CN101101292B - 一种生物分子高通量定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物分子高通量定量检测方法，其使用分子编码的方法实现了生物分子的高通量定量检测，其能够显著提高生物学研究、临床检验、食品卫生检验、环境检测和法医学检验等领域相关应用的效率。

Description

一种生物分子高通量定量检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物分子高通量定量检测方法。

背景技术

在生物学研究和临床诊断中，经常需要了解研究标本或临床标本中含有多少种生物分子及其含量的信息。在高通量定量检测方法(highthroughputdetection methods)问世以前，需要了解一个标本中存在多少种生物分子，就需要对该标本实施多少次检测，不仅费时费力，而且在实际工作中，研究标本和临床标本的数量往往是有限的，难以对其实施太多次数的检测，极难获得大量的检测信息。因此，高通量定量检测技术不仅可以大幅度提高生物学研究和实验诊断的检测效率，还可以大幅度提高从一个有限量标本中可以获得的信息丰度。

需要从标本中检测的生物分子称为检测目的分子或检测靶分子(targetmolecules，TMs)。现有生物学研究已经证实每种TM都存在至少一种能与之发生特异性结合的生物分子，称为这种TM的生物分子识别元件(biomolecularrecognization elements，BREs)。与BRE的特异性结合常被用作TM分离和检测方法的技术基础。

生物芯片(Biochips)技术作为第一个高通量生物分子检测技术，很好地诠释了高通量定量检测方法对生物学研究的巨大促进作用。生物芯片采用微型电子与微机械系统(Micro Electronic Mechanical System，MEMS)，将不同TMs的BREs分别固定在某个固相支持物上，并排列成有序的点阵，称为生物芯片。其中，固相支持物称为生物芯片的片基(film base)，每个BRE在基片上的占位称为芯片的1个位点，所有位点组成的点阵称为生物芯片的探针微阵列。生物芯片与待测标本反应之后，不同的TM被位于某一位点的特异性BRE所结合，再用一种报告分子，如荧光分子，来指示这种TM与BRE的特异性结合，使得结合了TM的位点发生可以被机电技术或人工识别的变化。反过来，通过判读生物芯片与待测标本反应之后不同位点的变化，根据预先确定的位点与BRE的对应关系，一次检测反应就可以检出待测标本中成千上万的生物分子。生物芯片实现高通量定量检测的技术引起了相关领域学者的极大兴趣和高度重视，被不断派生、发展和应用，对比较基因组学、蛋白质组学、药物筛选和临床检测等学科的发展起到了积极的推动作用，被誉为21世纪生命支撑平台。

但是，生物芯片也存在由其方法学原理所决定的固有不足，主要是：(1)反应效率不高，所有TMs的BREs都被固定在一个固相基片上，使得芯片与待测标本的杂交成为一种固-液相模式的杂交，固液相杂交反应存在空间位阻作用，降低了TM与BRE结合的效率，使得芯片杂交往往需要过夜；(2)重复性不佳，生物芯片不同片基对BRE的吸附能力不同，片基不同位点吸附BRE的效率不同，报告分子对不同标本的标记效率也存在差异，这使得生物芯片难以取得较好的重复性，有报道指出生物芯片的重复性一般在85％以内；(3)不能用于定量分析，为了提高生物芯片的重复性，研究者在生物芯片中引入了内源标准化信噪比(Internally Normalized Ratio，INR)，可以作为消除TMs—BREs结合效率差异的对照，也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异，但由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因，根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的含量是不恰当的。

针对生物芯片的固有不足，美国Luminex公司开发了另一种高通量定量检测技术，英文名称为flexible Multi-Analyte Profiling，简称xMAP。xMAP的检测过程全部在液相完成，因此又称为液相芯片(liquid chips)。在xMAP技术中，首先对一些塑料微球进行颜色编码，即使用两种不同的荧光染料将直径约5.6μm的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色，受分辨技术的限制，最多可以获得100种经荧光编码的微球。然后将不同BREs通过化学方法共价交联在不同颜色的微球上，根据检测的需要将结合有不同BRE的微球以及TMs的另一种结合有荧光分子的BREs共同组成检测试剂，与待测标本进行反应之后，将形成编码微球-TM-荧光报告分子复合物。最后利用一种专用的分析仪对这种微球-TM-荧光报告分子复合物进行检测，分析仪可发出两束不同的激光，一束用于激发荧光报告分子，根据荧光强度可以判定微球上结合的TM的量，另一束激光用于激发微球上的荧光素，判定是那种微球，根据预先确定的微球与BRE的对应关系，确定是那一种TM。

