DK155766B - Reagens til bestemmelse af ristocetin-cofaktor (v. willebrand-faktor) - Google Patents

Description

DK 155766B

o

Opfindelsen angår et middel til bestemmelse af ristocetin-cofaktoren, der også betegnes v. Willeb'rand--faktoren eller F VIII R:RCF. Dette indeholder garvede thrombocyter, der er behandlet med en protease-inhibitor 5 og eventuelt et farvestof, og ristocetin A.

Til diagnose af v. Willebrand-syndromet (WS) er bestemmelsen af ristocetin-cofaktor(F VIII R:RCF)-aktiviteten egnet. Kendte fremgangsmåder beror på, at antibio-tiket ristocetin A i humant blodpladerigt plasma inducerer 10 aggregation af blodplader, men ikke i plasma fra mennesker med v. Willebrand-syndromet.

Ristocetin-cofaktoren kan ifølge kendte teknik bestemmes på følgende måde:

Til humant citratplasma sættes en suspension af 15 vaskede humane blodplader, og aggregationen af blodpladerne udløses ved tilsætning af ristocetin og måles ved hjælp af transmissionsændringen i et fotometer med en anordning til måling af aggregationer (aggregometer). Transmissionen vokser på grund af aggregationen af blodplader. For at få 20 en referencekurve anvendes aftrappede poolede human-plas-mafortyndinger. Aggregationen kan måles som en stigning af transmissionen pr. tidsenhed og optegnes mod plasmafortyndingen. Ud fra referencekurven kan indholdet af ristocetin--cofaktor i et patientplasma aflæses.

25 Ulemper ved sådanne fremgangsmåder er, at de kræver erfarent teknisk personale, eksakt arbejde og en skriver, der nøje gengiver transmissionsændringen ved aggregationen, da en fejl i stigningsmålingen på 1 grad kan svare til en fejl på 10% i ristocetin-cofaktor-koncentrationen.

30 Det er desuden meget kostbart at tilvejebringe de til fremgangsmåden nødvendige friske blodpladesuspensioner med konstant blodpladeantal. Disse suspensioner er kun begrænset lagerstabile.

En yderligere ulempe ved den nævnte fremgangsmåde 35 er det store prøvevolumen, der kræver store mængder af det dyre ristocetin. Da ristocetirikoncentrationen kun kan

O

DK 155766B

2 varieres inden for et snævert område, er en besparelse kun mulig ved en nedsættelse af prøvevolumenet. Ved en agglu-tinationstest på testplader, ligesom en latex-test, reduceres prøvevolumenet til en tiendedel uden at påvirke prø-5 vens følsomhed. Friske blodpladesuspensioner er ikke egnet hertil, da de allerede indeholder blodpladeaggregater, der fremkalder en agglutination af nul-kontrollen.

Bestemmelsen af ristocetin-cofaktoren er allerede blevet forenklet yderligere ved anvendelse af garvede blod-10 plader. Ved fiksering med glutardialdehyd (DE offentliggørelsesskrift nr. 2.546.166) eller formaldehyd (Allain et al., J. Lab. Clin. Med. (1975), 85_, 318) fås blodpladesuspensioner, der også er aktive efter oplagring, især når de frysetørres. Når man resuspenderer sådanne frysetør-15 rede blodplader, finder man ganske vist også en forøget mængde blodpladeaggregater, der begrænser anvendelsen ved en agglutinationstest, da nul-kontrollen også her udviser spontane agglutinationer. Også når blodplader frysetørres sammen med ristocetin dannes der spontant aggregater 20 ved resuspenderingen, som gør deres anvendelse ved en ag-. . glutinationstest umulig.

Det har nu vist sig, at de beskrevne ulemper ved de kendte fremgangsmåder kan undgås ved anvendelse af et reagens, der beror på, at det overraskende har vist sig, • ·25· ... at thrombocyter, der er behandlet med en proteaseinhibi-tor og et til fiksering af proteiner kendt garvestof, kan frysetørres sammen med ristocetin og hjælpemidler og oplagres længere tid ved stuetemperatur eller endog ved 37°C uden nedsættelse af deres anvendelighed til bestemmelse 30 af ristocetin-cofaktoren.

Opfindelsen angår et middel til bestemmelse af ristocetin-cofaktoren (v. Willebrand-faktoren, F VIII R:RCF), hvilket middel er ejendommeligt ved, at det indeholder thrombocyter, der er behandlet med en proteasein-35 hibitor, et til fiksering af proteiner kendt garvestof og eventuelt et til farvning af proteiner kendt farvestof, og ristocetin A.

O

DK 155766B

3

Det her omhandlede reagens muliggør en semikvantita-tiv bestemmelse af ristocetin-cofaktoren ifølge agglutina-tionsmetoden og med kun to pipetteringstrin (reagens og prøve) og under anvendelse af en kun ringe mængde ristoce-5 tin.

