positiv seleksjon (CD14+ celler) eller ved negativ seleksjon (dvs. fjerning av celler som ikke er monocytter; f.eks. CD3+, CDl 9+ og CD2+ celler).

Fortrinnsvis blir monocytter anriket fra leukaferese-produktet ved elutriering, en automatisert metode for å isolere monocytter fra den aktuelle leukaferesen. Metoder for leukaferese er kjent på området. For eksempel kan elutriering utføres i Gambro BCT Elutra™ Celle Separeringsystemet (Gambro BCT, Lakewood, CO). Elutrieringsbuffer kan fremstilles ved tilsetning av 1000 ml 5% Humant Albumin Serum (HSA) til en 4 l pose av Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS). Cellene kan fraksjoneres ved elutriering i henhold til produsentens protokoll. I en foretrukket utførelsesform blir en modifisert versjon av produsentens (Gambro) protokoll anvendt for elutriering, hvor den endelige rotor off-fraksjonen er den fjerde fraksjonen istedenfor den femte fraksjonen. CBC med differensiell analyse kan utføres for monocyttfraksjonen for å verifisere renhet og utvinning. Alternativt kan monocyttrenhet bedømmes ved immunofenotyping med CD14. De anrikede monocyttene kan deretter differensieres til dendrittiske celler eller kan fryses og lagres for senere bruk. I én utførelsesform blir cellene frosset i 25 ml eller 50 ml fryseposer. Eksempler på fryseposer omfatter Cryocyte™ fryseposer, Origen™ fryseposer (Cryostore) og Pall™ fryseposer. Foretrukket inneholder hver frysepose 15 ml opptil 3 x 10<9 >celler i dyrkningsmedium (f.eks. AIM V, X-VIVO, RPMI, osv.) med omtrent 10-12% DMSO og 10-20% varmeinaktivert, filtrert plasma, ca.107 til 507 mg/l endelig konsentrasjon av CaCl2 og ca.44 til 241 mg/l endelig konsentrasjon av MgSO4. Cellene kan fryses ved anvendelse av en kontrollert hastighet fryser, deretter lagres cryogent.

I en alternativ utførelsesform blir, etter inkubering av PBMC’er og rensing ved Ficoll tetthetsgradient, PBMC’ene resuspendert i AIM-V<® >medium og sådd ut i T150 cm<2 >kolber ved 2,0 x 10<8 >celler pr. kolbe. I tilfelle at et utilstrekkelig antall av PBMC’er blir oppnådd, kan PBMC’ene fryses og kombineres med en andre leukaferese. Monocytter blir selektert fra den mononukleære cellepopulasjonen av PBMC’er ved adhesjon til sterile vevskultur plastkolber i én til to timer ved 37<0>C, 5% CO2, ≥ 75% fuktighet. Ikke-adherente og semi-adherente celler fjernes. PBS blir tilsatt til kolbene for å fjerne de gjenværende ikke-adherente cellene, semiadherente celler og gjenværende medium. De gjenværende adherente cellene er overveiende monocytter og representerer en populasjon av anrikede monocytter.

Fremgangsmåter for differensiering av monocytter til dendrittiske celler

En rekke metoder for differensiering av monocytter til dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området. Se U.S.6,607,722 , WO 97/29182, Romani, et al. (1994) J. Exp. Med.180:83-93; Sallusto og Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179:1109 og on og Reddy et al. (1997) Blood 90:3640-3646. De fleste av disse metodene omfatter dyrking av monocytter i nærvær av cytokiner som induserer differensiering av monocytter til dendrittiske celler. Eksempler på alternative metoder for differensiering av monocytter til dendrittiske celler omfatter, men er ikke begrenset til eksponering for fysisk forstyrrelse (f.eks. shearing), bestråling i nærvær av et lysaktiverbart middel som er i stand til danne fotoaddukter med cellulære DNA-komponenter og/eller behandling med et DNA bindende middel, fulgt av inkubering med sykdoms-effektor midler, slik som mikrober, sopper, virus og maligne celler. Se U.S. patent 6,607,722.

I én utførelsesform blir monocytter differensiert til dendrittiske celler ved dyrking i medium omfattende en blanding som induserer differensiering av monocytter til dendrittiske celler. Egnede medier for dyrking av monocytter, umodne og modne dendrittiske celler omfatter, men er ikke begrenset til, AIM-V, X-VIVO-15, RPMI, DMEM og lignende. Blandinger som induserer differensiering av monocytter til dendrittiske celler er kjent på området og omfatter, men er ikke begrenset til, GM-CSF pluss IL-4; GM-CSF pluss IL-13; og IFNα.

I en foretrukket utførelsesform blir anrikede monocytter differensiert til dendrittiske celler ved dyrking i nærvær av GM-CSF og IL-4 (se f.eks. WO 97/29182; .Sallusto og Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med.179:1109; og Romani et al. (1994) J. Exp. Med.180:83- 93). I korthet blir anrikede monocytter, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 1 x 10<6 >celler/ml dyrket i AIM V-medium, X-VIVO 15-medium eller annet egnet medium i nærvær 800 U/ml GM-CSF og 500 U/ml IL-4 i omtrent 4-7 dager, fortrinnsvis 6 dager ved 37<0>C, 5% CO2, ≥75% fuktighet for å tillate differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler. Cytokinkonsentrasjoner kan varieres. For eksempel er foretrukne konsentrasjoner av GM-CSF 500 til 1500U/ml, mer foretrukket 700 til 1000 U/ml, mest foretrukket 800 U/ml. Foretrukne konsentrasjoner av IL-4 er 400-1500 U/ml, mer foretrukket 450 til 1000 U/ml, mest foretrukket 500 U/ml. IL-13 eller IL-15 kan anvendes istedenfor eller i tillegg til IL-4. IFNα kan anvendes istedenfor GM-CSF pluss IL-4, IL-13 eller IL-15. Ettersom monocyttene differensierer til dendrittiske celler, mister de progressivt ekspresjon av CD14 og oppnår CD80-ekspresjon i overensstemmelse med fenotypen av dendrittiske celler i umoden tilstand.

Fremgangsmåter for modning av umodne dendrittiske celler til modne dendrittiske celler

Fremgangsmåter for modning av umodne dendrittiske celler til modne dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området og omfatter, men er ikke begrenset til, antigen-opptak og/eller kontakt med blandinger som induserer modning. Blandinger som induserer modning av umodne dendrittiske celler omfatter, men er ikke begrenset til, monocytt kondisjonert medium; PBMC kondisjonert medium; fiksert Staphylococcus aureus (Pansorbin™); lipopolysakkarider (LPS); andre bakteriecelle produkter, slik som monofosforyllipid A (MPL), lipoteichoic syre, osv.; fosforylcholin; kalsium ionoforer; forbol-estere slik som PMA; varmesjokk proteiner; nukleotider, slik som ATP, osv.; lipopeptider; Toll-lignende reseptor 4; kunstige ligander for Toll-lignende reseptorer; dobbeltrådet RNA, slik som poly-I:C, osv.; immunstimulerende DNA-sekvenser; modnings-cocktail (TNF-α, IL-6, IL-1β og PGE2); GM-CSF, IL-4 og modningscocktail (TNFα, IL-6, IL-1β og PGE2), GM-CSF, IL-4, PGE2 og sekvensiell signalering av IFNγ fulgt av signalering med CD40L; og lignende. Se for eksempel Cisco et al. (2004) J Immunol 172:7162-7168; Jonluit et al. (1997) Eur J Immunol 27:3135-3142; U.S. patentsøknad 20040203143; PCT søknad PCT/US2005/036304 og U.S. patentsøknad 11/246,387.

I én utførelsesform blir en modnings-cocktail inneholdende TNFα, IL-6, IL-1β og PGE2 tilsatt til en kultur av umodne dendrittiske celler. Cellene blir deretter dyrket natten over (omtrent 12 timer eller mer) for å fremstille modne dendrittiske celler.

I én alternativ utførelsesform blir umodne dendrittiske celler transfektert, fortrinnsvis ved elektroporering, med mRNA som koder for CD40L og eventuelt med mRNA som koder for ett eller flere antigener og deretter dyrket natten over (omtrent 12 timer eller mer) i nærvær av IFNγ og eventuelt PGE2 for å produsere modne dendrittiske celler. Et humant CD40L-cDNA og protein er vist i SEKV ID NR:120 og SEKV ID NR:121, henholdsvis. Andre CD40L-mRNA’er er kjent for fagfolk på området.

I en foretrukket utførelsesform blir en modnings-formulering i AIM V-medium tilsatt direkte til den umodne DC, hvilket gir en endelig konsentrasjon av TNF-α (10 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) og PGE2 (1 μg/ml). Cellene kan deretter dyrkes natten over (omtrent 12 timer eller mer) for å produsere modne dendrittiske celler. Modning kan eventuelt bli ytterligere økt ved eksponering av cellene for CD40-Ligand (CD40L), enten tilsatt til dyrkningsmediene eller mer foretrukket uttrykt i cellen. CD40L kan uttrykkes konstitutivt eller transient. Fortrinnsvis blir de modne dendrittiske cellene transfektert med et mRNA som koder for CD40L og eventuelt med mRNA som koder for ett eller flere antigener av interesse.

Antigener

Hvilket som helst antigen kan lastes inn i umodne eller modne dendrittiske celler. Antigenet vil deretter bli prosessert og presentert av de modne DC’ene. Eksempler på antigener omfatter, men er ikke begrenset til, virale partikler, bakterier eller andre patogener, proteiner og fragmenter derav, polypeptider, patogene lysater, patogene ekstrakter, patogene nukleinsyrer, kreftceller, kreftcelle-proteiner og fragmenter derav, kreftcellelysater, kreftcelleekstrakter og kreftcelle nukleinsyrer. Antigener kan være naturlig forekommende, kjemisk prosessert eller rekombinant fremstilt. Antigenene kan leveres til cellene som polypeptider, proteiner eller som nukleinsyrer ved anvendelse av metoder kjent på området.

Et antigen kan leveres i dets ”naturlige” form ved at ingen human intervensjon var involvert ved preparing av antigenet eller i å indusere det til å trenge inn i omgivelsen hvor det treffer den dendrittiske cellen. Alternativt eller i tillegg kan antigenet omfatte et uberabeidet preparat, for eksempel av typen som er vanlig administrert i et konvensjonelt allergi”skudd” eller i et tumorlysat.

Antigenet kan alternativt være hovedsakelig renset, f.eks. minst ca.90% rent.

Når antigenet er et peptid kan det fremstilles, for eksempel ved proteolytisk kløyving av isolerte proteiner. Hvilken som helst av en rekke kløyvingsmidler kan anvendes omfattende, men ikke begrenset til, pepsin, cyanogen bromid, trypsin, chymotrypsin, osv. Alternativt kan peptider bli kjemisk syntetisert, fortrinnsvis i en automatisert syntesemaskin slik som er tilgjengelig på området eller uttrykkes rekombinant. I tillegg kan rekombinante teknikker anvendes for å fremstille en nukleinsyre som koder for peptidet av interesse og for å uttrykke dette peptidet under ønskede betingelser. Alternativt kan antigen som koder for nukleinsyrer renses eller avledes fra en celle, vev eller virus.

Antigenet kan ha en struktur som er forskjellig fra hvilken som helst naturlig forekommende forbindelse. I visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er antigenet et ”modifisert antigen” ved at antigenet har en struktur som er hovedsakelig identisk med den av et naturlig forekommende antigen men som omfatter ett eller flere avvik fra den nøyaktige strukturen av den naturlig forekommende forbindelsen.