尽管xMAP技术相比Biochips技术有一些显著的优势，例如几乎没有空间位阻效应，杂交反应快、效率高；重复性得到极大提高，xMAP通过对多个同色微球进行重复检测，极大地提高了检测的重复性；实现了一定的定量功能等，但xMAP技术也存在一些显著的不足：(1)检测通量有限，由于荧光编码最多可以获得100种不同颜色的聚丙乙烯微球，xMAP的检测通量就不可能超过100种TM/测试；(2)应用开发难度大、成本高，xMAP每检测一种TM，都需要开发两种不同的BRE，加大了应用开发的难度、周期和成本，这使得xMAP技术的应用价格居高不下；(3)没有定量分析的准确依据，xMAP技术中可以测定每个微球-TM-荧光报告分子复合物的荧光强度，也可以测定多个同色微球中被结合了荧光报告分子的微球所占的比例，这些信息可以用于分析相应TM的含量，但由于每个微球交联BRE的量不可能完全相同，根据微球-TM-荧光报告分子复合物的荧光强度进行定量将存在很大的误差，由于采样的随机性，每次分析采集的微球都各不相同，因此每次测试的发光微球比例也不可能完全相同，所以xMAP只能根据以上两个指标，从统计学意义上进行定量分析，而不能给出有直接关系的定量公式。

综上所述，高通量定量检测方法是生物学研究和临床诊断的一种重要技术手段，但现有的高通量定量检测技术都还存在一定的不足，开发一种更优秀的高通量定量检测技术弥补现有技术的不足，进一步促进生物学研究的发展和临床检测的进步，是迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物分子通用高通量定量检测方法。其能够显著提高生物学研究、临床检验、食品卫生检验、环境检测和法医学检验等领域相关应用的效率。

为实现本发明目的而提供的一种生物分子高通量定量检测方法，使用分子编码的方法实现了生物分子的高通量定量检测。

所述的生物分子高通量定量检测方法，把不同的编码分子(CodingMolecules，CMs)标记在不同生物分子识别元件(BREs)上，形成分子性质各不相同的生物识别元件-编码分子(BRE-CM)，将所有能与检测靶分子特异性结合的生物识别元件-编码分子(tBRE-CM)和至少1种参考生物识别元件-编码分子(rBRE-CM)以及合适的缓冲液组成检测试剂，将检测试剂和检测标本在合适的温度和缓冲液中保温一定时间，然后用能够鉴别生物识别元件-编码分子(BRE-CM)性质差异的分离检测方法，测定出标本/检测试剂混合物中中各种生物识别元件-编码分子(BRE-CM)的浓度，进而计算出标本中靶分子的浓度。

所述的生物分子高通量定量检测方法，包括下列步骤：

步骤A，制备生物分子编码分析检测试剂；

步骤B，将所述检测试剂与检测标本混合，检测试剂中的BRE-CM与检测标本中的TMs进行结合反应；

步骤C，用分离检测方法对标本-检测试剂混合物进行分析，使各种BRE-CMs和TM-BRE-CMs组分被分离并测定每种组分含量；

步骤D，根据消耗BRE-CMs的量或生成的TM-BRE-CMs的量，计算出标本中各种靶分子的浓度。

所述步骤A包括下列步骤：

步骤A1，给不同TM的BRE标记上不同的CM，进行分子编码，形成分子性质不同的BRE-CM复合分子；

步骤A2，将所有能与TM发生特异性结合的BRE-CM(tBRE-CM)和至少一种用作参考的BRE-CM(rBRE-CM)按一定浓度，与根据检测对象所需的适量缓冲液混合，作为BMCA的检测试剂。