Det har vist sig at være gunstigt at fiksere blodpladerne med en opløsning af et C^_^-alkanaldehyd, fortrinsvis formaldehyd, eller et C2_g-dialdehyd, fortrinsvis glutardialdehyd, i en mindstekoncentration på 0,2% 10 (w:v) i mindst 2 timer ved mellem 4 og 37°C og desuden behandle dem med en proteaseinhibitor, fortrinsvis diiso- _6 propylfluorphosphat, i en mindstekoncentration på 10 M. Thrombocyterne farves eventuelt med et til farvning af proteiner kendt farvestof, især med et ved gelelektroforese 15 anvendt farvestof, såsom Coomassie-blåt eller et reaktionsfarvestof, såsom Remazol®-turkisblåt EEAD 505. Derved er koncentrationen af farvestof mindst 0,05 mg/ml, og farve-tiden er højst 24 timer.

7 11

Til suspensionen, der indeholder 10 til 10 throm-20 bocyter/ml, sættes så meget ristocetin A, at den indeholder 0,2-10 mg/ml, fortrinsvis 2,5 mg/ml. Suspensionen tørres sammen med frysetørringshjælpemidler. Som hjælpemidler anvendes der pr. ml suspension 1-100 mg af en eller flere aminosyrer, fortrinsvis glycin og natriumglutaminat, 25 2-30 mg af en sukkerart, fortrinsvis saccharose, og 0,5- -10 mg af et beskyttelseskolloid, fortrinsvis humanalbumin.

Opfindelsen forklares nærmere ved det følgende eksempel .

30

Eksempel 1,3 Liter thrombocytkoncentrat suspenderes i 4 liter phosphatpuffer, 0,15M, pH-værdi 7,2, og erythrocyterne fracentrifugeres. Vaskningen og centrifugeringen gentages 35 to gange, og den ovenstående væske indstilles derefter

Q

på 3 x 10 blodplader/ml. Under strenge forsigtighedsfor-

O

4

DK 155766B

anstaltninger (aftræk, handsker) tilsættes der diisopropyl- _3 fluorphosphat til en slutkoncentration på 10 M og omrøres 1 time ved stuetemperatur. Efter centrifugering bortkastes den ovenstående væske, og bundfaldet vaskes to gan-5 ge med phosphatpuffer. Blodpladesuspensionen indstilles med en 35%'s formaldehydopløsning til en koncentration på 4% formaldehyd og omrøres let ved 4°C i 44 timer. Derefter dialyseres der grundigt mod phosphatpuffer. Blodpladekon- q centrationen indstilles på 3 x 10 /ml, og til 1 liter sus-10 pension sættes 2,5 g ristocetin A, 10 g saccharose, 10 g glycin, 16,7 g N-glutaminat og 2 g humanalbumin. Efter frysning frysetørres der. Blodpladeantallet er konstant før og efter frysetørringen.

Blodpladerne kan også farves efter fiksering, f.eks.

15 med Remazol-blåt (Hoechst EE AD 505), der farver blodpladerne intensivt blå og forøger prøvens følsomhed.

Blodpladerne kan farves ved tilsætning af 0,25 mg/-ml remazolblåt til den fikserede og dialyserede blodplade-suspension og 30 minutters omrøring. Derefter centrifugeres 20 der, og bundfaldet vaskes. Efter centrifugering viderebe-handles blodpladerne ligesom de ufarvede blodplader.

Også ved dette reagens kan der efter rekonstituering i vand ikke iagttages aggregater.

25

Bestemmelse af ristocetin-cofaktoren.

Lyofilisatet rekonstitueres med 1 ml vand til 1 ml udgangssuspension, der tilsættes en geometrisk fortyndingsrække af poolet humanplasma, og agglutinationen bedømmes.

Prøveblanding: 50 filter plasmafortynding og 50 ^μΐΐ-30 ter reagens blandes godt på en glasplade, der omrystes i 1 minut, og efter 1 minuts hvile aflæses titertrinnet.

Stabilitet efter belastningsforsøg: Efter 4 ugers oplagring ved 37°C findes de samme titertrin.

35

Claims (5)

1. Middel til bestemmelse af ristocetin-cofaktor, kendetegnet ved, at det indeholder thrombocyter, der er behandlet med en serin-proteinase-inhibitor og et til 5 fiksering af proteiner kendt garvestof og eventuelt et til farvning af proteiner kendt farvestof, og ristocetin A.

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteinase-inhibitoren er diisopropylfluorphosphat.

3. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at det er frysetørret.

4. Middel ifølge krav 1, k e n d e t eg net ved, at farvestoffet for thrombocyterne er Remazol^-turkisblåt EEAD 505.

5. Middel ifølge krav 3, kendetegnet ved, 15 at det indeholder 1-100 mg aminosyrer, 2-30 mg af en sukker- 9 art og 0,5-10 mg af et beskyttelseskolloid til ca. 3 x 10 thrombocyter. 20 25 30 35