JPS5878599A - リストセチンコフアクタ−測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウィルブランド因子またはＩＦＶＩＲ：ＲＣＦ
とも称されるリストセチンコファクター（補助因子）を
測定するための試薬に関する。これはなめし剤（ｔａｎ
ｎｉｎｇ　ａｇ＠ｎｔ）およびプロテアーゼ阻害剤で、
そして場合によシ染料で処理された血小板およびリスト
セチンＡを含有する。

リストセチンコファクター（Ｆ　ＶＩ　Ｒ：ＲＣＦ）活
性の測定はウィルブランド症候群（ＷＳ）の診断に適し
ている。既知の方法は抗生物質であるリスト七チンムが
人の血小板に富む血漿中で血小板の凝集を引き起こすが
、ウィルブランド症候群の患者からの血小板に富む血漿
中ではその凝集を引き起とさないという事実に基づくも
６である。

現在のところ、リストセチンコファクターはつぎのよう
にして測定することができる。

クエン酸添加の人血漿を洗浄された人血小板の懸濁物に
加える。リストセチンの添加により血小板の凝集が引き
起こされ、そして凝集を測定するための装置を有する光
度計（凝集検出針）における透過の変化を使用してその
凝集を測定する。透過は血小板の凝集により増加する。

対照曲線を得るためにプールした人血漿の段階希釈液が
使用される。凝集は単位時間内の透過の増大として測定
し、そして血漿希釈液に対してプロットすることができ
る。患者の血漿中のリストセチンコファクターの含量を
対照曲線から読み取ることができる。□ この種の方法の′欠点はそれが経験を積んだ技術者、正
確な操作および凝集による透過の変化を正確に再現する
記録計を必要とすることである。なぜならば傾斜を測定
する場合に１＠の誤差はリストセチンコファクター濃度
の１０１の誤差に相当するからである。

さらにその方法に必要な一定数の血小板を有する新鮮な
血小板懸濁物を製造、す・るのに極めて時間がかかる。

これらの懸濁物は限られた期間だけ保存することができ
る。

上記の方法のもう一つの欠点は試験容量が大きいことで
あり、そのために高価なりストセチンを大量に必要とす
る。リストセチンの濃度は狭い範囲内でのみ変えること
ができるので、試験容量を減らすことによってのみ節約
が可能である。ラテックス試験の方法で試験皿上で行わ
れる凝集試験は、試験６感度に影響を及ぼすことなく試
験容量を１０分の１まで減少させる。

血小板の新鮮な懸濁物はこの目的に対しては適当ではな
い。なぜならばそれらはすでに零点チェックにおいて凝
集反応を引き起こすＬうな血小板の凝集物を含有してい
るからである。

リストセチンコファクターの測定はすでになめし剤で処
理された血小板を使用することによりさらに簡単にされ
ている。グルタルアルデヒド（ドイツ特許出願公開公報
第２，５４６，１６６号）か、またはホルマリンで［ｒ
Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ１１ｎ、Ｍｅｄ、Ｊ第８５巻第３１８頁
（１９７５年）〕固定することにより、特に凍結乾燥し
た場合には貯蔵後でさえも活性であるような血小板の懸
濁物が得られる。

しかしながらこの方法で凍結乾燥した血小板を再度懸濁
した場合には、血小板凝集物が増加することが見い出さ
れた。そのことは零点チェックが今度も自然の凝集を示
すので凝集反応試験においてそれらを使用する際に不利
な作用を示す、血小板をリストセチンとともに凍結乾燥
した場合でさえも再度懸濁すると自然の凝集物を形成し
、そのために凝集反応試験においてそれらを使用するこ
とが不可能になる。

今や、ブロテ、アーゼ阻害剤および蛋白質を固定するた
めに知られているなめし剤で処理された血小板はりスト
セチンおよび補助剤とともに凍結乾燥することができ、
そしてリストセチンコファクターを測定するためのそれ
らの有用性を喪失することなく、比較的長期間室温でか
ま１−ｊ３７℃でさえも保存することができるという驚
くべき発見に基づい次試薬を使用することにより、既知
の方法が有する上記の欠点が回避されることが見い出さ
れ友。

本発明はリストセチンコファクター（ウィルブランド因
子、１’　ＮＩ　Ｒ：ＲＣ１’　）を測定するための試
薬に関するものであり、それはプロテアーゼ阻害剤およ
び蛋白質を固定するために知られているなめし剤で、そ
して場合により蛋白質を染色するために知られている染
料で処理され友血小板およびリストセチンＡを含有する
。

本発明による試薬はピペットを使用する２つの段階（試
薬および試料）を有し、そしてごく少量のりストセチン
を使用する凝集反応方法によるリストセチンコファクタ
ーの半定量的な測定を可能にする。