所述分子性质不同为分子量的差异，或者所带电荷的差异，或者光学性质的差异或者分子物理尺寸的差异。

所述步骤C中的分离检测方法是能够利用所述分子性质差异对BRE-CM和TM-BRE-CM进行组分分离和定量测定的方法。

所述步骤D具体包括下列步骤：

根据靶分子与其生物识别元件的结合比k，所述检测试剂中rBRE-CM的浓度，步骤B中加入所述检测试剂的体积V_R和所述检测标本的体积V_S，以及步骤C中测得的tBRE-CM的浓度与rBRE-CM浓度之比相对检测试剂中tBRE-CM与rBRE-CM的浓度之比的降低值ΔR，计算出每种靶分子的浓度，或者是TM-BRE-CM的量来计算标本中相应TM的浓度。

但是，下述情况除外：

当不等式I成立时，对应靶分子的浓度低于生物分子编码分析的最低检出限C_min，不进行靶分子的浓度计算；

所述不等式I为：

|ΔR|≤3×SD_ΔR

其中SD_ΔR是ΔR的变异系数。

$C_{\min }=\frac{1}{k}\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{rBRE}-\mathrm{CM}}\×(\mathrm{\ΔR}+3\×{\mathrm{SD}}_{\mathrm{\ΔR}})$

当步骤C中某tBRE-CM的浓度为零时，相应靶分子的含量超过生物分子编码分析的检测上限，认为靶分子的浓度满足等式II，不进行靶分子的浓度计算；

所述等式II为：

$C_{\mathrm{TM}}\≥k\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{tBRE}-\mathrm{CM}}$

其中，C_tBRE-CM是检测试剂中相应tBRE-CM的浓度。

所述分离检测方法为电泳分析方法或者色谱分析方法。

所述生物分子为核酸或者蛋白质或者细胞表面标志物。

本发明的有益效果是：本发明提供的一种生物分子高通量定量检测方法，可以实现蛋白质/细胞、核酸片段等所有生物大分子的高通量定量检测，显著提高生物学研究、临床检验、食品卫生检验、环境检测和法医学检验等领域相关应用的效率。

附图说明

图1为本发明的利用生物分子编码分析(BMCA)进行生物分子高通量定量检测的方法实施过程示意图；

图2为生物分子编码分析方法(BMCA)分析蛋白质的虚拟电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的一种生物分子通用高通量定量检测方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在从事免疫PCR(immuno polymerase chain reaction，immuno-PCR)检测HIV(Human immunodeficiency virus，人类免疫缺陷病毒)早期蛋白的研究过程中，发现给抗体分子标记不同长度的双链DNA(double straind DNA，dsDNA)之后，抗体-dsDNA复合物在电泳中形成的条带位置不同。据此，得到了一种与生物芯片和xMAP技术完全不同的生物分子通用的高通量定量检测方法，即生物分子编码分析(Biomolecules Coding Assay，BMCA)。

本发明利用生物分子编码分析(BMCA)进行生物分子高通量定量检测的方法仍然利用TM与其BRE结合的特异性作为本方法特异性的保证。但与现有生物分子检测技术不同的是，本发明使用分子编码的方法实现了生物分子的高通量定量检测。

即把不同的编码分子(Coding Molecules，CMs)标记在不同生物分子识别元件(BREs)上，形成分子性质各不相同的生物识别元件-编码分子(BRE-CM)，将所有能与检测靶分子特异性结合的生物识别元件-编码分子(tBRE-CM)和至少1种参考生物识别元件-编码分子(rBRE-CM)以及合适的缓冲液组成检测试剂，将检测试剂和检测标本在合适的温度和缓冲液中保温一定时间，然后用能够鉴别生物识别元件-编码分子(BRE-CM)性质差异的分离检测方法，如电泳分析方法或者色谱分析方法，测定出标本/检测试剂混合物中中各种生物识别元件-编码分子(BRE-CM)的浓度，进而计算出标本中靶分子的浓度。

本发明的生物分子通用高通量定量检测方法，包括如下基本步骤：

步骤1，制备包含至少1种rBRE-CM和若干种tBRE-CM的生物分子编码分析(BMCA)检测试剂；

如图1中A部分所示，首先，给不同TM的BRE标记上不同的CM，进行分子编码，形成分子性质不同的BRE-CM复合分子：

BRE1-CM1

BRE2-CM2

BRE3-CM3

所述分子性质不同可以是分子量的差异、所带电荷的差异、光学性质的差异或分子物理尺寸的差异，但并不限于这些差异。

对生物识别元件(BRE)的分子编码并不影响它与靶分子(TM)结合的特异性，而因为编码分子(CM)具有不同的分子性质，使得分子性质相同或不同的生物识别元件(BRE)被转变成分子性质不同生物识别元件-编码分子(BRE-CM)。

