CN111961213B - 一种序列可控的超分子聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种序列可控的超分子聚合物的制备方法，包括：将具有聚集诱导发光特性的客体分子与CB[8]结合，生成三元络合物；将三元络合物作为单体进一步自分类聚合而获得序列可控的超分子聚合物。本发明通过结构简单的客体分子与CB[8]分子的主客体相互作用就能形成序列可控的超分子聚合物；生成的序列可控的荧光超分子聚合物可用于尿液中的毒品检测，能检测人工尿液中的吗啡，具有较好的稳定性、灵敏度和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及聚集诱导发光技术领域，特别地，涉及一种利用聚集诱导发光技术观察超分子聚合以及利用聚集诱导发光分子(AIEgen)与葫芦脲8(CB[8])制备序列可控的超分子聚合物的方法；还涉及将超分子聚合物作为分子探针区分吗啡和海洛因这两种结构相似毒品的检测方法；以及利用超分子聚合物检测人造尿液中的吗啡的应用。
背景技术
序列控制在生物体系中起着重要作用，是生命关键特征的先决条件。例如，由腺嘌呤-胸腺嘧啶(AT)和鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)碱基对自分类而形成的DNA双螺旋序列是遗传信息存储、复制、转录、表达和遗传的分子基础。碱基对发生错误可导致严重的遗传疾病。然而，自然界已经发展出复杂的纠错机制，以确保高保真的DNA序列。最基本的方法是DNA模板控制DNA序列，DNA聚合酶检查每个碱基，一旦检测到添加了错误的碱基，它将立即去除错误的碱基而替换成正确的碱基。蛋白质的合成依赖于mRNA和tRNA来精确控制20个氨基酸的序列。一旦发生错误，酶会解离错误的氨基酸并加上正确的氨基酸。
具有可控单体序列的合成聚合物具有许多科学和技术上的重要性，包括数据存储、纳米电子学和催化作用。然而，共价聚合的序列控制远非易事。制备序列控制的聚合物最显著的方法是通过迭代化学逐个连接单体。例如，使用固相载体合成寡肽。然而，它仍然是一个繁琐的过程，需要非常高的反应产率和重复的纯化步骤以消除具有错误结构的杂质。近年来，超分子聚合物引起了人们极大的兴趣。因为将它们结合在一起的非共价相互作用赋予了材料动态、可逆和可降解的特性。尽管超分子聚合物领域在过去二十年中发展迅速，取得了令人瞩目的成就。但是仍有很大的改进空间。序列控制也是超分子聚合的巨大挑战。超分子聚合最常用的方法是使用设计好的超分子单体制备一种结构简单而明确的聚合物，例如，主体AA与单体BB、主体与单体AB、或主体与单体ABBA形成(-AB-BA-)n型超分子聚合物，以及主体分子与单体BB形成(-BB-)n型超分子聚合物。为了使人造超分子聚合物与天然生物大分子一样复杂，必须使用多组分单体制备自分类超分子聚合物。自分类是一种自组装过程，分子在复杂混合物中能与其配对物选择性和特异性地形成复合物。目前，制备自分类超分子聚合物的方法主要是利用人造大环的尺寸大小来制备。据我们所知，很少有研究仅利用客体分子的特性而不是人造大环的尺寸就制备出具有自分类序列控制超分子聚合物。
尿液药物测试经常用于临床、就业、教育和法律环境。尿液药物测试的目的是监测对处方治疗的依从性，并检测非处方和非法物质的使用，特别是海洛因、非处方阿片类药物和苯二氮卓类药物，所有这些药物都会增加致命性过量剂量的风险。传统的色谱技术，例如，质谱、拉曼、FTIR非常耗时、昂贵，不适用于现场检测，还需要许多清理步骤和训练有素的技术人员。然而荧光检测方法非常简单、快速、灵敏、方便携带，能实现现场检测。海洛因和吗啡是众所周知的麻醉药，属于一类被称为阿片类药物的药物，吸食他们经常发生意外过量和致命中毒。事实上，海洛因是最常见的含有可卡因的共同滥用药物之一，其滥用程度仅次于乙醇。海洛因共享吗啡的核心结构，只在吗啡的基础上添加了两个乙酰基。摄入后，海洛因脱乙酰化为单乙酰吗啡(6MAM)，然后转化为吗啡，然后代谢为吗啡-3-葡糖苷酸(M-3-G)和吗啡-6-葡糖苷酸(M-6-G)，最后是去甲吗啡。吗啡是海洛因和可待因的主要代谢产物。在尿液中，海洛因和6MAM的检测窗口只有数小时，而吗啡能持续数天后，相比之下，尿液中排出的吗啡已被用作海洛因可能滥用的特定标志物。因此，尿液中存在吗啡表明在2至3天内可能接触吗啡、海洛因或可待因。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种序列可控的超分子聚合物及其制备方法，以及将该超分子聚合物作为分子探针检测人造尿液中的吗啡并区分吗啡和海洛因这两种结构相似毒品的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种序列可控的超分子聚合物的制备方法，包括：