Når, for eksempel, det naturlig forekommende antigenet er et protein eller polypeptid-antigen, ville et modifisert antigen sammenlignet med dette protein eller polypeptid-antigenet ha en aminosyresekvens som skiller seg fra den av det naturlig forekommende antigenet ved addisjon, substitusjon eller delesjon av én eller flere aminosyrer og/eller ville omfatte én eller flere aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i det naturlig forekommende antigenet ved addisjon, substitusjon eller delesjon av én eller flere kjemiske grupper kovalent bundet til aminosyren. I ett aspekt har de naturlig forekommende og modifiserte antigenene minst én region på minst 5 aminosyrer som er minst 75% identisk. Fagfolk på området vil forstå at, ved sammenligning av to aminosyresekvenser for å bestemme graden av deres identitet, trenger ikke avstanden mellom strekninger (dvs. regioner på minst to) av identiske aminosyrer alltid være nøyaktig konservert. Naturlig forekommende og modifiserte protein eller polypeptid-antigener kan fremvise minst omtrent 80% identitet, mer alternativt 85%, 90%, 95% eller mer enn 99% identitet i aminosyresekvens for minst én region på minst 5 aminosyrer. Ofte kan det være anvendelig for en mye lengre region (f.eks.10, 20, 50 eller 100 eller mer aminosyrer) av aminosyresekvens å vise den angitte graden av identitet.

I foretrukne utførelsesformer blir antigenet levert som et polynukleotid eller gen som koder for antigenet, slik at ekspresjon av genet resulterer i antigenproduksjon enten i individet som behandles (når levert in vivo) eller cellekultur systemet (når levert in vitro). Teknikker for fremstilling av nukleinsyrer omfattende et uttrykkbart gen eller mRNA og for innføring av slike nukleinsyrer inn i et ekspresjonssystem hvor hvilket som helst protein kodet for av det uttrykkbare genet vil bli produsert er kjent på området og i korthet beskrevet nedenfor.

Fortrinnsvis blir antigenet levert som et mRNA. RNA eller mRNA oppnådd fra en celle (for eksempel kreftcelle, patogen celle eller patogen-infisert celle) kan lastes direkte inn i dendrittiske celler. Alternativt kan RNA eller mRNA amplifiseres før lasting. I én utførelsesform blir totalt eller målrettet mRNA amplifisert ved RT-PCR ved anvendelse av en primer inneholdende en sense promoter for å fremstille en cDNA ekspresjonskonstruksjon. RNA transkribert in vitro fra ekspresjonskonstruksjonen kan deretter anvendes for å laste cellene. Metoder for isolering, amplifisering, in vitro transkribering av RNA og lasting av RNA eller andre nukleinsyrer inn i dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området. Se for eksempel PCT/US04/39539 og U.S. provisional application 60/522,310.

I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen er antigenet ett eller flere HIV-proteiner eller fragmenter derav. Som et ikke-begrensende eksempel, kan plasma fra en HIV-infisert pasient tjene som en kilde for isolering av HIV-RNA. I én utførelsesform blir en andel av plasmaet sentrifugert og supernatanten blir oppsamlet og filtrert ved anvendelse av 0,22 μm filtere og lagret ved - 20<0>C inntil anvendelse ved formulering av den dendrittiske celle-vaksinen. HIV-RNA til stede i plasma blir amplifisert ved RT-PCR og in vitro transkripsjonsreaksjoner for å gi en tilstrekkelig mengde av amplifisert HIV-RNA for lasting inn i dendrittiske celler. I korthet blir viralt RNA revers transkribert til enkeltrådet (ss) DNA ved anvendelse av en revers transkriptase, passende reaksjonsbuffere og tilfedige heksamerer eller målrettede revers primere. Det enkeltrådete cDNA blir deretter amplifisert ved PCR til dobbeltrådet DNA i en primær PCR-reaksjon ved anvendelse av multiple primere. Identiteten til regionen(e) amplifisert i den primære PCR-reaksjonen blir bestemt ved seleksjon av spesifikke primere komplementære til målsekvenser som flankerer disse regionene. Produktet av den primære PCR-reaksjonen blir renset ved anvendelse av et QIAquick<® >PCR Rensnings-kit og tjener deretter som templat i den andre runden eller nested PCR amplifisering. I denne runden med amplifisering inneholder 5’-primerene et overheng med et RNA polymerasebindingssete (f.eks. en T7 promoter) og 3’-primeren inneholder et overheng med poly T strekninger. Modifikasjonene innført ved de overhengende regionene i en nested runde av PCR muliggjør transkripsjon av PCR-produktet in vitro og vellykket translasjon ved levering til dendrittiske celler. Rensing av det in vitro transkriberte RNA blir utført ved anvendelse av Qiagen RNeasy<® >kit og RNA’et blir eluert i nukleasefritt vann. Om nødvendig blir etanol presipitering utført for å konsentrere RNA’et. RNA’et blir resuspendert i nukleasefritt vann og ført gjennom et 0,8/0,2 μm polyetersulfon (PES)-filter, deretter utlevert i 0,5 ml polypropylenrør med sikker lås og lastet inn i DC eller cryopreservert ved ≤150°C inntil tining før transfeksjon.

I en annen foretrukket utførelsesform blir RNA eller mRNA ekstrahert fra én eller flere kreftceller. RNA eller mRNA kan lastes direkte inn i dendrittiske celler eller det kan først amplifiseres ved RT-PCR og in vitro transkripsjon ved anvendelse av metodene beskrevet i PCT/US04/39539.

Antigen-lasting av dendrittiske celler

Dendrittiske celler kan lastes med ett eller flere antigener som umodne dendrittiske celler, modne dendrittiske celler eller under differensiering fra umodne til modne dendrittiske celler. Dendrittiske celler kan innta antigener, slik som proteiner, peptider, virus, celler, cellelysater og lignende. Følgelig kan antigenlasting utføres enkelt ved å bringe den dendrittiske cellen i kontakt med antigenet eller nukleinsyren som koder for antigenet. Andre metoder for lasting av dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området, omfattende, men ikke begrenset til nukleinsyre transfeksjon, eksosomer, virale vektorer, mikropartikkel levering, osv.. Se for eksempel Mitchell et al. (2000) Curr Opin MoI Ther 2:176-181;

Zitovogel et al. (1998) Nature 4:594-600; Jenne et al., (2001) Trends Immunol 22:102-106 og U.S. patent publikasjon 2005/0158856. Ett eller flere antigener kan lastes direkte inn i de dendrittiske cellene eller nukleinsyrer som koder for ett eller flere antigener kan lastes (transfekteres) inn i de dendrittiske cellene. I en foretrukket utførelsesform blir de dendrittiske cellene lastet med nukleinsyrer som koder for ett eller flere antigener. Foretrukket er nukleinsyren et mRNA.

Metode for å transfektere nukleinsyrer inn i dendrittiske celler er kjent for fagfolk på området og omfatter, men er ikke begrenset til, passiv transfeksjon, lipidmediert transfeksjon, kationisk lipidmediert transfeksjon (f.eks. DOTAP), kationisk peptidmediert transfeksjon, elektroporering. Se Nair et al. (1998) Nat Biotechnology 16:364-369; Van Tendeloo et al. (2001) Blood 98:49-56; Saeboe-Larssen et al. (2002) J Immunol Methods 259:191-203; Boczkowski et al (2000) Cancer Res 60:1028-1034; Gilboa et al. Immunol Rev (2004) 199:251-263; U.S. provisional application 60/583,579; og U.S. patentsøknad 10/177,390.

Lasting av dendrittisk celle ved peptid pulsing

Metoder for lasting av dendrittiske celler med proteiner, polypeptider, peptider, celle eller vevsekstrakter og andre typer av antigener er kjent for fagfolk på området. I en foretrukket utførelsesform, blir umodne dendrittiske celler lastet med ett eller flere antigener. I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir peptider, polypeptider og/eller celle eller vevsekstrakter lastet ganske enkelt ved inkubering med umodne dendrittiske celler i dyrkningsmedium.

Antigen-lasting ved elektroporering fulgt av modning av umodne dendrittiske celler ved anvendelse av en cytokin-cocktail

I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir umodne dendrittiske celler høstet ved tapping av dyrkingskolben for å rykke løs cellene. Celler i suspensjon blir deretter overført til koniske rør. PBS blir tilsatt til dyrkingskolben for å fjerne de gjenværende flytende cellene og gjenværende medium, som blir tilsatt til den koniske kolben. Noen umodne dendrittiske celler kan forbli adherente til kolben. Løsrivelse av disse cellene blir fremmet ved tilsetning av PBS og inkubering av kolbene ved et sted fra 2<0>C opptil romtemperatur. Ved slutten av inkuberingsperioden, blir kolbene tappet og de løsrevne cellene blir tilsatt til det koniske røret. Den totale cellesuspensjon blir deretter pelletert, vasket i PBS og resuspendert i avkjølt ViaSpan® ved 4x10<7>/ml i 0,5 ml og plassert på is. DC’er blir blandet med mRNA ved 2μg/10<6 >celler for mRNA som koder for antigen(er) og plassert i en 4mm gap elektroporerings-kuvette og elektroporert ved en puls på 275-350V, 100-300Ω og 150μF og fortrinnsvis ved 325V, 200Ω. Umiddelbart etter elektroporering blir DC’er vasket i X-VIVO 15-medium og resuspendert ved 1x10<6>/ml i X-VIVO 15 supplert med GM-CSF (800U/ml), IL-4 (500U/ml) og PGE2 (1μg/ml), TNF-α (10ng/ml), IL-1β (10ng/ml) og IL-6 (100ng/ml). De umodne dendrittiske cellene blir deretter inkubert natten over ved 37<0>C, 5% CO2, ≥75% fuktighet for å produsere stabile modne dendrittiske celler. Modne dendrittiske celler blir deretter vasket i PBS.

Antigen-lasting ved elektroporering og modning ved anvendelse av CD40L

I én utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir umodne dendrittiske celler modnet ved anvendelse av CD40L og IFN-γ. Fortrinnsvis blir umodne DC’er transfektert med 4 μg CD40L mRNA pr.10 og mRNA (2 μg/10 celler) som koder for ett eller flere antigener ved elektroporering som beskrevet ovenfor og blir deretter dyrket natten over i X-VIVO 15 supplert med GM-CSF (800-1000 U/ml), IL-4 (500-1000 U/ml), IFN-γ (500-1000U/ml) eller TNF-α (10ng/ml) og PGE2 (1μg/ml) for å danne stabile modne dendrittiske celler. Dendrittiske celler modnet ved denne prosessen utskiller høyere nivåer av IL-12 (en T-cellevekstfaktor) og minimal IL-10, sammenlignet med dendrittisk celle modnet ved cytokin cocktailprosessen beskrevet ovenfor.