然后将所有tBRE-CM和rBRE-CM按一定浓度组成检测试剂。

因此，本发明的分子编码分析检测试剂(BMCA检测试剂)中包含至少1种rBRE-CM和若干种tBRE-CM：

rBRE-CM

tBRE1-CM1

tBRE2-CM2

tBRE3-CM3

…

步骤2，将所述检测试剂和检测标本混合，检测试剂中的tBRE-CM与混合液中的靶分子(TM)的进行结合反应。

如图1中C部分所示，将检测试剂、检测标本和缓冲液混合后，在合适温度下反应一定时间。

如果标本中含有被检测的靶分子(TM)，如图1中B部分所示，TM将与相应的tBRE-CM形成TM-BRE-CM复合分子，同时其相应的tBRE-CM被消耗。

步骤3，将各种BRE-CM或TM-BRE-CM进行定量检测。使用色谱或电泳等组分分离检测方法对标本与检测试剂混合物进行组分分析。由于各种BRE-CM和TM-BRE-CM具有各不相同的分子性质，因此能够在色谱或电泳中彼此分离并被定量测定，如图1中D1部分和图1中D2部分所示。

步骤4，计算标本中各靶分子(TM)的浓度。

根据靶分子(TM)与其生物识别元件(BRE)的结合比k，以及BMCA检测试剂中rBRE-CM的浓度C_rBRE-CM，步骤S200中加入检测试剂的体积(V_R)和标本的体积(V_S)，以及步骤S300中测得的tBRE-CM的浓度与rBRE-CM浓度之比相对检测试剂中tBRE-CM与rBRE-CM的浓度之比的降低值ΔR，利用公式(1)，可以计算出每种靶分子(TM)的浓度C_TM。

公式(1)：

$C_{\mathrm{TM}}=\frac{1}{k}\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{rBRE}-\mathrm{CM}}\×\mathrm{\ΔR}---\left(1\right)$

但是，公式(1)有两个例外：

一是当不等式(I)成立时，对应靶分子(TM)的浓度低于生物分子编码分析(BMCA)的最低检出险，而不使用公式(1)进行计算。

二是当剩余tBRE-CM的浓度为零时，相应靶分子(TM)的含量超过生物分子编码分析(BMCA)的检测上限，应认为靶分子(TM)的浓度满足等式(II)，而不应该使用公式(1)进行计算。

不等式(I)：

|ΔR|≤3×SD_ΔR   (I)

其中SD_ΔR是ΔR的变异系数。

不等式(II)：

$C_{\mathrm{TM}}\≥k\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{tBRE}-\mathrm{CM}}---\left(\mathrm{II}\right)$

其中，C_tBRE-CM是检测试剂中tBRE-CM的浓度。

下面进一步详细说明本发明利用生物分子编码分析(BMCA)进行生物分子通用高通量定量检测。

利用本发明的生物分子编码分析(BMCA)进行生物分子通用高通量定量检测方法，即利用物分子编码分析方法(BMCA)分析蛋白质、核酸片段或细胞表面标志物等所有生物大分子，实现对蛋白质、细胞表面标志物、核酸片段等所有生物大分子的高通量定量检测。

为了详细说明本发明利用生物分子编码分析(BMCA)进行生物分子通用高通量定量检测，即利用生物分子编码分析方法(BMCA)在实现生物大分子，如蛋白质、核酸以及细胞目标面标志物的分析应用，现以生物分子编码分析方法(BMCA)分析核酸片断和蛋白质的方法为例，说明本发明的利用生物分子编码分析(BMCA)进行生物分子通用高通量定量检测，但应当说明的是，本发明利用生物分子编码分析(BMCA)进行生物分子通用高通量定量检测并不只限于本实例所述的方式。