将具有聚集诱导发光特性的客体分子与CB[8]结合，生成三元络合物；
将所述三元络合物作为单体进一步自分类聚合而获得序列可控的超分子聚合物。
优选地，通过1-甲基-4-苯基-吡啶盐和/或4-苯基-1,1-二甲基哌嗪盐生成所述客体分子。所述客体分子具有如下所示的结构：
X为Br-、I-、PF6 -中的任意一种。
另一方面，本发明还提供一种根据上述制备方法制备的超分子聚合物，所述超分子具有物具有如下所示的结构：
其中，n为正整数。
另一方面，本发明还提供一种利用如上所述的超分子聚合物制备的荧光探针，所述荧光探针随着运动受限的程度能发射不同程度增强的荧光。
另一方面，本发明还提供一种利用如上所述的超分子聚合物在毒品检测中的应用，通过采用荧光指示剂置换的方法来测试毒品与CB[8]的解离常数以实现毒品的检测。
另一方面，本发明还提供一种如上所述的超分子聚合物在区分吗啡和海洛因中的应用，所述超分子聚合物的结合常数处于吗啡和海洛因与CB[8]的结合常数之间。
实施本发明可以达到以下有益效果：本发明通过结构简单的客体分子与CB[8]分子的主客体相互作用就能形成序列可控的超分子聚合物；生成的序列可控的荧光超分子聚合物可用于尿液中的毒品检测，能检测人工尿液中的吗啡，具有较好的稳定性、灵敏度和准确性。
附图说明
图1示出了通过核磁滴定来研究本发明的超分子聚合的过程：(a)通过1HNMR监测将CB[8]逐渐滴定到0.8mM CSPP中的过程，(b)示意图反映了滴定中涉及的动态过程。；
图2示出了核欧佛豪瑟效应频谱图(2D NOESY)来研究CSPP-CB[8]在D2O中的络合。(a)不同三元络合物之间的快速内转换示意图以及部分NOESY谱图，以此推导出当CB[8]与CSPP的比率为0.5时，空腔内客体分子之间的堆积结构；(b)显示三元络合物和超分子聚合物之间缓慢交换的示意图，以及推测的聚合物序列的错误校正。含有0.75eq.CB[8]和0.95eq.CB[8]的CSPP溶液的部分NOESY谱图，表明了在三元络合物和超分子聚合物中客体之间的分子堆积情况；(c)当CB[8]与CSPP的比率为1.0时超分子聚合物的示意图，部分NOESY谱图和超分子聚合物中客体分子之间的可能分子堆积。CSPP的浓度为0.8mM。NOE相关关系以紫色标记，交换介导的NOE相关性以蓝色标记，化学交换以红色标记；
图3示出了CSPP-CB[8](1:0.5)络合物的D2O溶液在制备12小时后的二维相关谱图(2D COSY)(400MHz，295K)。它显示出COSY信号：Hb'-Hc'，Hd'-He'，Hg'-Hh'，Hi'-Hj'，Hx'-Hy'。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O；
图4示出了CSPP-CB[8](1:0.5)络合物的D2O溶液在制备12小时后的2DNOESY谱图(400MHz，295K)，显示了1H-1H空间相关(Hy'-Ha'，Hc'-He'，Hb'-He'，Hd'-Hf'，Hc'-Hg'，Hh'-Hi'，Hh'-Hj'，Ha'-Hb'，Hb'-Hc'，Hg'-Hh'，Hd'-He'，Hk'-Hj')。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。分子堆积产生的空间相关标记为紫色；
图5示出了CSPP-CB[8](1:0.5)络合物的D2O溶液在制备一天后的旋转系统欧佛豪瑟效应频谱图(2D ROESY)(400MHz，295K)，显示了1H-1H空间相关(Hc'-He'，Hd'-Hf'，Hh'-Hi'，Hh'-Hj'，Ha'-Hb'，Hb'-Hc'，Hg'-Hh'，Hk'-Hi'，Hk'-Hj')，化学交换信号(Ha'-Ha”)和交换介导的NOE相关性(Hb'-He”，Hk'-Ha”)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇。NOE相关性标记为紫色；
图6示出了CSPP-CB[8](1:0.75)络合物的D2O溶液在制备12小时后的2D COSY谱图(400MHz，295K)。它显示出COSY信号：Hb'-Hc'，Hd'-He'，Hg'-Hh'，Hi'-Hj'。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇；
