JP2000310641A - 微生物の検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 被験水中の微生物の存否や濃度を簡便かつ迅
速に検査する方法の提供。 【解決手段】 分子生物学分野においてタンパク質や核
酸などの分子間相互作用の計測技術として提案されてい
る蛍光偏光度法を応用して、所望の微生物を含んだ被験
水もしくはその抽出物の懸濁液に蛍光プローブを添加し
たときの蛍光偏光度を計測すれば被験水中の該微生物の
存否を迅速に検査することができ、さらに、濃度が既知
の標品について同様の検査をして得られた蛍光偏光度に
基づく検量線と比較すれば被験水中の該微生物の濃度を
定量・評価することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】最近、原虫クリプトスポリジ
ウムや病原性大腸菌Ｏ−１５７などを原因としたの新興
もしくは再興の水系感染症の発生が大きな社会問題とな
っている。これら感染症の集団発生を未然に防止するた
めには、食品製造プロセスや水処理プロセスにおける原
因微生物のモニタリングが必要不可欠である。また、病
原微生物を除去して安全な浄水を供給するための新水処
理プロセスを開発する場合においても、原因微生物の存
否を評価する必要がある。本発明は、迅速かつ簡便な水
中の微生物の検査方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】新興の水系感染症の原因微生物として、
例えばクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類が
ある（総説として例えば、保坂三継（１９９８）「水系
原虫感染症―原因微生物と流行発生―」、用水と廃水、
第４０巻、第２号、１１頁；金子光美（１９９８）「原
虫類やその他の病原微生物の検出とその除去技術」、用
水と廃水、第１０巻、第４号、３２頁など）。これら原
虫類は環境水中においてはオーシストもしくはシストと
呼ばれる嚢胞状の殻に包まれた形態で存在しており、ク
リプトスポリジウムのオーシストやジアルジアのシスト
が検査の対象となっている。従来の検査法としては、顕
微鏡観察法、免疫学的検査法、遺伝子検査法がある。

【０００３】まず、顕微鏡観察法は、色素もしくは蛍光
色素で微生物細胞を染色し、顕微鏡もしくは蛍光顕微鏡
によって染色された微生物数を計数する方法であり、微
生物の種を問わず、非特異的に細胞を染色するために、
形態や大きさの点から他の微生物（酵母や細菌など）と
の識別は可能であるが、近縁種のオーシストとの識別に
は熟練を要するため、一般には誤判定を招きやすいとさ
れている。ついで、免疫学的検査法としては、蛍光抗体
染色、フローサイトメーター分析、蛍光分光分析、酵素
抗体法、ウェスタン分析等が挙げられる。免疫学的検査
法は、対象とする微生物もしくはその生体成分に対して
特異的に結合する抗体を用いることによって、検査対象
の微生物のみを特異的に検出することが可能であるが、
顕微鏡による目視観察、高額なフローサイトメーター分
析機器、染色操作が煩雑、多量の微生物を含んだ試料が
必要など、操作性や定量性の点で満足のゆく検査方法と
はいえない。

【０００４】さらに、遺伝子検査法としては、サザン分
析、ノーザン分析、ＲＣＲ[polymerase chain reactio
n] 分析、ＲＴ−ＰＣＲ [逆転写ＰＣＲ] 分析等が挙げ
られる。遺伝子検査法は、着目する遺伝子に十分配慮す
れば、検査対象の微生物を特異的に検出することが可能
であるが、遺伝子解析に関する専門知識が必要、試験操
作が煩雑な上に、存在の有無は判定できても、存在量に
ついての定量的な評価が困難である。