实施例一生物分子编码分析方法(BMCA)分析核酸片段的方法

以124bpds DNA作为rBRE-CM，以大肠杆菌16S RNA基因组探针作为tBRE1，以175bp ds DNA作为CM₁，以金黄色葡萄球菌16S RNA基因组探针作为tBRE₂，以322bp ds DNA标记的CM₂，配制由rBRE-CM3.3ng/μl、tBRE-CM₁3.9ng/μl、tBRE-CM₂15ng/μl组成的检测试剂。以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌16S RNA基因组DNA的PCR产物作为检测标本。以安捷伦2100生物芯片分析仪和DNA2100型电泳芯片作为分离检测方法，建立BMCA检测系统，对金黄色葡萄球菌16S RNA基因的PCR产物进行检测。

TM：金黄色葡萄球菌16S RNA基因片段

tBRE₁：5′CGAACGGTAACAGGAAGAAGC3′

tBRE₂：5′CTTCTCTGATGTTAGCGGCG3′

CM₁：5′CGTGGTCATCACCTCG TCAATTGGTGCGGTCTACATGGACCCGAACCGTGACCCTGAAGCCGTCGTTGACGAAAGTTGCTGGAGTGATCTTGAGTTCTGCAAAAACACCAAGAATTGGTATTGTTACGGCAAGATGGTGGCGGAGCAAGCCGCGTGGGAGACGGCAGAGGAGAAA3′

CM₂：5′GGCTACACGGTCAAAGGAACCGTACGGAATCCAGATGATCCGAAGAATACACATTTGAGAGAGATCGAAGGAGCCAAGGAGAGACTGATTCTGTGCAAAGCAGATCTTCAGGACTACGATGCTCTTAAGGCGGCTATCGATGGTTGTGACGGCGTCTTTCACACGGCTTCTCCGGTCACTGACGATCCCGAGCAAATGGTGGAGCCGGCCGTGAACGGAGCCAAGTTTGTAGTTAATGCTGCAGCTGAAGCCAAGGTGAAGCGCGTGGTCATCACCTCGTCAATTGGTGCGGTCTACATGGACCCGAACCGTGACCCTGAAG3′

rBRE-CM：5′TGACGATCCCGAGCAAATGGTGGAGCCGGCCGTGAACGGAGCCAAGTTTGTAGTTAATGCTGCAGCTGAAGCCAAGGTGAAGCGCGTGGTCATCACCTCGTCAATTGGTGCGGTCTACATGGAC3′

检测标本：

金黄色葡萄球菌16S RNA基因的PCR产物作为标本1，稀释为50％后作检测标本2，稀释为25％后作检测标本3。

检测过程如下：

1.进行生物识别元件(BRE)的分子编码与制备检测试剂。

(1)CM₁标记tBRE₁：将tBRE₁的序列加挂在CM₁正义链引物的5′端，合成引物P1：5′CGAACGGTAACAGGAAGAAAACAAGCCGTGGTCATCACCTCGTC3′，将P1与CM₁按一定的比例混合，其物质的量之比为1:1～10:1，体系中含Taq酶0.1～1U/μl和1.5～3.0mmol/L MgCl₂。94℃变性5～20分钟(min)，迅速降温到50～60℃，保温30秒(s)～10分钟(min)，升温到72℃，保温5～30分钟(min)。之后用高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或PCR产物纯化试剂盒纯化tBRE₁-CM₁。

(2)CM₂标记tBRE₂：将tBRE₂的序列加挂在CM₂正义链引物的5′端，合成引物P2：5′CTTCTCTGATGTTAGGCTCTAGGGCGGGCTACACGGTCAAAGGA3′，将P2与CM₂按一定的比例混合，其物质的量之比为1:1～10:1，体系中含Taq酶0.1～1U/μl和1.5～3.0mmol/L MgCl₂。94℃变性5～20分钟(min)，迅速降温到50～60℃，保温30秒(s)～10分钟(min)，升温到72℃，保温5～30分钟(min)。之后用高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或PCR产物纯化试剂盒纯化tBRE₂-CM₂。。

(3)按rBRE-CM3.3nmol/μl、tBRE₁-CM₁3.9nmol/μl、tBRE₂-CM₂15nmol/μl组成检测试剂，其中含2×PCR缓冲液和2.0-5.0mmol/L MgCl₂。