图7示出了CSPP-CB[8](1:0.75)络合物的D2O溶液在制备2小时后的2DNOESY谱图(400MHz，295K)，显示1H-1H空间相关(Hh'-Hi'，Hh”-Hi”，Hh'-Hj'，Hh”-Hj”，Hc'-He'，Hd'-Hf'，Hc'-Hg'，Hk”-Ha”)，化学交换信号(Ha'-Ha”，Hc'-Hc”，Hd'-Hd”，Hh'-Hh”)和交换介导的NOE相关性(Hb'-He”，Hc”-He'，Hb”-Hd'，Hd'-Hf”，Hc'-Hg”)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇。NOE相关性以紫色标记，交换介导的NOE相关性以蓝色标记，化学交换以红色标记；
图8示出了CSPP-CB[8](1:0.75)络合物的D2O溶液在制备12小时后的2D ROESY谱图(400MHz，295K)，显示1H-1H空间相关(Hh'-Hi'，Hh”-Hi”，Hh'-Hj'，Hh”-Hj”，Hc'-He'，Hd'-Hf')，化学交换信号(Ha'-Ha”，Hc'-Hc”，Hd'-Hd”，Hf'-Hf”，Hh'-Hh”，Hg'-Hg”)和交换介导的NOE相关性(Hb'-He”，Hc”-He'，Hb”-Hd'，Hd'-Hf”)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇。NOE相关性以紫色标记，交换介导的NOE相关性以蓝色标记，化学交换以红色标记；
图9示出了CSPP-CB[8](1:0.95)络合物的D2O溶液在制备2小时后的2DNOESY谱图(400MHz，295K)，显示1H-1H空间相关(Hh'-Hi'，Hh”-Hi”，Hh”-Hj”，Hc'-He'，Hk”-Ha”)，化学交换信号(Ha'-Ha”，Hc'-Hc”，Hd'-Hd”，Hg'-Hg”，Hh'-Hh”)和交换介导的NOE相关性(Hb'-He”，Hc”-He'，Hb”-Hd'，Hg'-Hh”)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇。NOE相关性以紫色标记，交换介导的NOE相关性以蓝色标记，化学交换以红色标记；
图10示出了CSPP-CB[8](1:0.95)络合物的D2O溶液在制备12小时后的2D ROESY谱图(400MHz，295K)，显示1H-1H空间相关(Hh'-Hi'，Hh”-Hi”，Hh”-Hj”)，化学交换信号(Ha'-Ha”，Hc'-Hc”，Hd'-Hd”，Hf'-Hf”，Hh'-Hh”，Hg'-Hg”)和交换介导的NOE相关性(Hb'-He”，Hc”-He'，Hb”-Hd'，Hk'-Ha”)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇。NOE相关性以紫色标记，交换介导的NOE相关性以蓝色标记，化学交换以红色标记；
图11示出了CSPP-CB[8](1:1)络合物的D2O溶液在制备12小时后的2DCOSY谱图(400MHz，295K)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇；
图12示出了CSPP-CB[8](1:1)络合物的D2O溶液在制备12小时后的2DNOESY谱图(400MHz，295K)，显示1H-1H空间相关(Hb”-Hd”,Hc”-He”,Hh”-Hj”,Hh”-Hi”,Hk”-Ha”)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇。分子堆积产生的空间相关性标记为紫色；
图13示出了CSPP-CB[8](1:1)络合物的D2O溶液在制备一天后的2DROESY谱图(400MHz，295K)。CSPP的浓度为0.8mM。#指D2O。*指乙醇；
图14示出了0.8mM CSPP的D2O溶液的2D COSY谱图(400MHz，295K)的。它显示出COSY信号：Hb-Hc，Hd-He，Hg-Hh，Hi-Hj，Hx-Hy。#指D2O；
图15示出了0.8mM CSPP的D2O溶液的2D NOESY谱图(400MHz，295K)，显示1H-1H空间相关(Hd-Hg，Hf-Hg，Hk-Hj，Hi-Hj)。Hd-Hg的空间相关表示两个CSPP分子的头尾排列。#指D2O。；
图16示出了0.8mM CSPP的D2O溶液的2D ROESY谱图(400MHz，295K)，显示1H-1H空间相关(Ha-Hb,Hb-Hc,Hc-Hd,Hg-Hh,Hh-Hi,Hk-Hi,Hk-Hj)和COSY信号(Hi-Hj)。#指D2O；
图17示出了CSPP-CB[8]寡聚体的分子模拟，其中CB[8]的颜色以浅红色显示。这里使用Gaussian 09包中的通用力场来优化几何形状；
