JP5391071B2

JP5391071B2 - ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体及びその使用

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Publication number: JP5391071B2
Application number: JP2009537894A
Authority: JP
Inventors: 克己青柳; 雪路井澤
Original assignee: Advanced Life Science Institute Inc
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Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2014-01-15
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Description

本発明は、ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体及びその使用に関するものであり、肺小細胞がんを含む各疾病の早期発見や治療のモニタリング、再発のモニタリング等に広く利用されるものである。

わが国における死因の第１位は悪性新生物であり、その中でも肺癌の死亡率は、男性では胃癌を抜いて第１位、女性でも第３位となっており、年々上昇する傾向にある。肺癌は病理組織学的に以下の主に４つの組織型に分類されている。すなわち、肺門部に発生する肺扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）と肺小細胞癌（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＬＣ）、肺野部に発生する肺腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）と肺大細胞癌（Ｌａｒｇｅ−ｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。

特に肺小細胞癌は、増殖が速く早期に遠隔転移を起こすため、初診時ではすでに全身性に転移した進行癌で発見されることが多い。この型の癌の治癒率については、病変が一側の肺野に限局している肺小細胞癌の限局型（Ｌｉｍｉｔｅｄｄｉｓｅａｓｅ：ＬＤ）患者の治癒率は約２０％であるが、両肺や他の臓器に転移した進展型（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ：ＥＤ）の患者では、事実上治癒は難しいと言われている。

また、肺小細胞癌は抗癌剤に感受性が高いため、化学療法が治療法の第一選択とされるのに対して、非肺小細胞癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｎｏｎ−ＳＣＬＣ）は、化学療法の奏功率が低いために外科療法が治療法の第一選択とされている。

そのため、肺小細胞癌は肺癌の中でも特に早期発見・治療が必要な癌であり、そのためにも肺小細胞癌と非肺小細胞癌を鑑別診断することは、治療方針を決定する上で極めて重要である。

肺癌を発見する方法のひとつに喀痰検査がある。しかし、喀痰検査は主に肺扁平上皮癌の検査には好適であるが、肺小細胞癌に対する陽性率は低いという問題がある。また、Ｘ線撮影法も肺癌の発見に広く用いられている方法であるが、肺門部に生じる肺扁平上皮癌や肺小細胞癌に対しては、肺門部が心臓の影となるので癌組織の陰影が非常に撮影され難いという問題がある。また、肺小細胞癌については、肺野の異常陰影を呈する患者に対して喀痰細胞診、胸部Ｘ線単純撮影、ＣＴスキャン、気管支内視鏡等を用いても、この型の肺癌の早期発見は容易ではないとされている。

また、癌を診断するための検査方法の幾つか、例えば放射線照射やバイオプシー、気管支内視鏡などは、患者に対して苦痛を与え、また高価な機器や熟練した技術などを必要とする。

そのため、より簡便な血液検査によって治癒可能な時期に癌を高率に診断することを可能とする、腫瘍マーカーの研究が行われている。今日では、癌疾患の発見、診断、病状経過のモニタリングの指標、再発診断等に３０以上の腫瘍マーカーが利用されている。

肺癌は組織型が多彩であるため、全ての型の肺癌の発見あるいは診断に有効な腫瘍マーカーはいまだ報告されていない。そのため今日では、肺癌の組織型ごとに有効なマーカーが選択され、使用されている。

例えば、肺腺癌に対しては癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）やシアリルＬｅｘ−ｉ抗原が、肺扁平上皮癌に対しては扁平上皮癌関連抗原（ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｒｅｌａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ：ＳＣＣ）が、肺小細胞癌に対しては神経特異エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ）などが、主に選択、使用されている。

しかしＮＳＥは、（１）治癒可能な早期癌に対する陽性率が低いこと、（２）治療による一過性の測定値の上昇が認められること、（３）採血時の溶血により測定値が上昇すること、（４）肺小細胞癌患者と健常人との測定値差が小さいこと、などの欠点があり、肺小細胞癌に対する有効な腫瘍マーカーであるとは必ずしも言えなかった。

ガストリン放出ペプチド（Ｇａｓｔｒｉｎ−ＲｅｌｅａｓｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅ：ＧＲＰ）は、ＭｃＤｏｎａｌｄらが１９７８年にブタ胃組織から単離した、ガストリン分泌促進作用を有する２７個のアミノ酸よりなる脳腸ペプチドである。ヒトにおいてもＧＲＰの存在は確認されており、ヒトＧＲＰをコードする遺伝子も１９８４年にクローニングされている。

国立がんセンターの山口らは、神経内分泌細胞に由来すると考えられている肺小細胞癌の生物学的特性の研究過程で、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃｈｏｒｍｏｎｅ）やカルシトニンなどを含む１５種類以上の脳腸ホルモンを測定し、ＧＲＰが最も高頻度にかつ高濃度に培養肺小細胞癌株で積極的に分泌されることを明らかにした（非特許文献１）。さらに、血中ＧＲＰの濃縮法を組み合わせたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を構築し、肺小細胞癌患者は健康な人に較べ高い血中ＧＲＰ濃度を呈することを明らかにした。しかし、ＧＲＰは血中で速やかに分解されるため血中濃度が低く、また上記アッセイは煩雑な濃縮操作を必要としたため、臨床応用が困難であった。

その後の研究により、各種の細胞においてａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇによって３種のＧＲＰ前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）が産生されることが明らかにされた（非特許文献２）。これら３種のＰｒｏＧＲＰは、その１−９８番目においてアミノ酸配列が共通している一方、９９番目以降はａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇによって、互いに異なるアミノ酸配列となっている。この共通する１〜９８番目のアミノ酸配列を配列番号１に示す。以後、特に断らない限り、本発明におけるＰｒｏＧＲＰ、その部分配列、分解物等のアミノ酸残基の番号表示は、配列番号１のアミノ酸配列のそれをもって表すこととする。

３種のＰｒｏＧＲＰの１−２７番目のアミノ酸配列は、ガストリン分泌促進活性をもつ成熟ＧＲＰのそれと同一である。これら３種の前駆体は、いずれもホルモン前駆体切断酵素によって、１−２７番目のアミノ酸配列からなる成熟型ＧＲＰと、３１番目以降のアミノ酸配列からなるガストリン分泌促進活性をもたないＰｒｏＧＲＰの分解物であるＣ末端側フラグメント（ＰｒｏＧＲＰ−Ｃｆｒａｇ)とに分解される。

