JP4755755B2 - 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法に関する。本発明は、特に、遺伝子、免疫系、タンパク質、アミノ酸、糖等の生体高分子に関する検査、解析、分析が要求される分野、例えば、工学分野、食品、農産、水産加工等の農学分野、薬学分野、衛生、保健、免疫、疾病、遺伝等の医学分野、化学もしくは生物学等の理学分野等、あらゆる分野に関係するものである。
【0002】
本発明は、特に、遺伝子の変異解析、多型解析、マッピング、塩基配列解析、発現解析等において適した複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法に関する。
【0003】
【従来の技術】
従来、遺伝子プローブ(標識化された特定のDNAまたはRNA配列)分析を行うために、遺伝子増幅技術(例えばPCR)を用いて目的の遺伝子配列を増幅し、ハイブリダイゼーション・ライゲーション検出法を用いて、ターゲット配列にハイブリダイズされたプローブの配列が分離され且つ検出されるようにすることにより(例えば、プローブは磁性粒子とアクリジニウムエスエルの組み合わせを含有する)特定の配列が存在するか否かを決定するものがあった(特表平9−510878号)。
【0004】
この方法は、詳しくは、ターゲットポリ核酸配列を同定する方法であって、(a)2種類のプローブがライゲーションされたときに、それらのプローブが、前記ターゲットポリ核酸の予想配列の一部または全部に相補的であるようにし、該プローブの一方は、そのプローブが反応混合物から容易に分離され得るようにする部分に結合され、さらに、他方のプローブは、ラベルに結合されるようにし、(b)該プローブをターゲットポリ核酸と混合することにより、それらのプローブが該ターゲットポリ核酸にハイブリダイズするようにし、(c)ライゲーション用試薬を添加し、(d)反応混合物を変成することにより、ターゲットポリ核酸からプローブが分離されるようにし、(e)分離を容易にする前記部分を利用して、プローブを分離し、さらに、(f)分離後のプローブを分析して該プローブに前記ラベルが結合されているか否かを決定するものである。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記の遺伝子プローブ分析方法にあっては、分析は、常に1種類の塩基配列の検査に限られるものである。そのために、複数の分析を行うには、上記の方法を、各種類ごとに別途行う必要がある。そのために、各種類ごとに、容器や、反応物質や、試薬の多種類を大量に用意する必要や、各検査毎に容器等を洗浄する必要や、恒温装置等の設備が必要になったり、各種類ごとに処理を順次行う必要があり、処理時間を長く必要とし、また、大きな処理空間や処理設備を必要とすることになるという問題点を有していた。
【0006】
また、各種類の検査ごとに種々の手間がかかるため、処理が煩雑になり、使用者に大きな手間がかかるという問題点をも有していた。
【0007】
さらに、各処理ごとに異なる懸濁液や試薬等を種類間でクロスコンタミネーションが生じないように用意する必要があるので、処理の管理に大きな手間がかかることになるという問題点を有していた。
【0008】
そこで、本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、第1の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、その処理時間のみならず、その作業空間を省き、効率的に処理を行うことができる複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【0009】
第2の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、各検査ごとには微小な量であっても、それらをまとめてバルクな量を扱うことによって、より扱いやすく使い勝手の良い複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【0010】
第3の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、各検査における共通に必要とする試薬等の物品や、温度等の環境等の設備、人手を節約し、検査コストを低下させることができる複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【0011】
第4の目的は、複数種類の検査をまとめて並行して行うことにより、各種類の検査に同一の条件を設定することが可能となり、各種類間で同一条件での検査結果の比較を行うことができ、これによって各種類間の本質的な相違点の発見や、信頼性のある精度の高い検査結果を得ることができる複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【0012】
第5の目的は、特に、遺伝物質の塩基配列の決定等のように大量の情報を得る必要があるために、多数の単純な処理を繰り返す必要があるような検査や処理に適した複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【0013】
【課題を解決するための手段】
以上の課題を解決するために、第1の発明は、各検査種類間で相互に識別可能となるように標識化された複数検査種類の標識化検出体群と、各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の微粒子群とを含む懸濁液であって、前記検査種類ごとに、前記微粒子による前記標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出することによって、複数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並行して行われる複数検査多重化用懸濁液である。
【0014】
ここで、「検査種類」とは、並行して行おうとする複数の検査の種類をいう。検査種類は、例えば、検査対象物の種類、同一検査対象物における検査部位の種類によって区別することができる。
【0015】
また、「標識化検出体」とは、標識化された検出体であり、「検出体」とは、検出に用いられる微小な固体であって、各検査種類ごとに前記懸濁液中に多数含まれる。「標識化」は、例えば標識物質と結合することによって行う。標識物質は、光学物質のみならず、種々の瞬時に定量可能な他の物理量、化学量をもつ物質によって行っても良い。「保持の程度」は、保持量の多少、すなわち検出の際の標識の程度を意味し、標識化が光学的に行われる場合には、例えば光の強度である。「結合物質を有する」態様としては、結合物質が結合し、結合物質が付着し、もしくは固定し、結合物質を吸着し、結合物質を微粒子の表面にコーティングしている場合、または他物質を媒介にして結合物質を有する場合を含む。
【0016】
本発明によれば、各微粒子ごとに前記結合物質を介して保持された前記標識化検出体による標識化の状態を検出しまた検出できないことによって、その標識によって識別しようとする検査種類を特定し、その検査種類について種々の情報を容易に得ることができる。
【0017】
第2の発明は、第1の発明において、前記各検査種類の前記標識化検出体は各検査種類の標識物質とのみ結合することによって標識化され、各検査種類ごとの標識物質の全体は、所定の種類が所定の量比含まれたものであって、その種類またはその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なる複数検査多重化用懸濁液である。ここで、「標識物質」には、例えば、蛍光物質等の発光物質、電磁波を発する物質、磁場を発する物質、電荷をもつ物質等がある。
【0018】