图18示出了1H NMR研究CB[8]滴定1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)。MPP的浓度为2mM。新形成的MPP-CB[8]络合物在D2O中完全聚集，因此未显示其1H NMR信号；
图19示出了1H NMR研究CB[8]滴定(4-甲酰基苯基)-1,1-二甲基哌嗪(FPDP)。FPDP的浓度为2mM。
图20示出了FPDP:CB[8]＝1：0.5在D2O中溶液的2D COSY谱图(400MHz，293K)。FPDP的浓度为2mM。
图21示出了FPDP:CB[8]＝1：0.5在D2O中溶液的2D NOESY谱图(400MHz，293K)。FPDP的浓度为2mM。
图22示出了1H NMR研究CB[8]滴定以1:1比例共混的MPP和FPDP混合物。FPDP和MPP的浓度均为2.4mM。当CB[8]比率低于0.42当量时，CB[8]主要与MPP形成AA型三元络合物，其在D2O中完全聚集，因此未显示其1HNMR信号。当CB[8]比率高于0.5当量时，BB型和AB型三元络合物同时形成。当加入1.0eq.CB[8]时，三种三元络合物的百分比分别为45％AA，46％BB和9％AB。
图23示出了MPP:FPDP:CB[8]＝1:1:0.8在D2O中溶液的2D COSY谱图(400MHz，293K)。FPDP和MPP的浓度均为2.4mM。
图24示出了MPP:FPDP:CB[8]＝1:1:0.8在D2O中溶液的2D NOESY谱图(400MHz，293K)。FPDP和MPP的浓度均为2.4mM。
图25示出了比例为1:1的MPP和FPDP混合物与CB[8]形成络合物的示意图。测试了MPP:FPDP:CB[8]＝1:1:0.8络合物的2D NOESY谱图，并列出了部分提取的2D NOESY谱图。基于NOE相关性和交换介导的NOE相关性，提出了CB[8]腔内客体分子的堆积情况。
图26示出了(a)MPP:FPDP＝1:1混合物在D2O中的1H NMR谱图(400MHz，293K)。加入0.5eq.DMSO作为内标以进行定量分析。(b)0.8eq.CB[8]加入到MPP:FPDP＝1:1混合物之后的1H NMR谱图。根据积分结果计算出三种三元络合物与CB[8]的比例分别为53.4％AA，39.8％BB和6.8％AB。FPDP和MPP的浓度均为2.4mM。*指DMSO。
图27示出了MPP(1mM)和FPDP(1mM)的水溶液在298K滴定CB[8]水溶液(0.05mM)的ITC曲线。
图28示出了MPP和FPDP(各0.5mM)的混合物水溶液滴定CB[8]水溶液(0.05mM)的ITC曲线。
图29示出了0.2mM CB[8]的水溶液在298K滴定CSPP(10μM)的ITC曲线。
图30示出了(a)在CSPP(10μM)的水溶液中逐渐增加CB[8]时的紫外-可见吸收光谱和(b)荧光发射光谱。λex＝405nm。随着CB[8]比例的增加，(c)最大吸收波长的变化和(d)在615nm处的PL强度的变化；d图内部插入的荧光图像是CSPP-CB[8]超分子聚合物的自组装结构(10μM，1:1摩尔比)。
图31示出了(a)CSPP:CB[8]＝1:1的水溶液在不同的低浓度时的荧光变化，其显示出临界超分子聚合浓度。(b)通过动态光散射测量超分子聚合物(CSPP:CB[8]＝1:1)在不同浓度时的水合动力学直径。
图32示出了(a)用于药物检测的荧光指示剂置换方法的示意图。在此，以吗啡作为实例。(b)当加入吗啡或海洛因来竞争CB[8]时，CSPP-CB[8]络合物在615nm处的相对荧光强度变化。通过荧光法测定了吗啡和海洛因与CB[8]的结合常数。(c)在含有10％人造尿液中，吗啡检测的校准曲线；(d)表格列出了定量测定在含有10％人造尿液中掺入的吗啡的浓度(n＝3)。通过测定人造尿液中掺入的目标吗啡的回收率来研究该方法在复杂生物体系中的实际应用。CSPP和CB[8]的浓度均为10μM。
图33示出了当吗啡竞争CB[8]时，10μM CSPP-CB[8]1:1络合物的PL光谱以及在615nm处的相对荧光强度变化。从拟合曲线中，可以获得斜率变化最大时的吗啡浓度(3.9μM)，即是KL2,app。然后根据Adrian Velazquez-Campoy’s method KL2＝KL2,app/(1+[L1]/KL1)计算出KL2为0.34μM。
图34示出了当海洛因竞争CB[8]时，10μM CSPP-CB[8]1:1络合物的PL光谱以及在615nm处的相对荧光强度变化。从拟合曲线中，可以获得斜率变化最大时的海洛因浓度(128.6μM)，即是KL2,app。因此计算出KL2为11.23μM。