Ｈｏｌｓｔら（非特許文献３）は、ＰｒｏＧＲＰの４２−５３番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ＰｒｏＧＲＰ（４２−５３）とする）に対する抗血清を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法によって、肺小細胞癌患者の血漿中のＰｒｏＧＲＰまたはＰｒｏＧＲＰ−Ｃｆｒａｇのレベルが高いことを報告した。しかし、この方法では沈殿抽出操作が必要であり、感度も十分ではなかった。

三宅らは、ＰｒｏＧＲＰがＧＲＰよりも血中で安定性が高いこと、ならびに３種のＰｒｏＧＲＰの共通部分である３１−９８番目のアミノ酸配列が他の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性を示さないことに着目し、同アミノ酸配列からなる組換え体ペプチド（以下、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）とする）を抗原として得た高力価の抗血清を用いて、沈殿抽出操作が不要の高感度ＲＩＡ法を構築した（非特許文献１）。この方法により、ＰｒｏＧＲＰはＧＲＰと同様に優れた腫瘍マーカーになることが示された。

しかし、この方法は抽出操作を必要としない点で有利であるが、測定に４日間を必要とすることや感度が１０ｐＭ（７７．３ｐｇ抗原／ｍＬ）と十分でないため、健常人血清中のＰｒｏＧＲＰ値を測定することはできず、臨床応用には至っていない。

また、前述したＨｏｌｓｔら及び三宅らのＲＩＡ法はインヒビション法であるため、ＰｒｏＧＲＰの断片の一部でも抗原性を有していれば測定可能であるが、その感度はサンドイッチ法に比べて低く、高感度化が必要なＰｒｏＧＲＰ測定法の臨床応用は困難である。すなわち、ＰｒｏＧＲＰの検出を臨床応用するためには、検出の感度を高めることは必須であり、特にサンドイッチ法で利用可能な抗体が必要となる。

山口、青柳らは、ＰｒｏＧＲＰの肺小細胞癌用腫瘍マーカーとしての臨床応用を目的として、ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）を原理とする、サンドイッチ法を用いた簡便で高感度なＰｒｏＧＲＰ測定試薬を開発した（特許文献１）。この方法は約２時間で結果を与え、また高い感度（２ｐｇ／ｍＬ）を有していることから、現在幅広く臨床応用されており、肺小細胞癌においてＮＳＥよりも高い感度、特異性を有していることが明らかとなっている。

また、この測定法を用いて、肺小細胞癌以外にも、神経内分泌腫瘍（甲状腺髄様癌など）、神経内分泌腫瘍的性格を示す癌（食道小細胞癌、膵小細胞癌、前立腺小細胞癌など）でも血清ＰｒｏＧＲＰ値が上昇することが明らかとなり、今後これらの腫瘍の早期発見や治療のモニタリングなどにも応用されていくと思われる。

しかしながら、ＰｒｏＧＲＰの血中での安定性は、ＧＲＰのそれと比較した場合には高いが、一般的な他の腫瘍マーカーに比べて、測定値のばらつきが認められる。そのため、ＰｒｏＧＲＰを検出対象とした方法では、測定用検体は、採血後すみやかに測定時まで凍結保存されなければならないという制約がある（非特許文献４）。

青柳は、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の内部領域であるＰｒｏＧＲＰの４０−７５番目のアミノ酸残基あるいはＰｒｏＧＲＰの４０−７９番目のアミノ酸残基を認識する２種類以上の抗体を用いたサンドイッチ測定法を開発した（特許文献３）。この方法は、４℃で保存した検体の測定で比較的安定な結果を与え、また特許文献２に記載されている方法とほぼ同等の検出感度を示す。しかしながら、この方法は、特許文献３の実施例４に示されるとおり、１００μＬという一般的な免疫測定法と比較して多めの検体量を必要とする。
特許第３２１０９９４号公報特開平６−９８７９４号国際特許公開ＷＯ２００６／１１７９９４号パンフレットＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第５４巻、第２１３６−２１４０頁Ｓｐｉｎｄｅｌら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１９８７年、第１巻、第２２４−２３２頁Ｈｏｌｓｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９８９年、第７巻、第１８３１−１８３８頁臨床検査、１９９５年、第３９巻、第９８１−９８６頁

特許文献３に記載された方法において、検出感度を維持しつつ必要な検体量をさらに少量にすることができれば、臨床現場において、測定に要するコストの削減や患者の負担軽減を達成することができる。また、検体の保存による測定感度の低下がより少ない測定方法は、検体の取扱いをより簡便にすることができる。本発明は、検体の保存によっても検出感度の低下が少なく、より少量の検体量で測定が可能である、新しいＰｒｏＧＲＰの測定法を提供するものである。

本発明は、ＰｒｏＧＲＰの特定の領域に対する抗体を用いたイムノアッセイ法が上記の課題を解決できることを見いだし、以下の各発明を完成した。

（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列の４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識する２種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び／又はその分解物を測定する方法。

（２）サンドイッチ免疫測定法である、（１）に記載の方法。

（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列の４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体。

（４）寄託番号ＦＥＲＭＰ−２１３０８で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ９が産生する（３）に記載のモノクローナル抗体。

（５）寄託番号ＦＥＲＭＰ−２１３０９で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ１７が産生する（３）に記載のモノクローナル抗体。

（６）寄託番号ＦＥＲＭＰ−２１３０８で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ９。

（７）寄託番号ＦＥＲＭＰ−２１３０９で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ１７。

（８）２種以上の異なる抗体の少なくとも一方が（４）又は（５）のいずれかに記載の抗体である、（１）に記載の方法。

（９）（３）〜（５）のいずれかに記載の抗体を含む、ガストリン放出ペプチド前駆体もしくはその分解物を測定するためのキット。

（１０）癌の診断又は治療効果のモニタリングを行うためのキットである、（９）に記載のキット。

本発明の方法は、検体中でも安定に保存されているＰｒｏＧＲＰの分解物を測定対象とすることによって、従来の測定法と同等の検出感度が得られることに加え、採取後の検体の取扱い方に影響を受けにくくなり、再現性の高い測定値が得られる、などの効果を奏する。このことにより、肺小細胞癌などの疾病の診断のために、検体を採血する臨床現場において、採血後の検体の取扱いがさらに容易になり、ＰｒｏＧＲＰの測定値が検体の取扱いによってばらつくことがなくなり、より安定した結果が得られ、測定値の信頼性が高くなる。また臨床所見から追加試験の要請あるいは再検査の必要性が生じた場合など、凍結保存検体ではなく冷蔵保存検体を用いた測定が可能となり、測定に要するコストを削減することができる。また、本発明の方法は、高い検出感度を維持しながら、測定検体量の減少及び測定時間の短縮が可能となり、臨床場面におけるコストを削減し、患者の負担を軽減することができる。