第3の発明は、第2の発明において、各検査種類ごとの標識物質の全体は、各検査種類ごとに前記標識化検出体の略全てに分配され、1個の標識化検出体は1種類の標識物質とのみ結合したものである複数検査多重化用懸濁液である。
【0019】
第4の発明は、第1の発明ないし第3の発明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体群は、その検査種類ごとに異なるように標識化された前記検査対象物群であり、前記結合物質群はその標識化検査対象物が所定構造を持つ場合のみ結合しうる物質である。「検査対象物」には遺伝物質、免疫系、タンパク質、アミノ酸、糖等の生体高分子等を含む。
【0020】
第5の発明は、第1の発明ないし第3の発明のいずれかにおいて、各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想され、相互に異なるように標識化されたら既知の複数種類の構造体であって、前記結合物質と結合した該既知の構造体から前記未知の構造の決定を行う複数検査多重化用懸濁液である。
【0021】
第6の発明は、第1の発明ないし第3の発明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の存在の有無、またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体および結合物質は、前記検査対象物を介してのみ互いに結合するように選ばれた物質である。
【0022】
第7の発明は、第4の発明において、遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体は、各々、一本鎖の検査部位が1検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたDNA断片等の遺伝物質であり、各検査種類の前記結合物質は、正常なまたは異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質である。
【0023】
第8の発明は、第4の発明または第6の発明のいずれかにおいて、所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体は、前記タンパク質であって、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質である。「物質」には、例えば抗体を含む。
【0024】
第9の発明は、第6の発明において、複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質について、未知のDNAを懸濁するDNA抽出液中での存在の有無、または存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体群は、各検査種類ごとに多数含まれ、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに該当する塩基配列の合成、増幅を開始する既知の多数の複数検査種類のプライマー群であり、前記結合物質は、そのプライマー群と対をなす複数検査種類のプライマー群である。
【0025】
第10の発明は、第5の発明において、変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記標識化検出体の各構造体は、前記プライマーの3’末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基若しくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造の異なるものを互いに識別可能に標識化させたものであり、前記結合物質は、前記プライマーの3’末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであり、前記微粒子は、前記構造ごとに前記標識化されたプライマーを前記プライマーを介して保持する複数検査多重化懸濁液である。
【0026】
ここで、「プライマーの3’末端もしくはその近傍」としたのは、プライマーの3’末端から離れれば離れるほど、その変異部位に相当する位置における塩基または塩基配列がPCR法による合成、増幅における影響が小さくなり、その塩基または塩基配列の相違に拘わらず合成、増幅されるおそれがあるからである。また、「相当する塩基もしくは塩基配列を有しない」とは、検査対象であるDNAの対応する位置に欠失が存在する場合のプライマーを意味する。
【0027】
第11の発明は、第1の発明ないし第10の発明のいずれかにおいて、前記微粒子は、磁場等により遠隔操作可能となる複数検査多重化用懸濁液である。
【0028】
第12の発明は、第1の発明、第4の発明または第6の発明のいずれかにおいて、前記標識化検出体は、複数の検査部位をもつ二本鎖のDNAを、各検査部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、PCRプライマーに影響を及ぼさない程度に離れているTypeII S制限酵素認識配列を3’末端の上流側に設けるとともに、標識化された複数検査種類のプライマーと、それと対をなす複数検査種類のプライマーとを用いてTypeII S制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化され、他端に検査部位の突出末端を有するDNA断片である。
【0029】
ここで、「各検査部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、PCRプライマーに影響を及ぼさない程度に離れている」とは、好ましくは10塩基以上離れている場合をいう。理想的には、20〜30塩基程度離れているのが良い。しかし、現在知られているTypeII S制限酵素では、最大10〜20塩基程度である。
【0030】
第13の発明は、各検査種類間で相互に識別可能となるように標識化された複数検査種類の標識化検出体群を生成する生成工程と、少なくとも、生成された複数検査種類の標識化検出体群、および、各検査種類の検査の内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の微粒子群を、液中に懸濁させて処理を行う処理工程と、前記検査種類ごとに、前記微粒子による標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出する検出工程とを有することによって、複数検査種類の検査を並行して行う複数検査多重化方法である。
【0031】
第14の発明は、第13の発明において、前記生成工程は、各検査種類ごとに、多数の検出体と、所定の種類が所定の量比含まれた各検査種類の標識物質とを液中に懸濁させて結合させる工程を有し、前記種類またはその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なる複数検査多重化方法である。
【0032】
第15の発明は、第14の発明において、前記生成工程において、各検査種類の標識物質の全体は、各検査種類ごとの前記標識化検出体の略全てに分配され、1個の前記標識化検出体は1種類の標識物質とのみ結合する工程を有する複数検査多重化方法である。
【0033】
第16の発明は、第13の発明ないし第15の発明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、各々前記検査対象物を標識化したものであり、前記検査工程において、前記結合物質はその検査対象物が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物質である。
【0034】
第17の発明は、第13の発明ないし第15の発明のいずれかにおいて、各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想される既知の複数種類の構造体であって、相互に異なるように標識化されたものであり、前記結合物質と結合した前記既知の構造体から前記未知の構造を決定する複数検査多重化方法である。