图35示出了将20μM吗啡加入到含有不同干扰物质的10μM CSPP-CB[8]1：1溶液之后，探针在615nm处相对荧光强度的变化。其中干扰物质有10mM PBS(pH7.4)，0.5M尿素，0.5mg/mL尿酸，25％人造尿液，10mM肌酐，0.5mg/mL BSA。I0是加入吗啡前样品的荧光发射强度。I是加入吗啡后样品的荧光发射强度。
图36示出了生物样品(10％v FBS，100％v FBS和10mg/ml BSA)和10μM CSPP-CB[8]1:1络合物的荧光发射。激发波长是405nm。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本说明书中记载的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
共价聚合制备序列可控的聚合物远非易事。共价聚合通过迭代化学逐个连接单体，这是一个繁琐的过程，需要非常高的反应产率和重复的纯化步骤以消除具有错误结构的杂质。相比于共价聚合，超分子聚合具有动态可逆的特性。但是序列控制也是超分子聚合的巨大挑战。为了使人造超分子聚合物与天然生物大分子一样复杂，必须使用多组分单体制备自分类超分子聚合物。但是目前制备自分类超分子聚合物的方法主要是利用人造大环的尺寸大小来制备。本发明就该技术问题而提出的技术思路是：利用客体分子的特性来制备出具有自分类序列控制超分子聚合物。即设计了两头都能选择性与CB[8]结合的客体分子结构。在热动力学上，相同一边更容易同时结合在CB[8]空腔内，而不同边结合在CB[8]空腔内是不稳定的，随着聚合物的增长，不稳定的单元转变成稳定的单元。另外，本发明采用聚集诱导发光行为克服了荧光物质分子容易猝灭的问题。具有聚集诱导发光性质的分子在单分散时不发光，而在组装后随着其运动受限的程度能发射不同程度增强的荧光。利用AIEgen的发光特性，本发明捕捉到超分子聚合的两个阶段结构的变化。并且，此超分子聚合物发射红色荧光，与以往大多数发射蓝色、绿色荧光的CB[8]络合物相比，本发明能减少生物体系蛋白质自发荧光的影响。本发明实现了人造尿液中吗啡的检测，具有较好的检测灵敏度和准确性。本发明在含有电解质的溶液中具有较好的稳定性，并且能实现在低浓度情况下区分吗啡和海洛因这两个结构非常相似的鸦片类毒品。
本发明提供了一种序列可控的超分子聚合物的制备方法，包括：
将具有聚集诱导发光特性的客体分子与CB[8]结合，生成三元络合物；
将所述三元络合物作为单体进一步自分类聚合而获得序列可控的超分子聚合物。
本发明通过碳碳双键将1-甲基-4-苯基-吡啶盐(称作基团A)和4-苯基-1,1-二甲基哌嗪盐(称作基团B)连接起来。获得以下化学结构：
其中，X是I-。其名称简化为CSPP。
利用A和B这两个基团与CB[8]选择性结合的方式，即首先形成多种三元络合物，然后三元络合物作为单体进一步自分类聚合而获得(-AA-BB-)n序列的超分子聚合物，如下图所示。n为正整数。
CB[8]的结构如下：
进一步地，本发明通过核磁滴定和二维核磁谱图研究了超分子聚合过程，表征清楚了三元络合物单体，以及超分子聚合物的结构和分子排列。利用模型分子的ITC滴定证明了超分子序列自分类的原因是动态可逆过程和热动力学稳定性控制了最终超分子聚合物的序列结构。并且利用AIEgen的发光特性研究了超分子聚合的过程。而且超分子聚合物的扩散系数测试，水合动力学直径的研究，以及超分子自组装进一步证明了超分子聚合物的形成。将此超分子聚合物作为分子探针实现了人造尿液中吗啡的检测，以及区分吗啡和海洛因这两种结构相似的鸦片类毒品。
1.核磁滴定和二维核磁研究超分子聚合过程
如图1所示，采用1H NMR研究了CB[8]滴定CSPP的情况。随着CB[8]的加入，只出现了一组新的尖锐的氢峰，所有共轭结构上的质子(从Hb'到Hh')都向高场移动，位移大约0.5ppm左右(表1)。而吡啶上的甲基氢Ha'向高场移动一点(0.12ppm，表1)，说明其被包裹在CB[8]端口附近。哌嗪上的氢Hi'，Hj'和Hk'都向低场移动了一点(小于0.1ppm，表1)，说明他们在CB[8]端口外围附近。在加入0.55eq.CB[8]时，自由CSPP的氢峰完全消失，说明这个时候体系全部是两个客体分子穿入到一个CB[8]空腔的三元络合物结构。综合这些情况，我们推测CSPP与CB[8]形成的各种三元络合物结构可以互相转换，形成分子梭。即CB[8]在客体分子上进行穿梭运动，以及两个客体分子之间不同重叠构象的高频分子内转化，这些运动都非常快，超过了核磁仪器的分辨率而不能被区分。从而导致CB[8]的核磁位移是平均了的信号(没有裂分)，三元络合物的客体分子也是平均了的信号。向CSPP中加入0.55eq.CB[8]时的2D COSY证明了三元络合物各个峰的归属(图3)。