マルチピンペプチドで合成した８個の連続するアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに対するモノクローナル抗体ＰＧＣＹ９の結合能を示すグラフである。横軸は各ポリペプチドとその配列番号１におけるアミノ酸残基の番号を、縦軸は吸光度を示す。マルチピンペプチドで合成した８個の連続するアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに対するモノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７の結合能を示すグラフである。横軸は各ポリペプチドとその配列番号１におけるアミノ酸残基の番号を、縦軸は吸光度を示す。マルチピンペプチドで合成した８個の連続するアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに対するモノクローナル抗体ＰＧＣＹ２４の結合能を示すグラフである。横軸は各ポリペプチドとその配列番号１におけるアミノ酸残基の番号を、縦軸は吸光度を示す。マルチピンペプチドで合成した８個の連続するアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに対するモノクローナル抗体ＰＧＣＹ１２の結合能を示すグラフである。横軸は各ポリペプチドとその配列番号１におけるアミノ酸残基の番号を、縦軸は吸光度を示す。マルチピンペプチドで合成した８個の連続するアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに対するモノクローナル抗体ＰＧＣＹ５の結合能を示すグラフである。横軸は各ポリペプチドとその配列番号１におけるアミノ酸残基の番号を、縦軸は吸光度を示す。ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）と各種モノクローナル抗体が認識するエピトープの位置の関係を示す模式図である。アミノ酸番号４７−６８番目の部分ペプチドに結合する抗体であるＰＧＣＹ９とＰＧＣＹ１７を用いた測定法の標準曲線である。横軸はＰｒｏＧＲＰの濃度を、縦軸は吸光度を示す。マイクロプレートの固相に抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を介して結合させたＰｒｏＧＲＰに対する各モノクローナル抗体と、ビオチン化ＰｒｏＧＲＰとの反応性を示すグラフである。横軸に各モノクローナル抗体を、縦軸に吸光度を示している。

本発明は、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識することができる２以上の異なる抗体を使用し、サンドイッチ免疫測定法によってＰｒｏＧＲＰ又はＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸残基を有するＰｒｏＧＲＰの分解物を検出する方法である。当該イムノアッセイ法は、採取された検体を冷蔵保存した場合でも、その検出感度が低下しないという特徴を有している。このことは、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸残基を有するＰｒｏＧＲＰの分解物は、検体に含まれるプロテアーゼあるいはその他の原因による検体保存中のさらなる分解反応に対して比較的安定であることを意味するものと推察される。

本発明の方法で利用することができる抗体は、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識することができる抗体であり、これによってＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸残基を有するＰｒｏＧＲＰの分解物に結合することができる。斯かる抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。

本発明の方法で利用することができる抗体は、好ましくはＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸配列におけるＮ末端部分に提示されるエピトープと、Ｃ末端部分に提示されるエピトープを認識することのできる２以上の異なるモノクローナル抗体であることが望ましい。特に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＰ−２１３０８として寄託されたハイブリドーマＧＣＹ９及び受託番号ＦＥＲＭＰ−２１３０９として寄託されたハイブリドーマＧＣＹ１７が産生するモノクローナル抗体であるＰＧＣＹ９とＰＧＣＹ１７の利用が特に好ましい。この２種類のハイブリドーマ細胞は、大腸菌を利用して生産した組み換えＰｒｏＧＲＰの３１−９８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）と表すこととする）を抗原として免疫したマウスの抗体産生細胞から通常の方法で作製されたハイブリドーマ細胞であり、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）内部のペプチドを用いたスクリーニングによって選別された、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸によって提示されるエピトープを認識する抗体を産生する細胞である。

この様に、本発明で利用することができる抗体は、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を抗原としてマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの実験動物を免疫して回収される抗体産生細胞から、通常の方法でモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製し、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド（以下、ＰｒｏＧＲＰ（４７−６８）と表すこととする）を用いて所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることで得ることができる。また、ＰｒｏＧＲＰ（４７−６８）を抗原として用いてもよい。また、前記ポリペプチドは、サイクログロブリンやキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体に結合させて使用してもよい。

マウスを例に取って、動物を免疫する方法を説明する。ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）などのポリペプチドをフロインド完全アジュバント、ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ社）等のアジュバンドと１：１に混ぜ、交流ジョイントで結合した二本の注射筒で繰り返しジョイントを通過させる、あるいは超音波処理する等の方法によりエマルジョンを作製する。作製した抗原含有エマルジョンを、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内のいずれか、または複数部位に注入する。一回目の免疫終了の後、１〜４週間の間隔を開け、二回目の免疫を同様に実施する。以後同様に、血中のＰｒｏＧＲＰに対する抗体の抗体価が上昇するまで、免疫を続ける。

抗体価の測定は以下の様に行うことができる。ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を１μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解し、ウエルあたり５０μＬの容量で９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩吸着する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で各ウエルを洗浄後アッセイに用いる。アッセイの前に、１％ＢＳＡ入りＰＢＳ等でブロッキングを行ってもよい。眼窩静脈叢、尾静脈または尾動脈等から採血し、ＰＢＳ−Ｔで３０倍に希釈した後遠心を行う。得られた上清をＰＢＳ−Ｔで希釈系列を作成し、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）をコートしマイクロタイタープレートの各ウエルに５０μＬずつ添加する。室温で３０分反応後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔなどで適切に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ溶液を各ウエルに５０μＬずつ添加する。更に室温で３０分反応後、過酸化水素、オルトフェニレンジアミン基質液を添加して３０分間反応させ、２ＮＨ_２ＳＯ_４を５０μＬ添加して反応を停止させ、各ウエルの吸光度を測定する。

免疫したマウスで、十分に投与した抗原に対する抗体価が上昇していることを確認した後、脾臓を取り出し、脾臓細胞を単離する。別に培養しておいたマウスミエローマ（例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４等）と、ポリエチレングリコール等を用いることにより融合する。融合に成功した細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）培地で選択培養する。７〜１４日程度、数日おきに培地を半量交換しながら培養を継続した後、培養上清の抗体価を測定する。ポジティブウエルの細胞を限界希釈法にてクローニングし、目的の抗体産生ハイブリドーマを得る。