【0035】
第18の発明は、第13の発明ないし第15の発明のいずれかにおいて、前記検査対象物の存在の有無および存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記検査工程における前記検出体および結合物質は、前記検査対象物が存在する場合のみ互いに結合するように選ばれた物質であり、前記処理工程においては、前記検査対象物をも懸濁する複数検査多重化方法である。
【0036】
第19の発明は、第13の発明ないし第15の発明のいずれかにおいて、遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、生成工程において、前記標識化検出体として一本鎖の検査部位が1検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたDNA断片等の遺伝物質を生成し、各検査種類の前記結合物質は、正常または異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質である複数検査多重化方法である。
【0037】
第20の発明は、第16の発明において、前記生成工程は、複数検査種類の検査部位をもつ二本鎖のDNAと、各検査種類ごとに、一端に結合した標識物質で標識化され、プライマーの3’末端の下流側にある検査部位が突出末端となる切断部位をもつTypeII S制限酵素の認識部位が挿入されたプライマー群と、それと対をなすプライマー群と、を混合してPCRにより2本鎖DNA断片を増幅する増幅工程と、増幅された前記DNA断片をTypeII S制限酵素で処理することによって、前記標識化検出体として、他端に検査部位の突出末端を有するDNA断片を生成する酵素反応工程とを有し、前記処理工程は、各検査種類毎に、前記標識化検出体の突出末端の塩基配列が正常型である場合に結合可能な塩基配列をもつ突出末端を有するDNA断片を有する複数検査種類の微粒子群、および前記標識化検出体を液中に懸濁して混合しライゲーション反応を行う複数検査多重化方法である。
【0038】
第21の発明は、第18の発明において、前記生成工程は、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに、未知の多数のDNAを懸濁するDNA抽出液中にその塩基配列が存在するか否かの検査の対象となる既知の複数検査種類のDNA合成を開始するプライマー群と、それと対をなす複数検査種類のプライマー群を各検査種類ごとに多数有する微粒子とを、未知の多数のDNAを懸濁するDNA抽出液中に懸濁してPCR法により増幅する増幅工程を有する複数検査多重化方法である。
【0039】
第22の発明は、第17の発明において、各検査種類における変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記増幅工程は、前記標識化検出体の各構造体として、前記プライマー3’末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造が異なるものを互いに識別可能に標識化させ、前記結合物質は、前記プライマーの3’末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーを多数有する微粒子とを、未知の多数のDNAを懸濁するDNA抽出液中に懸濁してPCR法により増幅する複数検査多重化方法である。
【0040】
第23の発明は、第13の発明ないし第15の発明のいずれかにおいて、所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記処理工程における前記標識化検出体は、複数検査種類のタンパク質であって、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質である複数検査多重化方法である。なお、以上の第13から第23の発明において、前記微粒子は、例えば、磁性粒子を有し、磁場等により遠隔操作可能となるものが好ましい。
【0041】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を、図面に基づいて以下に説明する。なお、この実施の形態は特に指定のない限り本発明を制限するものと解してはならない。
【0042】
図1は、第1の実施の形態に係るその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を示すものである。
図1(a)に示すように、本実施の形態では、例えば、一人の患者から抽出した遺伝物質である特定の二本鎖の検体DNA11の複数箇所の検査部位12、13にある塩基配列をもつ各検査対象の構造が予想される構造と一致するか否か、すなわち構造の当否の検査を行うものである。
【0043】
前記「検査種類」とは、ここでは検体DNA11上の位置およびその塩基配列が異なる検査部位12、13の種類を意味する。この例では、説明上簡単のため、2種類の前記検査部位12、13のみを示し、また、各検査部位12、13の塩基数は2塩基の場合のみを示しているが、この種類数およびこの塩基数に限定されるものではない。
【0044】
図1(a)は、さらに、一端が2つの種類の標識物質14、15のどちらかのみと結合し、3’末端の上流側に設けられ前記検査部位12に切断部位をもつように、認識部位と切断部位にある塩基とが10塩基以上離れたTypeII S制限酵素認識配列16を含有するプライマー17からなるプライマー群18を有する。
【0045】
また、このプライマー17と対をなし、標識化のされていないプライマー20からなるプライマー群21を有している。ここで、前記標識物質14、15は例えば種類の異なる2種類の蛍光物質である。蛍光物質には、例えば、FITC(フルオレッセイン イソチオシアネート)、ローダミン、イソチオシアネート、IRD40,Cy3等の誘起物質またはユウロピウム錯体等の無機物質がある。
【0046】
前記検査部位13に対しても、同様にして、標識化がされ、前記TypeII S制限酵素認識配列を含有するプライマー19からなるプライマー群22を有する。また、このプライマー19と対をなし、標識化のされていないプライマー23からなるプライマー群24を有する。
【0047】
ここで、前記プライマー群18では、前記標識物質14と結合したプライマー17と、標識物質15と結合したプライマー17との量比(各プライマーに標識物質が略均等に分配されるとすれば、個数比に略相当する)とは、2対1である。それに対して、プライマー群22では、前記標識物質14と結合したプライマー19と、標識物質15と結合したプライマー19との量比は、1対2である。
【0048】
次に、図1(b)において、これらの検体DNA11、プライマー群18およびプライマー群21、プライマー群22、およびプライマー群24を混合し、PCRを実行する。
【0049】
すると、図1(b)に示すように、標識化されたプライマー側末端の近傍にTypeII S制限酵素認識部位を有する2種類の二本鎖DNA断片群25、26が並行して合成される。
【0050】
次に、図1(c)に示すように、増幅された前記DNA断片群25、26をTypeII S制限酵素で処理することによって、末端に標識物質を有し、他端に検査部位12の突出末端6を有する多数のDNA断片からなるDNA断片群27、同様に、他端に検査部位13の突出末端28を有する多数のDNA断片からなるDNA断片群29が生成される。このDNA断片群27、29が前記複数検査種類の標識化検出体群に相当する。
以上説明した、図1(a),(b),(c)の各工程が、前記生成工程に対応する。
【0051】
