CN104177503A - 一种激酶通路相关“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术 - Google Patents
一种激酶通路相关“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种激酶通路相关“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术。该组合式标志物中的多肽具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列,该组合式标志物中的蛋白具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列,该组合式标志物中的多肽位于蛋白的D4和D5功能域。该组合式标志物存在于人体代谢的K-K激酶通路中,其含量和存在形式与肿瘤代谢进程密切相关。本发明还提供了该组合式标志物的检测技术,验证了本发明中的“多肽-蛋白组合式”标志物在6种恶性肿瘤样本中的含量显著高于正常样本。本发明中的组合式标志物能更精确反映样本中标志物的表达情况,具有更高的特异性和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种激酶通路相关“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术。
背景技术
恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一,极大的危害人类的健康,并将成为新世纪人类第一杀手。目前,对肿瘤的治疗方法和手段日渐丰富,肿瘤切除和器官移植仍然是肿瘤患者治疗的主要方法。然而早期肿瘤具有发病隐匿、无明显症状的特点,多数肿瘤患者就诊时已失去手术根治的机会。实现肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低癌症死亡率的重要措施。
目前可用于肿瘤辅助诊断的生物标志物主要包括蛋白质、糖蛋白、激素、受体和RNA分子,主要存在于血清、血浆、尿和组织等生物样本中。机体中的蛋白通过不同酶降解产生的各种大小不一、氨基酸序列不同的蛋白碎片,称为多肽。多肽分子量普遍偏小,可顺畅通过胞膜,由组织或器官进入到血液循环中,未与蛋白完全解离的部分多肽也跟随蛋白一同进入血清中。这些解离或未完全解离的多肽统称为血清多肽。当机体发生病变甚至是癌变时,干扰了正常的蛋白代谢,刺激了酶降解蛋白形成多肽的进程,也打破了血清多肽在机体内存在的平衡。通过血清多肽图谱(血肽图)分析可找出与机体病变相关血清多肽,这些血清多肽就成为了研究某些疾病的潜在标志物,称之为血清多肽标志物,蕴含着丰富的疾病代谢信息。当生理状态发生变化,特别是向肿瘤状态转化时,蛋白代谢发生改变,导致多肽也发生改变,从而形成了“多肽-疾病”关系链,因此血清多肽可进行代谢相关疾病诊断。2006年Villanueva J的研究发现了61种具有癌症特征的肽段标志物和不同蛋白酶活性之间存在着直接关联,认为血清多肽组中蕴含的蛋白质降解模式携带着重要的、具有临床应用价值的肿瘤标志物信息,指出几种肽段模式在临床上有望作为肿瘤的标志物,对前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌的诊断有一定研究意义。从而肯定了多肽标志物在疾病诊断的应用前景。越来越多的研究也证实了多肽用于肿瘤等疾病诊断的临床可行性。
目前,被研究人员所认可的生物标志物多为血清蛋白标志物,也有少量游离型多肽标志物。如通过联检甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)等可显著提高肝癌诊断的阳性率。随着临床应用的深入,常规报道的血清蛋白或多肽标志物及其检测方式逐渐暴露出敏感性不强等共性问题。比如,AFP在辅助诊断肝癌的研究中,敏感性仅为40%~65%,特异性也只有76%~96%不等,尤其对肿瘤直径小于3cm的肝癌早期患者的诊断敏感性及特异性更低,而且在不同肿瘤中均可以检出不同表达水平的某些蛋白标志物,降低了蛋白标志物的可信度,给肿瘤等疾病的临床诊断和评判带来了困惑,限制了蛋白标志物的临床应用。同时,由于单一多肽标志物的分子量通常较小,抗原表位少,免疫原性低,因而增加了制备针对同一多肽不同抗原表位的特异性抗体的难度,也导致了双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附法)难以应用到血清多肽标志物的研究中。