【０００５】ところで、タンパク質や核酸分子等の生体
分子間の結合特性を検出する方法として蛍光偏光度法が
知られている（総説として例えば、Checovich, W. J. e
t al., (1995) Fluorescence polarization: a new too
l for cell and molecular biology, Nature, vol.375,
p254 ）。この方法は、１９２６年にPerrinによって最
初に報告され（Perrin, F. (1926) J. Phys. Rad., vo
l.1, p390）、最近、再び注目されるようになった。蛍
光偏光度法の測定原理は、蛍光分子を懸濁した溶液に、
振幅方向が均一な蛍光を入射光として照射すると、蛍光
分子の自由運動によって入射光が散乱されあらゆる振幅
方向の反射光を生じるが、標的分子との結合等の固定化
によって蛍光分子の自由運動が拘束された状態では、入
射光に対して特定の振幅面に偏光された反射光が生じる
という現象に基づき、偏光の程度（偏光度）を指標とし
て蛍光分子と標的分子との結合状態（結合量や結合強
度）を調べることができる。つまり、蛍光分子と結合し
うる標的分子が被験水中に存在しなければ、蛍光分子は
自由運動状態となり偏光度は微小であるが、蛍光分子と
結合する標的分子が被験水中に存在する場合には、蛍光
分子と標的分子との結合によって蛍光分子が固定化され
運動状態が低減するために偏光度が高くなることから、
偏光度の変化を計測することによって被験水中の標的分
子の存在量を推定できる。

【０００６】この蛍光偏光度法の適用例（総説として例
えば、Mineno, J. (1997) 蛋白質・核酸・酵素，第４２
巻，第１号，７７頁）としては、抗体とその抗原タンパ
ク質の結合測定やタンパク分解酵素とその基質タンパク
質分子との反応性測定などのタンパク質分子間の相互作
用分析、ＤＮＡハイブリダイゼーションなど核酸分子間
の相互作用分析、ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質との
結合測定やタンパク質と糖鎖との結合測定など異種分子
間の相互作用分析などがある。しかしながら、いずれも
単離精製した生体分子に関する事例であり、微生物の細
胞のような巨大分子に適用した例は報告がない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従来知られている微生
物（とりわけクリプトスポリジウム等の原虫類）の検査
方法は、前記したように、操作の簡便さや検出精度の点
で満足のゆく方法がない。また、蛍光偏光度法について
は単離精製した生体分子に関する適用例はあるが、微生
物の細胞のような巨大分子に適用した例はない。そこ
で、本発明においては、蛍光偏光度法の原理に基づい
た、被験水中の原虫類や病原性細菌など微生物の存否や
濃度を簡便かつ迅速に検査する方法を提供することを課
題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従来は単離精製した生体
分子についてのみ適用されていた蛍光偏光度法に関し
て、蛍光プローブの選定、被験水の前処理条件、結合溶
媒条件、偏光度測定条件等を最適化することによって、
被験水中の微生物や細胞等の生物体を検出・定量するこ
とができる。すなわち、本発明は、検査対象の微生物を
構成する物質に結合しうる化合物を蛍光物質で修飾した
蛍光プローブを被験水に添加して蛍光偏光度を計測する
ことを特徴とし、該蛍光偏光度の変化量から被験水中に
含まれる対象微生物の濃度を定量する微生物の検査方法
である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の説明に先立ち、まずは用
語を説明する。 ・標的分子：検査したい微生物細胞の表面に露出したタ
ンパク質や糖鎖、もしくは、微生物細胞内に存在するタ
ンパク質、核酸、糖質、脂質等の生体成分のうち、検査
に用いるプローブが特異的に結合しうる生体成分を意味
する。 ・プローブ：標的分子と結合しうる化合物。具体的に
は、抗体、レクチン、オリゴヌクレオチド等が挙げられ
る。 ・蛍光プローブ：フルオレセイン、ＦＩＴＣ[fluoresce
in isothiocyanate]、ローダミン、テキサスレッド等の
蛍光化合物で修飾したプローブ。 本発明は、検査したい微生物の種類に応じてプローブを
選定すれば、目的の微生物量を定量することができるた
め、検査対象の微生物種に特に限定はないが、一例とし
て、上下水道分野で特に問題視されている原虫クリプト
スポリジウムについて、検査手順の流れに沿って以下に
記載する。