而2D NOESY(图4)和2D ROESY(图5)证明了CB[8]空腔内部两个客体分子的排列方式。我们发现了主客体结合的NOE信号Hy'-Ha'(图2a)，以及两个客体分子之间的NOE信号(图2a)：Hb'-He'，Hc'-He'，Hc'-Hg'，Hd'-Hf'，Hh'-Hi'和负的ROE信号(图5)：Hc'-He'，Hd'-Hf'，Hh'-Hi'。这些数据证明了在CB[8]空腔的两个客体分子的分子梭排列结构：AA，BB和AB1(图2a)。另外我们发现纯CSPP具有Hd-Hg的NOE信号(图14-图16)，说明纯的CSPP溶液中具有类似AB1中两个客体分子排列方式的二聚体结构。进而从侧面证明AB1是一种比较常见的排列方式。
继续滴加CB[8]，原来的三元络合物的核磁峰继续存在，但是又出现了一组新的很宽的峰(图1)。当CB[8]含量达到1.0eq.的时候，客体分子只剩下一组很宽很弱的峰，这是来自超分子聚合物的信号。我们测试了加入0.75eq.CB[8]的2D COSY，2D NOESY和2D ROESY。2D ROESY图谱显示了很强的化学交换信号(与对角线上自耦合符号相同)：Hc”-Hc'，Hd”-Hd'，Hf”-Hf'，Hg”-Hg',Hh”-Hh',Ha”-Ha'(图8)。这些信息不仅说明体系存在三元络合物与超分子聚合物的化学交换，而且还能帮助指定新生聚合物对应氢的位置。核磁滴定结果显示(图1)，聚合物的Ha”向高场移动很多，相对于自由客体分子移动了1.11ppm(表1)。Hb”,Hg”和Hh”也进一步向高场移动，相对于自由客体分子分别移动了0.78,1.1和0.65ppm(表1)。说明客体分子的这一部分基团被CB[8]包裹在空腔深处。我们又测试了1.0eq.CB[8]时的2D NOESY，图谱显示了Hb”-Hd”,Hc”-He”,Hh”-Hj”,Hh”-Hi”,Hk”-Ha”的NOE信号(图2c和图12)。Hk”与Ha”的空间相关证明两者的距离在
以内。说明客体分子以头尾相碰的方式依次排列，并被CB[8]连接成超分子聚合物。其它NOE信号说明超分子聚合物结构中具有AA和BB的排列方式，但是没有AB的排列方式(图2c和图12)。AA具有两种排列方式，其中一种排列方式与三元络合物中的AA一样(Hc”-He”的NOE信号)。与第一种排列方式相比，第二种AA排列中的一个A分子向空腔内部移动，直到Ha”和Hb”被CB[8]完全包裹(Hb”-Hd”的NOE信号)。这种排列方式正好与Ha”和Hb”核磁峰进一步向高场移动很多的结果相一致。另外，我们通过分子模拟得到超分子聚合物可能的能量最低排列方式(图17)。模拟出的AA型排列方式正好与根据核磁位移和2D NOESY推断出的第二种AA排列结果一致。可能因为超分子聚合物太刚性，部分AA排列稍微分开两个客体分子之间的距离来减少排斥力，所以实际上具有两种AA排列方式。分子模拟出的BB排列方式正好与根据NOE信号证明的排列方式一致。因此，我们推测出超分子聚合物的可能结构如图2c所示。
表1列出了在CB[8]滴定过程时CSPP中氢的化学位移：
2.核磁研究超分子聚合过程中的动态自分类
当CB[8]含量在0.55-1.0eq.之间时，混合体系同时存在三元络合物和超分子聚合物。在0.75eq.CB[8]的2D NOESY图谱上(图2b和图7)，不仅能看到三元络合物体系中的三种排列方式(Hc'-He',Hc'-g',Hd'-Hf',Hh'-Hi',Hh'-Hj')，而且也发现交换介导的NOE相关信号(Hb'-He”,Hc”-He',Hb”-Hd',Hd'-Hf”,Hc'-Hg”)。另外，也发现了超分子聚合物中BB单元的信号Hh”-Hi”,Hh”-Hj”。以三元络合物为单体形成超分子聚合物的时候，AB1不能直接形成超分子聚合物，而是转变成AA和BB，两者作为超分子聚合的单体。AA与BB两种单体形成超分子聚合物从理论上讲是随机结合的，可以形成三种聚合物序列，包括自恋型自分类序列，社交型自分类序列和非绝对自分类序列(前面两种自分类共混的情况)，如图2b所示。当比较CSPP-0.75eq.CB[8]与CSPP-0.95eq.CB[8]的2D NOESY图谱时，我们发现Hc'-Hg'，Hc'-Hg”，Hd'-Hf'和Hd'-Hf”这些相关信号出现在前一个图谱中，但在后一个图谱中消失了(图2b，图7和图9)。这些信号的消失主要是由聚合诱导的AB1三元络合物的减少引起的。然而，在这些信号中，交换介导的NOE相关信号Hc'-Hg”可能来自两种方式：第一，源自三元络合物单体聚合后在聚合物链中新形成的AB2单元(即聚合物链中的误差，如图2b)；第二，聚合物单元解离的络合物进一步进行穿梭运动后，重新形成的AB1三元络合物(图2b)。因此，Hc'-Hg'相关性的消失可能表明在一定程度上发生了聚合物链中错误的校正。