近年来,单一标志物或简单的血清标志物联合检测在肿瘤诊断中的应用研究得到很高的重视。如通过联检甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)可显著提高肝癌诊断的阳性率,但由于各个标志物彼此并无直接关联性,且在多种疾病状态中均可检出,因而诊断特异性不强,同时成本上的数倍增加也限制了这种模式在常规体检中的推广。解决这些问题的关键在于挖掘与肿瘤代谢通路更加密切相关的多肽、蛋白标志物,并开发出相关的高灵敏度检测技术和产品。目前,尚缺乏紧密联系肿瘤代谢通路相关的全新标志物及定量检测技术。
激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system,KKS)中的高分子量激肽原(High MolecμLar Weight Kininogen,缩写为HK)是血浆中的一种糖蛋白,分子量120kDa,该分子可划分为6个结构域(D1-D6)。D1、D2和D3区组成重链;D3后是1个小区段D4,含有缓激肽片段;D5和D6区组成分子的轻链。HK在Lys362-Lys363和Arg371-Ser372之间被激活后,释放D4区缓激肽BK,产生HKa。HKa由含D1、D2和D3的重链和含D5和D6的轻链组成,重链和轻链由1个二硫键连接起来。HK转变为HKa后,发生结构重排、构象变化等使D5区暴露更加明显,D5区是HKa的活性中心,发挥HKa的主要作用,如介导炎症反应、抑制血管内皮细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长与转移等。目前,尚未见将激酶及其降解肽进行组合后作为疾病标志物的相关报道及应用。
发明内容
有鉴于此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种激酶通路相关“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术,该组合式标志物系首次提出的一种全新的,与肿瘤代谢进程紧密联系的激酶通路相关多肽-蛋白组合式标志物,该组合式标志物的定量检测技术,可获取精确的组合式标志物定量检测结果,可用于相关肿瘤的早期诊断,具有更高的特异性。
本发明提供了一种“多肽-蛋白组合式”标志物,其由多肽HKP09、多肽HKP15和蛋白HKa组成;
蛋白HKa为多肽HKP09和多肽HKP15的前体蛋白;
多肽HKP09的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
多肽HKP15的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;
蛋白HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明首先通过对比肿瘤与正常样本之间的血清多肽差异谱,筛选并精确查找到机体病变后异常表达的多肽,然后通过多肽反推到它所对应的前体蛋白,最后找到两者的组合形式,并最终确定“多肽-蛋白组合式”标志物。
本发明提供的“多肽-蛋白组合式”标志物的关键是前体蛋白结构中的特定多肽与对应的游离型的特定多肽序列结构完全一致、免疫特性一致,多肽自然存在于前体蛋白表面,是前体蛋白的一个重要结构域,多肽和蛋白互不干扰各自的免疫学特异性结合位点。本发明提供的“多肽-蛋白组合式”标志物首次将激酶降解的多肽HKP09及HKP15与其前体蛋白HKa进行优化组合,在检测时可同时分析紧密联系的多肽和前体蛋白,而不是完全孤立的去分析蛋白或者多肽。突破“混合式”或单一标志物的局限,最终实现该新型标志物与疾病之间的内在联系。本发明提供的“多肽-蛋白组合式”标志物不同于单一蛋白标志物或者单一多肽标志物,也不能理解为单一多肽和蛋白的简单混合。
作为优选,多肽HKP09或多肽HKP15以酰胺键或二硫键与蛋白HKa相连。
本发明还提供了一种非疾病诊断目的的检测多肽-蛋白组合式标志物的方法,包括:以抗蛋白HKa的抗体为捕获抗体,以抗多肽HKP09和多肽HKP15的抗体为检测抗体,定量检测样本中的多肽-蛋白组合式标志物。