次に、図1(d)に示すように、前記結合物質として、末端に突出末端30を有するDNA断片31を有する微粒子32を用意する。このDNA断片31の突出末端30は、前記検査部位12の塩基配列が正常型(検査部位12が正常であった場合にはGAとする)であった場合には、それと相補的な突出末端を有する(TC)。
【0052】
これを多数集めたものが前記検査部位12に対応する微粒子群36である。同様にして、前記結合物質として、末端に突出末端33をもつDNA断片34を有する微粒子35を用意する。このDNA断片34の突出末端33は、前記検査部位13の塩基配列が正常型(検査部位13が正常であった場合にはACとする)であった場合には、それと相補的な突出末端を有する(GT)。これを多数集めたものが前記検査部位13に対応する微粒子群37である。なお、前記微粒子32、35には、各々同種のDNA断片31、34のみを有している。
【0053】
図1(c)で生成された,DNA断片群27、29と、前記図1(d)において生成された前記微粒子群36、37を混合し、ライゲーション反応を行う。これにより、いずれの検査部位12、13も正常型である場合には、前記微粒子群36、37の各々が有する多数の結合物質であるDNA断片31およびDNA断片34は、各々標識化検出体である多数のDNA断片群27およびDNA断片群29と結合する。この図1(d)が前記処理工程に対応する。
【0054】
その結合は、多数の物質同士でランダムに行われるため、統計的誤差を除き検出体の前記標識物質14および前記標識物質15との量比が維持された状態で、結合可能な結合物質と結合する。この誤差は、個数が増加すればするほど小さくなる。
【0055】
したがって、図1(e)に示すように、各々標識物質14および標識物質15は、各検査種類毎に異なる量比、すなわち、F1:F2=2:1,およびF1:F2=2:1に限りなく近いいずれかの状態で標識化された複合粒子38および複合粒子39が得られることになる。
【0056】
一方、いずれかの検査部位12、13が変異型である場合(dでの配列と異なる場合)には、それぞれ、各複合粒子38または複合粒子39は検出されないことになる。
【0057】
したがって、1本の反応容器中で上記の反応を行い、フローサイトメータで検出を行うことにより、2種類以上の変異部位を同時に検出することが可能である。このフローサイトメータによる検出が、前記検出工程に相当する。
【0058】
以上の実施の形態の説明では、検査部位12のまたは検査部位13の構造(各々AT,CA)が正常か異常かであるかを調べるのみであった。もし、各検査部位12、検査部位13の構造をも特定しようとするのであれば、前記構造体として予想される全検査部位の構造に対応する塩基配列の組み合わせを、前記プライマー群18の3’末端またはその近傍に含むプライマー群18を形成し、相互に識別可能とするように標識化したものを各検査部位(12、13)ごとに全て互いに異なるように標識化したものを用いることによって行うことができる。
【0059】
また、以上の説明で用いられた2塩基突出は、例えばFok I等のTypeII S制限酵素による4塩基突出末端など、3塩基以上の突出末端を用いることが可能である。例えば、4塩基突出末端の場合には、異なる配列として認識が可能な場合の数は256種類となり、同時に検出可能な変異部位ある変異からなる検出の種類の数を増加させることができる。
【0060】
続いて、第2の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を、図2に基づいて説明する。
本実施の形態は、食品等に汚染されている複数の微生物種の存在を、その微生物種毎に、1本の反応容器中で反応させることによって検出するものである。
【0061】
図2(a)で、複数の微生物種を含むと予想される含微生物試料40を用意する。図2(b)において、この含微生物試料40から、その含微生物試料40に含有されている様々な未知の各種検体DNA(DNA(1)、DNA(2)、DNA(3)等)41を抽出する。
【0062】
次に、図2(c)に示すように、前記含微生物試料40に含有されているか否かの検査の対象となる検査対象物が、例えば、2種類(もちろん、3種類以上の微生物種であっても良い)の微生物種であるとする。この2種類が前記検査種類に相当する。
【0063】
また、第1の微生物種および第2の微生物種に各々特有となるように、前記2種類の標識物質を結合することによって標識化(コード化)されたプライマー43、46を用意する。前記プライマー43、46は、例えば、一端が2種類の標識物質(例えば蛍光物質)42、44の一方のみと結合したものを多数用意し、各々プライマー群45とプライマー群47とする。このプライマー群45、47が標識化された複数検査種類の標識化検出体群に相当する。
【0064】
但し、プライマー群45では、前記標識物質42と結合したプライマー43と、標識物質44と結合したプライマー43との量比(各プライマーに標識物質が略均等に分配されるとすれば、個数比に略相当する)は、2対1である。それに対して、プライマー群47では、前記標識物質42と結合したプライマー46と、標識物質44と結合したプライマー46との量比は、1対2として互いに異なるように標識化する。この標識化を行うまでの工程である図2(c)は前記生成工程に相当する。
【0065】
前記結合物質として、前記プライマー43、46と対をなすプライマー48、49を微粒子50、51に各々固定化されたものを用意する。その際、同一の前記微粒子50または微粒子51には、同一の配列を有するプライマー48、またはプライマー49のみが固定化されるようにした多数の微粒子50、51からなる2検査種類の微粒子群52、53を用意する。
【0066】
次に、これらのプライマー群45、47および微粒子群52、53を懸濁させた懸濁液に、検査対象物として図2(b)で示した抽出されたDNA試料を混合し、PCRを行う。すると、前記試料中に、第1の微生物種および第2の微生物種が存在していた場合には、PCR法により、前記微粒子50、51が有するプライマー48、49と標識化されたプライマー43、46によって、図2(d)に示すように標識化された二本鎖のDNA断片が形成される。
【0067】
多数のプライマー43、46と多数のプライマー48、49による二本鎖の形成はランダムに行われるため、統計的誤差を除き標識化検出体の前記標識物質42および前記標識化検出体の前記標識物質44との量比が維持された状態で二本鎖が形成される。
【0068】
この誤差は、個数が増加すればするほど小さくなる。したがって、図2(d)に示すように、各々標識物質42および標識物質44は、各微生物種毎に異なる量比、すなわち、F1:F2=2:1、およびF1:F2=2:1に限りなく近いいずれかの状態で標識化された複合粒子54、55が得られることになる。したがって、フローサイトメータを用いた分析によって、前記量比を検出することによって、これらの複合粒子54、55の存在を確認することができる。
【0069】
この図2(d)(e)が前記処理工程に相当し、前記フローサイトメータによる分析が前記検出工程に相当する。
【0070】
一方、いずれかの微生物種が前記試料中に存在しない場合には、それぞれ、各複合粒子54または複合粒子55は検出されないことになる。
【0071】
続いて、第3の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を図3に基づいて説明する。
【0072】
この実施の形態では、試料中に存在する複数の異なるタンパク質について、それぞれ構造の変異を有するか否かの検査を1個の容器中での反応によって可能とするものである。
【0073】
図3(a)に示すように、ヒト等の組織より、タンパク質(P1)60および異なる種類のタンパク質(P2)63を含む粗抽出液を用意する。
【0074】
各タンパク質60、63には、後述する微粒子群77、79に固定化されるべき所定の固定化部位61、64と、変異があるか否かの構造の当否、もしくはそれが存在するか否か、またはどのくらい存在するか否かの存在の程度の検査の対象となる部位である検査部位62、65とを有する。