3.探索超分子聚合动态自分类的原因
为了充分了解A与B在CB[8]空腔中的排列方式，我们制备了两个模型分子，1-甲基-4-苯基吡啶碘盐(MPP)作为A；4-(4-甲酰基苯基)-1,1-二甲基哌嗪碘盐(FDPP)作为B，同过核磁滴定和二维核磁来分别研究他们与CB[8]的结合情况(从图18到图26)。当0.8eq.CB[8]加入到两个模型分子以1：1物理共混体系时，混合物中含有53.4％AA,39.8％BB和6.8％AB。其2D NOESY谱图中的NOE信号和化学交换介导的NOE信号证明了混合体系具有AA，BB以及两种AB的排列方式(如图25所示)，这些是统计意义上都会发生的情况，但是AB的含量远少于AA和BB的含量。
然后，我们试图了解自分类体系的热力动力学。于是我们分析了模型化合物滴定CB[8]的ITC数据(图27，图28和表2)。在298K时，AA模型的结合常数为1.15×1012M-2(ΔG＝-68.84kJ/mol)，BB模型中的结合常数为1.37×1012M-2(ΔG＝-69.29kJ/mol)，对于A和B的1:1混合物(含有AA，BB和两种AB模型络合物)，其表观结合常数为7.78×108M-2(ΔG＝-50.77kJ/mol)。因此，三种基于CB[8]的模型三元络合物在水中的热力学稳定性的排序是BB≈AA>>AB。显然，AB是热力学不稳定的。因此，我们可以推测随着超分子聚合物分子量的增加，伴随着聚合物刚性的增加，聚合物链将在相对弱的AB2单元处断裂。断开的地方成为链末端或者重新聚合形成超分子聚合物的AA和BB单元(参见图2b中的方案图)。结果，通过动态超分子断开和结合，热力学校正了聚合过程中的组装错误，从而巧妙地实现了超分子聚合物的序列控制。
表2使用模型化合物滴定CB[8]时，从ITC实验获得的吉布斯自由能变化以及结合常数：
[a]当只有一个客体分子进入CB[8]空腔时吉布斯自由能的变化。[b]当第二个客体分子进入一个客体分子-CB[8]络合物的腔内时吉布斯自由能的变化。[c]两个客体分子被包裹在CB[8]空腔时的结合常数。
4.利用AIEgen的发光性质来观察超分子的聚合过程
使用UV-vis和荧光光谱研究了CB[8]滴定CSPP的超分子聚合过程(图30)。随着CB[8]分子比例的增加，吸收波长从387nm逐渐红移到417nm，最后在1.3比例之后保持不变。这是因为超分子聚合增加了电子共轭，所以吸收波长红移直到聚合物完全形成。而荧光光谱显示，随着CB[8]分子比例的增加，荧光强度逐渐增强，但是出现两个拐点。第一个拐点在0.5附近，即形成CSPP与CB[8]的三元络合物。这个时候的分子梭运动导致AIEgen的运动受限程度比较小。而在加入0.5eq.CB[8]之后，开始形成超分子聚合物，AIEgen的两头都被CB[8]包裹，分子运动受到极大限制，导致荧光极大增强。超分子聚合物形成前后荧光发射波长的变化比较小，仅仅从纯CSPP的622nm蓝移到超分子聚合物的615nm。可能是因为超分子聚合延长了电子共轭使发射红移；同时客体分子被CB[8]疏水空腔包裹使发射蓝移。两种因素引起的发射波长变化在发射波峰很宽的情况下表现不明显。
5.其它实验证明超分子聚合
在图30d中插入的荧光图片是CSPP与CB[8]比率为1:1时的超分子自组装结构。自组装体是细的纤维平行粘附在一起形成片状自组装结构，这一现象从侧面说明CSPP与CB[8]形成了超分子聚合物。另外，我们利用PL荧光测试了临界超分子聚合的浓度是2.8μM(图31a)。利用DLS测试了1:1比率CSPP与CB[8]在不同浓度时的水合直径(图31b)。结果显示随着超分子聚合物浓度的增强，水合直径逐渐增大，在200μM之后达到平衡，粒径达到1μm左右，证明形成了高分子量的聚合物聚集体。DOSY实验(表3)显示与纯CSPP(3.79×10-10m2 s-1)和三元络合物(2.64×10-10m2 s-1)相比，超分子聚合物的扩散系数变小(1.93×10-10m2s-1)，说明因为发生超分子聚合而导致粒径变大。采用静态光散射，我们测试了0.5mM CSPP-CB[8]1:1络合物在50mM NaAc缓冲液(pH 4.8)中的重均分子量，达到43.4±17.3kDa。
表3不同样品在DOSY测试中测得的扩散系数：
[a,c,d]CSPP，CSPP与CB[8]的络合物浓度都是0.8mM。[b]CB[8]的浓度是100μM。
表4：CSPP与CB[8]络合前后的光物理性质：
简写：λabs＝最大吸收波长，λem＝最大发射波长，Φw＝在水溶液中的量子产率,Φs＝固态时的量子产率，τ＝平均荧光寿命。[a]激发波长是400nm。