2.检测试剂与标本反应。

取200μl Eppendof管6支，编1～6号按表1操作，检测标本1、标本2和标本3首先在99℃变性5～10℃后立即置冰浴备检，首先按表1.加样：

表1.加样表

加样完毕后，用涡旋混合器混匀，3000rpm离心30s，置50～60℃，保温30～60分钟(min)以完成BRE-CM与核酸片断的杂交。

3.进行电泳检测

使用Agilent 2100 Analyzer和DNA 1000型电泳芯片进行电泳检测，按仪器和DNA 1000电泳芯片的操作常规进行电泳检测。各检测标本和标本空白中rBRE-CM和tBRE₁-CM₁、tBRE₂-CM₂的浓度见表2。

表2.检测结果

4.计算靶分子(TM)的浓度。

(1)k：由于BRE-CM与靶分子(TM)的结合比为1:1，所以k＝1

V_R＝5μl

V_S＝5μl

C_rBRE-CM＝3.3nmol/μl

(2)计算比率下降值ΔR，见表3：

表3.各组分的ΔR值

(3)计算各靶分子(TM)浓度

由于标本1、2、3中ΔR₁均满足不等式(I)，故TM₁的含量均为0nmol/μl；由于ΔR₂不满足不等式(I)，且标本1、2、3中剩余tBRE₂-CM₂的浓度均大于零，固可以用公式1对TM₂的浓度进行计算。结果见表4：

表4.检测标本中靶分子(TM)含量

(4)结果分析：

理论上，标本2中TM2的浓度应当为标本1的50％，标本2中的浓度应当为标本2的50％，而实际测得的浓度与此有一些小的误差，其是稀释时的加样误差所致。

实施例二生物分子编码分析方法(BMCA)分析蛋白质的方法

以124bp dsDNA作为rBRE-CM，以地高辛(Dig)作为tBRE₁，以367bpdsDNA作为CM₁，以生物素(Bio)作为tBRE₂，以394bp dsDNA作为CM₂，按照2.0ng/μl rBRE-CM、1.6ng/μl Dig-367bpdsDNA(tBRE₁-CM₁)和2.0ng/μlBio-394bpdsDNA(tBRE₂-CM₂)组成BMCA检测试剂R1，以安捷伦2100生物分析仪和DNA1000型电泳芯片作为分离检测方法，构建BMCA检测系统。

TM：链亲和素

下面详细说明本实施例利用生物分子编码分析方法(BMCA)进行蛋白质检测过程的过程：

1.制备检测试剂

(1)PCR制备124bp dsDNA：

PCR引物S：5′GACGATCCCGAGCAAAT3′

PCR引物A：5′GTCCATGTAGACCGCACC3′

PCR模版：为甘蓝型油菜(Brassica napus.L.)中一条肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因的一个片断，克隆载体为pMD18-T(TaKaRa)，含Amp抗性基因，转入大肠杆菌DH5α，用热裂解法提取核酸作为PCR模版。

PCR条件为：

(2)PCR制备Dig-367bp dsDNA：

PCR引物S：5′Dig-GGTGGATACATCGCTTCTT3′

PCR引物A：5′CTTCAGGGTCACGGTTCG3′

其余过程与制备124bp dsDNA的方法过程相同，请参照制备124bpdsDNA过程，本实施例中不再一一详细描述。

(3)PCR制备Bio-394bp dsDNA：

PCR引物S：5′Bio-GGTGGATACATCGCTTCTT3′

PCR引物A：5′CACTCCAGCAACTTTCGT3′

其余过程与制备124bp dsDNA的方法过程相同，请参照制备124bpdsDNA过程，本实施例中不再一一详细描述。

(4)测定PCR产物中dsDNA浓度

使用Bio-RAD SmartSpectTM3000型紫外分光光度计，按操作规程进行。

(5)配制检测试剂R1：

按20ng/μl124bp dsDNA、16ng/μl Dig-(367bp)dsDNA和20ng/μlBio-(394bp)dsDNA配制成R；将R用去离子水稀释10倍，配成R1。

2.准备检测标本

取1mg StreptAvidin1支，14,000rpm离心10min；加入1×PBS(pH7.4)1ml，颠倒混匀溶解3min；取500μlEP管3支，标S10ng、S1ng和S500pg，向S10ng管中加入1×PBS(pH7.4)99μl、1mg/ml StreptAvidin1μl，向S1ng管中加入1×PBS(pH7.4)90μl、S10ng10μl，向S500pg管中加入1×PBS(pH7.4)50μl、S10ng50μl，反复颠倒混匀，置4℃冰箱备用。