Antigen-lasting ved elektroporering av modne dendrittiske celler

Modne dendrittiske celler kan lastes med antigen ved metoder kjent for fagfolk på området. I én ikke-begrensende utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir, på den sjette dagen etter initiering av differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler, en modningsformulering i AIM V-medium tilsatt direkte til den umodne DC, hvilket gir en endelig konsentrasjon av TNF-α (10 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) og PGE2 (1 μg/ml). Cellene blir deretter dyrket natten over for å produsere modne dendrittiske celler. DC blir deretter høstet og ko-elektroporert med 1 μg av antigenkodende RNA og eventuelt med 4 μg av CD40L RNA pr.10<6 >celler. Etter elektroporering blir cellene dyrket i 4 timer ved 1 x 10<6 >celler AIM V-medium supplert med GM-CSF (800 U/ml) og IL-4 (500 U/ml). Cellene kan deretter formuleres for administrering til et subjekt uten frysing eller formuleres for frysing. For frysing blir cellene foretrukket formulert i varme-inaktivert autologt plasma, 10% DMSO og 5% dekstrose ved 2 x 10<7 >celler/ml. Cryogene medisinglass blir fylt med 0,7 ml for et totalt antall på 1,4 x 10<7 >celler pr. medisinglass. Medisinglass blir deretter frosset i alkohol bokser ved -85 °C i minimum 4 timer og overført til den cryogene fryseren for lagring. Den frosne dendrittiske celle-vaksinen kan deretter tines og administreres til et subjekt uten vasking eller reformulering.

Strømningscytometri-analyse av DC’er for å bedømme modning

I en foretrukket metode blir 10<6 >DC’er høstet og resuspendert i avkjølt PBS/ 1%FCS. Fykoerytrin (PE) eller FITC-konjugerte antistoffer spesifikke for MHC-molekyler (HLA-ABC, HLA-DR), ko-stimulerende molekyler (CD80, CD86), modningsmarkører (CD83) og monocyttmarkører (CD14) blir blandet med 1x10<5 >DC’er pr. brønn i en 96-brønners plater (BD Biosciences) og inkubert ved 4°C i minimum 15 minutter. Isotype-matchede antistoffer ble anvendt som kontroller. Etter grundig vasking ble fluorescensanalyse utført med et FACScalibur strømningscytometer (BD Biosciences) ved anvendelse av CellQuest programvare (BD Biosciences).

Vaksineformulering

Metoder for formulering av dendrittiske celle-vaksiner er kjent for fagfolk på området. I en foretrukket utførelsesform blir de modne dendrittiske cellene vasket og resuspendert i varme-inaktivert plasma (fortrinnsvis autologt plasma) og 10% dekstrose i en konsentrasjon på 4 x 10<7 >celler/ml. Cellene kan deretter fortynnes 1:1 med en blanding av varme-inaktivert plasma og 20% DMSO, hvilket gir en endelig konsentrasjon på 5% dekstrose, 10% DMSO i varme-inaktivert plasma. Målet for endelig fylt formulering er 1,4 x 10<7 >celler/0,7 ml i en beholder egnet for cyropreservering. De dendrittiske cellene kan deretter administreres til en pasient eller fryses, fortrinnsvis ved -85<0>C og lagres i cryogen fryser (fortrinnsvis i en tørr flytende nitrogen fryser utformet for å forhindre kontaminering), fortrinnsvis ved en temperatur på ≤-150°C. Den frosne vaksinen kan deretter sendes til et klinisk åsted for pasientadministrering (fortrinnsvis ved intradermal injeksjon). Ved tining kan vaksinen administreres direkte til pasienten uten ytterligere prosessering.

Andre egnede formuleringer for administrering kan omfatte vandige isotoniske sterile injeksjonsløsninger, som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatiske midler og oppløsninger som gjør formuleringen isotonisk med blodet til den tilsiktede mottageren og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan omfatte suspenderingsmidler, solubiliseringsmidler, fortykningsmidler, stabiliseringsmidler, konserveringsmidler, immunstimulanter, cytokiner og adjuvanser.

I en foretrukket utførelsesform blir modne dendrittiske celler suspendert i varme-inaktivert autologt plasma og 10% dekstrose, i en endelig konsentrasjon på 4 x 10<7 >celler/ml. Disse cellene blir deretter fortynnet 1:1 med en blanding av varme-inaktivert autologt plasma og 20% DMSO, hvilket gir en endelig konsentrasjon på 2 x 10<7 >celler/ml i varme-inaktivert autologt plasma som inneholder 5% dekstrose og 10% DMSO. Den endelige fylte formuleringen er 1,4 x 10<7 >celler/0,7 ml i en beholder egnet for cyropreservering. Vaksinen blir deretter frosset og lagret ved ≤-150<0>C i en tørr flytende nitrogen fryser. Vaksinen er klar for administrering etter tining, uten behov for vasking og resuspendering.

Administreringsmetoder

Den dendrittiske celle-vaksinen kan administreres ved en rekke metoder, slik som, men ikke begrenset til, injeksjon (f.eks. subkutan, intradermal, intravenøs, intralymfatisk, intraartikulær, intramuskulær, intraperitoneal), ved kontinuerlig infusjon, forlenget frigjøring fra implantater, osv. DC-vaksiner har typisk blitt administrert ved to til fire ukers intervaller. Den dendrittiske cellevaksinen kan administreres med fysiologisk akseptable bærere, buffere, fortynningsmidler, adjuvantia, immunmodulatorer, osv. Fortrinnsvis er den dendrittiske celle-vaksinen autolog til pasienten den blir administrert til eller er HLA-matchet.

Dosen av celler (f.eks. aktiverte T-celler eller dendrittiske celler) administrert til et subjekt er i en effektiv mengde, effektiv for å oppnå den ønskede fordelaktige terapeutiske responsen i subjektet over tid eller for å hemme vekst av kreftceller eller for å hemme infeksjon. En foretrukket dose er omtrent 10<7 >celler. Biologisk respons modifikatorer blir eventuelt tilsatt for behandling ved DC’ene eller aktiverte T-celler ifølge oppfinnelsen. For eksempel blir cellene eventuelt administrert med en adjuvans eller cytokin slik som GM-CSF, IL-12 eller IL-2.

Fremgangsmåter for å bedømme immunogenisitet av antigen-lastede dendrittiske celler eller omprogrammerte (”educated”) T-celler

Immunogenisiteten av de antigen-lastede dendrittiske cellene eller omprogrammerte T-celler fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan bestemmes ved velkjente metoder omfattende, men ikke begrenset til de følgende:

<51>Cr-frigjøring lysis-analyse. Lysering av peptid-pulsede <51>Cr-merkede mål ved antigen-spesifikke T-celler kan sammenlignes. ”Mer aktive” blandinger vil vise større lysis av mål som en funksjon av tiden. Kinetikken for lysis så vel som total mål-lysis ved et fastsatt tidspunkt (f.eks.4 timer) kan anvendes for å bedømme ytelse. Ware, CF. et al. (1983) J. Immunol.131:1312.

Cytokin-frigjøringsanalyse. Analyse av typene og mengdene av cytokiner sekretert av T-celler ved kontakt med modifiserte APC’er kan være et mål for funksjonell aktivitet. Cytokiner kan måles ved ELISA eller ELISPOT-analyser for å bestemme hastigheten og total mengde av cytokinproduksjon. Fujihashi, K. et al. (1993) J. Immunol. Meth.160:181; Tanquay, S. og Killion, JJ. (1994) Lymphokine Cytokine Res.13:259.

In vitro T-celle omprogrammering (”education”). Blandingene ifølge oppfinnelsen kan undersøkes for evne til å fremkalle reaktive T-cellepopulasjoner fra normal donor eller pasient-avledet PBMC. I dette systemet kan fremkalte T-celler testes for lytisk aktivitet, cytokin-frigjøring, polyklonalitet og kryss-reaktivitet med den antigeniske epitopen. Parkhurst, M.R. et al. (1996) J. Immunol.

157:2539.

Proliferasjonsforsøk. T-celler vil proliferere som respons på reaktive blandinger. Proliferasjon kan overvåkes kvantitativt ved å måle, for eksempel 3H-tymidin-opptak. Caruso, A. et al. (1997) Cytometry 27:71.

Transgene dyremodeller. Immunogenisitet kan bedømmes in vivo ved vaksinering av HLA transgene mus med blandingene ifølge oppfinnelsen og bestemme karakteren og størrelsen av den induserte immunresponsen. Alternativt tillater hu-PBL-SCID mus-modellen rekonstituering av et humant immunsystem i en mus ved valgt overføring av human PBL. Disse dyrene kan vaksineres med blandingene og analyseres for immunrespons som tidligere nevnt i Shirai, M. et al. (1995) J. Immunol.154:2733; Mosier, D.E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2443.

Primat modeller. Et ikke-humant primat (sjimpanse) modellsystem kan anvendes for å overvåke in vivo immunogenisiteter av HLA-begrensede ligander. Det har blitt vist at sjimpanse har overlappende MHC-ligand-spesifisiteter med humane MHC-molekyler hvilket følgelig tillater en å teste HLA-begrensede ligander for relativ in vivo immunogenisitet. Bertoni, R. et al. (1998) J. Immunol. 161:4447.

Overvåkning av TCR signaltransduksjonshendelser. Mange intracellulære signaltransduksjonshendelser (f.eks. fosforylering) er forbundet med vellykket TCR engasjement ved MHC-ligand-komplekser. Den kvalitative og kvantitative analysen av disse hendelsene har blitt korrelert med de relative evnene av blandinger til å aktivere effektorceller gjennom TCR engasjement. Salazar, E. et al. (2000) Int. J. Cancer 85:829; Isakov, N. et al. (1995) J. Exp. Med.181:375).

Fremgangsmåter for isolering og karakterisering av immunceller

Celle-isolering eller immunanalyser for deteksjon av celler under cellerensing kan utføres i hvilken som helst av mange konfigurasjoner, f.eks. de gjenomgått i Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, FIa.; Tijan (1985) “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,” Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam; Harlow og Lane, supra; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FIa.; Price og Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; og Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY.

Celler kan isoleres og karakteriseres ved strømningscytometri-metoder slik som en FACS-analyse. En rekke strømningscytometrimetoder er kjent. For en generell oversikt over fluorescens-aktivert strømningscytometri se for eksempel Abbas et al. (1991) Cellular and Molecular immunology W.B. Saunders Company, spesielt kapittel 3 og Kuby (1992) Immunology W.H. Freeman og Company, spesielt kapittel 6. FACS maskiner er tilgjengelige, f.eks. fra Becton Dickinson.

Merkingsmidler som kan anvendes for å merke celle-antigen omfatter, men er ikke begrenset til monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, proteiner eller andre polymerer slik som affinitetsmatrikser, karbohydrater eller lipider. Deteksjon forløper ved hvilken som helst kjent metode, slik som immunoblotting, western blot analyse, tracking av radioaktive eller bioluminescente markører, kapillær elektroforese eller andre metoder som sporer et molekyl basert på størrelse, ladning eller affinitet.

De følgende eksemplene skal illustrere, heller enn å begrense oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Dendrittisk celle fremstilt fra daggammel leukaferese

Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) ble oppsamlet fra 4 humane donorer ved leukaferese og transportert ved levering over natten til et produksjonsanlegg for dendrittiske celler i temperatur-overvåkede forsendelseskasser holdt ved en temperatur på 8<0>C -26<0>C. På leveringsdagen gjennomgikk leukaferese-produktet Ficoll tetthetsgradient-sentrifugering i 50 ml koniske rør (800 x g) i 20 minutter ved romtemperatur (omtrent 19-22<0>C) for å separere og konsentrere den mononukleære cellefraksjonen som omfatter dendrittisk celle-forløpere (monocytter). Etter to vasketrinn med fosfatbufret saltoppløsning (PBS), ble cellekonsentrasjon og celleviabilitet bestemt. Etter det tredje sentrifugering/vasketrinn med PBS, ble mononukleære celler resuspendert i StemSpan™ H2000 medium (StemCell Technologies, Inc.) og sådd ut i T150 cm<2 >kolber ved 2,0 x 10<8 >celler pr. kolbe. Monocytter ble deretter selektert fra den mononukleære cellepopulasjonen ved adhesjon til den sterile vevskultur plastkolben i 1-2 timer ved 37<0>C, 5% CO2, ≥75% fuktighet. Ikke-adherente og semi-adherente celler (primære lymfocytter) ble kastet. De gjenværende adherente cellene, som var overveiende monocytter, ble dyrket i StemSpan™ H2000-medium inneholdende GM-CSF (800 U/ml) og IL-4 (500 U/ml). Disse cellene ble inkubert i 6 dager ved 37<0>C, 5% CO2, ≥75% fuktighet for å tillate differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler.