作为优选,定量检测具体为:捕获抗体与蛋白特异性结合,检测抗体与多肽或蛋白特异性结合,形成捕获抗体-蛋白-多肽-检测抗体复合物;根据“捕获抗体-蛋白-多肽-检测抗体”中检测抗体的含量,获得“蛋白-多肽组合式”标志物的含量。
本发明提供的检测方法中包含了两类分别与组合式标志物中的多肽和蛋白特异性结合的抗体,其中,捕获抗体与HKa特异性结合,检测抗体与HKP09或HKP15特异性结合,捕获抗体与检测抗体的抗原表位不同,且多肽和蛋白互不干扰各自的免疫学特异性结合位点,因此,捕获抗体不会与组合式标志物中的多肽特异性结合。通过两种特异性抗体对“多肽-蛋白组合式”标志物进行定量检测,从而更精确的反映样品中标志物的表达情况,具有更高的特异性和准确度。
与多肽特异性结合的检测抗体可先通过多肽偶联制备免疫原,再进行动物免疫和细胞株筛选,与蛋白特异性结合的捕获抗体可通过蛋白直接免疫动物获取单克隆抗体和多克隆抗体。
在一些实施方案中,检测抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
优选的,检测抗体为单克隆抗体。
在一些实施方案中,捕获抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
优选的,捕获抗体为单克隆抗体。
作为优选,定量检测为免疫学方法。
优选的,定量检测为免疫荧光法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、化学发光法或免疫印迹法。
更优选的,定量检测为双抗体夹心ELISA。
在本发明的一些实施方案中,非诊断目的定量检测待测样本中“多肽-蛋白组合式”标志物的双抗体夹心ELISA方法的原理如图1所示,该方法具体包括以下步骤:
步骤1:以与组合式标志物中的蛋白特异性结合的单克隆抗体为捕获抗体;以与组合式标志物中的多肽特异性结合的单克隆抗体为检测抗体;
步骤2:将捕获抗体固定到固相材料表面,加入待测样品或者不同浓度的“多肽-蛋白组合式”标志物的标准品,使捕获抗体捕获待测样品中的“多肽-蛋白组合式”标志物;
步骤3:使检测抗体与捕获的“多肽-蛋白组合式”标志物上的多肽结合;
步骤4:定量检测抗体上的标记物质,从而推导获得“多肽-蛋白组合式”标志物的含量。
本发明提供的方法可直接对检测抗体进行标记,也可通过经标记的抗体与检测抗体结合从而实现定量,本发明对此不作限定,其皆在本发明的保护范围之内。
在一些实施方案中,检测抗体标记生物酶、吖啶酯、荧光素、放射性核素。
作为优选,检测抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)。
在检测抗体上标记辣根过氧化物酶,则定量检测抗体上的标记物质具体为:检测抗体与捕获的“多肽-蛋白组合式”标志物结合后,加入底物显色液,经显色检测OD450值,根据OD450值与不同浓度“多肽-蛋白组合式”标志物标准品的浓度值,计算多肽-前体蛋白标志物的含量。
在一些实施方案中,显色液为TMB显色液或邻苯二胺(OPD)显色液。
本发明提供的“多肽-蛋白组合式”标志物的抗体在制备检测肿瘤相关检测产品中的应用。
优选的,肿瘤为肺癌、胃癌、乳腺癌、食管癌、肠癌或肝癌
本发明提供的方法可用于多种生物样本的检测,本发明对此不做限定,其实施皆在本发明的保护范围之内。
在一些实施方案中,待测物为血浆、血清、尿液或组织。
优选的,待测物为血清。
本发明还提供了一种多肽分子标志物,为多肽HKP09或多肽HKP15,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。
本发明提供的多肽HKP09或HKP15由其前体蛋白HKa代谢产生,并且属于HKa的两个不同功能域,其中,具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽HKP09位于HKa蛋白的D4区,具体位于HKa蛋白的381~389位氨基酸。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽HKP15位于HKa蛋白的D5区,具体位于497~511位氨基酸。HKP09和HKP15均通过免疫共沉淀分析得到。
本发明通过实验证实,具有本发明提供的组合式分子标志物在肿瘤样本中的含量显著(P<0.001)高于正常样本。因此,能够作为肿瘤标志物应用。本发明还提供了“多肽-蛋白组合式”标志物的定量检测技术,由于采用两种特异性抗体,分别与血清中的“多肽-蛋白组合式”标志物的多肽和蛋白特异性结合,从而更精确的反映样品中标志物的表达情况,具有更高的特异性和准确度。以肠癌的检测为例,采用双抗体夹心ELISA的方法检测的特异性和灵敏度均可达到90%以上。