【0075】
図3(b)に示すように、タンパク質60、63の前記検査部位62、65が正常型である場合に、その検査部位62、65と特異的に結合する標識化された多数の抗体68、70からなる抗体群69、71を示す。
【0076】
各抗体群69では、前記標識物質66と結合した抗体68と、標識物質67と結合した抗体68との個数の比は、2対1である。それに対して、抗体群71では、前記標識物質66と結合した抗体70と、前記標識物質67と結合した抗体70との個数の比は、1対2である。
【0077】
次に、これらのタンパク質60、63を、抗体群69、71が懸濁されている懸濁液中に投入して混合し、反応させる。
【0078】
すると図3(c)に示すように、タンパク質60によって、前記標識物質66、67が2対1となるように標識化されたタンパク質群72が得られ、タンパク質63によって、標識物質66、67が1対2となるように標識化されたタンパク質群73が得られる。このタンパク質群72、73は前記標識化検出体群に相当する。すなわち、図3(a),(b),(c)が前記生成工程に相当する。
【0079】
一方、図3(d)に示すように、前記結合物質として、前記固定化部位61、64と結合可能な多数の抗体76、78を多数の微粒子74、75に固定化させた微粒子群77、79を用意する。但し、同一の粒子には、同一の抗体のみが固定化されるようにする。
【0080】
次にその微粒子群77、79が懸濁する懸濁液中に、前記標識化されたタンパク質群72、73を懸濁させて混合する。もし、前記タンパク質60、63の検査部位62、65が正常型である場合には、図3(e)に示すような、標識化された複合粒子80、81が形成される。
【0081】
多数の抗体68、71と、多数のタンパク質60、63との結合はランダムに行われるため、統計的誤差を除き検出体の前記標識物質66および前記検出体の前記標識物質67との量比が維持された状態で複合粒子80、81が形成される。この誤差は、個数が増大すればする程小さくなる。
【0082】
したがって、図3(e)に示すように、各々標識物質66および67は、各タンパク質毎に異なる量比、すなわち、F1:F2=2:1、およびF1:F2=2:1に限りなく近いいずれかの状態で標識化されることになる。したがって、フローサイトメータを用いた1粒子ごとに、前記量比を検出することによって、これらの複合粒子80、81の存在を確認することができる。この図3(d)(e)の工程が前記処理工程に相当し、フローサイトメータによる検出が前記検出工程に相当する。
【0083】
さらに、第3の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法の他の例として、前記抗体68、70に代えて、発癌に関連するタンパク質の変異した検査部位に特異的に結合する抗体68、70を選択し、変異の有無によって結合の可否が決定されるようにする。
【0084】
この例では、そのような抗体群によって結合された各複合粒子80、81の蛍光強度を測定することによって、変異された(発癌に関係する)タンパク質の有無、そのタンパク質の種類間の量の相違や比若しくは1タンパク質あたりの変異部位の個数の相違や比を検出することができる。
【0085】
第4の実施の形態に係る複数検査多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を、図4に基づいて説明する。
【0086】
本実施の形態は、第2の実施の形態として、図2で説明した複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質に、変異が予想される変異部位を有する遺伝物質が含まれている場合にその変異の構造をも特定するためのものである。
【0087】
図4(a)は、説明の簡単のために、検体DNA90に検査部位として1塩基の変異部位91が存在する場合に、その構造を決定する方法を示す。
【0088】
前記標識化検出体の各構造体として、プライマー93の3’末端もしくはその近傍95、97であって前記変異部位91に相当する位置において変異が予想される1塩基A,G,T,Cを各々有する(図4では説明の簡単のためにAとGのみについて図示している)多数のプライマー93からなる4種類のプライマー群96、98を液中に懸濁したものを用いる。
【0089】
各A,G(T,C)を有する各プライマー群96、98に属する各プライマー93は、1の種類の標識物質92、94とのみ結合し、各種類ごとに、前記標識物質92,94と結合した各プライマー群96、98は、予め定めた量比、例えば、プライマー群96については、F1:F2=2:1であり、プライマー群98についてはF1:F2=1:2である。
【0090】
なお、結合物質として、前記プライマー93と対をなすプライマー100を用いる。この多数のプライマー100を有する多数の微粒子99は微粒子群101を構成する。
【0091】
これらのプライマー群96、98、前記微粒子群101を液中に懸濁させて、PCR法により増幅し、前記プライマー群96、98のいずれかと結合して微粒子99に形成された複合体を検出することによって、前記変異部位91の構造を特定することができる。
【0092】
図4(b)は、2種類の検体DNA(1)102,検体DNA(2)111の各々に変異部位103、112(説明の簡単上、1塩基の構造をもつとする)がある場合に、その変異部位の構造の当否を決定するものである。
【0093】
本例では、標識化検出体として、標識化されたプライマー105、109とを用意する。前記プライマー105、109は、例えば、一端が2種類の標識物質(例えば蛍光物質)92、94の一方のみと結合したものを多数用意し、各々プライマー群104と、プライマー群110とする。
【0094】
プライマー群104では、前記標識物質92と結合したプライマー105と、標識物質94と結合したプライマー105との個数の比は、1対2であり、標識物質92と結合したプライマー109と、標識物質94と結合したプライマー109との個数の比は2対1として互いに異なるように標識化する。
【0095】
また、前記結合物質としては、前記プライマー105、109と各々対をなすプライマー106、113であり、その3’末端もしくはその近傍107、117の前記変異部位103、112に相当する位置において、変異が予想される1塩基A、Gを各々もつ多数のプライマー106、113を有する2種類の微粒子99からなる微粒子群108、115を用意する。
【0096】
この前記プライマー群104、110、検体DNA(1)102,DNA(2)111、微粒子群108、115を液中に懸濁させてPCR法で増幅させる。その結果、前記DNA(1)またはDNA(2)の変異部位103、112が該当する塩基を有する場合のみフローサイトメータで前記量比を持った蛍光が観測され、前記変異部位の構造の当否を決定することができる。
【0097】
図4(c)は、説明の簡単のために、検体DNA121に検査部位として1塩基の変異部位122が存在する場合に、その構造を決定する方法を示す。
【0098】
前記標識化検出体の各構造体として、プライマー116の3’末端もしくはその近傍117、119であって、前記変異部位122に相当する位置117、119において変異が予想される変異が予想される塩基A,G,T,C(説明の簡単のためA,Gのみ図示)を各々有する多数のプライマー116からなる4種類のプライマー群118、120を用いる。各プライマー群118、120に属する各プライマー116は、1の種類の標識物質92、94とのみ結合し、各種類ごとに、前記標識物質92、94と結合した各プライマー群118、120は、予め定めた量比、例えば、プライマー群118については、F1:F2=2:1であり、プライマー群120についてはF1:F2=2:1である。
【0099】