Populasjonen, som var rik på umodne dendrittiske celler, ble høstet ved forsiktig tapping av kolbene for å løsrive cellene. Celler i suspensjon ble overført til koniske rør. Ytterligere PBS ble tilsatt til kolbene for å fjerne de gjenværende flytende cellene og gjenværende medium og tilsatt til cellesuspensjonen i det koniske røret. Løsrivelse av de gjenværende adherente cellene ble fullført ved tilsetning av PBS og inkubering av kolbene ved 2-8<0>C i omtrent 10 minutter. Mens disse cellene ble inkubert, ble cellesuspensjonen i det koniske røret sentrifugert og cellepelleten ble resuspendert i PBS. Ved slutten av inkuberingsperioden, ble kolbene forsiktig tappet og innholdet tilsatt til cellesuspensjonen i det koniske røret. Den totale cellesuspensjon ble pelletert og resuspendert i PBS og en prøve ble fjernet for cellekonsentrasjon, celleviabilitet og immunfenotyping. De følgende fire settene av cellemarkører ble undersøkt ved strømningscytometri: monocytt linje markører (CD3, CD14, CD19 og CD56), indikasjon på tilstedeværelse av dendrittiske celler (CD11c), en antigenpresenterende cellemarkør (HLA-DR) og en moden dendrittisk celle-markør (CD83). Det umoden dendrittisk celle-anrikede preparatet uttrykte ubetydelige nivåer av linje-markører og CD83 og høye nivåer av CD11c og HLA-DR.

Umodne dendrittiske celler ble vasket én gang med OPTI-MEM® I redusert serum medium (GIBCO™) med HEPES-buffer, L-glutamin, uten fenolrød. De dendrittiske cellene ble deretter transfektert med amplifisert tumor-RNA ved elektroporering ved et forhold på omtrent 2 μg RNA pr.10<6 >dendrittiske celler. Elektroporering ble utført i 4 mm gap kuvetter inneholdende 600 μl av en cellesuspensjon inneholdende 5 x 10<7 >celler/ml, ved en puls på 500 V i 500 μs.

Etter elektroporering ble transfekterte celler overført til T150 kolber (én kuvette pr. kolbe) inneholdende StemSpan H2000™ medium (serumfritt dyrkningsmedium), supplert med IL-4 (500 U/ml) og GM-CSF (800 U/mI). Transfekterte celler ble inkubert i 2-3 timer ved 37<0>C, 5% CO2, ≥75% fuktighet for å tillate cellene å komme seg etter elektroporering.

De umodne elektroporerte dendrittiske cellene ble modnet i StemSpan H2000™ medium, supplert med IL-4 (500 U/ml) og GM-CSF (800 U/ml) og en modnings-cocktail (IL-1β ved 5ng/ml, IL-6 ved 150 ng/ml, TNF-α ved 5 ng/ml og PGE2 ved 1 μg/ml) ved 37<0>C, 5% CO2, ≥75% fuktighet i 20-24 timer. Alle cytokiner, så vel som PGE2, ble rekonstituert eller fortynnet (i tilfellet av PGE2) i PBS med 1% HSA. Før fortynningstrinnet ble PGE2 rekonstituert i etanol. Modne dendrittiske celler ble deretter skyllet med PBS før tilsetning av celledissosieringsbuffer (trypsin-fri) og deretter vasket tre ganger med PBS for å fjerne celle dissosieringsbufferen. Prøver ble oppsamlet for cellekonsentrasjon, levedyktighet og immunfenotyping. En sammenligning av immunfenotypingen av umodne og modne dendrittiske celler er vist i Tabell 1.

Tabell 1

Transfekterte modne dendrittiske celler ble suspendert i autologt plasma i en endelig konsentrasjon på 2 x 10<7 >celler/ml. Cellene ble deretter fortynnet 1:1 med en blanding av 80% plasma og 20% DMSO, hvilket gir en endelig konsentrasjon på 3 x 10<6 >eller 1 x 10<7 >celler/ml i 90% plasma med 10% DMSO, deretter frosset i cryo medisinglass ved anvendelse av frysing med kontrollert hastighet og lagret ved ≤-150<0>C.

Eksempel 2

Dendrittiske celle-vaksiner fremstilt fra daggammelt leukaferese-produkt forblir viable i minst 2 timer etter tining i 10% DMSO

En frosset dendrittisk celle-vaksine fremstilt som beskrevet i Eksempel 1 ble tint ved 37<0>C og holdt ved 20-25<0>C eller ved 2-8<0>C i 2 timer. Viabilitet ble bestemt umiddelbart etter tining og ved 30 minutters intervaller i opptil to timer. Viabilitet umiddelbart etter tining ved 37<0>C var 92%. Resultatene er vist i Tabell 2 og bekrefter at vaksinen kan tines og lagres i 10% DMSO i minst to timer.

Tabell 2

Eksempel 3

Isolering av mononukleære celler fra en pasient og differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler

Mononukleære celler fra perifert blod og plasma ble oppsamlet fra en pasient eller frivillig ved leukaferese ved romtemperatur ved et klinisk sete.

Leukaferese-produktet (PBMC’er) og serum ble sendt over natten i en temperaturkontrollert beholder holdt i et temperaturområde på 6-28<0>C. Dagen etter leukaferese, ble PBMC’ene renset ved Ficoll tetthetsgradient sentrifugering i 50 ml koniske rør ved romtemperatur for å separere og konsentrere den mononukleære celle-fraksjonen som omfatter monocytter (dendrittisk celle-forløpere) og leukocytter. De mononukleære cellene ble vasket mange ganger i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og cellekonsentrasjonen ble bestemt. Etter den endelige sentrifugeringen/vasketrinnet med PBS, ble mononukleære celler resuspendert i AIM-V-medium og sådd ut i T150 cm<2 >kolber ved 2,0 x 10<8 >celler pr. kolbe.

Monocytter ble deretter selektert fra den mononukleære cellepopulasjonen ved adhesjon til sterile vevskulturkolber i én til to timer ved 37<0>C, 5% CO2, ≥ 75% fuktighet. Ikke-adherente og semi-adherente celler ble fjernet ved forsiktig vasking med PBS. De gjenværende adherente cellene, som overveiende var monocytter, ble dyrket i X-VIVO 15-dyrkningsmedium inneholdende 1000 U/ml GM-CSF og 1000 U/ml IL-4. Cellene ble inkubert i 6 dager ved 37<0>C, 5% CO2, ≥ 75% fuktighet for å tillate differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler.

Etter in vitro-dyrking ble populasjonen som var rik på umodne dendrittiske celler høstet ved tapping av kolbene for å løsrive cellene. Celler i suspensjon ble overført til koniske rør. PBS ble tilsatt til kolbene for å fjerne de gjenværende flytende cellene og gjenværende medium og deretter tilsatt til cellesuspensjonen i samme koniske rør. Løsrivelse av gjenværende adherente umodne dendrittiske celler ble fremmet ved inkubering i PBS ved 2-8<0>C. Ved slutten av inkuberingsperioden ble kolbene tappet og innholdet tilsatt til cellesuspensjonen i samme koniske rør. Den totale cellesuspensjon ble deretter pelletert og resuspendert i PBS og en prøve ble fjernet for å bestemme cellekonsentrasjonen.

Umodne dendrittiske celler ble vasket og resuspendert i ViaSpan og transfektert med 2 μg antigen-kodende mRNA pr.10<6 >dendrittiske celler.

Elektroporering ble utført i 4 mm gap kuvetter inneholdende 0,4 ml av cellesuspensjonen (4 x 10<7 >celler/ml) ved en puls på 300V, 100Ω og 150 μF. Etter elektroporering, ble transfekterte celler fortynnet med X-VIVO 15-medium, sentrifugert og resuspendert i X-VIVO 15-medium (serumfritt) supplert med GM-CSF (800 U/ml), IL-4 (500 U/ml), IL-1β (10 ng/ml), IL-6 (150 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) og PGE2 (1 μg/ml). Cellene ble inkubert ved 37<0>C, 5% CO2, ≥ 75% fuktighet natten over for modning.

Transfekterte modne dendrittiske celler ble suspendert i varme-inaktivert autologt plasma og 10% dekstrose, i en endelig konsentrasjon på 4 x 10<7 >celler/ml. Cellene ble deretter fortynnet 1:1 med en blanding av 20% DMSO, hvilket gir en endelig konsentrasjon på 2 x 10<7 >celler/ml i varme-inaktivert autologt plasma som inneholder 10% DMSO og 5% dekstrose og deretter frosset i sterile cryo medisinglass ved ≤150<0>C.

Eksempel 4

Fysisk og funksjonell karakterisering av dendrittiske celler fremstilt fra monocytter inkubert over natten ved 6-28<0>C

Dataene i dette eksemplet underbygger funksjonaliteten og muligheten til å produsere RNA-transfekterte dendrittiske celler fra daggammelt afereseprodukt. Dendrittiske celler ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 3. Dataene nedenfor viser at dendrittiske celler kan bli reproduserbart fremstilt ved passende utbytte fra et enkelt daggammelt afereseprodukt og at de resulterende cellene (1) fremviser en klassisk moden fenotype, (2) kan bli effektivt transfektert med RNA og (3) kan bli cryopreservert med høy viabilitet etter tining.

Immunofenotype av DC’er. De modne DC’ene ble omfattende karakterisert ved FACS-merking for molekylære markører som skulle være til stede eller fraværende fra det endelige celle-preparatet. HLA-DR, CD83, CD86, CD80, CD1a og CD209 skulle fremvise høy ekspresjon og CD14, CD56, CD19 og CD3 skulle fremvise lav ekspresjon. Tabell 3 (nedenfor) viser resultatene (gjennomsnitt og standardavvik for prosent positive celler) satt sammen fra 11 påfølgende kjøringer for fremstilling av dendrittiske celle-vaksiner fra PBMC’ER oppnådd fra ulike friske donorer.

Tabell 3

Ekspresjon av celleoverflate-markører i DC’er produsert fra daggamle monocytter

Disse data, sammen med fotomikrografier (ikke vist) demonstrerer at DC’ene fremstilt ved betingelsen ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelse fremviser klassisk DC-fenotype og morfologi. Videre er det relativt lave standardavviket indikativt for reproduserbarheten av fremgangsmåten.

Utbytte, fenotype og viabilitet. Dendrittisk celle-metodene er grundig testet og vist å reproduserbart fremstille høykvalitets RNA-transfekterte modne dendrittiske celler. Tabell 4 viser resultatet av 11 vaksine kjøringer som anvender totalt amplifisert tumorcellelinje RNA som antigen nyttelast og normale donor dendrittiske celler som konstituenten.