3.进行检测标本与检测试剂的结合反应

取200μl EP管3支，分别标记为R1b、R1Sn、R1Sp，按表5加样：

表5BMCA生物结合反应操作加样表

加样完毕后用蜗旋混匀，6,000rpm离心5s，40℃水浴1h，之后6,000rpm离心10s备检。

4.准备凝胶和染料混合物

从4℃冰箱中取出DNA1000试剂盒，室温平衡30min，从试剂盒中取出凝胶1支、浓缩染料1支，将浓缩染料在蜗旋振荡器上振荡混匀10s，在微型离心机上室温14000rpm离心5s，吸取25μl浓缩染料，加入到凝胶管中，在蜗旋振荡器上振荡混匀10s，全部转入1支带滤芯的Eppendof管的滤芯中，室温2200G(6000rpm)离心15min，弃虑芯，盖上Eppendof管的管盖，标记为Gd。

5.准备电泳芯片

将DNA1000芯片从4℃冰箱中取出，室温平衡30min，置于灌胶器上，在黑色圆圈标记的G孔中加入9μl Gd，用定量注射器压入1ml空气压胶60s，释放注射器压缩定位卡，待注射器自动弹起10s后将注射器拉回1ml，卸下注射器，向另外两个没有黑色圆圈标记的G孔中加入Gd各9μl。

6.芯片上样

在1-12孔和ladder孔中各加5μl DNA Maker，在1-12泳道中分别加入R1b、R1b、R1b、R1b、R1b、R1b、R1Sn、R1Sn、R1Sn、R1Sp、R1Sp、R1Sp各1μl，在ladder孔中加入ladder1μl，将加好样的DNA1000电泳芯片置于专用振荡器上振荡1min，备检。

7.芯片电泳

用清洗芯片(加去离子水)清洗2100分析仪的电极10s，将准备好的DNA1000电泳芯片放入2100分析仪，打开Agilent Technologies2100Bioanalyzer-2100expert B02.02 SI238软件，选取分析芯片型号为DNA1000，输入各泳道的样品名称，点击“start”按钮，开始电泳。

8.实验结果及分析

(1)生物分子编码分析方法(BMCA)分析蛋白质的虚拟电泳图如图2所示，行1-3为R1Sn；行4-6为R1Sp；行7-9为R01Sn；行10-12为R01Sp。

(2)电泳测得各BMCA测试中BRE-CM的浓度如表6所示

表6.BMCA检测蛋白质实验结果

(3)根据表6结果，计算tBRE-CM/rBRE-CM，结果如表7所示。

表7.BMCA检测蛋白实验中tBRE-CM与rBRE-CM的比值

(4)计算标本空白中tBRE-CM2/rBRE-CM的均值(RR)及标准差SD_ΔR

RR＝(1.01+0.99+1.00+1.00+0.99+1.00)/6＝1.00

SD_ΔR＝0.01

(5)计算BMCA检测Slng时tBRE-CM2/rBRE-CM的均值(R_T1)及测得标本中链亲和素的浓度(C_TM1)

R_T1＝(0.59+0.60+0.59)/3＝0.59

由于R_T1的降低值＝R_R-R_T＝1.00-0.59＝0.41>3×SD_ΔR，可以使用公式：

$C_{\mathrm{TM}}=\frac{1}{k}\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{rBRE}-\mathrm{CM}}\×\mathrm{\ΔR}$

来计算检测标本中链亲和素的浓度：

$C_{\mathrm{TM}1}=\frac{1}{4}\×\frac{5}{1}\×2.0\×0.41=1.03(\mathrm{ng}/\mathrm{\μl}).$

(6)计算BMCA检测S500pg时tBRE-CM2/rBRE-CM的均值(R_T2)及测得标本中链亲和素的浓度(C_TM2)

R_T2＝(0.82+0.82+0.83)/3＝0.82

由于R_T2的降低值＝R_R-R_T＝1.00-0.82＝0.18>3×SD_ΔR，可以使用公式：

$C_{\mathrm{TM}}=\frac{1}{k}\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{rBRE}-\mathrm{CM}}\×\mathrm{\ΔR}$