上記方法で得られた抗体のエピトープを解析することによって、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識する抗体を、取得することができる。エピトープ解析は、マルチピンペプチド法により合成したＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の連続する８−１２アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはＰｒｏＧＲＰ（４７−６８）に対する抗体の反応を調べることによって行うことができる。例えば、組換え体で発現させたＰｒｏＧＲＰ（４７−６８）あるいはＦｍｏｃ法やＢｏｃ法で化学合成させたＰｒｏＧＲＰ（４７−６８）をマイクロタイタープレートにコートし、上述した免疫測定法で、抗体の各ペプチドに対する反応性を調べることにより、決定することができる。

マルチピンペプチド法により合成した、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の連続する８−１２アミノ酸配列からなるポリペプチドを用いたエピトープ解析の結果、本発明で特に好ましい抗体の一つであるＰＧＣＹ９は、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸によって提示されるエピトープのうち、５５−６６番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体であることが確認された。また本発明で特に好ましいもう一つの抗体であるＰＧＣＹ１７は、少なくとも４５−５７番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体であることが確認された。

本発明で利用される抗体は、担体やマイクロプレートに固相化したり、ビオチン等の適当なラベル化試薬でラベリングしたりすることも可能である。固相化やラベリングの各操作は、種々の実験手法の解説書に記載されている方法に準じて行えばよく、本発明で利用される抗体に特有の操作は特に必要とはされない。

本発明の方法は、上記の抗体を利用したサンドイッチイムノアッセイ法、具体的にはサンドイッチＥＬＩＳＡ法である。サンドイッチＥＬＩＳＡ法の基本操作は、「超高感度免疫測定法」（石川栄治、１９９３年、学会出版センター）あるいはその他種々の実験手法の解説書に記載されている方法に準じて行うことができ、本発明の実施に特有の操作は特に必要とはされないが、次のような工程で行うことができる。

すなわち、ＰｒｏＧＲＰ及び／又はその分解物は、（１）ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識する第一の抗体と検体中のＰｒｏＧＲＰ及び・又はその分解物とを反応させる工程、（２）該抗体により捕捉されたＰｒｏＧＲＰ及び／又はその分解物を、（１）の抗体とは異なるがＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識する第二の抗体と反応させる工程、及び（３）（２）により生ずる免疫複合体を検出する工程を含む測定法によって、検出することができる。

本発明の方法の操作法の例は、次のように表すことができる。第一の抗体を１〜１０μｇ／ｍＬ程度の濃度になるように緩衝液、例えば０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した溶液を、マイクロタイタープレートの各ウエルに等量置き、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳ等の洗浄用緩衝液で各ウエルを洗浄後、第一の抗体が結合していない各ウエルの内壁を、カゼインナトリウム等の適当なタンパク質を含む緩衝溶液を用いて数時間インキュベートを行ってブロッキングする。ブロッキング液を除去後、各ウエルに、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む反応液と検体を添加する。検体の添加量は、その測定法の感度によって適宜変更される。３７℃程度の温度で１時間ほど反応させた後、界面活性剤を含む緩衝液（例えばＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ−Ｔ）で各ウエルを洗浄し、適当なラベル試薬でラベル化された第二の抗体を各ウエルに添加して数十分反応後、各ウエルを洗浄し、ラベル試薬に応じた方法で第二の抗体を検出する。なお、この上記の操作法は飽くまで例であり、各段階の操作の詳細、例えば緩衝液、ラベル試薬、添加量等は、適宜調節することができる。

モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９とＰＧＣＹ１７の２種類のモノクローナル抗体を用いた本発明の方法の検出感度は２．５ｐｇ／ｍＬであり、検体量は２５μＬ程度を用いればよい。この検出感度は、ほぼ全ての健常人の血中ＰｒｏＧＲＰの測定を可能にするものであり、臨床現場において検査コストの削減、患者の負担軽減に寄与するものである。

本発明は、上述の方法に加え、検体中のＰｒｏＧＲＰもしくはその分解物を測定するためのキット、特にＰｒｏＧＲＰ及び／又はその分解物を測定することによって肺小細胞癌の診断や化学療法のモニタリングを行うための診断薬キットも提供する。かかるキットは、上述したＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸によって提示されるエピトープを認識する抗体を少なくとも２種含み、その他任意に反応緩衝液や２次抗体の希釈液、ＰｒｏＧＲＰの標準物質、説明書その他の構成物を含んでいてもよい。キットに含まれる抗体の好ましい例としては、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸によって提示されるエピトープを認識する２種以上の異なる抗体であり、代表例としてはモノクローナル抗体ＰＧＣＹ９とモノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７である。

ＰｒｏＧＲＰ及び／又はその分解物と結合する抗体は、ＰｒｏＧＲＰの４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識する抗体のみを選択して使用することが好ましいが、再現性の高い測定値を得ることができる範囲内で、かかる抗体以外の抗体が測定系に含まれていてもよい。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明する。

実施例１

特許第３２１０９９４号の実施例１に記載した方法により組換え体を作成し、大腸菌で発現させた配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを精製した。特許第３２１０９９４号の実施例１では、この組換え体はＧＲＰ（３１−９８）と記載されているが、正しくはＧＲＰ前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）の（３１−９８）部分であるので、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）とここでは記載する。

ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）：ブタサイログロブリン（ＴＧ）を重量比1：３で結合させた抗原タンパク質（ＰｒｏＧＲＰ−ＴＧと表す) を、０．１５ＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に希釈し、等量のタイターマックスと混和し、ＰｒｏＧＲＰ−ＴＧ懸濁液とした。ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の濃度が０．０５ｍｇ／０．１ｍＬとなるように調製した該懸濁液を、４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に約２０日の間隔で４〜６回投与した。さらに約４週間後、追加免疫として、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の濃度が０．１ｍｇ／０．１ｍＬとなるように調製した生理食塩水溶液を２日間投与した。最終追加免疫後３日目に、この免疫動物より無菌的に脾臓を摘出し、ハサミで切片としてさらにメッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄後、８−アザグアニジンを含む同培地で数日間培養した。復帰突然変異体を完全に除いた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４をＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄後、該細胞２．４×１０^７個と前記脾臓細胞２．０×１０^８個を遠心管に入れ混合した。混合した２種類の細胞を、２００×ｇ、５分間遠心分離を行なって上清を除去した後、ＨＶＪＥｎｖｅｌｏｐＣｅｌｌＦｕｓｉｏｎＫｉｔ(ＧｅｎｏｍＯＮＥ−ＣＦ、石原産業（株）) を用いて細胞融合させた。融合した細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（以下、３種類の化合物を纏めてＨＡＴと表す）、１０%ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びマウスインターロイキン−６（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、９６ウエルプレートに添加して１〜２週間培養した。培養約１〜２週間後、抗原としてＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を用いたＥＬＩＳＡ法を行って、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）に対して反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。