Tabell 4

Oppsummering av frigjøringstest-resultater for DC vaksineprodukt fremstilt i 11 konsistens kjøringer

Modnede RNA-transfekterte DC’er uttrykker CCR7 og er vandrende. I tillegg til de modne DC-markørene beskrevet ovenfor, ble CCR7-ekspresjon, som er kritisk for lymfeknute migrering av DC’ene in vivo, evaluert. I dette studiet ble FACS-analyse med et CCR7-spesifikt antistoff anvendt for å undersøke tinte RNAtransfekterte DC’er fremstilt ved anvendelse av full-skala GMP prosessen (konsistens kjøringene 3, 4, 6, 7, 8 og 10). Resultatene er vist i Tabell 5 nedenfor:

Tabell 5

Prosentandel av CCR7<+ >dendrittiske celler

*% positive celler

I tillegg til å demonstrere den fysiske tilstedeværelsen av CCR7 i DC’ene etter modning, ble det vist at DC’er også har vandrende kapasitet ved anvendelse av kollagen gel matriks spontan migrerings-analyse, som indikerer at det uttrykte CCR7 er også funksjonelt (data ikke vist).

RNA-transfekterte DC’er gir funksjonell kostimulatorisk støtte. Forsøkene beskrevet ovenfor viser at de fremstilt DC’ene uttrykker alle de kritiske kostimulatoriske markørene, mens forsøkene nedenfor viser at disse molekylene er funksjonelle. For dette formål ble evnen av DC’ene til å stimulere interferon gamma (IFN-γ)-produksjon fra PBMC’er i en allo blandet lymfocytt (MLR)-analyse bestemt ved anvendelse av tinte DC’er fremstilt fra 3 forskjellige donorer sammen med tidligere frossede PBMC’er fra hver donor. Forventningen var at DC’er ikke ville stimulere INF-γ-produksjon fra deres HLA-matchede autologe PBMC’er men ville gjøre det når blandet med ikke-autologe PBMC’er. Alle parvise kombinasjoner ble testet ved anvendelse av ELISPOT (INF-γ) som avlesningen. Dataene er presentert i Figur 2. Resultatet av dette forsøket viser, som forventet, at kun mismatchede DC/PBMC-kombinasjoner fremkaller INF-γ-produksjon, en egenskap som krever ekspresjon av funksjonell MHC og kostimulatoriske molekyler.

Modnede DC’er har ytterligere funksjonalitet. I dette forsøket inneholder cytokin-cocktailen anvendt for å modne DC’ene etter transfeksjon og før frysing TNF-α, IL-1β, IL-6 og PGE2. For å vise at modnede DC’er er bedre enn de umodne DC’ene, ble evnen av disse to populasjonene (fra samme donor) til å stimulere TH1 cytokinproduksjon fra autologe T-celler. Begge populasjonene av DC’er ble transfektert med RNA som koder for Flu matriksprotein og anvendt for å stimulere Flu-spesifikke hukommelses CTL fra autologe PBMC’er. Figur 3 nedenfor viser resultatene av ELISPOT analysene (# spots/brønn som en funksjon av tilført PBMC). Ingen statistisk forskjell mellom umodne og modne DC’er til å fremkalle INF-γ produksjon fra Flu-spesifikke hukommelses T-celler ble observert. Imidlertid kunne bare de modne DC’ene også fremkalle IL-2-produksjon fra disse cellene. IL-2-induksjon er ansett å være viktig fordi (1) indusert IL-2-sekresjon opprettholder autokrin antigen-spesifikk CTL proliferasjon og (2) lav produksjon av INF-γ og IL-2 er nylig vist å korrelere med økt dødelighetsrisiko for HIV-pasienter og i et nyere studie, har mangel på sekresjon av INF-γ eller IL-2 resultert i svekket T-celle-funksjon og en manglende evne til å opprettholde sentrale hukommelsesresponser. For enkelhet ble de negative kontrollene ikke fremstilt grafisk. Det gjennomsnittlige antall spots observert fra PBMC alene (dvs. ingen DC’er) var 9,7 (INF-γ) og 1,3 (IL-2). Dette forsøket ble gjentatt med vaksiner fremstilt fra PBMC’ene fra 3 uavhengige donorer og resultatene var kvalitativt identiske.

Følgelig har de modne DC’ene ytterligere og bedre funksjonalitet sammenlignet med de umodne DC’ene.

RNA-transfekterte DC’er er, etter tining, stabile. Selv om kliniske protokoller kan fastsette umiddelbar injeksjon av den dendrittiske celle-vaksinen ved tining, kunne det oppstå uforutsette omstendigheter som kunne forsinke administrering. For å demonstrere at DC’ene ville forbli viable og funksjonelle dersom tint men ikke umiddelbart injisert, ble følgende forsøk utført. To medisinglass hver av 2 dendrittiske celle-preparater svarende til 2 forskjellige friske donorer ble tint. Ett medisinglass fra hver donor ble umiddelbart testet i en allo MLR analyse mens det andre medisinglasset fra hvert preparat ble tillat å forbli ved romtemperatur i 40 minutter før det ble analysert ved samme metode. PBMC’ene anvendt i dette forsøket omfattet autologe celler fra hver donor så vel som en tredje prøve av PBMC’er fra en donor ubeslektet med begge. Avlesningen for dette forsøket var ELISPOT (INF-γ). Resultatet av dette forsøket er vist i Figur 4 og indikerer at det ikke er noen merkbar forskjell i funksjon mellom DC’ene analysert umiddelbart ved tining og de som forble ved romtemperatur i 40 minutter. I tillegg til dette funksjonelle forsøket, ble celleviabilitet etter tining og 40 minutter etter tining ved trypan farge eksklusjon bestemt og identiske resultater ble oppnådd (data ikke vist).

Frysing-tining påvirker ikke DC-funksjon. For å bedømme hvorvidt DC-funksjon blir negativt påvirket av fryse-tine-prosessen, ble funksjonaliteten av DC’er før frysing og etter tining sammenlignet. Funksjonalitet ble bedømt ved evnen av DC’ene til å stimulere en hukommelse Flu-spesifikk respons fra autolog PBMC som en funksjon av avtagende Flu mRNA-konsentrasjon anvendt for transfeksjon.

Forsøkets avlesning var ELISPOT (INF-γ). Resultater er vist i Figur 5 nedenfor og indikerer at fryse-tine-prosessen ikke har noen effekt på funksjonaliteten av DC’ene i dette forsøket. En konstant mengde av GFP mRNA (0,5 μg) ble blandet inn for å overvåke transfeksjons-effektiviteter. ”Etter tining”-prøver ble tint etter å ha vært frosset i 24 timer.

Proteinekspresjon etter elektroporering av DC’er med mRNA. Som et første trinn vurderte vi hvorvidt transfeksjon av DC’er med mRNA fører til riktig ekspresjon av det mRNA-kodete proteinet. For fremstilling av DC’er, ble PBMC’er (enten ferske eller frosne) oppnådd ved leukaferese fra friske frivillige anriket for monocytter ved adherens til plastkolbe etter en 2 timers inkubering in vitro. Etter vasking ble adherente celler dyrket i seks dager i X-VIVO 15-medium supplert med rekombinant granulocytt/makrofag-kolonistimulerende faktor (rGM-CSF) og interleukin-4 (rIL-4) for å danne umodne DC’er (iDC’er). iDC’er ble deretter elektroporert (300V, 150μF, 100Ω) med RNA som koder for virale eller kontrollproteiner og induset til modne i 24 timer i X-VIVO 15-medium supplert med IL-1β, IL-4, IL-6, GM-CSF, TNF-α og prostaglandin E2 (PGE2). For å teste ekspresjonen av protein etter transfeksjon, ble DC’er elektroporert med RNA som koder for Grønt Fluorescerende Protein (GFP) og ekspresjon ble målt ved strømningscytometri. Som vist i Figur 6 uttrykker en stor fraksjon av modne DC’er produsert fra daggamle monocytter høye nivåer av GFP opptil fire dager etter transfeksjon, hvilket bekrefter at denne fremgangsmåten er effektiv med hensyn til å fremme langvarig proteinekspresjon i DC’er.

Deretter ble evnen av autologe DC’er transfektert ved elektroporering med mRNA som koder for CMV pp65-protein til å indusere CD4 og CD8 T-celleresponser i PBMC’er fra CMV-infiserte individer bestemt. CMV-infiserte subjekter ble identifisert ved å stimulere PBMC’er fra mange bloddonorer med veldefinerte immundominante peptider avledet fra pp65-proteinet og måling av IL-2/IFN-γsekresjon så vel som celleproliferasjon i både CD4 og CD8 T-celler. Individer for hvilke positive CMV-spesifikke T-celle-responser ble detektert og som gikk med på å gjennomgå leukaferese ble etter informert samtykke valgt for ytterligere studier.

DC’er fra disse individene ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Modne DC’er transfektert med RNA som koder for CMV pp65-proteinet ble deretter inkubert i 16 timer (ICS) eller 6 dager (proliferasjon) med autologe PBMC’er ved et 1/40-forhold. Etter stimulering ble IL-2 og IFN-γ-sekresjon (Figur 7) og proliferasjon (Figur 8) av CMV-spesifikke CD4 og CD8 T-celler fastsatt ved strømningscytometri. DC’er elektroporert med CMV pp65-RNA induserte selektivt høy IFN-γ og IL-2-ekspresjon så vel som proliferasjon av CD8 T-celler fra CMV-infiserte subjekter. Imidlertid induserer denne protokollen minimal CD4 T-celleaktivering, som vist ved det lave nivået av cytokinsekresjon og proliferasjon detektert i CD4 T-celler (Figurene 7 og 8, nederste paneler).

Eksempel 5

Sammenligning av differensiering av monocytter til dendrittiske celler ved anvendelse av 500 U/ml eller 1000 U/ml IL-4

PBMC’er fra daggamle leukafereser holdt ved en temperatur på 6-28<0>C ble vasket og sådd ut ved ~2x10<8>/ kolbe i AIM-V-media i et 2 timers adherens-trinn. Etter 2 timer ble ikke-adherente celler fjernet og adherente celler ble vasket og resusupendert i X-VIVO 15 supplert med 1000 U/ml GM-CSF og enten 500 U/ml eller 1000 U/ml IL-4; inkubert ved 37<0>C i 6 dager. I tillegg ble, for dyrking i X-VIVO 15 supplert med 1000 U/ml GM-CSF og 500 U/ml IL-4, effekten av å skifte mediet ved dag 3 sammenlignet med dyrking i 6 dager uten å skifte medium. Spesifikt ble, ved dag 3, medium fjernet sammen med celler i suspensjon; kolben ble forsiktig vasket med X-VIVO-medium for å høste løst adherente celler; og mediet og vask ble sentrifugert ved1300 rpm i 8 minutter for å pellettere celler. Cellene ble resuspendert i friskt X-VIVO 15-medium supplert med 1000 U/ml GM-CSF og 500 U/ml IL-4; mediet og cellene tilsatt tilbake til kolber fortsatt inneholdende de adherente cellene; og kolbene ble inkubert ved 37<0>C i ytterligere tre dager.

Alle kolbene ble høstet individuelt for elektroporering. Dag 6 DC’er ble transfektert med 2 μg GFP mRNA pr.10<6 >celler (20 μg GFP mRNA pr.5x10<6 >celler), resuspendert i X-VIVO 15 og sådd ut ved 1x10<6>/ml; supplert med 800 U/ml GM-CSF og 500 U/ml IL-4 og modnet med cytokin-cocktail (TNFα – 10ng/ml; IL-1β - 10ng/ml; IL-6 - 100 ng/ml; PGE2 - 1μg/ml). DC’ene ble inkubert natten over ved 37<0>C; 5% CO2. Fenotyping ble foretatt for umodne DC’er ved dag 6 (umoden DC;

Figur 9) og 24 timer etter transfeksjon (moden DC; Figur 10). Utbyttet (% Rec) og viabilitet (% V) for hver dyrkingsbetingelse umiddelbart etter transfeksjon og ved 24 timer etter transfeksjon er vist i Tabellene 6A-C.