生物保藏说明
保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆抗体杂交瘤细胞3D11于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆抗体杂交瘤细胞2G6于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1示“多肽-蛋白组合式”标志物定量检测技术原理图;其中,示HKa蛋白,示多肽HKP09或HKP15,示抗HKa蛋白抗体,示抗多肽HKP09或HKP15抗体,示标记物质;
图2示“多肽-蛋白组合式”标志物在108例正常人中含量的分布图;
图3示“多肽-蛋白组合式”标志物在正常与不同肿瘤的含量差异分析图;
图4示双抗体夹心ELISA法检测肠癌样品的ROC曲线图;
图5示双抗体夹心ELISA法检测食管癌样品的ROC曲线图;
图6示双抗体夹心ELISA法检测胃癌样品的ROC曲线图;
图7示双抗体夹心ELISA法检测乳腺癌样品的ROC曲线图;
图8示双抗体夹心ELISA法检测肺癌样品的ROC曲线图;
图9示双抗体夹心ELISA法检测肝癌样品的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种激酶通路相关“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
其他试剂或耗材均为普通市售品,皆可于市场购得。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的实施例中“多肽-蛋白组合式”标志物的标准品用从血浆中提取的天然蛋白HKa替代。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:抗多肽HKP09/HKP15抗体的制备
将如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽标志物记为HKP09,将如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列多肽标志物记为HKP15。
1、分别制备HKP15与BSA、HKP09与BSA的偶联物
1)溶液配制:
MES生物偶联缓冲液:0.1mol/L,pH值6.0
多肽溶液:用MES生物偶联缓冲液将多肽HKP09或HKP15配置成浓度为5mg/mL;
载体蛋白溶液:用MES生物偶联缓冲液将载体蛋白BSA配置成浓度为10mg/mL;
偶联剂溶液:用MES生物偶联缓冲液将EDC配置成浓度为10mg/mL;
2)HKP09、HKP15与BSA的偶联物制备
取含5mg多肽的多肽溶液,与含5mg EDC的偶联剂溶液混合,25℃反应5min,再加入含5mg BSA的载体蛋白溶液,25℃中速搅拌偶联12小时。将偶联物转移至截留分子量为12~14kDa的透析袋中,以0.02mol/L,pH值为7.4的PBS缓冲液透析24小时。收集透析后的偶联物,记为HKP09-BSA或HKP15-BSA。采用紫外分光光度法扫描计算偶联比(多肽:蛋白),结果表明:偶联物HKP09-BSA的浓度为1.05mg/mL,偶联物HKP15-BSA的浓度为1.09mg/mL,HKP09与BSA的偶联比为62:1。
2、动物免疫与抗体筛选
取偶联制备的两种多肽免疫原HKP15-BSA、HKP09-BSA各50μg,总免疫抗原含量为100μg,混合均匀后,加入弗氏完全佐剂做乳化处理,免疫Balb/C小鼠。免疫剂量为30μg/只,共进行4次免疫后,取Balb/C小鼠尾血检测免疫血清抗体效价,效价达到1:8000。通过细胞融合,分别采用HKP09和HKP15作为检测抗原,进行阳性杂交瘤细胞株的筛选和克隆,最终筛选出最优的细胞株记为3D11,保藏编号为CGMCC No.9331,于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3、抗多肽HKP09、HKP15抗体的纯化与HRP标记
采用亲和层析法将所制备的抗多肽HKP09、HKP15抗体进行纯化,纯化后抗体的浓度为0.47mg/mL,纯化后的抗体纯度达到95%以上。采用过碘酸钠法对纯化抗体进行HRP标记,标记后抗体浓度为0.9mg/mL,效价为1:4000。