また、第1の微粒子群の例としては、前記プライマー116と対をなし、その3’末端もしくはその近傍の前記変異部位122に相当する位置124、125において、変異が予想される塩基A,G(T、C)を有する多数のプライマー123を結合物質として用いる。この多数のプライマー123を有する4種類の微粒子99からなる微粒子群126、127を用いる。これらのプライマー群118、120、検体DNA121,及び微粒子群126、127を液中に懸濁させてPCR法により増幅を行うことにより、変異部位122の構造に対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、全体としての強度を測定することにより、その変異部位を有するDNAが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析することができる。
【0100】
第2の微粒子群の例として、前記プライマー116と対をなし、その3’末端もしくはその近傍の前記変異部位122に相当する位置124、125において、変異が予想される塩基A,G(T、C)を有する多数のプライマー123を結合物質として用いる。この4種類の多数のプライマー123が同一量比となるように有する1種類の微粒子99からなる微粒子群129を用いる。これらのプライマー群118、120、検体DNA121,及び微粒子群129を液中に懸濁させてPCR法により増幅を行うことにより、変異部位122に対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、全体としての強度を測定することにより、その変異部位を有するDNAが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析することができる。
【0101】
第3の微粒子群の例として、前記プライマー116と対をなし、その3’末端から離れた内部にあって前記変異部位131に相当する位置131において、適当な塩基、例えば、A(G、T、Cでも可、またはイノシン)を有する1種類の多数のプライマー132を結合物質として用いる。この多数のプライマー132を有する微粒子99からなる微粒子群130を用いる。この例では、変異部位に相当する位置が3’末端から離れているので、その変異部位に相当する位置にくる塩基または塩基配列はPCR法による増幅に大きな影響を与えないので、結合物質を共通のものを用いることができる。したがって、第3の微粒子群を用いた場合には第1の微粒子群の場合に比較して検査処理を簡単化することができる。なお、第1の微粒子群および第3の微粒子群を用いることによって、他のDNAが存在した状態での並行検査が可能となる。
【0102】
これらのプライマー群118、120、検体DNA121,及び微粒子群130を液中に懸濁させてPCR法により増幅を行うことにより、変異部位122の構造に対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、全体としての強度を測定することにより、その変異部位を有するDNAが試料中でどの程度の割合で存在するかを解析することができる。
【0103】
以上の実施の形態は、本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、説明の便宜上、2検査種類の検査を、2種類の標識化検出体を用いて検査を多並行して行い、2種類の標識物質によって標識化したものについて説明したが、この場合に限られず、3検査種類以上の検査、および3以上の種類の標識物質を用いて検査を行うことができる。
【0104】
以上の例では、標識物質が発光物質の場合について説明したが、標識物質は、この例に限られず、磁場、核スピン状態等、種々の瞬時に定量可能な物理量をもつ物質であっても良い。また、発光物質であっても、発光波長および発光強度のみならず、発光偏光度、発光位相、発光寿命等を検出するようにしても良い。
【0105】
以上の検査は、DNAに関する多型、微生物種類の検査、タンパク質の変異に関する場合について行われているが、これらの例に限られることなく、糖やアミノ酸等に関する検査にも用いることができるのはいうまでもない。
【0106】
また、抗体以外にも、レクチン、その他のタンパク質、低分子物質など、検査物質に特異的に結合する物質を用いることができる。この場合、糖、脂質、その他の低分子量および高分子量からなる、特異的結合が可能な種々の物質の検査を行うことが可能である。
【0107】
また、以上の例では、変異部位は1塩基または2塩基の変異の場合についてのみ説明したが、この例に限られることなく、例えば、3以上の塩基からなる塩基配列をもつ変異の場合、欠失、挿入がある場合についても適用できることはいうまでもない。さらに、変異部位の解析方法は、必ずしも複数検査種類の並行検査を行う場合に限られず、1検査種類の検査のみを行う際にも使用することができる。
【0108】
【発明の効果】
第1の発明または第13の発明によれば、複数検査種類の検査を多重化することによって並行して実行することができる。したがって、処理時間を短縮化し、かつ効率化することができるとともに、処理に必要な作業面積を省略化し、使用する装置はコンパクトなもので済むことになる。
【0109】
また、各検査ごとには微小な量であっても、それらをまとめてバルクな量を扱うことによって、より扱いやすく使い勝手が良い。さらに、各検査における共通に必要とする試薬等の物品や、温度等の環境等の設備、人手を節約し、検査コストを低下させることができる。
【0110】
さらに、各種類の検査に同一の条件を設定することが可能となり、各種類間で同一条件での検査結果の比較を行うことができる。これによって各種類間の本質的な相違点の発見や、信頼性のある精度の高い検査結果を得ることができる。また、遺伝物質の塩基配列の決定等のように大量の情報を得る必要があるために、多数の単純な処理を繰り返す必要があるような検査や処理を効率的に行う場合に適している。
【0111】
第2の発明または第14の発明によれば、所定の種類が所定の量比含まれた標識物質が各検査種類間で識別可能となるように異ならせることによって標識化している。したがって、前述した効果の他に、少数の種類の標識物質を用いて多数の検査種類間(例えば、数百、数千、数万種以上)を識別することができるという効果を奏する。また、各検査種類ごとに多数の関係物質を懸濁させることによって容易にかつ統計誤差内の正確で精密な標識化を実現することができる。
【0112】
第3の発明または第15の発明によれば、前述した効果の他に、各検出体ごとに1種類の種類の標識物質とのみ結合するようにしている。したがって、量比は個々の微粒子に特異的に結合した標識物質の検出強度になるので、単に存在の有無のみならず、存在の程度をも容易に検出することができる。
【0113】
第4の発明または第16の発明は、前述した効果の他に、例えば、DNAの塩基配列等の構造について、高い信頼性をもって高い精度で決定することができる。
【0114】
第5の発明、第10の発明、第17の発明または第22の発明によると、前述した効果の他に、複数検査種類の検査対象物質の未知の構造をも高い精度で決定することができる。
【0115】
第6の発明または第18の発明は、前述した効果の他に、例えば、ある試料中に微生物種が存在するか否かに関する検査に適用しやすい。これによって、大腸菌、O-157等の有無の検査を容易かつ確実に実行することができる。
【0116】
第7の発明または第19の発明は、前述した効果の他に、標識化検出体として、1種類のDNA等の構造の当否の検査が行われる1本鎖の検査部位が含まれるように切断したものを用いている。したがって、DNAの塩基配列にある複数の変異を並行して効率的にかつ正確に特定することができる。
【0117】