Tabell 6A

1000 U/ml IL-4

Tabell 6B

500 U/ml IL-4

Tabell SC

500 U/ml IL-4, skifte medium ved dag 3

Eksempel 6

Anrikning av monocytter ved elutriering og differensiering til umodne og modne DC’er

Elutriering også kjent som motstrøm sentrifugering, ble utført i Elutra™ Celle Separeringsystemet (Gambro BCT, Lakewood, CO) som en automatisert metode for å isolere monocytter fra en daggammel leukaferese, hvilken hadde blitt sendt til produksjonsanlegget fra et oppsamlingssted ved over natten-levering i en temperaturkontrollert (6-28<0>C) beholder. Elutrieringsbuffer ble fremstilt ved tilsetning av 1000ml 5% Humant Albumin Serum (HSA, Baxter Healthcare, Westlake, CA) til en 4 l pose av Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS, Cambrex Bio Science, Walkersville, MD). Denne elutrieringsbufferen ble tilsatt til de daggamle fereseproduktene i et volum likt det for feresen. Elutra™ Celle Separeringsystemet (Gambro BCT, Lakewood, CO) ble primet med elutrieringsbuffer og ferese-produktet ble lastet. Etter at elutrierings-prosedyren var utført, ble monocytter oppsamlet fra rotor off-fraksjonen. Monocyttene ble lagret frosne.

Frosne elutrierte monocytter ble tint og deretter differensiert ved 1 millioner celler/ml i X-VIVO 15 (Cambrex Bioscience, Walkersville, MD) med 800 U/ml GM-CSF (Berlex Laboratories, Richmond, CA) og 500 U/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) i kolber i 5 dager for å fremstille umodne dendrittiske celler (iDC). iDC’en ble høstet og antigen-lastet med amplifisert RCC tumor-RNA ved anvendelse av elektroporering. Celler ble dyrket med 800 U/ml GM-CSF, 500 U/ml IL-4 og modnings cytokiner (TNF-α, IL-1β, IL-6 og PGE2) og høstet etter 24 timers dyrking. Celletelling og levedyktighet for de modne dendrittiske cellene (mDC) ble bestemt ved anvendelse av Trypan blå eksklusjon ved ViCeIl (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). Den resulterende mDC ble fenotype bestemt. Cellene dyrket i kolber var 99% CD83+ og 0,2% CD14+. Utbyttet av mDC var 34% av CD14+ cellene dyrket i kolber.

Eksempel 7

Sammenligning av ekspresjon av ko-stimulerende molekyler i DC fremstilt fra fersk versus daggammel leukaferese

Perifert blod ble oppsamlet fra 3 friske humane donorer på tre separate dager ved leukaferese og transportert til University of Montreal innen 30 minutter etter oppsamling. Tjue ml av leukaferesen ble fjernet og autologt plasma ble fremstilt ved sentrifugering. Leukaferese-volumet ble delt i to like deler. En del ble prosessert umiddelbart for å danne ”ferske” monocytter mens den andre delen ble lagret som 20 ml alikvoter i fem 50 ml koniske rør for å danne celler fra en ”daggammel ferese”. Rørene ble plassert i en plastbeholder innenfor en boks som ble lagret skråstilt på en vuggende plattform mellom 16-20<0>C i 24 timer. Etter inkuberingsperioden, ble PBMC’ene separert ved anvendelse av Ficoll tetthetsgradient.

En mononukleær cellefraksjon som omfatter de dendrittiske celle-forløperne (monocytter) ble separert fra både fersk og daggammel ferese ved anvendelse av en Ficoll tetthetsgradient. Leukaferesen ble lagt på Ficoll i 50 ml koniske rør og rør ble sentrifugert (800Xg) i 20 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket fire ganger med fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og tellet for å bestemme cellekonsentrasjon og celleviabilitet. For å oppnå en høyt renset monocyttpopulasjon ble den mononukleære fraksjonen ytterligere renset ved anvendelse av CD14 mikrokuler (Miltenyi).1x10<9 >celler ble resuspendert i 8 ml buffer inneholdende PBS, 0,5% BSA og 2 mM EDTA (Miltenyi buffer).2 ml CD14 mikrokuler ble tilsatt til hvert 50 ml rør inneholdende de 1x10<9 >cellene og inkubert ved 4<0>C i 15 minutter. Cellene ble vasket i 100 ml av den samme bufferen, sentrifugert ved 300Xg og resuspendert i 20 ml Miltenyi buffer. Cellesuspensjonen ble applisert på fire LS-kolonner plassert under magnetisk felt (Miltenyi Quadromax™). Etter application av cellene ved anvendelse av strømning ved naturlig fall, ble kolonnene vasket tre ganger med 3 ml Miltenyi buffer.

Monocyttene ble eluert to ganger i fravær av et magnetisk felt med 5 ml Miltenyi buffer og sentrifugert ved 300Xg i 10 minutter. Renhet av både eluatet og gjennomstrømningsfraksjonene ble bestemt med strømningscytometri ved anvendelse av antistoffer spesifikke for CD3, CD19, CD16, CD56, CD14 og CD209. Eluatfraksjonen inneholdt 88-98% monocytter og mindre enn 2% små celler. De ikke-adherente fraksjonene inneholdt kun en liten prosentandel (2 %) av monocytter. Totalt RNA ble ekstrahert fra en andel av de rensede monocyttene (50 millioner) ved dette tidspunktet.

For å fremstille modne differensierte DC’er, ble 50 millioner monocytter sådd ut i T150cm<2 >kolber i X-VIVO-medium inneholdende IL-4 og GM-CSF ved 37°C i fem dager. En cytokin-cocktail (TIP) inneholdende tumornekrosefaktor, interferon gamma og prostaglandin E2 ble tilsatt til cellene ved dag fem. Celler ble høstet ved dag seks av dyrkingen og ble ved dette tidspunktet betegnet ”TIP-DC’er”. Populasjonen, som er rik på dendrittiske celler, ble høstet ved forsiktig tapping av kolbene for å løsrive cellene, ytterligere fosfatbufret saltoppløsning (PBS)-vaskinger og løsrivelse av de gjenværende adherente cellene ved inkubering i PBS og ved 2-8<0>C i omtrent 10 minutter. Den totale cellesuspensjonen ble pelletert og resuspendert i PBS og analysert for cellekonsentrasjon, celleviabilitet og immunfenotyping. De følgende settene av cellemarkører ble undersøkt ved strømningscytometri: monocytt linje markører (CD3, CD14, CD19, CD16 og CD56), indikasjon på tilstedeværelse av dendrittiske celler (CD11c, CD1a og CD209), en antigenpresenterende celle-markør (HLA-II), markører for migrering (CD38 og CCR7) og markører for modne dendrittiske celler (CD83 og CD86).

20 millioner TIP-DC’er ble resuspendert i 600 μl ViaSpan™ og elektroporert med CD40L RNA ved et forhold på 4 μg av RNA pr. én million dendrittiske celler. Elektroporering ble utført i 4 mm gap kuvetter, ved en puls på 300V i 300 μs. Etter elektroporering ble celler overført til T75 kolber (én kuvette pr. kolbe) inneholdende X-VIVO-medium (serumfritt dyrkningsmedium), supplert med IL-4 og GM-CSF. Transfekterte celler ble inkubert i 4 timer ved 37<0>C, 5% CO2, ≥ 75% fuktighet for å tillate cellene å komme seg etter elektroporering. Etter dette ble celler ytterligere modnet og betegnet ”PME-CD40L DC’er”. RNA ble isolert fra en andel av PME-CD40L DC’ene dannet.

PME-CD40L DC’er ble frosset i 90% autologt plasma med 10% DMSO, i kryo ampuller ved anvendelse av frysing ved kontrollert hastighet og lagret ved ≤ -85°C. En frosset dendrittisk celle-vaksine fremstilt som beskrevet ovenfor ble tint ved 37<0>C og holdt ved 20-25<0>C i 30 minutter. Viabilitet ble bestemt umiddelbart etter tining og ved 10 minutters intervaller opptil 30 minutter. PME-CD40L DC’er etter tining ble analysert ved strømningscytometri ved anvendelse av antistoffer spesifikke for monocyttlinje markører (CD14), dendrittisk celle-markører (CD11c, CD1a og CD209), en antigenpresenterende celle-markør (HLA-II), markører for migrering (CD38 og CCR7) og markører for modne dendrittiske celler (CD80, CD83 og CD86).

Resultater

Fremstilling av monocytter

Dataene fra de tre donorene viser at positiv seleksjon ved anvendelse av CD14 kule resulterer i 88-98% ren populasjon av monocytter (Tabell 7). Maksimal mengde av små celle kontaminering er 2% (Tabell 7). Den ikke-adherente (gjennomstrømning) fraksjonen inneholdt opptil 2% monocytter (store celler) i alle tre donorene (data ikke vist). Det er derfor ikke noe signifikant tap av monocytter i den ikke-adherente fraksjonen. Små cellepopulasjon kontamineringen til stede i eluatet er sammensatt primært av T-celler som åpenbart fra høy CD3-ekspresjon og lavere CD19, 16 eller 56 markør-ekspresjon (data ikke vist). Det var ingen synlige forskjeller i ekspresjon av CD83, CD86, CD11C, HLA-I eller HLA-II-markører i eluatfraksjonen mellom fersk og daggammel leukaferese.

TIP-DC’er

Monocytter var svært rene initielt (90%) og renheten ble ytterligere forbedret under differensieringsprosessen ettersom prosentandelen av store celler i TIP-DC’ene fra alle tre donorene var 98-99% og, følgelig, var prosentdelen av små celler mindre enn 2% (data ikke vist). Analyse av fenotypen av TIP-DC’er med strømningscytometri avslørte at det var en forskjell i ekspresjon av CD83 mellom TIP-DC’er dannet fra fersk og daggammel leukaferese. Prosentandelen av positive celler angir antall celler positive for en markør under undersøkelse.

Prosentandelen av DC’er som uttrykker overflate modnings markøren CD83 var lavere i TIP-DC’er’ fra alle 3 donorene fremstilt fra fersk leukaferese enn de fremstilt fra daggammel leukaferese (Tabell 8). Det var ingen andre forskjeller i noen som helst andre markører fra TIP-DC’ene dannet fra fersk og daggammel leukaferese.

PME-CD40L DC’er

4 timer etter transfeksjon

DC’ene etter transfeksjon (PME-CD40L DC’er) ble analysert for ekspresjon av CD154 (CD40L) fire timer etter transfeksjon. PME-CD40L DC’er fra daggammel leukaferese uttrykte mere CD40L i donorene 1 og 2 fire timer etter transfeksjon enn PME-CD40L DC’er dannet fra frisk leukaferese (Tabell 9). Det var også en forskjell i gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) for CD40L mellom PME-CD40L DC’ene dannet fra fersk og daggammel ferese i donorene én og to (Tabell 9).

PME-CD40L DC’er etter tining

PME-CD40L DC’er ble analysert for ekspresjon av en rekke DC-markører etter tining. Det var forskjeller i fenotypen av ”etter tining”-PME-CD40L DC’er dannet fra fersk versus daggammel leukaferese. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet av CD40L-ekspresjon i PME-CD40L DC’er fremstilt fra frisk leukaferese var lavere enn DC’er fremstilt fra daggammel Leukaferese (Tabell 9).