实施例2:抗前体蛋白HKa抗体的制备
取前体蛋白HKa 10μg,加入生理盐水稀释成0.5mL,免疫Balb/c小鼠,共免疫4次,采集免疫血清并检测效价。效价达到1:3200000后,取Balb/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG作用下融合后,通过细胞筛选,获得能与HKa特异结合的单克隆细胞株,记为2G6,保藏编号为CGMCC No.9332,于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
采用亲和层析法将2G6所制备的单克隆抗体进行纯化,纯化后单克隆抗体的浓度为0.66mg/mL,纯化后的抗体纯度达到95%以上。
实施例3:双抗体夹心ELISA法检测“多肽-蛋白组合式”标志物在正常人和6种肿瘤患者血清中的含量
实验设计如表1所示:
表1实验设计
组别 | 样本类别 | 样本数量 |
阴性对照组 | 正常人血清 | 108 |
实验组1 | 临床确诊肝癌患者血清 | 32 |
实验组2 | 临床确诊肺癌患者血清 | 32 |
实验组3 | 临床确诊胃癌患者血清 | 32 |
实验组4 | 临床确诊乳腺癌患者血清 | 32 |
实验组5 | 临床确诊食管癌患者血清 | 32 |
实验组6 | 临床确诊肠癌患者血清 | 32 |
1、试剂准备
96孔酶标板、碳酸盐包被缓冲液(0.5mol/L,pH 9.0)、PBST缓冲液(20mmol/L,pH 7.4)、卵清蛋白封闭剂(2%OVA)、TMB显色液、硫酸终止液(2mol/L);
取本发明实施例1制备的经纯化并经HRP标记的多肽抗体;
取1000ng/mL本发明实施例2制备的经纯化的抗前体蛋白单克隆抗体溶液100μL(以包被缓冲液稀释),置于96孔板中,4℃放置过夜;弃包被后溶液,每孔用PBST缓冲液按300μL/次,清洗5次,拍干;加入300μL 2%OVA,37℃静置封闭2小时;弃封闭后溶液,每孔用PBST缓冲液按300μL/次,清洗5次,拍干,制得包被有捕获抗体的酶标板。
2、实验方法
1)分别取各组待测血清样品,每个血清样品以PBST缓冲液按1:20稀释后,取100μL,加入包被有捕获抗体的酶标板孔内,37℃静置孵育1.5小时;
2)弃孵育后溶液,每孔用PBST缓冲液按300μL/次,清洗5次,拍干;
3)按照100μL/孔,加入以PBST缓冲液稀释的酶标检测抗体,酶标检测抗体稀释比例为1:2000,37℃静置孵育40分钟;
4)弃孵育后溶液,每孔用PBST缓冲液按300μL/次,清洗5次,拍干;
5)按照100μL/孔,加入TMB显色液,37℃避光显色15分钟;
6)按照50μL/孔,加入硫酸终止液,终止反应;
7)用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值(OD450)。
3、各组样本中“多肽-蛋白组合式”标志物的平均含量
根据标准曲线及公式,计算获得各组血清样品中“多肽-蛋白组合式”标志物的平均含量,该含量表示在前体蛋白HKa上多肽标志物HKP15的含量与HKP09的含量之和。结果如表2所示:
表2各组血清样品中多肽-前体蛋白标志物的含量
组别 | 平均含量(ng/mL) | 标准差SD(ng/mL) |
阴性对照组 | 10.9 | 8.8 |
实验组1 | 20.7 | 7.1 |
实验组2 | 36.5 | 14.8 |
实验组3 | 38.1 | 18.4 |
实验组4 | 28.6 | 12.4 |
实验组5 | 32.9 | 9.0 |
实验组6 | 36.1 | 9.1 |
另外,“多肽-蛋白组合式”标志物在108例正常人中含量的分布如图2所示。“多肽-蛋白组合式”标志物在正常与6种不同肿瘤的含量差异性分析如图3所示。
结果显示:108例正常人血清中“多肽-蛋白组合式”标志物的平均含量为10.9mg/mL,标准偏差SD为8.78,以平均值+2SD作为其在正常人群的界定值,含量为28.4ng/mL,依据此界定值作为区分标准,则所检测的108例正常人样本中,有103例的检测值低于28.4ng/mL,与临床阴性符合率为95.37%。