最小濃度α２ｑｂ（ｗ：ｖ）のｃ’１〜ｃ４−アルカン
アルデヒド好ましくはホルムアルデヒドか、またＦｉｃ
２〜Ｃ６のジアルデヒド好ましくはグルタルアルデヒド
の溶液を用いて４℃〜５７℃で少なくとも２時間血小板
を固定し、さらに最小濃ｆ１０−６Ｍのプロテアーゼ阻
害剤好ましくはジイソプロピルフルオロホス７エートで
それらを処理するノ のが好ましいことが見い出された。血小板は場合により
蛋白質を染色するために知られている染料特にゲル電気
泳動で使用される染料の１種） たとえばクマシーブルーでか、または反応性の染料次と
えばレマゾール（Ｒｅｍａｚｏ１■）ターコイスプルー
ＩＡＤ　５０５で染色される。この几めの染料の濃度は
少なくともＱ、０５ｓｆ／−であり、染色時間は最高２
４時間である６　１−あたり１０７〜１０１１個の血小
板を含有する懸濁物に充分量のりストセチンＡを加えて
、それが１−あ九りＱ、２〜１０ｑ好ましくは２．５ｑ
を含有するようにする。

凍結乾燥用補助剤と一緒にその懸濁物を乾燥する。補助
剤として懸濁物１ｄあたり１橿′１次は数種のアミノ酸
好ましくはグリシンおよびグルタミン酸ナトリウム１〜
１００ｗＩ％糖好ましくは蔗糖２〜３０ｑおよび保護コ
ロイド好ましくは人アルブミン（Ｌ５〜１０ｍ＋９を加
える。

本発明をさらによく理解せしめるために以下下に実施例
をあげて説明する。

血小板濃縮物１．３ｔｔ−（Ｌ１５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ
７、２）　４　ｔに懸濁し、そして遠心分離により赤血
球を除去す、る。洗浄および遠心分離を２回くり返し、
そしてつぎに上澄み液を調節して１−あたり３Ｘ１０９
個の血小板を含むようにする。

安全の九めの厳密な予防借地（フード、手袋）を施こし
、ジイソプロピルフルオロホスフェートを加えて最終濃
度１０−５Ｍとなし、そしてその混合物を室温で１時間
攪拌する。遠心分離したのち上澄み液を廃棄し、そして
沈殿を燐酸緩衝液で２回洗浄する。３５１ホルムアルデ
ヒド溶液を用いてその血小板の懸濁物をホルムアルデヒ
ド濃度が４ｇＧになるように調節し、そして４℃で４４
時間穏和に攪拌する。つぎにその懸濁物を燐酸緩衝液に
対して充分に透析する。血小板の濃度を３Ｘ１０９／ｓ
ｇに調節し、リストモチイム２．５ｒ、蔗糖１０ｔ１グ
リシｙ１０ｒ、　　グＡ／タミ、ン酸ナトリウム１＆７
ｆおよび人アルブミン２ｔを含む懸濁物１ｔに加える。

凍結したのちその混合物を凍結乾燥する。血小板の数は
凍結乾燥の前および後で一定である。

ま九固定し次のちに血小板をたとえばレマゾールブルー
（Ｒｅｍａｚｏｌ■ｂｌｕｅ）　ヘキスト社製ＦＪＡＤ
５０５）で染色することもでき、それは血小板を濃青色
に染め、試験の感度を増大する。

血小板は固定し且つ透析し九血小板の懸濁物にレマゾー
ルブルー０．２５１１Ｐ／−を加え、そして３０分間攪
拌することにより染色することができる。つぎにその混
合物を遠心分離し、そして沈殿を洗浄する。遠心分離し
次のち血小板をさらに染色されていない血小板と同様に
処理する。

この試薬の場合には水で再調整し九のちも凝集物は認め
られない。

リストセチンコファクターの測定はつぎのようにして行
われる。このためには凍結乾燥した物質を水１−で再調
整して初期懸濁物１−を得、プールした人血漿の幾何学
的系列希釈液に加え、そして凝集を評価する。

検定はつぎのようにして行われる。血漿希釈液５０μｔ
および試薬５０μｔをガラス皿上で充分に混合し、１分
間振盪し、１分間放置し、そしてつぎにタイターを読み
とる。

貯蔵安定性試験は３７℃で４週間保存したのちに同様に
してタイターを調べることにより行われる。

ゲゼルシャフト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）セリンプロテイオーゼ阻害剤および蛋白質を固定す
   るために知られているなめし剤で、そして場合により蛋
   白質を染色する次めに知られている染料で処理された血
   小板およびリストセチンＡを含有する、リストセチンコ
   ファクターを測定するための試薬。 ２ルプロテイナーゼ阻害剤がジイソプロピルフルオロホ
   ス７エートである、特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ３）凍結乾燥され几特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ４）血小板に対する染料がレマゾール（Ｒｅｍａｇｏｌ
   ■）ターコイスプルーＩＣＩＡＤ　５０５である、特許
   請求の範囲第１項記載の試薬。 ５）約３Ｘ１０９個の血小板に対してアミノ酸１〜１０
   ０１Ｉｖ１糖２〜３０ｍ１Ｐおよび保１１コｏイド０．
   ５〜１０１１１Ｆを特徴する特許請求の範囲第３項記載
   の試薬。