Det var også en tendens som indikerer at, i to donorer er transfeksjonseffektiviteten (av prosent positive av CD40L-ekspresjon) lavere i DC’er dannet fra fersk leukaferese (Tabell 9).

Prosent positive celler målt ved strømningscytometri viste at, i to av tre tilfeller blir flere celler merket positive med CD83-antistoffer i dendrittiske celler fremstilt fra den daggamle andelen av leukaferesen (Tabell 10).

Selv om forskjellen i prosent positive celler for CD80, CD83 og CD86 ikke alltid er høyere i DC’en dannet fra daggammel leukaferese (Donor 3, Tabell 10), er gjennomsnittlig fluorescerende intensitet av celler dannet fra daggammel leukaferese merket med spesifikke antistoffer høyere i alle donorene (Tabell 11). I tillegg til CD80, CD86 og CD83, viste HLA-I og HLA-II samme resultat (Tabell 11). Det gjennomsnittlige fluorescerende intensitet-signalet korrelerer med en høyere protein nivå ekspresjon pr. celle og ekspresjon av CD80, CD83, CD86, HLA-I og HLA-II-molekyler er oppregulert i en moden DC. Derfor reflekterer fenotypen av disse cellene en mer moden status for dendrittiske celler oppnådd fra daggammel andel i alle tre donorer. Disse endringene avspeiler modningsstatus for DC. Tatt under ett tillater data oppnådd med måling av prosent positive celler så vel som gjennomsnittlig fluorescerende intensitet oss å konkludere med at celler dannet fra daggammel andel av en leukaferese fremviser en mer moden fenotype.

Eksempel 8

Mikromatrise-analyse av genekspresjon i ferske versus daggamle monocytter og dendrittiske celler fremstilt derav

RNA-prøvene fra ferske monocytter og daggamle monocytter (monocytter som hadde vært inkubert ved 16-20<0>C i 24 timer etter leukaferese) og RNA fra DC’er fremstilt fra ferske og daggamle monocytter, som beskrevet i Eksempel 8, ble påført på Human Genome U133 Pluss 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) i henhold til fabrikantens instruksjon (Genechip<® >Expression Analysis Technical Manual, 2004). I korthet ble tre mikrogram av totalt RNA spiked med Genechip<® >PoIy-A RNA Control Kit (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) omdannet til første tråd-cDNA ved anvendelse av Superscript™ II revers transkriptase. Andretråd cDNA-syntese ble fulgt av in vitro transkripsjon for lineær amplifisering av hvert transkript og inkorporering av biotinylert CTP og UTP. cRNA-produktene ble fragmentert til omtrent 100 nukleotider og hybridisert i 16 timer til mikromatrisene. Mikromatrisene ble deretter vasket ved lav (6XSSPE) og høy (100mM MES, 0,1M NaCl) stringens og merket med streptavidin-fykoerytrin.

Fluorescens ble amplifisert ved tilsetning av biotinylert anti-streptavidin og en ytterligere alikvot av streptavidin-fykoerytrin merking. GeneChip<® >Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) ble anvendt for å oppsamle fluorescenssignal ved 3 um oppløsning etter eksitasjon ved 570 nm. Gjennomsnittlig signal fra to sekvensielle scanninger ble beregnet for hvert mikromatrise trekk. Scannede bilder ble analysert med Genechip<® >Operating Software v1.1 (Affymetrix, Santa Clara, Calif). Høy lineær korrelasjon (R<2>>0,95) for 4 kontroll-RNA’er inkludert i PoIy-A RNA Control Kit (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) ble bekreftet å garantere for suksessen av merkingsprosessen.

Alle profil-data ble innført i dataprogrammet Genespring og ble normalisert i henhold til prøvetype (dvs monocyttprøver til monocytt og dendrittiske prøver til dendrittisk). Tre trinn ble utført i normaliseringstrinnet og ble i henhold til standardmetoden foreslått av Genespring for Affymetrix matriser.

4) datatransformasjon (alle verdier mindre enn 0,01 ble satt til 0,01)

5) Normalisering til den 50. percentil.

6) Normalisering til medianen.

Dataene ble først filtrert for flag med manglede spots. Dataene ble deretter analysert med en énveis anova uten tilfeldig predikering modeller med et konfidensnivå i området fra p,05 eller p,1. Listen over filtrerte gener fremstilt ble deretter analysert for enten ganger endringer, ekspresjonsnivå eller konfidens. Dette ble utført ved anvendelse av prøvene som gjennomsnitt eller som individuelle prøver. Ekspresjonsnivå mellom ferske og dag monocytter eller dendrittiske celler ble sammenlignet før eller etter en anova. Listene over gener ble sammenlignet med hverandre og de som overlapper i mange lister ble valgt for deres pålitelighet. Gener med endret steady state RNA-nivåer i dendrittiske celler fremstilt fra daggamle monocytter versus dendrittisk celle fremstilt fra ferske monocytter er listet opp i Tabell 12A. Beskrivelser av disse genene er listet opp i Tabell 12B. Gener med endret steady state RNA-nivåer i daggamle monocytter versus ferske monocytter er listet opp i Tabell 13A. Beskrivelser av disse genene er listet opp i Tabell 13B. Disse resultatene viser at ferske monocytter er fenotypisk forskjellige fra daggamle monocytter og at dendrittiske celler fremstilt fra ferske monocytter er fenotypisk forskjellig fra dendrittiske celler fremstilt fra daggamle monocytter.

Tabell 12A

Gener med endrede steady state-RNA-nivåer i dendrittiske celler fremstilt fra daggamle monocytter sammenlignet med dendrittiske celler fremstilt fra ferske monocytter

Tabell 12B Beskrivelse av gener listet opp i Tabell 12A

Tabell 13A

Gener med endret ”steady state” RNA-nivåer i daggamle monocytter sammenlignet med ferske monocytter

Tabell 13B Beskrivelse av gener listet opp i Tabell 13A

De dendrittisk celle-genene ble ytterligere normalisert for ekspresjon av to husholdningsgener vist å forbli konstante mellom DC er produsert fra ferske og daggamle monocytter. Den gjennomsnittlige ekspresjonen av hvert gen (normalisert) ble dividert med den gjennomsnittlige ekspresjonen (normalisert) av GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase) eller β-aktin for å tilvirke et forhold av ekspresjon i forhold til husholdningsgenet. Resultatene for seks gener er vist i Tabell 14. ”DCdo” angir DC’er fremstilt fra daggarnie monocytter. ”DCf” angir DC’er fremstilt fra friske monocytter.

Tabell 14

Steady state RNA-ekspresjons-ratio for visse RNA’er til GAPDH eller β-Aktin i DC<:>er fremstilt fra daggamle eller ferske monocytter

Ytterligere verifisering, hittil av differensiell ekspresjon i monocytter av to av kandidat-genene ble utført ved Kvantitativ Sanntid PCR (QPCR) ved anvendelse av primerene vist i Tabell 15. Første tråd cDNA ble dannet fra hver total RNA (identisk med den anvendt i GeneChip analysen) ved anvendelse av oligo(dT) primere og Superscript™ III Første tråd Syntese System for RT-PCR i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). QPCR ble utført ved anvendelse av et ABI Prism<® >7900HT Sekvens Deteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) i henhold til produsentens instruksjon (ABI Prism<® >7900HT Sekvens Deteksjonssystem brukerveiledning). TaqMan<® >Genekspresjon Assays eller Custom TaqMan<® >Genekspresjon Assays (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) ble anvendt som TaqMan<® >prober. PCR-reaksjoner ble utført in triplo ved anvendelse av ABsolute™ QPCR ROX Mix (ABgene, Surrey, UK).

Kvantifisering av relative cDNA-konsentrasjoner ble utført ved anvendelse av relativ standardkurve-metoden som beskrevet i ABI Prism<® >7700 Sekvens Deteksjonssystem bruker bulletin nr.2 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Ett cDNA med mest ekspresjon av hvert gen i GeneChip-analysen ble anvendt for generering av den relative standardkurven. Alle data er vist som ekspresjon relativt til intern GAPDH-ekspresjon. APAF-1 og CDCA2 effektorprotein 2 ble vist å redusere, realtivt til GAPDH, minst 2,5 ganger og 3 ganger, henholdsvis mellom ferske og daggamle monocytter.

Tabell 15

Primere

Eksempel 10

Sammenligning av dendrittiske celler fremstilt fra PBMC’er inkubert ved romtemperatur i 23, 48 eller 71 timer fra tidspunktet for isolering fra en donor Metoder:

”Frisk donor” leukaferese-produkter fra to donorer ble mottatt etter sending over natten. Omtrent én tredjedel av hvert produkt ble prosessert for DC dannelse ved det angitte tidspunktet etter aferese-oppsamling som følger. Leukafereseproduktet (dvs. PBMC’er) ble inkubert ved romtemperatur i 23, 48 eller 71 timer før ficoll-histopaque tetthetsgradient sentrifugering og adherens-trinnet beskrevet nedenfor. Etter inkuberingsperioden ved romtemperatur, ble viabiliteten av PBMC’ene og prosentdelene av B-celler, T-celler, monocytter og NK-celler bestemt. Resultatene er vist i Tabell 16.

Tabell 16

Karakterisering av cellulært produkt ved dag 0 av dyrking

Fremstilling av DC-produkter

PBMC’er ble fremstilt ved ficoll-histopaque tetthetssentrifugering og vasket fire ganger i PBS ved romtemperatur.2x 10<8 >PBMC’er ble resuspendert i 30 ml AIM-V-medium (Invitrogen) og tillat å adhere til 150 cm<3 >plastkolber i 2 timer ved 37<0>C. Ikke-adherente celler ble fjernet og gjenværende celler dyrket i X-VIVO 15-medium, supplert med 1000 U/ml GM-CSF (Leukin) og 1000 U/ml IL-4 (R&D systems), i 5 dager ved 37<0>C, 5% CO2. Umodne DC’er ble initielt modnet ved tilsetning av TNF-α (10 ng/ml), IFN-γ (1000 U/ml) og PGE2 (1μg/ml). Etter dyrking over natten, ble TIP-DC intermediat-produktene høstet ved fjerning av media og en kald PBS vasking. TIP-DC ble fenotype bestemt for å bekrefte fremstilling av en moden populasjon av celler. For å fremstille antigen-lastet, fullstendig moden DC, ble TIP-DC elektroporert: Celler ble resuspendert i avkjølt Viaspan ved 4x10<7>/ml i 0,5 ml og plassert på is. DC’er ble blandet med amplifisert totalt tumor nyrecelle karsinom-mRNA ved 1 μg/10<6 >celler, som en modell for antigen-kodende nyttelast, pluss 4 μg/10<6 >CD40L mRNA og plassert i en 4 mm gap elektroporerings-kuvette, fulgt av elektroporering ved anvendelse av et Biorad GenePulsar Xcell system. Umiddelbart etter elektroporering, ble DC’er vasket i X-VIVO 15-medium og til slutt resuspendert i 20 ml X-VIVO 15 supplert med GM-CSF (800 U/ml) og IL-4 (500 U/ml) ved 1x10<6>/ml og dyrket i 4 timer ved 37<0>C i lav adherens T75-kolber.

Celletellinger og bestemmelser av viabilitet ble utført ved anvendelse av propidiumjodid og CalTag telling kuler som beskrevet av produsenten. Post-ficoll PBMC-prøver, dag 6 TIP-DC, DC’er utvunnet 4 timer etter elektroporering og dyrking (PME-CD40L DC) og etter tining av sluttproduktet, ble alle underlagt celletelling og viabilitet-analyse. Resultatene er vist i Tabell 17.