第8の発明または第23の発明によると、前述した効果の他に、標識化検出体として、1種類のタンパク質の構造の当否、その存在の有無、その存在の程度の検査が行われるように、検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた抗体群を介して標識物質で標識化したものである。これによって、複数種類のタンパク質の検査部位について、迅速かつ効率的にタンパク質の変異型の検査を並行して行うことができる。
【0118】
第9の発明または第21の発明によれば、前述した効果の他に、複数検査種類の検査対象物である未知のDNAが懸濁するDNA抽出液中に遺伝物質が存在するか否かの検査を並行して迅速かつ効率的に行うことができる。
【0119】
第11の発明によれば、前述した効果の他に、磁性粒子等の遠隔操作可能となる微粒子を用いることによって、処理を一層効率的かつ容易に行うことができる。
【0120】
第12の発明または第20の発明によれば、前述した効果の他に、前記検出体として、複数の検査部位をもつ二本鎖のDNAを、各検査部位ごとに認識部位と切断部位とが10塩基対以上離れたTypeII S制限酵素認識配列を3’末端の上流側に設けるとともに、標識化された複数の検査種類のプライマーと、それと対をなす複数検査種類のプライマーとを用いてTypeII S制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化され、他端に検査部位の突出末端を有するDNA断片である。
本発明によれば、TypeII S制限酵素認識配列を用いることによって、検査部位に悪影響を与えることなく、任意の位置で二本鎖のDNAを切断することができるので、多様性または汎用性のある検査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第1の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【図2】本発明の第2の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【図3】本発明の第3の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【図4】本発明の第4の実施の形態に係る懸濁液および方法の説明図である。
【符号の説明】
11、41、90、102、111、121…検体DNA
12、13…検査部位
14、15、42、44、66、67、92、94…標識物質(蛍光物質)
17、19、20、23、43、46、93、105、109、116…プライマー
18、21、22、24、…プライマー群
25、26、…DNA断片群
31、34…DNA断片(結合物質)
27、29…DNA断片群(標識化検出体群)
32、35、50、51、74、75…微粒子
36、37、52、53、77、79…微粒子群
38、39、54、55、80、81…複合粒子
40…含微生物試料
45、47、96、98、104、110、118、120…プライマー群(標識化検出体群または構造体群)
48、49、100、106、113、123、132…プライマー(結合物質)
60、63…タンパク質
61、64…固定化部位
62、65…検査部位
68、70…抗体
69、71…抗体群
72、73…タンパク質群(標識化検出体群)
76、78…抗体(結合物質)
Claims (20)
- 各検査種類の検査で用いられ各検査種類ごとに多数含まれる検出体を、各検査種類間で相互に識別可能となるように各検査種類ごとに標識化した複数検査種類の標識化検出体群と、
各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の磁性粒子群とを含む懸濁液であって、
前記検査種類ごとに多数の前記磁性粒子による前記標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出することによって、複数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並行して行われるとともに、
前記各検査種類の前記標識化検出体は各検査種類の標識物質とのみ結合することによって標識化され、各検査種類ごとの前記標識物質の全体は、複数の所定の種類が所定の量比含まれたものであって、その種類およびその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なることを特徴とする複数検査多重化用懸濁液。 - 各検査種類ごとの標識物質の全体は、各検査種類ごとに前記標識化検出体の略全てに分配され、1個の標識化検出体は1種類の標識物質とのみ結合したものであることを特徴とする請求項1に記載の複数検査多重化用懸濁液。
- 複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体群は、その検査種類ごとに異なるように標識化された前記検査対象物群であり、前記結合物質群はその標識化検査対象物群が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物質であることを特徴とする請求項1または請求項2のいずれかの1項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
- 各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想され、相互に異なるように標識化された既知の複数種類の構造体であって、前記結合物質と結合した該既知の前記構造体から前記未知の構造の決定を行うことを特徴とする請求項1または請求項2のいずれかの1項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
- 複数検査種類の検査対象物の存在の有無、またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体および結合物質は、前記検査対象物を介してのみ互いに結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項1または請求項2のいずれかの1項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
- 遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体は、各々、一本鎖の検査部位が1検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたDNA断片等の遺伝物質であり、各検査種類の前記結合物質は、正常または異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質であることを特徴とする請求項3に記載の複数検査多重化用懸濁液。
- 所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体は、前記タンパク質であって、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項3または請求項5のいずれかの1項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
- 複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質について、未知のDNAを懸濁するDNA抽出液中での存在の有無、または存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体群は、各検査種類ごとに多数含まれ、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに該当する塩基配列の合成、増幅を開始する既知の多数の複数検査種類のプライマー群であり、