得られたハイブリドーマについて、常法の限界希釈法に従い、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を用いて目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化を行ない、最終的に５株のハイブリドーマ細胞を得、ＧＣＹ９、ＧＣＹ１７、ＧＣＹ１２、ＧＣＹ２４及びＧＣＹ５とそれぞれ命名した。ＧＣＹ９とＧＣＹ１７は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、平成１９年６月２２日付で寄託申請を行なった（ＧＣＹ９の寄託番号：ＦＥＲＭＰ−２１３０８、ＧＣＹ１７の寄託番号：ＦＥＲＭＰ−２１３０９）。また、ＧＣＹ９とＧＣＹ１７は、平成２０年８月５日付にてそれぞれ国際寄託された（ＧＣＹ９の国際寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１０９９１、ＧＣＹ１７の国際寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１０９９２）。

実施例２

（１）実施例１に記載の方法により得られたハイブリドーマを、マウスインターロイキン−６を含む無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養し、産生されるモノクローナル抗体を、プロテインＡを結合させたセファロースカラム（アマシャム）を用いて精製回収した。各ハイブリドーマＧＣＹ９、ＧＣＹ１７、ＧＣＹ１２、ＧＣＹ２４及びＧＣＹ５より産生されたモノクローナル抗体を、それぞれＰＧＣＹ９、ＰＧＣＹ１７、ＰＧＣＹ１２、ＰＧＣＹ２４及びＰＧＣＹ５と命名した。ＰＧＣＹ９、ＰＧＣＹ１７、ＰＧＣＹ１２、ＰＧＣＹ２４及びＰＧＣＹ５のサブタイプは、ウサギ抗マウスＩｇ各サブタイプキット（Ｚｙｍｅｄ社）を用いた実験により、ＰＧＣＹ９、ＰＧＣＹ１２、ＰＧＣＹ２４及びＰＧＣＹ５がＩｇＧ１、ＰＧＣＹ１７がＩｇＧ２ａであることが明らかとなった。

（２）ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）のアミノ酸配列に基づき、１アミノ酸ずつずらして調製された連続した８個のアミノ酸からなる計６１種類のポリペプチドを、マルチピンペプチド法で合成した。さらに、各ペプチドのＮ末端にビオチンを結合させた。ビオチン化ポリペプチドそれぞれをジメチルホルムアミドに溶解し、１μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳで希釈した。希釈された各ビオチン化ポリペプチド溶液を、アビジンが固相化された９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で各ウエルを洗浄後、各モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬに希釈した溶液を、各ウエルに１００μＬずつ添加した。室温で３０分間反応後、ＰＢＳ−Ｔで各ウエルを５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液を各ウエルに１００μＬずつ添加した。更に室温で３０分間反応後、ＰＢＳ−Ｔで５回各ウエルを洗浄し、基質溶液（２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を各ウエルに１００μＬずつ添加し、室温で３０分間反応後、２Ｎ硫酸を１００μＬずつ添加し、ただちに４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９、ＰＧＣＹ１７、ＰＧＣＹ２４、ＰＧＣＹ１２及びＰＧＣＹ５のＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）内部の各ペプチドに対する反応を図１〜図５に示す。

図１に示されるように、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９は、ＰｒｏＧＲＰ（５７−６４）に対して非常に弱く結合することが確認された。また図２と図３に示されるように、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４は、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）のアミノ酸配列における連続した８個のアミノ酸からなるポリペプチドには結合しないことが確認された。このことから、ＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４は、８個の連続するアミノ酸配列ではなく、８個より長いアミノ酸配列からなるポリペプチドによって提示されるエピトープを認識するものと推察される。一方、図４に示されるように、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１２はＰｒｏＧＲＰ（３４−４１）に強く結合し、その前後のＰｒｏＧＲＰ（３３−４０）及びＰｒｏＧＲＰ（３５−４２）には弱く結合することが確認された。したがって、ＰＧＣＹ１２は、ＰｒｏＧＲＰの３４−４１番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するものと推察される。また、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ５は、ＰｒｏＧＲＰ（６９−７６）とＰｒｏＧＲＰ（７０−７７）に対して強く結合し、ＰｒｏＧＲＰ（７１−７８）に結合し、またＰｒｏＧＲＰ（６８−７５）には非常に弱く結合することが確認された。したがって、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ５は、ＰｒｏＧＲＰの６９−７６番目のアミノ酸配列と７０−７７番目のアミノ酸配列によって提示される共通のエピトープを認識するものと推察される。

（３）表１に示されるＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の部分アミノ酸配列からなるポリペプチドをＦｍｏｃ法にて合成、精製した。６Ｍ尿素を溶解させたＰＢＳに、ＢＳＡを２０μｇ／ｍＬの濃度で溶解し、９６ウエルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウエルに１００μＬずつ加え、室温で３時間インキュベートした。各ウエルを５回ずつＰＢＳで洗浄し、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシミド（ＮＨＳ）を各々１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで溶解した溶液を各ウエルに１００μＬずつ加え、室温で２時間インキュベートして、ウエルに固定されたＢＳＡのカルボキシル基を活性化させた。各ウエルを３回ずつＰＢＳで洗浄し、それぞれのポリペプチドを５μｇ／ｍＬの濃度に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。これにより、各ポリペプチドはアミノ基を介して固定化されたＢＳＡに結合することになる。

ＰＢＳで各ウエルを２回洗浄後、１％ＢＳＡ、２％スクロースを含むＰＢＳを各ウエルに３５０μＬずつ添加し、室温で３時間インキュベーションを行い、その後吸引除去した。１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した各モノクローナル抗体を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で６０分間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で２０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、基質溶液（２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で２０分間反応させた後、２Ｎ硫酸を１００μＬずつ各ウエルに添加して反応を停止させ、ただちに４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。本発明の各モノクローナル抗体のほかに、特許文献３に示された、ＰｒｏＧＲＰの４０−６０アミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、かつ８個の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドには反応しないモノクローナル抗体であるＧＲＰ−３Ｄ６−２のエピトープも、同時に検討した。その結果を表１に示す。