Tabell 17

Gjenvinning og utbytte av DC under fremstilling av PME-CD40L DC

Fenotyping av PBMC og DC-produkter

Alle antistoffer ble hentet fra BD Biosciences og anvendt ved fortynninger anbefalt av produsenten. PBMC’er: 3x10<5 >celler ble hver merket med CD19-PE, CD14-PE og CD3-PE eller matchede isotype-konjugerte kontroller ved inkubering i antistoff i 30 minutter ved 4C. Etter inkubering ble de merkede cellene vasket 3 ganger i kald 1% FBS/PBS og resuspendert i PBS for fluorescensanalyse ved anvendelse av et FACScalibur strømningscytometer (BD Biosciences) ved anvendelse av CellQuest programvare (BD Biosciences).3 minutter før akkvisisjon, ble propidiumjodid (1ug/ml) tilsatt til hver prøve som et viabilitets fargestoff for gating formål. DC’er: 1x10<6 >celler (TIP-DC og PME-CD40L DC) ble resuspendert i avkjølt PBS/1% FBS. PE eller FITC-konjugerte antistoffer spesifikke for MHC-molekyler (HLA-ABC, HLA-DR) eller ko-stimulerende molekyler (CD80, CD86) eller modningsmarkører (CD83) eller monocytt/DC linje-markører (CD14, CD209) ble blandet med 1x10<5 >DC’er pr. og inkubert ved 4°C i 30 minutter. Isotype-matchede antistoffer ble anvendt som kontroller. Etter grundig vasking ble celler underlagt strømningscytometri som beskrevet ovenfor. Intracellulær CD40L ble bestemt som følger: 2 x 10<5 >PME-CD40L DC’er resuspendert i 250μl av Cytofix/Cytopermløsning (BD Biosciences) i minimum 10 minutter opptil 2 timer ved 4<0>C. Celler ble vasket to ganger med 2 ml merkingsbuffer (PBS, BSA, NaN3 og EDTA), resuspendert i 0,5 ml merkingsbuffer og lagret natten over ved 4°C. Celler ble resuspendert i 2,0 ml Perm/Vaskeløsning (BD Biosciences) i 15 minutter, sentrifugert og resuspendert i 100μl Perm/Vaskeløsning.20μl mus anti-human CD40L APC eller mus IgGl APC ble tilsatt til hvert DC-preparat og inkubert ved 4°C i 30 minutter i mørke. Celler ble vasket to ganger med 1mI Perm/Vaskeløsning og resuspendert i merkingsbuffer før strømningscytometrianalyse. Resultatene er vist i Tabell 18.

Tabell 18

Fenotype av intermediat TIP-DC og endelig PME-CD40L DC-produkt

Det vil forstås at spesielle utførelsesformer beskrevet her er vist for illustrasjon og ikke som begrensninger av oppfinnelsen. De viktigste trekkene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i forskjellige utførelsesformer uten å avvike fra omfanget av oppfinnelsen. Fagfolk på området vil forstå eller være i stand til å bestemme ved anvendelse av ikke mer enn rutinemessig eksperimentering, en rekke ekvivalenter til de spesifikke fremgangsmåtene beskrevet her. Slike ekvivalenter anses å være innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse og er omfattet av kravene.

Alle publikasjoner og patentsøknader nevnt i beskrivelsen er indikativ for kunnskapsnivået for fagfolk på området til hvilket foreliggende oppfinnelse tilhører.

Alle blandingene og/eller fremgangsmåtene beskrevet og påberopt her kan fremstilles og utføres uten unødvendig eksperimentering i lys av foreliggende beskrivelse. Selv om blandingene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i form av foretrukne utførelsesformer, vil det være klart for fagfolk på området at variasjoner kan anvendes for blandingene og/eller fremgangsmåtene og i trinnene eller i rekkefølgen av trinn i fremgangsmåten beskrevet her uten å avvike fra konseptet, idéen og omfanget av oppfinnelsen. Nærmere bestemt vil det være klart at visse midler som er både kjemisk og fysiologisk relaterte kan settes i stedet for midlene beskrevet her mens samme eller lignende resultater ville oppnås. Alle slike lignende erstatninger og modifikasjoner tydelige for fagfolk på området er ansett å være innenfor idéen, omfanget og konseptet ifølge oppfinnelsen som definert ved de tilhørende kravene.

Data i Tabell 16, fra to uavhengige forsøk, viser at aferese-produkter som blir opprettholdt i opptil 72 timer etter oppsamling fra pasienten kan gi høyst viable PBMC-populasjoner, uten signifikant bias i de gjenvunnede leukocytt undergruppene. Utsåing i kolber av PBMC’er fra hvert tidspunkt og dyrking for fremstilling av modne DC’er (TIP-DC’er) resulterer i en høy frekvens av viable celler, selv om den totale gjenvinningen av DC’er ved anvendelse av afereseprodukter opprettholdt i lengre tidsperioder viser nedgang (Tabell 17). Allikevel kan tilstrekkelig DC’er dannes for videre prosessering ved elektroporering med totalt amplifisert tumor-RNA og CD40L-RNA. Viktigst viser Tabellene 17 og 18 at TIP-DC’er dannet fra de forskjellige utgangsmaterialene er like mottagelige for elektroporering og gjenvinning, med fullstendig modning til sluttproduktet, PME-CD40L DC. PME-CD40L DC fremstilt fra dette studiet kan bli formulert som ”vaksine” og frosset og tint uten noen forringelse av DC-preparatene. Til slutt er aferese-produkter opprettholdt i opptil 72 timer etter oppsamling et viabelt råmateriale for sentralisert fremstilling av DC-vaksiner for klinisk anvendelse.

Claims

PATENTKRAV

1. Fremgangsmåte for fremstilling av dendrittiske celler fra monocytter, omfattende:

Anrikning av monocytter fra et leukafereseprodukt ved elutriering, idet før elutrieringen er monocyttene blitt inkubert uten dyrking ved en temperatur opprettholdt ved 1 ̊C - 14 ̊C i en periode på omtrent 6 til 96 timer etter tidspunktet for oppsamling av leukafereseproduktet fra et individ; og

Indusering av differensieringen av nevnte monocytter til dendrittiske celler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor monocyttene er humane monocytter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor inkubasjonstemperaturen blir opprettholdt ved 1 ̊C - 8 ̊C.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, hvor perioden for inkubering er 8 til 48 timer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor perioden for inkubering er 10 til 30 timer.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor perioden for inkubering er 26 til 72 timer.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor perioden for inkubering er 48 til 80 timer.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor differensieringen blir indusert ved å bringe monocyttene i kontakt med et dyrkningsmedium omfattende en effektiv mengde av en blanding som induserer differensiering av monocytter til umodne dendrittiske celler, idet blandingen er GM-CSF og IL-4; GM-CSF og IL-13; GM-CSF og IL-15; eller IFNα.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor de anrikede monocyttene blir frosset og tint før dyrkingen.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, videre omfattende et trinn for modning av de umodne dendrittiske cellene til modne dendrittiske celler.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, videre omfattende å laste ett eller flere antigen inn i nevnte modne dendrittiske celler.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller krav 11, hvor trinnet omfatter (a) å bringe de umodne dendrittiske cellene i kontakt med PGE2, TNFα, IL-6 og IL-1β eller (b)

signalering av nevnte umodne dendrittiske celler med IFN-γ, fulgt av signalering av de dendrittiske cellene med CD40L.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor nevnte signalering med CD40L blir utført ved translasjon av et rekombinant CD40L-mRNA inne i de dendrittiske cellene.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor trinnet omfatter å bringe de umodne dendrittiske cellene i kontakt med PGE2, TNFα og IFNγ for å fremstille modne dendrittiske celler.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, videre omfattende å transfektere nevnte modne dendrittiske celler med et RNA som koder for CD40L og/eller RNA som koder for ett eller flere antigener eller epitoper av interesse.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, hvor RNA-et koder for ett eller flere kreftcelleantigener og/eller ett eller flere patogene antigener.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, videre omfattende å laste de dendrittiske cellene med ett eller flere antigener for å fremstille en antigenlastet dendrittisk celle.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, hvor antigenet er autologt til individet.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 17 eller 18, hvor nevnte antigen blir lastet ved å transfektere nevnte dendrittiske celler med ett eller flere RNA-er som koder for nevnte antigen(er).

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, hvor de dendrittiske cellene blir transfektert med RNA-et ved elektroporering.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 20, hvor nevnte celler blir transfektert med omtrent 1-4 μg RNA pr.10<6 >dendrittiske celler.

22. Ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 21, hvor nevnte dendrittiske celler er umodne på tidspunktet for antigenlasting.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, videre omfattende å modne de nevnte antigenlastede umodne dendrittiske cellene til antigenlastede modne dendrittiske celler.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 17 til 23, hvor antigenet er fra eller avledet fra én eller flere kreftceller eller patogener.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, hvor kreften er valgt fra gruppen bestående av nyrecellekreft, kronisk lymfocyttisk leukemi, multippelt myelom, melanom, prostatakreft, brystkreft, lungekreft, kolonkreft, magekreft og pankreaskreft.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 24, hvor nevnte patogen er HIV eller HCV.

27. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, hvor nevnte monocytter blir utsatt for sporadisk eller kontinuerlig bevegelse i løpet av inkubasjonsperioden.

28. Fremgangsmåte ifølge er hvilket som helst foregående krav, hvor nevnte monocytter blir utsatt sporadisk eller kontinuerlig bevegelse assosiert med varefrakt i løpet av inkubasjonsperioden.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 27, nevnte bevegelse er assosiert med varefrakt.

30. Antigenlastet dendrittisk celle tilveiebringbar ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29 for anvendelse som et farmasøytikum, for eksempel som en vaksine, hvor nevnte celler har et stabilt tilstandsforhold mellom ALOX15 RNA, TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA og/eller CD69 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH RNA på mindre enn 1,0 og/eller et stabilt tilstandsforhold mellom CD52 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH på høyere enn 1,0.

31. Antigenlastet dendrittisk celle tilveiebringbar ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29 for anvendelse i behandling eller forebygging av kreft eller en sykdom forårsaket av et patogen, hvor nevnte celler har et stabilt tilstandsforhold mellom ALOX15 RNA, TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA og/eller CD69 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH RNA på mindre enn 1,0 og/eller et stabilt tilstandsforhold mellom CD52 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH på høyere enn 1,0.

32. Blanding omfattende dendrittisk celle tilveiebringbar ved fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29, hvor nevnte celler har et stabilt tilstandsforhold mellom ALOX15 RNA, TLR1 RNA, TLR2 RNA, IL-1β RNA og/eller CD69 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH RNA på mindre enn 1,0 og/eller et stabilt tilstandsforhold mellom CD52 RNA og β-aktin RNA eller GAPDH på høyere enn 1,0.

33. Blanding ifølge krav 32, hvor de dendrittiske cellene er antigenlastet.

34. Blanding ifølge krav 32 eller 33, hvor de dendrittiske cellene er transfektert med mRNA som koder for CD40L.

35. Blanding ifølge et hvilket som helst av kravene 32 til 34, hvor de modne dendrittiske cellene har økte nivåer av én eller flere av CD80, CD83, CD86, MHC klasse I-molekyler, eller MHC klasse II-molekyler sammenlignet med modne dendrittiske celler fremstilt fra ferske monocytter.

36. Vaksine omfattende blandingen ifølge hvilke som helst av kravene 32-35.