“多肽-蛋白组合式”标志物在肺癌、胃癌、肠癌、食管癌样本中平均含量最高,乳腺癌中含量次之,在肝癌中含量最低。与正常样本相比,各肿瘤样本的标志物含量要显著升高(P<0.001);在各肿瘤样本之间,标志物的含量也呈现显著差异(P<0.001)。可见,采用本发明提供的“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术可以区分正常人与癌症患者,可以作为癌症的检测标志物使用。
实施例4双抗体夹心ELISA检测特异性和灵敏度
根据实施例3提供的双抗体夹心ELISA检测结果,分别绘制各肿瘤患者血清样品的ROC曲线(受试者工作特征曲线),结果表明:
检测肠癌和正常样本的诊断特异性、灵敏度均在90%以上,如图4;
检测食管癌和正常样本的诊断特异性为86.2%,灵敏度为93.75,如图5;
检测胃癌和正常样本的诊断特异性为86.2%,灵敏度为84.4%,如图6;
检测乳腺癌和正常样本的诊断特异性为83.5%,灵敏度为81.2%,如图7;
检测肺癌和正常样本的诊断特异性为95.4%,灵敏度为75.0%,如图8;
检测肝癌和正常样本的诊断特异性为66.1%,灵敏度为96.9%,如图9。
综合结果表明,本发明所提供的“多肽-蛋白组合式”标志物及定量检测技术能够显著区分6种肿瘤样本(肠癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌)和正常人样本,检测灵敏度和特异性高。
与正常样本相比,各肿瘤样本的标志物含量要显著升高(P<0.001);在各肿瘤样本之间,标志物的含量也呈现显著差异(P<0.001)。可见,采用本发明提供的多肽-前体蛋白标志物可以区分正常人与癌症患者,可以作为癌症的检测标志物使用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种“多肽-蛋白组合式”标志物,其特征在于,由多肽HKP09、多肽HKP15和蛋白HKa组成;
所述蛋白HKa为多肽HKP09和多肽HKP15的前体蛋白;
所述多肽HKP09的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述多肽HKP15的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;
所述蛋白HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的“多肽-蛋白组合式”标志物,其特征在于,所述多肽HKP09或多肽HKP15以酰胺键或二硫键与所述蛋白HKa相连。
3.一种非疾病诊断目的检测权利要求1~2任一项所述“多肽-蛋白组合式”标志物的方法,其特征在于,包括:以抗蛋白HKa的抗体为捕获抗体,以抗多肽HKP09和多肽HKP15的抗体为检测抗体,定量检测样本中的“多肽-蛋白组合式”标志物。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述定量检测具体为:所述捕获抗体与所述蛋白特异性结合,所述检测抗体与所述多肽或蛋白均能特异性结合,通过检测形成的“捕获抗体-蛋白-多肽-检测抗体”复合物,获得样本中的“多肽-蛋白组合式”标志物的含量。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述定量检测为免疫学方法;优选的,所述定量检测为免疫荧光法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、化学发光法或免疫印迹法;更优选的,所述定量检测为双抗体夹心ELISA。
6.根据权利要求3~5任一项所述的方法,其特征在于,所述检测抗体为多克隆抗体或单克隆抗体,优选的为单克隆抗体;所述捕获抗体为多克隆抗体或单克隆抗体,优选的为单克隆抗体。
7.根据权利要求3~6任一项所述的方法,其特征在于,所述检测抗体标记生物酶、吖啶酯、荧光素、放射性核素,优选的,检测抗体标记HRP酶。
8.权利要求1~2任一项所述的“多肽-蛋白组合式”标志物的抗体在制备肿瘤相关检测产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为肺癌、胃癌、乳腺癌、食管癌、肠癌或肝癌。
10.一种多肽分子标志物,为多肽HKP09或多肽HKP15,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。
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