検討した４種のモノクローナル抗体は、表１に示されるように、ＰｒｏＧＲＰの部分アミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識すること、また全てのモノクローナル抗体がＰｒｏＧＲＰ（４２−５３）に結合しないことが確認できた。さらに、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９は、ＰｒｏＧＲＰ（５５−６６）、ＰｒｏＧＲＰ（５７−６８）、ＰｒｏＧＲＰ（５４−７８）及びＰｒｏＧＲＰ（５４−９０）に比較的強く結合した。また、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４は、ＰｒｏＧＲＰ（４７−６１）、ＰｒｏＧＲＰ（４０−６０）及びＰｒｏＧＲＰ（４４−６２）に比較的強く結合し、ＰｒｏＧＲＰ（４６−５９）に非常に弱く結合した。モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２は、ＰｒｏＧＲＰ（４７−６１）、ＰｒｏＧＲＰ（４０−６０）及びＰｒｏＧＲＰ（４４−６２）に比較的強く結合した。

（４）実施例１で作成した組換え体ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を１μｇ／ｍＬの濃度にＰＢＳで希釈し、９６ウエルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウエルに５０μＬずつ加え、４℃で一晩インキュベートした。各ウエルを２回ずつＰＢＳで洗浄し、０．５％カゼインナトリウムと２％スクロースを含むＰＢＳ（ｐＨ７．１）を各ウエルに３５０μＬずつ添加し、室温で３時間インキュベーションを行い、その後吸引除去した。反応液（１％ＢＳＡ、０．０５％カゼインナトリウム、１％ポリビニルピロリドン、１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）で、各ペプチドを２μｇ／ｍＬの濃度に希釈した溶液を、５０μＬずつ各ウエルに添加した。次に、1 μｇ／ｍＬの濃度に希釈した各モノクローナル抗体を５０μＬずつ各ウエルに添加して、室温で６０分間インキュベートを行った。この工程で、固相化されたＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）と溶液中の各ペプチドが競合して、各モノクローナル抗体と結合反応が行われる。その後、各ウエルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ (ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で２０分間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄後、基質溶液（２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Mクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μＬずつ各ウエルに添加し、室温で２０分間反応させた後、２Ｎ硫酸を１００μＬずつ各ウエルに添加して反応を停止させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。ペプチドを添加していないウエル（コントロール）を１００%として、その阻害率（％）を表２に示す。

表２に示されるように、各モノクローナル抗体の固相ポリペプチドに対する結合は、全てＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の存在で９０％以上阻害され、また全てＰｒｏＧＲＰ（４２−５３）の存在では阻害されないことが確認された。モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９では、８０％以上の結合阻害が確認されたポリペプチドは、ＰｒｏＧＲＰ（５５−６６）、ＰｒｏＧＲＰ（５４−７８）及びＰｒｏＧＲＰ（５４−９０）であった。モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４では、８０％以上の結合阻害が確認されたポリペプチドは、ＰｒｏＧＲＰ（４５−５７）、ＰｒｏＧＲＰ（４６−５９)、ＰｒｏＧＲＰ（４７−６１）、ＰｒｏＧＲＰ（４０−６０）及びＰｒｏＧＲＰ（４４−６２）であった。なお、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２で、８０％以上の結合阻害が確認されたポリペプチドは、ＰｒｏＧＲＰ（４６−５９）、ＰｒｏＧＲＰ（４７−６１）、ＰｒｏＧＲＰ（４０−６０）及びＰｒｏＧＲＰ（４４−６２）であり、ＰＧＣＹ１７やＰＧＣＹ２４で阻害活性が確認されたＰｒｏＧＲＰ（４５−５７）に対する結合は弱く阻害された。

モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９は、前記（３）に記載の通りＰｒｏＧＲＰ（５５−６６）及びＰｒｏＧＲＰ（５７−６８）に結合し、かつＰｒｏＧＲＰ（５７−６８）にＰｒｏＧＲＰ（５５−６６）よりも強く結合した。また（４）では、ＰｒｏＧＲＰ（５５−６６）で十分な阻害がかかり、ＰｒｏＧＲＰ（５７−６８）で弱い阻害反応が認められた。したがってモノクローナル抗体ＰＧＣＹ９は、ＰｒｏＧＲＰの５５−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するものと考えられる。

また（３）（４）のエピトープ解析結果から、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４は、ＰｒｏＧＲＰの４７−５７番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するものと推察される。なお、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２は、ＰＧＣＹ１７やＰＧＣＹ２４よりもＣ末端側のＰｒｏＧＲＰの４７−５９番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープであると考えられる。また、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ５とモノクローナル抗体ＰＧＣＹ１２が認識するエピトープは、８つの連続するアミノ酸配列から形成される連続エピトープである。さらに、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４は、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の内部の８個の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチドには結合せず、ＰｒｏＧＲＰ（４７−５７）の１１個の連続するアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するものと推定された。各モノクローナル抗体が認識すると推定されるエピトープを、表３に示す。

実施例３

本発明の各モノクローナル抗体と特許第３２１０９９４号の実施例６及び７に示されたモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２を用いて、血清などの検体保存中で安定なＰｒｏＧＲＰ部分ペプチドの同定を試みた。尚、モノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｇ２は、特許文献３に示されているように、ＰｒｏＧＲＰの８４−８８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識する抗体である。

凍結及び４℃でそれぞれ１、４、７日間保存した８例の検体Ａ〜Ｈについて、下記の測定を行った。９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに、各モノクローナル抗体（ＰＧＣＹ１７、ＰＧＣＹ９、ＧＲＰ−３Ｇ２）を４μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ加え、４℃で一晩インキュベートした。０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２回洗浄後、ブロッキング液（０．５％カゼインナトリウム、２％スクロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１）を３５０μＬ加え２時間静置した。ブロッキング液を除去後、反応液（１％ＢＳＡ、０．０５％カゼインナトリウム、１％ポリビニルピロリドン、１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）１００μＬと測定検体５０μＬを各ウエルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識をした各モノクローナル抗体（ＰＧＣＹ１２、ＰＧＣＹ１７、ＰＧＣＹ９、ＰＧＣＹ５）溶液１００μＬを添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０%過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μＬ加え、３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍ（リファレンス波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。