【００１０】（１）標的分子の選定：クリプトスポリジ
ウムは環境水中においては、スポロゾイドと呼ばれる感
染性虫体を内包したオーシストの形態で存在しており、
標的分子としては、オーシスト外皮表面に露出した生
体成分、スポロゾイド表皮に露出した生体成分、オ
ーシストもしくはスポロゾイドの細胞破砕物から抽出し
た生体成分等が挙げられる。環境水中のクリプトスポリ
ジウムの存在量を検査するためにはを標的分子として
選定すればよいが、感染能力を保持したクリプトスポリ
ジウムの存在量を評価するためにはを標的分子として
選定すればよい。の生体成分としては、ＤＮＡやＲＮ
Ａ等の核酸、タンパク質、糖質、脂質等が挙げられる
が、クリプトスポリジウムを限定的に検出するために
は、標的分子の選定に熟慮する必要があり、例えば、ク
リプトスポリジウムに特徴的な遺伝子の塩基配列を選定
すればよい。また、脱嚢時や感染・発症時に特徴的に発
現する遺伝子やタンパク質を標的分子として選定すれ
ば、感染能力を保持したクリプトスポリジウムの存在量
を評価することができる。これらのうち、検査の容易さ
を考慮すると、ないしはが簡便である。

【００１１】（２）蛍光プローブの選定：前記した標的
分子に特異的に結合するプローブとしては、抗体、レク
チン、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。このうち、
抗体についてはクリプトスポリジウムのオーシスト外皮
を抗原とした抗体が種々市販されており、入手の容易さ
や特異性の点で好適である。さらに、蛍光偏光度法にお
いては、標的分子に対してできる限り多くの蛍光プロー
ブが結合した方が検出感度が高まる可能性があるため、
モノクローナル抗体よりはむしろポリクローナル抗体の
方が好適である。

【００１２】プローブを標識する蛍光化合物は、蛍光偏
光度分析装置の検出特性に応じて選択することができ、
例えば、フルオレセイン、ＦＩＴＣ[fluorescein isoth
iocyanate]、ローダミン、テキサスレッド等が挙げられ
る。プローブへの蛍光化合物の修飾は公知の方法で行う
ことができる。あるいは、蛍光染色等の他の用途のため
に市販されている蛍光抗体を用いることもできる。

【００１３】（３）被験水の調製：被験水中のクリプト
スポリジウム・オーシスト濃度が10,000個／Ｌよりも低
いことが予想される場合には、遠心分離、ろ過捕集、化
学凝集沈殿などの公知の方法によって被験水中のクリプ
トスポリジウムを濃縮することが望ましい。スポロゾイ
ドもしくはその抽出物を標的分子として選定した場合に
は、公知の方法（例えば、Upton,S.J. (1994) ^A simpl
e and reliable method of producing in vitro infect
ion of Cryptosporidium parvum (Apicoplexa)", FEMS
Microbiol. Lett, vol.118, p45 ）で被験水を処理し
て、被験水中のオーシストをあらかじめ脱嚢させ、オー
シスト中のスポロゾイドを遊離させればよい。

【００１４】オーシストやスポロゾイドの抽出物を標的
分子として選定した場合には、公知の方法で所望の生体
成分を含んだ抽出物を得ることができる。ＤＮＡやＲＮ
Ａ等の核酸を標的分子として選定した場合には、抽出物
の懸濁液自体を試料として次項以降の工程に供してもよ
いが、ＰＣＲないしはＲＴ−ＰＣＲによって所望の塩基
配列を増幅すれば検出感度を高めることができる。

【００１５】（４）検査試薬の添加：被験水へ蛍光プロ
ーブを添加して、結合反応に供する。被験水へは、結合
反応を助長・安定化する目的で種々の化合物（例えば、
アルブミン、ポリビニールアルコール、ポリエチレング
リコール、エチレンジアミン四酢酸塩、プロテアーゼイ
ンヒビター、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ヘペス緩衝
液など）を必要に応じて添加してもよい。