前記結合物質は、そのプライマー群と対をなす複数検査種類のプライマー群であることを特徴とする請求項5に記載の複数検査多重化用懸濁液。 - 変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記標識化検出体の各構造体は、前記プライマーの3'末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造の異なるものを互いに識別可能に標識化させたものであり、前記結合物質は、前記プライマーの3'末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであり、前記磁性粒子は、前記構造ごとに前記標識化されたプライマーを前記プライマーを介して保持することを特徴とする請求項4に記載の複数検査多重化懸濁液。
- 前記標識化検出体は、複数の検査部位をもつ二本鎖のDNAを、各検査部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せず、PCRプライマーに影響を及ぼさない程度に離れているTypeII S制限酵素認識配列を3'末端の上流側に設けるとともに、標識化された複数検査種類のプライマーと、それと対をなす複数検査種類のプライマーとを用いてTypeII S制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化され、他端に検査部位の突出末端を有するDNA断片であることを特徴とする請求項1、請求項3または請求項5のいずれかの1項に記載の複数検査多重化用懸濁液。
- 各検査種類の検査で用いられ各検査種類ごとに多数含まれる検出体を、各検査種類間で相互に識別可能となるように各検査種類ごとに標識化して複数検査種類の多数の標識化検出体群を生成する生成工程と、少なくとも、各検査種類ごとに多数の生成された複数検査種類の標識化検出体群、および、各検査種類の検査の内容に応じて検査種類ごとに多数の前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の磁性粒子群を、液中に懸濁させて処理を行う処理工程と、前記検査種類ごとに、前記磁性粒子による標識化検出体の保持の有無またはその程度を検出する検出工程とを有することによって、複数検査種類の検査を並行して行うとともに、
前記生成工程は、各検査種類ごとに、多数の検出体と、複数の所定の種類が所定の量比含まれた各検査種類の標識物質とを液中に懸濁させて結合させる工程を有し、その種類およびその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となるように異なるものであることを特徴とする複数検査多重化方法。 - 前記生成工程において、各検査種類の標識物質の全体は、各検査種類ごとの前記標識化検出体の略全てに分配され、1個の前記標識化検出体は1種類の標識物質とのみ結合する工程を有することを特徴とする請求項11に記載の複数検査多重化方法。
- 複数検査種類の検査対象物の構造の当否を検査する場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、各々前記検査対象物を標識化したものであり、前記検出工程において、前記結合物質はその検査対象物が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物質であることを特徴とする請求項11または請求項12のいずれかの1項に記載の複数検査多重化方法。
- 各検査種類における検査対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記生成工程において、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想される既知の複数種類の構造体であって、相互に異なるように標識化されたものであり、前記結合物質と結合した前記既知の構造体から前記未知の構想を決定することを特徴とする請求項11または請求項12のいずれかの1項に記載の複数検査多重化方法。
- 前記検査対象物の存在の有無および存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記検査工程における前記標識化検出体および結合物質は、前記検査対象物が存在する場合のみ互いに結合するように選ばれた物質であり、前記処理工程においては、前記検査対象物をも懸濁して処理することを特徴とする請求項11または請求項12のいずれかの1項に記載の複数検査多重化方法。
- 遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、生成工程において、前記標識化検出体として一本鎖の検査部位が1検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化されたDNA断片等の遺伝物質を生成し、各検査種類の前記結合物質は、正常または異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質であることを特徴とする請求項11または請求項12のいずれかの1項に記載の複数検査多重化方法。
- 前記生成工程は、複数検査種類の検査部位をもつ二本鎖のDNAと、各検査種類ごとに、一端に結合した標識物質で標識化され、プライマーの3'末端の下流側にある検査部位が突出末端となる切断部位をもつTypeII S制限酵素の認識部位が挿入されたプライマー群と、それと対をなすプライマー群と、を混合してPCRにより2本鎖DNA断片を増幅する増幅工程と、増幅された前記DNA断片をTypeII S制限酵素で処理することによって、前記標識化検出体として、他端に検査部位の突出末端を有するDNA断片を生成する酵素反応工程とを有し、
前記処理工程は、各検査種類毎に、前記標識化検出体の突出末端の塩基配列が正常型である場合に結合可能な塩基配列をもつ突出末端を有するDNA断片を有する複数検査種類の磁性粒子群、および前記標識化検出体群を液中に懸濁して混合しライゲーション反応を行うものであることを特徴とする請求項13に記載の複数検査多重化方法。 - 前記生成工程は、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに、未知の多数のDNAを懸濁するDNA抽出液中にその塩基配列が存在するか否かの検査の対象となる既知の複数検査種類のDNA合成を開始するプライマー群と、それと対をなす複数検査種類のプライマー群を各検査種類ごとに多数有する磁性粒子とを、未知の多数のDNAを懸濁するDNA抽出液中に懸濁してPCR法により増幅する増幅工程を有することを特徴とする請求項15に記載の複数検査多重化方法。
- 各検査種類における変異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記増幅工程は、前記標識化検出体の各構造体として、前記プライマー3'末端もしくはその近傍であって前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造が異なるものを互いに識別可能に標識化させ、前記結合物質は、前記プライマーの3'末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーを多数有する磁性粒子とを、未知の多数のDNAを懸濁するDNA抽出液中に懸濁してPCR法により増幅することを特徴とする請求項14に記載の複数検査多重化方法。
- 所定の固定化部位を有する複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記処理工程における前記標識化検出体は、複数検査種類のタンパク質であって、前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質であることを特徴とする請求項11または請求項12のいずれかの1項に記載の複数検査多重化方法。
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