固相化抗体と標識抗体に認識部位の異なる抗体を組み合わせることで、検体中に存在するＰｒｏＧＲＰの部分分解物が有する部分アミノ酸配列を推定することができる。今回用いた抗体の組合せを図６に示す。モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１２とＰＧＣＹ１７を組み合わせると、検体中のＰｒｏＧＲＰ分解物の内、ＰｒｏＧＲＰの３４−５７番目のアミノ酸配列を有する分解物を測定することができる。同様に、ＰＧＣＹ１７とＰＧＣＹ９を組み合わせると４７−６８番目のアミノ酸配列を有する分解物を、ＰＧＣＹ９とＰＧＣＹ５を組み合わせると５５−７６番目のアミノ酸配列を有する分解物を、ＰＧＣＹ９とＧＲＰ−３Ｇ２を組み合わせると５５−８８番目のアミノ酸配列を有する分解物を、ＰＧＣＹ５とＧＲＰ−３Ｇ２を組み合わせると７０−８８番目のアミノ酸配列を有する分解物を、それぞれ測定することができる。
凍結保存した検体におけるＰｒｏＧＲＰ測定値を１００％として、４℃で１、４、７日間保存した検体におけるＰｒｏＧＲＰの測定値を表４に示す。

モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９とＧＲＰ−３Ｇ２の組合せ、及びモノクローナル抗体ＰＧＣＹ５とＧＲＰ−３Ｇ２の組合せでは、ほとんどの検体において、１日保存で８５％以上の免疫活性が保持されているが、４日保存では５５〜８５％に、さらに７日保存では全ての検体の免疫活性が８０％以下に低下した。これは、特許文献３に示されているように、保存期間中に血液中のプロテアーゼ等により、ＰｒｏＧＲＰが配列番号１のＬｙｓ−７９のＣ末端側で切断されることによる免疫活性の消失と考えられる。

モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１２とＰＧＣＹ１７の組合せ、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７とＰＧＣＹ９の組合せ、及びモノクローナル抗体ＰＧＣＹ５とＰＧＣＹ９の組合せでは、比較的安定に免疫活性が保持されているが、ＰＧＣＹ１２とＰＧＣＹ１７の組合せでは８検体中２検体（ＢとＨ）で保存によって免疫活性が上昇し、７日保存で１１０%を超えた。

また、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７とＰＧＣＹ９の組合せとモノクローナル抗体ＰＧＣＹ５とＰＧＣＹ９の組合せを比較すると、７日保存で、後者で４検体の免疫活性が８５％以下に低下した。一方、前者では、７日保存において全て８０％以上の免疫活性が保持されており、８検体中６検体で８５％以上の免疫活性が保持されていた。このことは、特許文献３に記載された方法によって測定されるＰｒｏＧＲＰの分解物よりも、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７とＰＧＣＹ９を組み合せることで測定される分解物の方が、検体を４℃で保存する場合において劣化がより少なく、測定対象として有利であることを意味する。

実施例４

特許文献３の実施例４に記載された方法において、抗体をモノクローナル抗体ＰＧＣＹ１７とＰＧＣＹ９の組合せに変更して、同モノクローナル抗体の組合せを利用した方法で必要とされる測定時間、測定検体量、測定感度を検討した。

９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに、モノクローナル抗体ＰＧＣＹ９を抗体固定液（０．６ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６）に５μｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液を１２０μＬ加え、４℃で一晩インキュベートした。０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２回洗浄後、ブロッキング液（０．５％カゼインナトリウム、５％スクロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１）を３５０μＬ加え２時間静置し、ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、プレートを乾燥させた。乾燥後、反応液（１％ＢＳＡ、１％ポリビニルピロリドン、０．０５％カゼインナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、４０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）１００μＬと測定検体２５μＬを各ウエルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ＨＲＰ標識したＰＧＣＹ１７のＦａｂ’を標識抗体希釈液（２％ＢＳＡ、０．２５％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％カゼインナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、１％スクロース、２５μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５）で溶解した液２００μＬを添加して室温で２０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を１００μＬ加え、２０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸１００μＬを加えて酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍ（リファレンス波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。その標準曲線を図７に示す。

その結果、本発明の方法は、総反応時間が１００分間で、サンプル量が２５μＬと少量にもかかわらず、約２．５ｐｇ／ｍＬのＰｒｏＧＲＰを検出できることが確認された。この感度は、健常人検体中のＰｒｏＧＲＰ濃度を検出するうえで十分な感度である。また、特許文献３の実施例４に記載された方法と比較すると、測定時間は１２０分から１００分に短縮され、測定用検体量が1／４に減少し、かつ検出感度は約１．７倍に上昇したことになる。

実施例５

ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍＭｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）抗体を０．５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に２．５μｇ／ｍＬの濃度で溶解した溶液５０μＬを９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに加え、４℃で一晩インキュベートした。０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２回洗浄後、ブロッキング液（０．５％カゼインナトリウム、２％スクロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１）を３５０μＬ加え２時間静置した。ブロッキング液を除去後、室温で乾燥させた。各モノクローナル抗体を反応液（１％ＢＳＡ、０．０５％カゼインナトリウム、１％ポリビニルピロリドン、１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）に５μｇ／ｍＬの濃度で希釈した液１００μＬを各ウエルに加え、３７℃で２時間反応させた。この反応で、固相のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）に、各モノクローナル抗体のＦｃ部分が結合することになる。

次に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で各ウエルを５回洗浄し、反応液（１％ＢＳＡ、０．０５％カゼインナトリウム、１％ポリビニルピロリドン、１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）１００μＬと、ビオチン化した組換え体ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）（０ｐｇ／ｍＬ、２００ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ）溶液５０μＬを各ウエルに添加し、３７℃で１時間反応させた。この反応で、各モノクローナル抗体が、ビオチン化した組換え体ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）と結合する。

洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で４回洗浄し、反応液（１％ＢＳＡ、０．０５％カゼインナトリウム、１％ポリビニルピロリドン、１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）で希釈したＨＲＰ標識をしたアビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ）溶液１００μＬを添加して、室温で３０分間反応させた。洗浄液で４回洗浄し、基質溶液（２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０％過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）１００μＬを加え、３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸１００μＬを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍ（リファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。その結果を、図８に示す。