来计算检测标本中链亲和素的浓度：

$C_{\mathrm{TM}2}=\frac{1}{4}\×\frac{5}{1}\×2.0\×0.18=0.45(\mathrm{ng}/\mathrm{\μl}).$

本实施例是为了更好地理解本发明进行的详细的描述，并不是对本发明所保护的范围的限定，因此，本领域普通技术人员不脱离本发明的主旨未经创造性劳动而对本明所做的改变在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种生物分子高通量定量检测方法，其特征在于，使用分子编码的方法实现了生物分子的高通量定量检测，具体是：把不同的编码分子标记在不同生物分子识别元件上，形成分子性质各不相同的生物分子识别元件-编码分子；将所有能与检测靶分子特异性结合的生物分子识别元件-编码分子和至少1种参考生物分子识别元件-编码分子以及合适的缓冲液组成检测试剂；将检测试剂和检测标本在合适的温度和缓冲液中保温一定时间，然后用能够鉴别生物分子识别元件-编码分子性质差异的分离检测方法，测定出标本/检测试剂混合物中各种生物分子识别元件-编码分子的浓度，进而计算出标本中靶分子的浓度；

该方法包括下列步骤：

步骤A，制备生物分子编码分析检测试剂，具体包括下列步骤：

步骤A1，给不同检测靶分子即TM的生物分子识别元件即BRE标记上不同的编码分子即CM，形成分子性质不同的生物分子识别元件-编码分子即BRE-CM；所述分子性质不同为分子量的差异，或者所带电荷的差异，或者光学性质的差异或者分子物理尺寸的差异；

步骤A2，将所有能与TM发生特异性结合的BRE-CM即tBRE-CM和至少一种用作参考的BRE-CM即rBRE-CM按一定浓度，与根据检测对象所需的适量缓冲液混合，作为生物分子编码分析即BMCA的检测试剂；

步骤B，将所述检测试剂与检测标本混合，检测试剂中的BRE-CM与检测标本中的TM进行结合反应，形成检测靶分子-生物分子识别元件-编码分子即TM-BRE-CM；

步骤C，用分离检测方法对标本/检测试剂混合物进行分析，使各种BRE-CM和TM-BRE-CM组分被分离并测定每种组分含量；所述分离检测方法是能够利用所述分子性质差异对BRE-CM和TM-BRE-CM进行组分分离和定量测定的方法；

步骤D，根据消耗BRE-CM的量或生成的TM-BRE-CM的量，计算出标本中各种靶分子的浓度，具体包括下列步骤：

根据靶分子与其生物分子识别元件的结合比k，所述检测试剂中rBRE-CM的浓度C_rBRE-CM，步骤B中加入所述检测试剂的体积V_R和所述检测标本的体积V_S，以及步骤C中测得的tBRE-CM的浓度与rBRE-CM浓度之比相对检测试剂中tBRE-CM与rBRE-CM的浓度之比的降低值ΔR，计算出每种靶分子的浓度C_TM：

$C_{\mathrm{TM}}=\frac{1}{k}\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{rBRE}-\mathrm{CM}}\×\mathrm{\ΔR}$

但是，下述情况除外：

当不等式I成立时，对应靶分子的浓度低于生物分子编码分析的最低检出限C_min，不进行靶分子的浓度计算；

所述不等式I为：

|ΔR|≤3×SD_ΔR

其中SD_ΔR是ΔR的变异系数；

当步骤C中测得的tBRE-CM的浓度为零时，相应靶分子的含量超过生物分子编码分析的检测上限，认为靶分子的浓度满足不等式II，不进行靶分子的浓度计算；

所述不等式II为：

$C_{\mathrm{TM}}\≥\frac{1}{k}\×\frac{V_R}{V_S}\×C_{\mathrm{tBRE}-\mathrm{CM}}$

其中，C_tBRE-CM是检测试剂中相应tBRE-CM的浓度。

2.根据权利要求1所述的生物分子高通量定量检测方法，其特征在于，所述分离检测方法为电泳分析方法或者色谱分析方法。

3.根据权利要求1所述的生物分子高通量定量检测方法，其特征在于，所述生物分子为核酸或者蛋白质或者细胞表面标志物。

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