6.超分子聚合物用于毒品检测
在充分证明CSPP与CB[8]超分子聚合物的形成以及其荧光性质(表4)之后，我们探索了超分子聚合物在毒品检测上的运用。如图32a所示，采用荧光指示剂置换的方法来测试毒品与CB[8]的解离常数以及实现毒品的检测。吗啡与海洛因的结构非常相似，但是与CB[8]的结合常数却相差2个数量级(图32b，图33，图34)，分别为2.9×106M-1和8.9×104M-1。因为超分子聚合物的结合常数正好处于这两个毒品与CB[8]的结合常数之间(图29，1.05×106M-1)，所以探针能在毒品低浓度区间(低于10μM)显著性地区分开这两个结构相似的毒品。另外，我们测试了吗啡在含有10％人造尿液体系下的标准曲线(图32c)，LOD达到1μM。并且测试浓度处于真实浓度的86％-103％之间(图32d)，表明这种方法具有一定的准确性。
7.超分子聚合物在含有电解质和蛋白质体系中的稳定性
测试了超分子探针在溶液中存在磷酸缓冲液、尿素、尿酸、人造尿液、肌酸酐或者牛血清白蛋白情况下是否还能检测吗啡。结果如图35显示，在这些干扰物质存在的情况下，吗啡竞争CB[8]仍然可以引起70％以上的荧光信号变化。说明超分子探针在含有电解质和蛋白质的溶液中还具有较好的稳定性。
8.超分子聚合物的红色荧光减少蛋白质自发荧光的影响
超分子聚合物在405nm激光激发时发射荧光的最大波长是615nm。这个发射极好地排除了蛋白质(BSA，FBS)自发荧光的影响(最大发射大约是464nm)，如图36所示。
实施本发明可以达到以下有益效果：
1.通过结构简单的客体分子与CB[8]分子的主客体相互作用就能形成序列可控的超分子聚合物。鉴于目前制备序列可控的合成聚合物非常困难。本发明为制备序列可控的聚合物提供一种新的思路。序列可控的合成聚合物有望用于数据储存和纳米电子等领域。
2.另外，AIEgen的发光性质是在其运动受限的时候，能量更多地以光辐射的方式发射出去。这个发光性质正好能检测到超分子聚合过程中结构微小的变化。本发明捕捉到超分子聚合的两个阶段，先是形成三元络合物，作为超分子聚合的单体，这个阶段荧光增强的速率慢一些；然后形成超分子聚合物，这个阶段AIEgen分子的运动受限程度大，荧光增强的速率快一些。
3.进一步地，本发明的序列可控荧光超分子聚合物成功应用于尿液中的毒品检测。本发明能检测人工尿液中的吗啡，具有较好的稳定性，灵敏度和准确性。尿中存在吗啡表明在2至3天内接触吗啡、海洛因或可待因。所以检测尿液中的吗啡能实现三种毒品的广谱性筛查。
4.通常情况下，葫芦脲与客体分子的络合物在含有电解质的体系中不稳定，容易被电解质离子竞争出客体分子。而本发明的超分子探针在含有磷酸盐缓冲液、尿素、尿酸、人造尿液、肌酸酐、牛血清白蛋白的体系中仍然能成功检测吗啡。
5.本发明的荧光超分子聚合物发射红色荧光，最大发射波长为615nm。该红色荧光的发射远离生物体系中蛋白质的自发荧光(最大发射波长为464nm左右)，从而减少自发荧光的影响，减少误差。
6.本发明测试了CB[8]与吗啡和海洛因的结合常数，并且能实现在低浓度情况下区分这两个结构非常相似的鸦片类毒品。
上面结合附图对本发明的实施方式进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多变形，这些均属于本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种序列可控的超分子聚合物的制备方法，其特征在于，包括：
将具有聚集诱导发光特性的客体分子与CB[8]结合，生成三元络合物，所述客体分子为CSPP，所述CSPP的结构为
X为I-；
将所述三元络合物作为单体进一步自分类聚合而获得序列可控的超分子聚合物。
2.一种利用权利要求1所述的序列可控的超分子聚合物的制备方法制备的超分子聚合物，其特征在于，所述超分子聚合物具有如下所示的结构：
其中，n为正整数。
3.一种利用权利要求2所述的超分子聚合物制备的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针随着运动受限的程度能发射不同程度增强的荧光。
4.一种如权利要求2所述的超分子聚合物在毒品检测中的应用，其特征在于，通过采用荧光指示剂置换的方法来测试毒品与CB[8]的解离常数以实现毒品的检测。
5.一种如权利要求2所述的超分子聚合物在区分吗啡和海洛因中的应用，其特征在于，所述超分子聚合物的结合常数处于吗啡和海洛因与CB[8]的结合常数之间。
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