これらのモノクローナル抗体の中で、ＰｒｏＧＲＰ（５５−６８）に結合するモノクローナル抗体ＰＧＣＹ９が最も高い反応性を示し、特許文献３の実施例４で固相に用いたモノクローナル抗体ＧＲＰ−３Ｄ６−２と比較しても、約３．３倍高い値を示した。ＰｒｏＧＲＰ（４７−５７）に結合するＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４は、ほぼ同じような反応性を示し、ＰＧＣＹ１７よりもわずかにＣ末端側であるＰｒｏＧＲＰ（４７−５９）を認識するＧＲＰ−３Ｄ６−２は、ＰＧＣＹ１７よりも高い反応性を示した。また、ＰｒｏＧＲＰ（７０−７６）近傍を認識するＰＧＣＹ５及びＧＲＰ−２Ｂ１０は、これらのモノクローナル抗体の中で低い反応性を示し、それらよりさらにＣ末端側であるＰｒｏＧＲＰ（８４−８８）を認識するＧＲＰ−３Ｇ２は、比較的高い反応性を示した。これらのモノクローナル抗体の認識部位と反応性から、５５番目から６８番目までのアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用することにより、高感度で測定検体中のＰｒｏＧＲＰ又はその分解物を捕捉することができると考えられる。また、ＰＧＣＹ５及びＧＲＰ−２Ｂ１０の反応性が低いことから、７０番以降のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は反応性が低いと考えられ、５５番目から６９番目までのアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用することによっても、高感度でＰｒｏＧＲＰ又はその分解物を捕捉することができると考えられる。

実施例６

（１）各モノクローナル抗体のビオチン化
各モノクローナル抗体０．５ｍｇを１ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に添加し、ジメチルホルムアミドに溶解したＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）をモル比ＩｇＧ：Ｂｉｏｔｉｎ＝１：２０となるように添加し、室温で６０分間ゆるやかに攪拌した。１．５Ｍグリシン溶液（ｐＨ８．９）を１００μＬ添加して、室温で１０分間ゆるやかに攪拌した。ＰＢＳを移動相としてゲルろ過を行い、ビオチン化モノクローナル抗体を得た。

（２）各モノクローナル抗体の組合せの検討
９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに、各モノクローナル抗体を５μｇ／ｍＬの濃度で抗体固定液（０．５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６）に溶解した溶液１００μＬを加え、４℃で一晩インキュベートした。０．１５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で２回洗浄後、ブロッキング液（０．５％カゼインナトリウム、２％スクロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．１）を３５０μＬ加え２時間静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去後、反応液（１％ＢＳＡ、０．０５％カゼインナトリウム、１％ポリビニルピロリドン、１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）１００μＬと組換え体ＰｒｏＧＲＰ（０、１００、５００、２０００ｐｇ／ｍＬ）を５０μＬずつ各ウエルに加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）で５回洗浄し、ビオチン化した各モノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で反応液に溶解させたものを１００μＬ添加して室温で３０分間反応させた。反応液で希釈したＨＲＰ標識をしたアビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ）溶液１００μＬを添加して、室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（２ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジアミン、３０%過酸化水素水０．９μＬ／ｍＬを含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０）１００μＬを加え、２０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍ（リファレンス波長６００ｎｍ）の吸光度を測定した。その反応性を、５段階（高い順から、☆；非常に高い反応性、◎；高い反応性、〇；中程度の反応、△；わずかな反応性、×；反応せず）に分けて表５に示した。

表５に示されるように、まず、同一モノクローナル抗体同士及び認識するエピトープが同じ又はこれを提示するアミノ酸配列が大きく重なり合っていると思われる抗体同士は、反応性が確認できなかった。ＰＧＣＹ９を固相化した場合、ビオチン化抗体としては、ＰＧＣＹ１７及びＰＧＣＹ２４が最も反応性が高く、次にＧＲＰ−３Ｇ２及びＰＧＣＹ５で、その次にＧＲＰ−２Ｂ１０及びＰＧＣＹ１２であり、ＧＲＰ−３Ｄ６−２では反応性は確認できなかった。

ＰＧＣＹ１７を固相化した場合、ビオチン化抗体としてはＰＧＣＹ９が最も反応性が高く、次にＧＲＰ−３Ｇ２、ＰＧＣＹ５、ＧＲＰ−２Ｂ１０及びＰＧＣＹ１２であり、ＰＧＣＹ２４及びＧＲＰ−３Ｄ６−２の反応性は確認できなかった。

ＰＧＣＹ２４を固相化した場合、ビオチン化抗体としてはＰＧＣＹ９が中程度の反応性を示したが、他の抗体はほとんど反応性を確認できなかった。

ＧＲＰ−３Ｄ６−２を固相化した場合、ビオチン化抗体としてはＧＲＰ−２Ｂ１０よりも、ＧＲＰ−３Ｇ２、ＰＧＣＹ５、及びＰＧＣＹ１２が若干高い反応性を示した。

ＰＧＣＹ９をビオチン化抗体として用いた場合、固相抗体としてＰＧＣＹ１７が最も高い反応性を示し、次にＧＲＰ−３Ｇ２、その次にＰＧＣＹ２４、ＰＧＣＹ５が高かった。

したがって、固相抗体にＰｒｏＧＲＰ（５５−６８）に結合するＰＧＣＹ９を用い、検出側の抗体である標識抗体にＰｒｏＧＲＰ（４７−５７）に結合するＰＧＣＹ１７やＰＧＣＹ２４を用いる、あるいはその逆の、固相抗体にＰＧＣＹ１７やＰＧＣＹ２４を用い、検出側の抗体である標識抗体にＰＧＣＹ９を用いることで、ＰｒｏＧＲＰ又はその分解物の高感度な測定を行うことが可能である。

本発明の方法は、新たに確認された、検体中でも安定に保存されているＰｒｏＧＲＰのある種の分解物上のエピトープを測定対象とすることによって、従来の測定法と同等の検出感度が得られることに加え、採取後の検体の取扱い方に影響を受けにくくなり、再現性の高い測定値が得られるなど、血中ＰｒｏＧＲＰの検出に有効である。

Claims

配列番号１に示されるアミノ酸配列の４７−６８番目のアミノ酸配列によって提示されるエピトープを認識する２種以上の異なるモノクローナル抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び／又はその分解物を測定する方法であって、
該２種以上の異なるモノクローナル抗体は、少なくとも寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９９１で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ９が産生するモノクローナル抗体、及び、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９９２で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ１７が産生するモノクローナル抗体を含む、
方法。
サンドイッチ免疫測定法である、請求項１に記載の方法。
寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９９１で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ９が産生するモノクローナル抗体。
寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９９２で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ１７が産生するモノクローナル抗体。
寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９９１で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ９。
寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９９２で寄託されたハイブリドーマＧＣＹ１７。
請求項３に記載のモノクローナル抗体、及び請求項４に記載のモノクローナル抗体を含む、ガストリン放出ペプチド前駆体もしくはその分解物を測定するためのキット。
癌の診断又は治療効果のモニタリングを行うためのキットである、請求項７に記載のキット。