【００１６】（５）結合反応：結合反応の条件は、標的
分子とプローブの組合せを考慮して、至適な温度・時間
を選定することができる。検査試薬を加えた後に速やか
に蛍光偏光度計測を実施してもよいが、室温〜３７℃に
加温、もしくは、氷温〜１５℃に冷却して、数分〜数時
間反応させた後に蛍光偏光度を計測することで、結合反
応を促進・安定化させることができ、所望の標的分子と
プローブの組合せに応じて至適な条件を選定することが
できる。蛍光プローブの添加濃度は、予備検討によって
至適化した濃度で添加することができる。核酸を標的分
子とし、オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場
合には、加熱とそれに続く徐冷によってアニーリングさ
せることができる。

【００１７】（６）蛍光偏光度の計測：蛍光偏光度の計
測は、市販の蛍光偏光度計を使用することができる。 （７）データ解析：濃度が既知のオーシスト懸濁液を被
験水として検量線を作成し、調べたい試料を被験水とし
た場合の蛍光偏光度の計測値と検量線とを比較すること
によって試料中のオーシスト濃度を推定することができ
る。

【００１８】

【実施例】既知量のクリプトスポリジウム・パルバム・
オーシストを含んだ水試料を被験水として、抗クリプト
スポリジウム抗体をプローブとして検査した。クリプト
スポリジウム懸濁液をＰＢＳ緩衝液で順次希釈して、１
ｍＬあたり０〜１０，０００個の範囲でオーシスト希釈
懸濁液を調整した。該希釈懸濁液１ｍＬに対して、ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ溶液［１ｍｇ−ウシ血清アルブミン；ＰＢＳ
緩衝液］を０．１ｍＬ添加して、更に、ＦＩＴＣ標識し
た抗クリプトスポリジウム・モノクローナル抗体（和光
純薬）を終濃度１００ｐｇ／ｍＬで添加し、３７℃にて
１分間保温した後に蛍光偏光度計（米国ＰａｎＶｅｒａ
社 ＢＥＡＣＯＮ（商標））を用いて蛍光偏光度を測定
した。

【００１９】結果を図１に示す。図１では、横軸にクリ
プトスポリジウム・オーシスト濃度を示し、縦軸に蛍光
偏光度をオーシストを含まない被験水の計測値に対する
相対値としてプロットした。本図から明らかなように、
オーシストの濃度に依存して蛍光偏光度が高まった。本
実施例の結果より、クリプトスポリジウム・オーシスト
数が１０，０００個以下の範囲においてその濃度に応じ
た定量評価が可能であることが明らかである。

【００２０】

【発明の効果】本発明によれば、従来法に比べて極めて
簡便に水中の微生物量を定量・評価することができる。
本発明は、抗体をプローブとして目的の微生物の存在量
を検査できるばかりでなく、微生物細胞もしくはその生
体成分に結合可能な蛍光化合物やレクチン等をプローブ
として用いることもできる。また、生物活性に特徴的な
生体成分（ＲＮＡ、タンパク質）を標的分子として選定
すれば、微生物の生死を識別することができる。さら
に、目的の微生物に特徴的な核酸を選定すれば、ＰＣＲ
やＲＴ−ＰＣＲによって増幅することができるため、さ
らに高感度に検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】クリプトスポリジウムに関して本願の検査方法
を用いて検出した実施例を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA17 CA03 DA02 EA01 GA04 GA07 GB03 GB21 HA07 KA07 LA01 NA06 NA11 4B063 QA01 QQ05 QQ06 QQ08 QQ18 QR31 QR48 QR56 QR66 QX02

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検査対象の微生物を構成する物質に結合
   しうる化合物を蛍光物質で修飾した蛍光プローブを被験
   水に添加して蛍光偏光度を計測することを特徴とし、該
   蛍光偏光度の変化量から被験水中に含まれる対象微生物
   の濃度を定量する微生物の検査方法。